作用于酪氨酸激酶以诊断和治疗骨关节炎的方法和组合物的制作方法

专利名称：作用于酪氨酸激酶以诊断和治疗骨关节炎的方法和组合物的制作方法
技术领域：
OA主要为非炎性疾病，其特征在于关节软骨的渐进损失引起的关节疼痛和强直。OA为最常见的年龄相关疾病之一，估计其影响全世界约5,600万人或60岁以上人口的80％。虽然一般认为OA为退化病症，但是此疾病与软骨细胞的活化相关，其中所述的软骨细胞为正常关节软骨中存在的主要细胞类型。此细胞活化的标志包括肥大、增殖、去分化、现存细胞外基质的降解和最终的细胞凋亡。
OA的分子病因学仍然未知。因此当前治疗OA的疗法针对于缓解症状(如减少关节疼痛和续发的炎性变化)，而不是针对于治疗疾病的根本原因。目前还没有阻止疾病进程的药物介入。许多患者因此发展到必需进行全关节置换术的疾病晚期。综述请见Pritzker，Brandt等编，《(Osteoarthritis》，Oxford University Press，50-61页(1998)。也见Sandell &Aigner，Arthritis Res.，第3卷，No.2，107-113页(2001)。
大规模的OA cDNA文库测序鉴定出多种推定的病态软骨细胞表达的基因产物或“标记基因”。见Stokes等，Arthritis Rheum.，第46卷，No.2，404-419页(2002)；Hu等，J.Biol.Chem.，第273卷，No.51，34406-34412页(1998)，Aigner等，Arthritis Rheum.，第44卷，No.12，pp.2777-2789(2001)；以及Kumar等，Osteoarthritis Cartilage.，第9卷，No.7，641-653页(2001)。然而尚未获得这些基因产物的功能信息，它们即使与OA有关，其作用也仍然未知。因此，OA的分子基础仍然未知，并且只知道极有限数量的潜在药物靶。
因此仍然需要治疗OA和相关疾病的治疗化合物和方法。还需要可能有用的新基因和基因产物，例如此类OA疗法的药物靶。还需要新的方法，尤其需要新的鉴定此类药物靶的新筛选测定法。
发明概述本发明涉及治疗和诊断OA的方法和组合物。本发明具体提供了受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族成员和其配体(例如GAS6和PROS1)的新用途，该亚家族包括TYRO3、Axl和cMer。申请人惊奇地发现TYRO3和其配体(特别是GAS6)在来自患有OA的个体的软骨细胞和组织中表达水平有所提高。此外，软骨细胞中TYRO3或Axl表达的提高和/或用TYRO3配体处理软骨细胞引起OA相关的若干不同基因的表达，而TYRO3、Axl或cMer的抑制(例如通过RNA干扰)阻断了IL-1或TNF介导的OA遗传标记的诱导表明受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族可能在体内介导软骨降解中发挥关键作用并因此是发展治疗、预防或减轻OA的新治疗法的有用的药物靶。
因此，本发明提供使用受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族成员(例如TYRO3、AXL和cMer)和/或其配体例如(GAS6或PROS1)的新筛选测定法来鉴定治疗OA的化合物。一方面，这些方法包括使测试化合物与含有TYRO3亚家族成员多肽和其配体的反应混合物接触，尤其是在允许配体与多肽结合以形成结合复合体的条件下接触。在优选的方面，TYRO3亚家族成员多肽为TYRO3，并且配体为TYRO3配体。然后可在存在测试化合物的反应混合物中检测结合复合体的形成水平，将这些水平与在不含测试化合物的条件下形成的结合复合体水平相比较。在这样的方法中，存在测试化合物条件下形成的结合复合体水平的下降表明测试化合物可用于治疗OA。
在这些方法的优选实施方案中，TYRO3多肽为包含SEQ ID NO2中所列氨基酸序列的多肽。在其他优选的实施方案中，TYRO3配体为GAS6多肽，优选为包含SEQ ID NO3中所列氨基酸序列的多肽。
其他方面，本发明还提供确诊患有OA的个体的诊断方法。在一个实施方案中，这些方法包括检测来源于个体(例如OA患者或怀疑患有OA的其它个体的)生物试样(例如软骨细胞、软骨组织和/或滑膜液或血清)中编码受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族多肽成员的核酸，优选TYRO3核酸，并比较所述生物试样中该核酸的水平与未患有OA的个体的核酸水平。在这样的实施方案中，所述生物试样中该核酸提高的水平表明该个体确实患有OA或个体要么具有增加的出现OA的危险。
在其他的实施方案中，本发明的诊断方面包括检测检测来源于个体(例如OA患者或怀疑患有OA的其它个体)的生物试样(例如软骨细胞、软骨组织和/或滑膜液或血清)中属于受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族的多肽的水平，优选检测TYRO3多肽的水平，并比较所述生物试样中该多肽的水平与未患有OA个体中该多肽的水平。在这样的实施方案中，个体生物试样中该多肽提高的水平表明个体确实患有OA或个体要么具有增加的出现OA的危险。
这些诊断方法特别优选的实施方案中，TYRO3多肽可为具有SEQ IDNO2中所列氨基酸序列的多肽，TYRO3核酸可为编码具有SEQ ID NO2中所列氨基酸序列多肽的核酸。
另外，本发明还提供了使用受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族成员的配体，优选使用TYRO3配体(如GAS6或PROS1)鉴定患有OA的个体的诊断方法。例如，在一个实施方案中，此类方法包括检测来源于个体(例如OA患者或怀疑患有OA的其它个体)的生物试样(例如软骨细胞、软骨组织和/或滑膜液或血清)中编码TYRO3亚家族成员配体的核酸，并比较所述生物试样中核酸水平与未患有OA的个体的核酸水平。在这样的实施方案中，编码该配体核酸的提高的水平表明个体确实患有OA或个体要么具有增加的出现OA的危险。
在其他的实施方案中，本发明的诊断方面包括检测来源于个体(例如OA患者或怀疑患有OA的其它个体的生物试样(例如软骨细胞、软骨组织和/或滑膜液或血清)中TYRO3亚家族成员配体多肽，优选检测TYRO3配体多肽并比较所述生物试样中该配体多肽的水平与未患有OA的个体中配体多肽的水平。在这样的实施方案中，所述个体生物试样中该配体多肽提高的水平表明个体确实患有OA或个体要么具有增加的出现OA的危险。
在这些诊断方法特别优选的实施方案中，TYRO3配体优选为GAS6多肽，如包含SEQ ID NO3中所列氨基酸序列的多肽。同样，编码TYRO3配体的核酸优选为编码GAS6的核酸，如编码SEQ ID NO3中所列氨基酸序列的核酸。在特别优选的实施方案中，编码TYRO3配体的核酸包含SEQID NO4中所列的核苷酸序列。
在另一方面，本发明涉及治疗、预防或减轻OA的方法，其包括给需要的受试者施用包含有效剂量的TYRO3亚家族成员和/或其配体调节剂的药物组合物。在多种优选的实施方案中，该药物组合物包含一种或多种TYRO3、Axl、cMer和/或其配体的调节剂。
另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含能在需要的受试者中治疗、预防或减轻OA的有效剂量剂量的TYRO3亚家族成员和/或其配体的调节剂，其中所述调节剂例如可抑制或与任何一个或多个此亚家族成员(例如TYRO3、Axl和cMer)结合的配体的活性、表达。在一个实施方案中，该药物组合物包含任何一种或多种选自针对TYRO3亚家族成员或其配体核酸序列的反义寡核苷酸、三螺旋DNA、siRNA、核酶、RNA适体或双链或单链RNA的物质，其中设计所述的物质用以抑制该家族成员或配体的表达。在另一个实施方案中，该药物组合物包含TYRO3亚家族成员或其配体的抗体，其中该抗体可例如抑制该成员和/或配体的活性。
还在本发明的另一方面，提供了包含检测来源于患者的生物试样中编码TYRO3亚家族成员或其配体的多核苷酸表达水平或检测该成员或其配体或其片段多肽水平的必需组分的测定法和试剂盒，此类试剂盒包含，例如与该多肽或其片段结合的抗体或与该多核苷酸杂交的寡核苷酸探针。在优选的实施方案中，此类试剂盒也包含详述操作的说明书，通过它使用试剂盒组分。
发明详述本发明涉及在此称为受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族的受体酪氨酸激酶亚家族，其包含同源蛋白质TYRO3、Axl和cMer。在此公开的数据表明这些多肽参与OA的发病机理并因此设想这些多肽和其配体为发展治疗、预防或减轻OA及相关病症的疗法的适当药物靶。
TYRO3多肽已在例如Polvi等，Gene，第134卷，No.2，289-293页(1993)；Schultz等，Mol.Brain Res.，第28卷，273-280页(1995)中有所描述。TYRO3也称为SKY、TIF、RSE、DTK和BRT。见Ohashi等，Oncogene，第9卷，699-705页(1994)；Dai等，Oncogene，第9卷，975-979页(1994)；Mark等；J.Biol.Chem.；第269卷；10720-10728页(1994)；Fujimoto等，Oncogene，第9卷，693-698页(1994)。优选的TYRO3氨基酸序列可从GenBank数据库获得并且登录号为NP_006284(SEQ IDNO2)。优选的编码此TYRO3多肽的cDNA序列也可从GenBank获得并具有登录号NM_006293(SEQ ID NO1)。cDNA序列的225-2897核苷酸与编码SEQ ID NO2氨基酸序列的开放阅读框(ORF)或“编码序列”(CDS)相对应。
TYRO3受体与也称为UFO或ARK的受体酪氨酸激酶Axl(描述见O’Bryan等，Mol.Cell Biol.，第11卷，5016-5013页(1991)；Janssen等，Oncogene，第6卷，2113-2120页(1991)；Rescigno等；Oncogene；第6卷；1909-1913页(1991)；Axl剪接变体Axlv1和Axlv2的GenBank登录号分别为NM_021913，SEQ ID NO32和NM_001699，SEQ ID NO30)和也称为EYK的受体酪氨酸激酶cMer(见Graham等，Cell Growth Differ.，第5卷，647-657页(1994)；Jia等，J.Biol.Chem.，第269卷，1839-1844页(1994)；GenBank登录号NM_006343和NP_006334；SEQ ID NO34和SEQ ID NO35)具有结构和序列同源性。总之，这三个多肽限定了这样一个酪氨酸激酶受体亚家族，它们各具有相似的胞外域，共有约35％的氨基酸序列同一性并包含两个免疫球蛋白样结构域和两个纤连蛋白III型重复。见Schulz等，Mol.Brain Res.，第28卷，273-280页(1995)。
已经描述了至少一个特异结合并活化TYRO3的配体。见例如Varnum等，Nature，第373卷，623-626页(1995)；Stitt等，Cell，第80卷，No.4，661-670页(1995)；Manfioletti等，Mol.Cell Biol.，第13卷，4976-4985页(1993)。此配体的代表性氨基酸序列也称为“生长抑制特异蛋白质 6”或“GAS6”，其可以从GenBank数据库获得并且登录号为NP_000811(SEQID NO3)。优选的编码GAS6多肽的核苷酸序列可从GenBank登录号NM_000820(SEQ ID NO4)获得。此cDNA序列尤其含有包含SEQ IDNO4135-2171核苷酸残基的开放阅读框。GAS6也表现为其他TYRO3亚家族成员、Axl和cMer的配体。见例如Nagata等，J.Biol.Chem.，第271卷，30022-30027页(1996)。
另一个特异结合TYRO3的配体是称为Protein S的蛋白质。见Stitt等(1995)，前文；Wimmel等，Cancer，第86卷，No.1，43-49页(1999)。优选的编码Protein S多肽(PROS1)的核苷酸序列可从GenBank登录号NM_000313获得并且在此也以SEQ ID NO28提供。代表性的优选PROS1氨基酸序列也可从GenBank登录号NP_000304(SEQ ID NO29)获得。
如下面实施例中公开的，申请人发现TYRO3、Axl、cMer和GAS6与OA的发病机理相关。例如数据表明软骨细胞中TYRO3基因的表达诱导若干与OA相关的遗传标记，包括可聚蛋白聚糖-1、MMP-13、iNOS和COX-2-，而软骨细胞中TYRO3的抑制降低了这些标记基因的表达。申请人也发现与正常软骨细胞中所见的TYRO3和GAS6基因的表达相比，它们在OA患者软骨细胞中都以提高的水平表达。此外，用GAS6处理软骨细胞也诱导OA标记基因。另外，siRNA实验也支持cMer和Axl剪接变体在OA发病机理中的作用。
这些令人吃惊的发现表明这些受体酪氨酸激酶其配体(例如GAS6和PROS1)可能在介导OA以及其他软骨障碍中发挥重要作用。这些发现尤其表明这些受体酪氨酸激酶及其配体可用作例如发展治疗、预防或减轻OA的疗法(本文也简称为“治疗”OA)的药物靶。
因此，本发明提供了可鉴定治疗OA的药物和其他治疗化合物的筛选测定法。本发明的筛选测定法具体包括鉴定特异结合编码TYRO3亚家族成员基因，优选与TYRO3基因或基因产物结合并抑制其表达或活性的化合物的筛选测定法。作为备选，本发明也提供了鉴定结合TYRO3亚家族特异配体的基因或基因产物(例如GAS6的基因或基因产物)并抑制配体的表达或活性的化合物的筛选测定法。此外，本发明也提供了鉴定抑制或者调节TYRO3受体与TYRO3配体结合(例如与GAS6结合)的化合物的筛选测定法。此类鉴定法中鉴定的化合物和调节剂可自身用于例如治疗OA的药物组合物和/或治疗方法中。因此下文提供了此类药物组合物和治疗方法，并为本发明的部分。
最后，申请人的发现也表明在此公开的TYRO3亚家族成员多肽和各自的配体可用于预后和诊断方法中以鉴定骨关节炎细胞和/或鉴定个体，例如患有OA的患者。下面提供了此类诊断和预后方法并且也为本发明的部分。
本发明及其说明可使用多种分子生物学、微生物学和重组DNA技术中的常规技术。此类技术为本领域熟知并在文献中详细阐明。见例如Sambrook，Fitsch & Maniatis，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，在此称为“Sambrook等(1989)”；D.N.Glover等，《DNA CloningA Practical Approach》，卷I和II(1985)，Gait编，《Oligonucleotide Synthesis》(1984)；Hames & S.J.Higgins编，《Nucleic Acid Hybridization》(1984)；Freshney编，《Animal Cell Culture》(1986)；《Immobilized Cells andEnzymes》IRL Press(1986)；Perbal，《A Practical Guide to MolecularCloning》(1984)；Ausubel等编，《Current Protocols in Molecular Biology》，John Wiley & Sons，Inc。
TYRO3多肽本发明涉及包括TYRO3、Axl、cMer和其变体的酪氨酸激酶亚家族。更具体而言，本发明涉及例如Polvi等，Gene，第134卷，No.2289-293页(1993)描述的TYRO3多肽。本发明具体提供了TYRO3、cMer和Axl在用于治疗OA和其他软骨障碍的药剂和药物组合物中的用途。因此，本发明提供使用TYRO3亚家族成员诊断和/或治疗OA和其他软骨障碍的方法和组合物。
在一个具体的实施方案中，TYRO3多肽来源于人类细胞和/或具有人类细胞TYRO3多肽的氨基酸序列。例如，特别优选的TYRO3多肽可包含GenBank登录号NP_006284(SEQ ID NO2)所列的氨基酸序列。然而，应当理解TYRO3多肽并不限于此特定序列，而是也包括本领域技术人员熟悉的同系物和变体。
因此，TYRO3多肽也包括含有一个或多个全长TYRO3多肽的表位或结构域氨基酸序列的多肽。多肽的表位代表了可产生针对它的抗体并且抗体所结合的多肽位点。所以包含TYRO3表位氨基酸序列的多肽可用于制作TYRO3多肽的抗体。表位优选包含至少5个，更优选至少10、15、20、25或50个氨基酸残基的长度。因此，包含TYRO3表位的多肽优选含有与全长TYRO3多肽序列的至少5个，至少10个，至少15个，至少20个，至少25个或至少50个氨基酸残基对应的氨基酸序列。
TYRO3多肽也包括SEQ ID NO2提供的代表性全长TYRO3多肽序列的类似物和衍生物。TYRO3多肽的类似物和衍生物具有与SEQ IDNO2中所列的代表性TYRO3多肽相同的或同源的特点。也可制备嵌合或融合多肽，其中融合多肽的TYRO3部分具有一个或多个TYRO3多肽的特征。因此此类融合多肽代表TYRO3多肽的实施方案。此类融合多肽也可包含标记多肽的氨基酸序列，例如包含FLAG、组氨酸标签、谷胱苷肽S-转移酶(GST)或IgG的Fc部分等。此外，融合多肽可包含增加多肽溶解性的氨基酸序列，如硫代还原酶氨基酸序列或一个或多个免疫球蛋白蛋白质(例如IgG1或IgG2)的序列。
TYRO3亚家族成员多肽的类似物或变体也可通过改变编码核酸分子(例如通过取代、添加或删除)得到。优选的TYRO3多肽类似物或变体具体包括SEQ ID NO2说明的特定TYRO3多肽序列的“功能保守变体”。多肽或多核苷酸的“功能保守变体”为已经改变或变化多肽中特定氨基酸残基或多核苷酸的密码子编码的氨基酸残基、但不改变多肽的全部构象和功能的变体。预计此类改变对的多肽的表观分子量或等电点只有微小影响或无影响。因此，此类改变的核酸分子优选编码功能相似的分子，即执行TYRO3多肽的一种或多种功能和/或具有一种或多种TYRO3多肽生物活性。
除了在此特别鉴定为保守的氨基酸残基外，在蛋白质或多肽的变体中氨基酸残基可以不同。因此，任意两个TYRO3亚家族的多肽成员变体或类似物之间的蛋白质或氨基酸序列相似性百分比可以变化。一般地，根据如Cluster Method和/或MEGALIGN或GCG比对算法之类的比对方案测定的这些多肽的变体或类似物之间的蛋白质或氨基酸序列之间的相似性百分比可为70-99％。优选这些多肽变体和类似物具有如通过BLAST、FASTA、DNA Strider、CLUSTAL等序列比较算法测定的至少约75％，更优选至少约80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。
如上面定义的功能保守变体不仅包括在此讨论的全长TYRO3亚家族多肽的变体，还包括经修饰(例如截短和删除)的TYRO3亚家族多肽的功能保守变体；所述的全长TYRO3亚家族多肽的变体包括例如含有下文实施例中说明的特定TYRO3亚家族多肽序列的多肽变体，功能保守变体包括片段的功能保守变体，例如与全长TYRO3亚家族多肽的结构域或表位相应的片段。
还在其他的实施方案中，TYRO3多肽的类似物为SEQ ID NO2提供的TYRO3多肽序列的等位变体或突变体。术语等位变体和突变体，当在此使用以描述多肽时指等位变体或突变体基因编码的多肽。因此，等位变体和突变体TYRO3多肽为TYRO3核酸等位变体和突变体编码的多肽。
还在其他的实施方案中，TYRO3亚家族成员多肽的类似物为相同物种的基本同源多肽，例如等位变体；或其他物种的基本同源多肽，例如直向同源多肽。术语“同源的”指拥有“共同进化起源”的两个蛋白质或核酸之间的关系，所述蛋白质包括同一生物物种的超家族蛋白质，例如免疫球蛋白超家族，以及不同生物物种的同源蛋白质，例如肌球蛋白轻链多肽等。见Reeck等，Cell，第50卷，667页(1987)。此类蛋白质(及其编码核酸)具有序列同源性，如通过其序列相似性以百分比同一性形式或存在特定残基或基序和保守位点反映的序列同源性。本发明优选的同源多肽具有上述为本发明其他TYRO3亚家族成员多肽变体和类似物指定的序列相似性或同源性水平。这些多肽的同系物或类似物也可从例如哺乳动物获得，所述哺乳动物如人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、狗、猫、绵羊、山羊、猪、马和牛等。
在其他的实施方案中，包括类似物、同系物等的TYRO3多肽变体为与编码一个或多个SEQ ID NO2中所列的具体TYRO3多肽序列的核酸分子的互补链杂交的核酸分子编码的多肽。当在适当的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸分子可与其他核酸分子退火时，核酸分子与另一个核酸分子(例如cDNA、基因组DNA或RNA)“可杂交”。见于例如Sambrook等，前文。温度和离子强度条件决定了杂交的“严谨性”。为初筛同源核酸，可使用相应于解链温度约55C的低严谨性杂交条件，例如5xSSC、0.1％SDS、0.25％乳液并且无甲酰胺；或者另选30％甲酰胺、5xSSC和0.5％SDS。中度严谨杂交条件相应于更高的Tm，例如具有40％甲酰胺的5x或6xSSC。高度严谨性杂交条件相应于最高的Tm，例如50％甲酰胺，5x或6xSSC。1xSSC溶液应理解为含有0.15M NaCl和0.015M柠檬酸钠的溶液。
杂交需要两个核酸含有互补序列，虽然依赖于杂交的严谨性，可能存在碱基间的错配。杂交核酸的适当严谨性依赖于核酸的长度和互补的程度，本领域熟知可发生改变。两个核苷酸序列间相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸杂交的Tm值越高。
为长度大于100个核苷酸的杂交，推导了计算Tm的方程式。见Sambrook等，前文，9.50-9.51页。
在具体的实施方案中，术语“标准杂交条件”指Tm约55℃并使用前述条件。在优选的实施方案中，Tm为60℃；在更优选的实施方案中，Tm为65℃。在具体的实施方案中，术语“高严谨性”指68℃在0.2x SSC中，42C在50％甲酰胺、4xSSC中的杂交和/或洗涤条件，或者这样的杂交条件，其提供的杂交水平与上述两条件之一中观察到相等。
还在其他的实施方案中，TYRO3亚家族成员多肽的变体(包括类似物、同系物和直向同源物)可通过分离TYRO3亚家族成员基因的变体鉴定，例如用基于亚家族多肽的氨基酸序列设计的简并寡核苷酸引物使用PCR鉴定并如下所述。
TYRO3亚家族多肽的衍生物还包括磷酸化多肽、十四烷基化多肽、甲基化多肽和其他化学修饰的多肽。TYRO3亚家族多肽还包括标记的变体，例如用碘或磷放射标记(见例如EP 372707B)，或其他可探测分子标记，所述分子如(但决不限于)生物素、荧光染料(例如Cy5或Cy3)、络合金属离子的螯合基团、生色团或荧光团、胶体金、粒子(如橡胶球)，或者与水溶性高分子连接，如与聚乙二醇(PEG)连接。TYRO3亚家族多肽的化学修饰可提供特定情况下的其他优势。见例如U.S.专利No.4,179,337。综述也见于Abuchowski等，《Enzymes as Drugs》，Holcerberg & Roberts编，367-383页(1981)。描述蛋白质修饰和融合蛋白的综述论文也可在Fracis，《Focus on Growth Factors》，第3卷4-10页，MediscriptMountviewCourt，Friern Barnet Lane，London N20，OLD，UK(1992)中找到。
TYRO3亚家族成员核酸通常，编码酪氨酸激酶TYRO3亚家族多肽成员的核酸包含编码TYRO3亚家族成员多肽和其片段的核酸序列互补链的核酸序列。因此，在一个优选的实施方案中，TYRO3核酸分子包含编码SEQ ID NO2中所列氨基酸序列的核苷酸序列。在此实施方案特别优选的方面，TYRO3核酸分子具有包含编码部分的核苷酸序列，编码部分即GenBank登录号NM_006293中所列并在此于SEQ ID NO1中提供的核苷酸序列的ORF。特别优选的核酸分子包含SEQ ID NO1中所列核苷酸序列的225-2897核苷酸序列。类似地，Axl激酶多肽变体AXLv1和AXLv2分别具有本文SEQID NO.30和32中提供的核苷酸序列和SEQ ID NO.34中提供的cMer。
还在其他的实施方案中，TYRO3亚家族核酸分子包含编码一个和多个TYRO3亚家族成员多肽关键结构域的核苷酸序列，所述结构域如受体结合位点、激酶结构域、胞外结构域和跨膜结构域。
TYRO3亚家族核酸分子也包括含有编码一个和多个TYRO3亚家族多肽序列片段的核酸。
TYRO3亚家族核酸分子也包括含有经修饰的多肽、变体编码序列的核酸分子，其中所述经修饰的多肽例如具有氨基酸取代、删除或截短，所述变体包括多肽的来自同一物种或不同物种的等位变体、类似物和同系物。在优选的实施方案中，此类核酸分子与TYRO3亚家族多肽编码序列，例如与SEQ ID NO1、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32或SEQ ID NO34中所列的编码序列具有至少50％，优选至少75％和更优选至少90％的序列同一性。
此外，编码TYRO3亚家族成员多肽的核酸分子包括与另一个核酸分子杂交的核酸分子，例如确定条件下的DNA印迹鉴定法中与另一个核酸分子杂交的核酸分子。例如，在特定的实施方案中TYRO3核酸分子包含与特定核酸序列(如SEQ ID NO1中所列的TYRO3编码序列)杂交的核苷酸序列。另外，核酸分子可在相同的确定的杂交条件下与编码全长TYRO3多肽的核苷酸序列的片段互补链杂交。优选杂交的实例包括上述所列的。
在其他的实施方案中，核酸分子包含全长TYRO3亚家族成员核酸序列的片段。此类核酸片段包含与编码全长TYRO3亚家族成员多肽的核苷酸序列的至少10个核苷酸，优选至少15个核苷酸和更优选至少20个核苷酸的序列对应的核苷酸序列。在优选的实施方案中，核酸片段包含至少10个，优选至少15个和更优选至少20个与全长TYRO3亚家族成员核酸序列或其片段互补和/或杂交的核苷酸的序列。为与更短核酸(即寡核苷酸)杂交，错配的位置更加重要，并且寡核苷酸的长度决定其特异性。见Sambrook等，前文，11.7-11.8页。可杂交核酸的最小长度优选为至少约10个核苷酸，更优选至少约15个核苷酸，还更优选至少约20个核苷酸。
包含此类片段核酸分子可用作寡核苷酸探针和引物，例如作为检测和扩增其他编码TYRO3亚家族成员多肽的核酸分子(包括编码变体多肽的基因)的PCR引物。寡核苷酸片段也可用作例如反义核酸来调节细胞中TYRO3亚家族成员基因的表达或转录水平。
核酸分子也包括“嵌合”核酸分子。此类嵌合核酸分子为这样的多核苷酸，其包含至少一个TYRO3亚家族成员核酸序列，例如可为任一上述全长或部分TYRO3、AXL或cMer核酸序列，还包含至少一个非TYRO3亚家族成员核酸序列，即一般与天然存在的亚家族成员基因无关的核酸序列。例如，非亚家族成员核酸序列可为来源于另一基因并一般与天然存在的亚家族成员基因无关的异源调节序列，例如启动子序列。非亚家族成员核酸序列也可为另一多肽的编码序列，所述多肽如FLAG、组氨酸标签、谷胱甘肽转移酶(GST)、血凝素、β-半乳糖苷酶、硫代还原酶或免疫球蛋白的一个或多个结构域，例如Fc区域。在优选的实施方案中，嵌合体核酸分子编码本发明的融合多肽。
可从任何来源分离核酸分子，不管是DNA、cDNA还是其他核酸分子，其包括例如来源于具有所需TYRO3亚家族成员基因的生物的细胞或细胞系的cDNA或基因组文库。就cDNA文库而言，优选来源于表达特定TYRO3亚家族成员基因的细胞或细胞系。获得基因的方法为本领域所熟知。见于例如Sambrook等(1989)，前文。
DNA可通过已知的标准方法从克隆DNA中获得，例如从DNA“文库”中获得，并优选从该蛋白质高水平表达组织制备的cDNA文库获得。在一个优选的实施方案中，DNA从“扣除”文库获得，以富集特定细胞类型或在特定条件下特定表达的基因的cDNA文库。使用此种扣除文库可增加分离特殊基因cDNA的机率。还在其他的实施方案中，文库可通过化学合成、cDNA克隆或从所需细胞纯化的基因组DNA或其片段的克隆制备。见例如Sambrook等(1989)，前文；Glover编，《DNA CloningA PracticalApproach》MRL Press，Ltd.Oxford，U.K.，卷I和II(1985)。
在一个实施方案中，可通过鉴定编码与TYRO3亚家族成员多肽(例如SEQ ID NO2中所列的TYRO3多肽)同源或基本相似的多肽的cDNA插入物从cDNA文库筛选所需TYRO3亚家族成员核酸。类似地，可通过鉴定具有与TYRO3亚家族成员核苷酸序列同源或基本相似的核酸序列的cDNA插入物从cDNA文库筛选所需TYRO3亚家族成员核酸。
来源于基因组DNA的克隆除了编码区域外可含有调节和内含子DNA区域。来源于cDNA的克隆通常不含有内含子序列。无论什么来源，基因优选分子克隆到增殖该基因的适当载体中。可以许多方法鉴定含有所需TYRO3亚家族成员基因的特定DNA片段。例如，可纯化并标记TYRO3亚家族成员基因的部分，以制备标记探针。见Benton & Davis，Science，第196卷，180页(1977)；Grunstein & Hogness；Proc.Natl.Acad.Sci.USA；第72卷；3961页(1975)。与探针基本同源的DNA片段(如来自另一个体的等位变体)将发生杂交。在特定的实施方案中，最高严谨性杂交条件用于鉴定同源TYRO3亚家族成员基因。
编码目的TYRO3亚家族成员基因衍生物和类似物的基因可通过多种本领域已知的方法产生。引起其产生的操作可在基因或蛋白质水平上进行。例如，克隆序列可通过大量本领域已知策略中的任一种修饰。见Sambrook等(1989)，前文。序列可在适当位点用限制性内切酶切割，然后在体外进行其他酶促修饰(必要的话)、分离和连接。在产生编码目的基因衍生物或类似物的基因的过程中，应注意确保经修饰的基因保留在与其来源基因相同的翻译阅读框中，在编码所需活性的基因区域中未受翻译终止信号中断。
此外，编码TYRO3亚家族成员的核酸序列可在体外或体内突变以建立和/或破坏翻译、起始和/或终止序列，或在编码区造成变化和/或形成新的限制酶位点或破坏已存在的位点，以便于进一步的体外修饰。也可进行修饰以引入限制性酶切位点并便于将基因克隆到表达载体中。可使用本领域已知的任何诱变技术，这包括(但不限于)体外定向诱变(见Hutchinson等，J.Biol.Chem.，第253卷，6551页(1978)；Zoller和Smith，DNA，第3卷，479-488页(1984)；Oliphant等，Gene，第44卷，177页(1986)；Hutchinson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第83卷，710页(1986))；使用TAB接头。见Pharmacia Corp.，Peapack，NJ等。PCR技术优选用于定向诱变。见Higuchi，《PCR TechnologyPrinciples and Applications forDNA Amplification》，Erlich编，Stockton Press，第6章，61-70页(1989)。
然后经鉴定和分离的基因可插入适当的克隆载体中。可使用本领域已知的大量载体-宿主系统。可能的载体包括(但不限于)质粒或经修饰的病毒，但是载体系统必需与所用宿主细胞相容。载体的实例包括(但不限于)大肠杆菌、噬菌体(如λ衍生物)或者质粒(如pBR322衍生物或pUC质粒衍生物)，例如pGEX载体、pmal-c、pFLAG、pKK质粒(Clonetech，Palo Alto，CA)、pET质粒(Novagen，Inc.，Madison，WI)、pRSET或pREP质粒、pcDNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)或pMAL质粒(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)等等。可通过例如将DNA片段连入具有互补粘性末端的克隆载体中完成插入克隆载体。然而，如果克隆载体中不存在用于片段化DNA的互补限制性酶切位点，DNA分子的末端可进行酶促修饰。备选地，可通过将核苷酸序列(接头)连接到DNA末端产生任何所需位点。这些连接的接头可包含编码限制酶识别序列的特定化学合成寡核苷酸。
重组分子可经由转化、转染、感染、电穿孔等引入宿主细胞以产生基因序列的多个拷贝。优选克隆基因包含在穿梭载体质粒上，其提供在克隆细胞(如大肠杆菌)中扩增，并使为随后插入适当表达细胞系的纯化更容易(如果需要这样的话)。例如，可通过连接大肠杆菌质粒的序列与酵母2m质粒的序列制备可在多于一种类型生物中复制的穿梭载体，以在大肠杆菌和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中都能复制。
应当理解，在此公开的编码TYRO3亚家族成员的核酸可为DNA或RNA并可为单链、双链或甚至三链，例如TYRO3单链TYRO3核酸和/或其互补链的三螺旋。TYRO3亚家族成员核酸包括基因组DNA、cDNA、RNA、mRNA、cRNA等；以及合成的或遗传操作的多核苷酸和有义和反义多核苷酸。此类合成的多核苷酸包括例如核苷碱基与氨基酸主链缀合形成的“蛋白质核酸”(PNA)。其他代表性的合成核酸包括含有经修饰碱基(如硫尿嘧啶、硫鸟嘌呤和氟尿嘧啶)的核酸。为方便起见，在本说明书中提供的代表性核苷酸序列以DNA序列提供。然而，应理解，其他类型核酸的相同序列(如RNA)也可使用并且是等价的。因此，例如在本说明书中当特定的核苷酸序列指特定位点的胸腺嘧啶时，应理解尿嘧啶(U)可在那一位点取代并为功能等价的。其他等价取代对于本领域普通技术人员而言也是显而易见的并且因此包括在本文公开的TYRO3亚家族成员核酸中。
多核苷酸可与天然调节序列相邻，或者其可与异源序列联系，这些序列如启动子、增强子、反应元件、信号序列、多腺苷酸化序列、内含子、5’和3’非编码区等。术语“异源的”在本文中指元件(如非天然存在序列)的组合。因此，TYRO3亚家族成员核酸可具有如启动子等一般不与TYRO3亚家族成员基因联系的序列。
核酸也可通过本领域公知的任何方法修饰。此类修饰的非限制性实例包括甲基化、“加帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰，如不带电连接(uncharged linkage)的修饰，例如甲基磷酸盐、磷酸三酯、磷酸酰胺、氨基甲酸酯等修饰；带电连接(charged linkage)的修饰，例如，磷酸酰、二硫代磷酸酯等修饰。核酸可含有一个或多个其他共价连接的部分，如蛋白质，例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚-L-赖氨酸等；嵌入剂，如吖啶、补骨脂素等；螯合剂，例如金属、放射性金属、铁、氧化金属等螯合剂；和烷化剂(alkylator)等。多核苷酸可通过形成甲基或乙基磷酸三酯或者烷基亚磷酰胺键而衍生。此外，本文的多核苷酸也可用能直接或间接提供可检测信号的标记修饰。代表性的标记包括放射性同位素、荧光分子、生物素等。
TYRO3配体多肽和核酸本发明还涉及属于在此公开的受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族的多肽的配体。因此，也提供了该配体多肽和核酸并认为是本发明有用的方面。
“配体”广义地说为任何与另一个分子结合的分子。在优选的实施方案中，配体为两个结合分子中可溶的或更小的分子，或者两者兼是。另一个分子称为“受体”。在优选的实施方案中，配体和其受体均为细胞产生的分子(优选为多肽)。优选地，配体为可溶性分子，受体为膜内在蛋白质，即在细胞表面呈现的蛋白质。
优选配体“特异结合”其受体和/或反之亦然。术语“特异结合”指配体区分其受体和其他物质(例如生理条件下的分子)的能力。优选配体以某种亲和力与其受体结合并且反之亦然。配体与其受体的亲合力一般由解离常数Kd定义。解离常数Kd优选具有低于约10μM的值，更优选低于约1μM，还更优选低于约100nM。在特别优选的实施方案中，解离常数Kd具有低于约10nM的值。
配体与其受体的结合常常为细胞中信号转导的步骤。配体-受体相互作用的非限制性实例包括(但不限于)激素与激素受体的结合，例如雌激素与雌激素受体的结合，以及神经递质与神经元表面受体的结合。在这种情况下，TYRO3配体一旦与TYRO3受体结合就刺激酪氨酸激酶活性。酪氨酸激酶活性的测定法为本领域所熟知并可用于鉴定配体。
特别优选的特异结合并活化TYRO3的配体在例如Varnum等(1995)，前文，中有所描述；也见于Stitt等(1995)，前文；Manfioletti等(1993)，前文。通常称为“生长抑制特异蛋白6”或“GAS6的此配体的代表性氨基酸序列以登录号NP_000811陈列于GenBank并在本文SEQ ID NO3中提供。此氨基酸序列由包含以登录号NM_000820陈列于GenBank的全长cDNA序列135-2171残基的开放阅读框编码并在本文以SEQ ID NO4提供。
因此，优选的TYRO3亚家族配体多肽包括GAS6多肽，如SEQ IDNO3氨基酸序列中所列的GAS6多肽。本发明提供了下文描述的测定法，通过该测定法本领域的技术人员还可鉴定其他TYRO3配体多肽和编码此类TYRO3配体多肽的核酸。TYRO3亚家族配体多肽也包括变体TYRO3亚家族配体多肽，包括变体GAS6多肽。这些包括变体，如TYRO3亚家族配体多肽的同系物、直向同源物、衍生物、突变体、嵌合体、融合物、片段、截短形式等。此类TYRO3亚家族配体变体按前文对TYRO3亚家族受体多肽的定义来限定。
类似地，本发明也提供了作为本文公开的OA的适当药物靶的TYRO3亚家族配体核酸，其包括编码SEQ ID NO3GAS6多肽的核酸，例如包含SEQ ID NO4中核苷酸135-2171序列的核酸。使用下文描述的筛选测定法还可鉴定其他TYRO3亚家族配体核酸，并且此类TYRO3亚家族配体核酸可根据本发明的方法使用。TYRO3亚家族配体核酸也包括变体TYRO3亚家族配体核酸，包括变体GAS6核酸。这些包括变体，如TYRO3亚家族配体核酸的同系物、直向同源物、衍生物、突变体、嵌合体、融合物、片段、截短形式等。此类变体TYRO3亚家族配体核酸按前文对TYRO3亚家族受体核酸的定义来限定。
TYRO3亚家族成员和其配体的表达可将编码酪氨酸激酶TYRO3亚家族多肽成员或其配体的核苷酸序列(包括嵌合蛋白质、抗原片段、其衍生物或类似物)的核苷酸序列插入适当的表达载体，即含有转录和翻译插入的蛋白质编码序列必需元件的载体。因此，例如编码TYRO3亚家族受体或配体的核酸可与表达载体中的启动子有效连接。cDNA和基因组序列都可在此类调节序列的控制下克隆和表达。此类载体可用于表达功能性或功能失活的TYRO3亚家族受体或其配体。
必需的转录和翻译信号可提供于重组表达载体。
可能的宿主-载体系统包括(但不限于)表达质粒转染或病毒(例如痘苗病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒等)感染的哺乳动物和其他脊椎动物细胞、病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系、微生物(如含有酵母载体的酵母)，或者噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。载体表达元件的长度和专一性有所不同。依赖于所使用的宿主-载体系统，可使用大量适当转录和翻译元件中的任何一个。
TYRO3亚家族成员多肽或其配体的表达可由本领域已知的任何启动子/增强子元件控制，但是这些调节元件必需在用于表达的所选宿主中具有功能。可用于控制基因表达的启动子包括(但不限于)巨细胞病毒(CMV)启动子(U.S.专利No.5,385,839和5,168,062)、SV40早期启动子区域(见Benoist和Chambon，Nature，第290卷，304-310页(1981))、劳斯肉瘤病毒3’长末端重复中含有的启动子(见Yamamoto等，Cell，第22卷，787-797页(1980))、疱疹胸腺嘧啶激酶启动子(见Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第78卷，1441-1445页(1981))、金属硫蛋白基因调节序列(见Brinster等，Nature，第296卷，39-42页(1982)；原核表达载体，如β-内酰胺酶启动子(见Villa-Komaroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第75卷，3727-373l页(1978))或tac启动子。见DeBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第80卷，21-25页(1983)和“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”，Sci.Am.，第242卷，74-94页。其他可使用的有用启动子元件包括来自酵母和其他真菌的启动子元件，如Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子，以及表现造血组织特异性的转录控制区域，具体为骨髓细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区域(见Mogram等，Nature，第315卷，338-340页(1985)；Kollias等，Cell，第46页，89-94页(1986))、造血干细胞分化因子启动子、促红细胞生成素受体启动子(见Maouche等，Blood，第15页，2557页(1991))等。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过使用非内源启动子控制细胞中编码TYRO3亚家族成员多肽和配体的内源基因的表达来表达该多肽和配体的方法。细胞中的内源基因为通常(即天然)发现于在该细胞基因组中的基因。然而非内源启动子为可用于控制基因表达但通常或天然地与内源基因无关的启动子或其他核苷酸序列。作为实例，可使用同源重组方法(优选使用本发明的非蛋白质编码核酸序列)以在内源基因附近插入可扩增基因或其他调节序列。然后插入序列可用于例如提供比细胞中天然存在的更高的基因表达水平，或者克服内源基因调节序列中的一个或多个妨碍正常的基因表达水平的突变。此类同源重组方法为本领域熟知。见例如由Skoultchi于1991年5月16日公布的国际专利申请WO 91/06666、由Chappel于1991年7月11日公布的国际专利申请WO 91/099555、由Kucherlapati和Campbell于1990年11月29日公布的国际专利申请WO90/14092。
蛋白质的可溶形式可通过收集培养液获得，或通过溶解包涵体获得，如用去污剂处理和如前述必要的话用超声或其他机械方法处理。溶解的或可溶蛋白质可使用多种技术分离，如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、等电聚焦、双向凝胶电泳、层析法(例如离子交换、亲和、免疫亲和和大小柱层析)、离心、溶解度差异、免疫沉淀作用，或者任何其他纯化蛋白质的标准技术。
优选的载体为病毒载体，如慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒、杆状病毒和其他具有目的细胞趋性的重组病毒。因此，可使用病毒载体或通过直接引入DNA在体内、离体或体外引入编码功能的或突变体TYRO3亚家族成员多肽或配体或编码其结构域或片段的基因。可通过如用病毒载体或受体配体或通过使用组织特异性启动子或两者均使用，将转基因载体靶向特定细胞，从而实现在靶组织中的表达。
TYRO3亚家族成员多肽和其配体的抗体如下文所述，TYRO3亚家族成员多肽和/或配体的抗体尤其可用于诊断和治疗方法。根据本发明，TYRO3亚家族成员多肽或配体(例如重组或通过化学合成产生的)，及其片段或其他衍生物或类似物(包括融合蛋白)可用作免疫原，以产生识别这些多肽或配体的抗体。此类抗体包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库。此种抗体优选对特定TYRO3亚家族成员多肽或配体特异，即特异结合例如分别具有SEQ ID NO2和3所列氨基酸序列的TYRO3受体或配体。然而，作为备选，抗体可对其他种生物的直向同源物特异，优选对另一种哺乳动物(如小鼠、大鼠或仓鼠等)的直向同源物特异。抗体可识别野生型、突变体或两种形式的多肽或其配体。
可使用多种本领域已知的方法产生多克隆抗体。为产生多克隆抗体，可通过注射多肽或衍生物(例如片段或融合蛋白)免疫多种宿主动物，其中所述的宿主动物包括(但不限于)兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等等。在一个实施方案中，TYRO3亚家族多肽或其片段可与免疫原载体缀合，例如与牛血清白蛋白(BSA)或匙孔槭血蓝蛋白(KLH)缀合。依赖于宿主物种，可使用多种佐剂以增强免疫应答，所述佐剂包括(但不限于)付氏(完全或不完全)佐剂、矿物凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质(如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔槭血蓝蛋白、二硝基苯酚和可能有用的人类佐剂(如卡介苗(BCG)和短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum))。
为制备针对TYRO3亚家族成员多肽或配体或其片段、类似物或衍生物的多克隆抗体，可使用任何为通过培养连续细胞系产生抗体分子的技术。这包括(但不限于)最初由Kohler和Milstein，Nature，第256卷，495-497页(1975)创立的杂交瘤(trioma)技术，以及三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(见Kozbor等，Immunol.Today，第4卷，72页(1983)；Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第80卷，2026-2030页(1983))和产生人类多克隆抗体的EBV-杂交瘤技术。见Cole等，《Monoclonal Antibodies andCancer Therapy)》，Alan R.Liss，Inc.，77-96页(1985)。在本发明额外的实施方案中，可在无菌动物中产生单克隆抗体。见国际专利出版号WO89/12690。实际上，根据本发明，也可使用为产生“嵌合抗体”发展的技术(见Morrison等，J.Bacteriol.，第159卷，870页(1984)；Neuberger等，Nature，第312卷，604-608页(1984)；Takeda等；Nature，第314卷；452-454页(1985))。简言之，此类技术包括将第一种生物(例如小鼠)的特定受体或配体特异的抗体分子基因与来源于第二种生物(例如人)的适当生物活性的抗体分子基因拼接。此类嵌合抗体在本发明的范围之内。
可通过已知技术产生含有抗体分子独特型的抗体片段。例如此类片段包括(但不限于)可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’)2片段、可通过还原F(ab’)2的二硫键产生的Fab’片段和用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段。
根据本发明，描述的为产生单链抗体的技术(见U.S.专利No.5,476,786、5,132,405和4,946,778)可改变来产生特异与特定TYRO3亚家族成员多肽或配体结合的特异单链抗体。本发明额外的实施方案使用为构建Fab表达文库而描述的技术(见Huse等，Science，第246卷，1275-1281页(1989))以允许迅速且容易地鉴定对TYRO3亚家族成员多肽或配体或者其衍生物或类似物具有目的特异性的单克隆Fab片段。
在产生和使用抗体过程中，筛选或检测目的抗体可通过本领域已知的技术完成，例如放射免疫测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、“夹层”免疫测定法、免疫放射测定法、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、原位免疫测定法(例如使用胶体金、酶或放射性同位素标记的原位免疫测定法)、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定法(例如凝胶凝集测定法和血细胞凝集测定法)、补体结合测定法、免疫荧光测定法、A蛋白测定法和免疫电泳测定法等。在一个实施方案中，通过检测初级抗体上的标记检测抗体结合。在另一个实施方案中，通过检测二级抗体或试剂与初级抗体的结合检测初级抗体。在还有的实施方案中，标记二级抗体。本领域已知许多在免疫测定法中检测结合的方法，并且这些方法在本发明的范围之内。
上述抗体可用于本领域已知的方法中，其中所述的方法与目的多肽或配体的定位和活性有关，例如为蛋白质印迹、原位多肽成像、使用上述和本领域已知的任一检测方法测量其在适当生理样品中的水平等。此类抗体也可用于与受体结合的配体的测定法中，例如U.S.专利No.5,679,582所述。抗体结合一般在生理条件下最容易发生，例如pH值7-8和生理离子强度。缓冲液中存在载体蛋白质能稳定测定法。虽然存在对最适条件干扰的耐受性，例如对增加或降低离子强度、温度或pH值，或者加入去污剂或离液盐的耐受性，但是此类干扰一般降低结合稳定性。
还在其他的实施方案中，抗体也可用于通过淘选技术或免疫吸附相关技术分离表达目的多肽或配体的细胞，例如OA软骨细胞。
在特定的实施方案中，可产生刺激或拮抗TYRO3亚家族成员多肽活性的抗体。胞内单链Fv抗体尤其可用于调节(抑制)多肽活性。见Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第90卷，7884-7893页(1993)；Chen，Mol.Med.Today，第3卷，160-167页(1997)；Spitz等，Anticancer Res.，第16卷，3415-3422页(1996)；Indolfi等，Nat.Med，第2卷，634-635(1996)；Kijma等，Pharmacol.Ther.，第68卷，247-267页(1995)。此类抗体可使用下文所述的鉴定配体的测定法测试。
应用及用途在此描述TYRO3亚家族成员多肽和其配体的应用和用途，包括上述的TYRO3、Axl、cMer、GAS6和PROSI核酸、多肽和其抗体的应用和用途。此外，在此描述的应用和方法包括使用化合物，例如调节剂，如调节TYRO3亚家族成员多肽和配体的拮抗剂或拮抗物，因此也包括化合物，例如调节剂，如调节这些多肽和配体表达的反义和/或抑制核酸。
申请人已经确定受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族成员以及其配体可在鉴定治疗、预防和减轻OA和其他具有病理软骨降解特征的病症的新疗法的筛选测定法和本文包括的在这一点上使用TYRO3亚家族成员和相关配体核酸和/或多肽的此类方法中作为药物靶。例如，下面描述的方法，其使用干扰或调节TYRO3亚家族受体与配体(如GAS6)结合的化合物。在其他的实施方案中，此类方法可使用调节TYRO3亚家族成员配体与适当TYRO3亚家族受体结合引起的下游信号事件的化合物。此类化合物可容易地由本领域技术人员鉴定，例如通过使用本发明的筛选测定法鉴定。
此外，TYRO3亚家族基因和其基因产物，以及TYRO3亚家族配体(如GAS6或PROS1)的基因和基因产物也可用作组织特异性标记以检测或鉴定OA软骨或组织，如OA软骨细胞。因此上文所述的TYRO3亚家族受体和配体的核酸和多肽可用于检测OA的方法中，例如用于通过使用TYRO3、Axl和/或cMer基因和基因产物(包括变体)检测样品中TYRO3、Axl和/或cMer的表达，如活体解剖、个体的组织样品中TYRO3、Axl和/或cMer的表达的诊断和预后应用中。在此提供了使用TYRO3亚家族成员核酸和多肽检测软骨降解，如与OA和其他关节炎病症相关的降解的方法。
药物筛选测定法使用筛选测定法，如使用下述筛选测定法，可以鉴定出与TYRO3亚家族成员受体和/或配体结合或相互作用的化合物，包括胞内化合物，例如蛋白质或蛋白质部分；与TYRO3亚家族成员受体或其配体、其他天然和合成的TYRO3亚家族成员配体和受体的基因相互作用的化合物；干扰TYRO3亚家族成员基因产物相互作用的化合物，例如干扰TYRO3亚家族成员基因产物与GAS6或另一配体特异结合的化合物；以及调节TYRO3亚家族成员基因活性的化合物，例如通过调节TYRO3亚家族成员受体或配体基因表达水平调节TYRO3亚家族成员基因活性的化合物；或者调节TYRO3亚家族成员受体或配体活性，例如生物活性的化合物。此类测定法可以这种方式用于鉴定与TYRO3、Axl或cMer和其各自配体相互作用的化合物。
因此，本发明的筛选测定法可用于鉴定与TYRO3亚家族成员基因和基因产物特异结合并且因此能够调节表达的化合物。例如，在此描述的筛选测定法可用于鉴定与TYRO3基因的启动子和其他调节序列结合并因此可调节TYRO3表达水平的化合物。见例如Platt，J.Biol.Chem.，第269卷，28558-28562页(1994)。筛选测定法也可用于鉴定与TYRO3核酸或多肽结合从而稳定TYRO3核酸或多肽的化合物。此外，这些筛选测定法也可用于鉴定抑制或调节此类结合相互作用并因此有用的化合物，例如TYRO3与特定转录因子或增强子结合或者TYRO3与稳定剂结合的激动剂或拮抗剂。在这些或相似的筛选测定法中鉴定的化合物因此可用于治疗与异常TYRO3亚家族成员基因表达和/或蛋白质(包括，但不限于OA)异常表达的水平相关的疾病或紊乱。
可通过此类筛选测定法鉴定的化合物种类包括(但不限于)小分子，例如有机和无机分子，其分子量小于约2kDa，更优选分子量小于约1kDa和/或能穿越血脑屏障或进入适当细胞并影响TYRO3亚家族成员基因或者参与亚家族调节通路的某基因的表达；以及大分子，例如分子量大于约2kDa的分子。通过这些筛选测定法鉴定的化合物也可包括核酸、肽和多肽。此类化合物(包括肽)的实例包括(但不限于)可溶性肽；组合文库的融合肽成员，如Lam等，Nature，第354卷，82-84页(1991)和Houghten等，Nature，第354卷，84-86页(1991)描述的组合文库融合肽成员；组合化学衍生的文库成员，如D-和/或L-构型氨基酸分子文库；磷酸肽，如随机或部分变性的定向磷酸肽文库成员(见例如Songyang等，Cell，第72卷，767-778页(1993))；抗体，包括(但不限于)多克隆、单克隆、人化、抗独特型、嵌合或单链抗体；抗体片段，包括(但不限于)Fab、F(ab’)2、Fab表达文库片段和其表位-结合片段。这些筛选测定法中使用的核酸可为DNA或RNA或合成核酸。具体的实例包括(但不限于)反义核酸和核酶，以及双链和三螺旋核酸分子。
结合化合物的测定法可容易地设计体外系统以鉴定能与本发明TYRO3亚家族成员基因产物的化合物。此类化合物可用于例如调节野生型TYRO3基因产物的表达、稳定性或活性或者另外用于调节突变体或其他变体TYRO3基因产物的表达、稳定性或活性。
通常，此类筛选测定法涉及在允许两种化合物相互作用(例如结合)从而形成可检测的复合物的条件下和足够的时间内制备包含TYRO3亚家族基因产物和测试化合物的反应混合物。测定法可以多种不同方式中的任一种进行。例如，一个实施方案包含将TYRO3亚家族多肽或测试化合物锚定在固相，并在反应最后和例如通过洗涤去除未结合化合物之后检测固相上的TYRO3亚家族多肽与测试化合物的复合体。例如在一个此种方法优选的实施方案中，TYRO3基因产物可锚定到固相上并且将标记化合物(例如根据上述任一方法标记的化合物)与其表面接触。在TYRO3基因产物和测试化合物之间可形成复合体的充分条件下孵育测试化合物足够的时间并从表面去除测试化合物的未结合分子(例如通过洗去除)之后检测剩余的标记分子。
在另一个备选的实施方案中，一种或多种不同测试化合物的分子与附着于固相并可在此接触标记的TYRO3亚家族多肽分子。在此类实施方案中，不同测试化合物分子优选与固相在特定位置结合，以使与TYRO3亚家族多肽结合的测试化合物可通过确定固相或表面上结合的TYRO3亚家族多肽的位置而鉴定。
与TYRO3亚家族多肽和配体相互作用的化合物的测定多种已知检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法的任一种也可用于检测和/或鉴定与受体和其配体相互作用的蛋白质。例如可使用共免疫沉淀、交联和通过梯度和层析柱的共纯化，以及本领域已知的其他技术。可使用此类测定法鉴定的蛋白质包括(但不限于)胞外蛋白质(如新的TYRO3亚家族成员配体)以及胞内蛋白质(如信号转导蛋白质)。
与TYRO3亚家族成员多肽和/或配体相互作用的化合物(包括其他胞内蛋白质和核酸)自身可用于本发明的方法中，例如用于调节TYRO3、Axl或cMer基因或基因产物的活性和治疗或预防软骨降解。另外，此类相互作用化合物自身可用于本发明的筛选测定法中，以鉴定其他调节TYRO3亚家族成员活性的化合物，例如通过与TYRO3配体结合和/或由此产生的下游信号事件调节TYRO3亚家族成员活性，此类相互作的化合物可依次用于治疗和预防软骨降解。
作为不具有限制性的实例，表达克隆测定法可用于鉴定新的TYRO3配体和其他特异与TYRO3受体相互作用的蛋白质。在此类测定法中，cDNA表达文库可从任何表达TYRO3-特异配体的细胞系产生，例如从表达GAS6的细胞产生。然后此表达文库的克隆可转染和感染到正常不表达TYRO3-特异配体的细胞中。然后用编码TYRO3-特异配体的克隆转染的细胞可表达此基因产物，并可使用标准技术(如FACS)或使用吸附有TYRO3多肽(例如TYRO3多肽Fc-融合物)的磁珠鉴定和分离。
另外，可使用本领域熟知的免疫沉淀技术从细胞系分离TYRO3亚家族成员多肽和/或配体。
也可使用上面任一种用于鉴定结合化合物的筛选测定法分离TYRO3亚家族成员多肽和/或配体。例如，TYRO3-Fc融合多肽可与固相结合或连接，标记化合物(例如TYRO3配体)可在允许形成融合多肽与测试化合物的复合体的条件下与表面接触足够的时间。然后从表面去除未结合的测试化合物分子(例如通过洗涤去除)，并检测仍然结合的标记化合物。
一旦这样分离，可使用标准技术以鉴定任何此类测定法中检测的蛋白质。例如可使用本领域熟知的技术(如Edman降解技术)确定至少与TYRO3、AXL或cMer基因产物相互作用的蛋白质氨基酸序列的部分。见例如Creighton，《ProteinsStructures and Molecular Principles》，W.H.Freeman & Co.，NY，34-49页(1983)。
一旦此类蛋白质得到鉴定，其氨基酸序列可用作产生使用例如上述常规的杂交或PCR技术筛选编码此类蛋白质的基因序列的寡核苷酸混合物的指南。见例如Ausubel，前文和《PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications》，Innis等编，Academic Press，Inc.，NY(1990)对产生此类寡核苷酸混合物的技术和其在筛选测定法中的用途的描述。
已知其他本领域的方法，其可用于同时鉴定编码与TYRO3亚家族成员基因或基因产物相互作用的蛋白质基因，例如可用标记的TYRO3多肽探测表达文库。
作为另一个非限制性实例，可使用双杂交系统检测在体内与TYRO3亚家族成员基因产物相互作用的蛋白质。简言之，使用这样的系统可构建编码两个杂合蛋白的质粒，其中一个优选包含与TYRO3(如情况可以是AXL或eMer)基因产物融合的转录激活子蛋白DNA结合结构域。另一个杂合蛋白优选包含用于第一个杂合体的与未知蛋白质融合的转录激活子蛋白的激活结构域，其中所述的未知蛋白由作为部分cDNA文库重组到质粒文库中的cDNA编码。DNA结合结构域融合质粒和cDNA文库可共转化到酿酒酵母菌株或其他含有报告基因如HBS、lacZ、HIS3或GFP的适当生物中。优选此报告基因的调节区域包含两种杂合蛋白转录激活子部分的结合位点。在这样的双杂交系统中，两种杂合蛋白中单独存在一种不能激活报告基因的转录。具体而言，DNA结合结构域杂合蛋白不能激活转录，因为其不能定位于必需的激活功能。同样激活结构域杂合蛋白不能激活转录，因为其不能定位于报告基因上的DNA结合位点。然而，两种杂合蛋白的相互作用重构了有功能的转录激活子蛋白并引起报告基因的表达。因此，在双杂合系统(如在此描述的系统)中，TYRO3多肽(即与转录激活子DNA结合结构域融合的TYRO3多肽)与测试多肽(即与转录激活子的DNA结合结构域融合的蛋白质)的相互作用可通过简单地检测报告基因基因产物的表达来检测。
可根据本领域已知的任何适当技术完成此类双杂合和其他测定法中DNA文库的筛选。作为特定的和非限制性实例，cDNA片段可插入载体以使其在翻译水平上与GAL4的转录激活结构域融合，并与“诱饵”GAL4融合质粒(编码TYRO3基因产物的GAL4融合物)共转化到酿酒酵母菌株或其他含有HIS3基因的适当生物中，其中所述的HIS3基因由含有GAL4激活序列的的启动子驱动。来源于此cDNA文库的与GAL4转录激活区融合的蛋白质将重构并激活GAL4蛋白质并从而驱动HIS3基因的表达，其中所述与GAL4转录激活区融合的蛋白质与GAL4融合物的TYRO3多肽部分相互作用。表达HIS3基因的菌落可通过其在含有缺少组氨酸的半固体琼脂基础培养基的培养皿上的生长来检测。然后可从这些菌株中纯化cDNA，测序并用于鉴定与TYRO3多肽相互作用的编码蛋白质。
一旦鉴定出与本发明的TYRO3亚家族成员基因或基因产物结合的化合物，这些方法中所述的筛选方法也可用于鉴定其他化合物，例如与这些结合化合物结合的小分子、肽和蛋白质。此类化合物也可用于调节与TYRO3亚家族成员基因及其基因产物相关的生物活性，例如通过与天然配体结合并阻止其与基因产物的相互作用来进行调节。
干扰TYRO3亚家族配体相互作用的化合物的测定法如上面提到的，TYRO3亚家族成员可与一种或多种分子相互作用，例如在体内或体外与特异配体相互作用。因此，破坏或干扰此结合相互作用的化合物可用于调节与酪氨酸激酶此亚家族相关的生物活性，例如调节酪氨酸激酶活性，包括例如软骨降解。此类化合物因此可用于治疗、预防或减轻与TYRO3表达和/或活性异常水平相关的紊乱，例如OA。
此类化合物包括(但不限于)根据上述筛选测定法鉴定的化合物，所述筛选测定法用于鉴定与TYRO3亚家族成员多肽结合的化合物，这包括在此描述的大量代表性化合物类别中的任何一种。
通常，鉴定干扰基因产物和结合配偶体(例如配体)相互作用的化合物的测定法包括在使基因产物和其结合配偶体结合并形成复合体的充足时间内和条件下制备含有基因产物及其结合配偶体测试反应混合物。为测试化合物的抑制活性，即抑制结合复合体形成或破坏曾经形成的结合复合体的能力，测试化合物优选也存在于测试反应混合物中。在一个代表性的实施方案中，测试化合物可最初与基因产物和其配偶体一起包含在测试反应混合物中。然而另外，测试化合物也可在稍后的时间加入测试反应混合物中，在加入基因产物和其配偶体之后。在优选的实施方案中，也可制备一种或多种不含测试化合物的对照反应混合物。一般地，对照反应混合物含有与测试反应混合物中相同的基因产物和结合配偶体，但是不含测试化合物。对照反应混合物也可含有测试反应混合物中没有的对照剂，以替代测试化合物。然后基因产物和结合配偶体间复合体的形成可在反应混合物中检测。在无测试化合物条件下，例如在对照反应混合物中而不是在存在测试化合物条件下此种复合体的形成表明测试化合物为干扰或调节基因产物和其结合配偶体相互作用的化合物。
此类用于筛选调节基因产物和结合配偶体相互作用的化合物的测定法可以多相、或者备选地以均相形式进行。多相测定法一般包括将基因产物或结合配偶体锚定在固相上并在反应结束时检测锚定到固相上的化合物。因此，此类测定法与上述用于检测和/或鉴定核酸和基因产物以及检测或鉴定配体的固相测定法相似。实际上，本领域的技术人员会认识到上述那些测定法的原理和技术中的许多方面可在此描述的固相测定法适度的实验中修改并应用，以鉴定调节基因产物和结合配偶体间相互作用的化合物。
不考虑所用的特定测定法，例如为鉴定通过竞争干扰TYRO3亚家族成员基因产物与结合配偶体相互作用的化合物或鉴定破坏已形成的结合复合体的化合物，可改变试剂加入反应混合物的顺序。可通过在存在测试化合物条件下进行反应鉴定通过竞争干扰基因产物与结合配偶体相互作用的化合物。具体而言，在此类鉴定法中，测试化合物可在基因产物和结合配偶体之前或同时加入反应混合物中。可通过在复合体形成之后加入测试化合物到反应混合物中测试破坏基因产物和结合配偶体已形成复合体的测试化合物。
在此描述的筛选测定法也可通过使用与全长TYRO3部分对应的肽或多肽、Axl或cMer多肽或蛋白质或者用包含此类肽或多肽序列的融合蛋白进行。例如，鉴定调节TYRO3多肽与结合配偶体相互作用的筛选测定法可使用相应于全长TYRO3多肽与结合配偶体结合的特定区域或结构域(例如受体“结合位点”)的肽或多肽进行。
本领域已知的多种方法可用于鉴定TYRO3亚家族成员多肽的特定结合位点。例如，可通过突变TYRO3基因并如上所述筛选结合的破坏鉴定结合位点。编码结合配偶体的基因也可在此类鉴定法中被突变以鉴定补偿TYRO3基因突变所致破坏的突变。然后这些突变的序列分析可揭示与两种蛋白质结合区域对应的突变。
在备选的实施方案中，蛋白质例如TYRO3蛋白质或TYRO3蛋白质结合配偶体可使用在此描述的方法锚定到固体表面或支持物上。另一个与锚定到固体表面的蛋白质结合的标记蛋白质可用蛋白水解酶处理，可根据上述结合测定法的方法允许其片段与连接到固体表面的蛋白质相互作用。洗涤之后，处理蛋白质的短标记肽段仍可与锚定蛋白质相联。可分离这些肽并且通过氨基酸序列鉴定其来自的全长蛋白质区域。
还在其他的实施方案中，干扰TYRO3亚家族成员多肽与其配体间相互作用的化合物也可通过筛选调节多肽(例如TYRO3多肽Fc融合构建体)与表达其特异配体的细胞结合的化合物来鉴定。
诊断和预后应用多种方法可用于使用试剂(如上述TYRO3亚家族成员核酸和多肽，以及此类核酸和多肽的抗体)的诊断和预后应用。例如使用在此描述的方法可以检测个体生物试样(如细胞或组织样品)中TYRO3亚家族核酸或蛋白质的表达，其中所述的样品为例如获得或来自个体受试者或患者的活检组织。用于此应用的优选的细胞或组织为与OA有关的细胞或组织，例如软骨细胞或关节连接组织(如软骨)、滑膜液和/或血清。如上面解释的，TYRO3受体和其配体GAS6在此类OA细胞和组织中以提高的水平表达。
因此，使用在此描述的方法以及其他本领域已知的方法，技术人员可检测到个体的细胞或组织样品中TYRO3或GAS6核酸或多肽提高的水平，并可因此检测和/或鉴定样品中的细胞或组织为OA的症状。在特定优选的实施方案中，此类方法鉴定的具体组织类型为软骨组织。通过使用此类方法检测个体的这些细胞或组织，技术人员可从而诊断个体中OA的存在。在优选的实施方案中，在此描述的方法使用预包装的诊断试剂盒进行。此类试剂盒可包含至少一种特定的TYRO3核酸或TYRO3基因产物特异的抗体试剂。例如该诊断试剂盒可用于检测TYRO3亚家族成员基因或基因产物的mRNA水平或蛋白质水平，该试剂盒包含(a)TYRO3亚家族成员或其片段的多核苷酸；(b)与(a)互补的核苷酸序列；(c)该TYRO3亚家族成员基因或其片段的表达产物；或者(d)该表达产物的抗体，并且其中组分(a)、(b)、(c)或(d)可包含基本组分。
在优选的实施方案中，试剂盒也含有其使用说明书用于例如检测患病细胞或组织或者诊断与TYRO3基因或基因产物异常表达相关的病症(如OA)。在优选的实施方案中，此类说明书可直接与试剂盒包装。然而在其他实施方案中，说明书可单独提供。例如，本发明提供了使用试剂盒的实施方案，其中试剂盒的说明书可例如从互联网下载。本发明的试剂盒也可优选在单独的容器、适当的缓冲液和其他使用试剂的溶液中包含例如核酸或TYRO3基因或基因产物的特异抗体，以检测TYRO3基因或基因产物。试剂盒和其中含有的任何试剂可用于例如临床情况下诊断表现和怀疑患有OA的患者。
包含TYRO3基因表达的任何组织类型的组织和任何细胞类型的细胞的样品也可用于此类诊断方法中，例如用于检测TYRO3基因的表达或TYRO3基因产物(如TYRO3多肽)，以及鉴定表达TYRO3基因或TYRO3基因产物的细胞，例如软骨细胞。因此，在一个实施方案中，在此描述的方法可原位实施，例如使用从个体(如活检组织)获得的细胞或组织。
在此描述的方法不仅限于诊断应用，也可用于预后应用，例如监测与TYRO3亚家族基因或基因产物异常表达相关疾病的进程，如OA的进程，或者监测其疗法。因此，本发明的预后方法可包括在代表性的实施方案中于处理或治疗过程(例如OA的药物治疗或运动疗法过程)中监测个体的TYRO3核酸或多肽水平。类似地，本发明的方法也可用于在治疗过程中检测和鉴定患病细胞或组织，例如与非OA细胞或组织相比过量表达TYRO3的细胞。在此类实施方案中，患病细胞减少的数量一般为有效治疗的标志。本发明的方法还可用于例如筛选候选药物或化合物和鉴定作为例如抗OA药物有效的候选药物和化合物。此类方法可例如使用动物模型在体内实施或者在体外实施，例如细胞培养测定。在一个实施方案中，此类方法可包括使测试化合物与细胞接触并鉴定细胞TYRO3基因或基因产物的表达是否得到抑制。在另一个实施方案中，测试化合物可与细胞接触或施用于生物，并在例如用于细胞培养测定的细胞培养基中或动物模型测定的组织、血液或其他体液中测量TYRO3核酸或多肽的胞外水平。
TYRO3亚家族核酸的检测本发明的诊断和预后方法包括测定TYRO3亚家族(优选TYRO3)基因表达水平的方法。多种本领域已知的方法可用于检测样品中核酸序列的测定水平。例如，可分离已知或怀疑表达特定基因的细胞类型或组织的RNA并使用本领域已知的杂交或PCR技术测试。分离的细胞可为例如来源于细胞培养或个体的细胞。取自细胞培养的细胞的分析可用于例如检测化合物对基因表达的影响或者另外验证细胞为表达目的基因的特定细胞类型的细胞。
作为非限制性实例，检测例如TYRO3核酸的诊断方法可包括在有利于核酸试剂与样品核酸中其互补序列特异退火或杂交的条件下接触和孵育从含有一种或多种标记核酸试剂的样品获得的核酸(包括重组DNA分子、克隆基因或其简并变体)，如重组TYRO3 DNA分子、克隆基因或其简并变体。孵育之后，去除所有非退火或非杂交核酸。然后检测已杂交核酸的存在(如果任何此类分子存在的话)，核酸试剂与其退火的TYRO3核酸序列水平可与对照样品预期的退火模式或水平比较，以确定TYRO3核酸是否以提高的水平表达，其中所述的对照样品为例如正常的非OA细胞或组织样品。
在此种检测方案优选的实施方案中，来自目的细胞类型或组织的核酸可固定到例如固体支持物(如膜或塑料表面)上，例如尼龙膜、微滴定板或聚苯乙烯珠上。孵育之后，非退火的标记TYRO3亚家族核酸试剂可容易地去除，并且可使用本领域熟知的标准技术检测剩余的退火的标记TYRO3亚家族核酸试剂。
备选的检测患者样品或其他细胞或组织来源中TYRO3亚家族核酸的诊断方法可包括扩增，例如通过PCR扩增，见例如U.S.专利No.4,683,202教导的实施方案，然后使用本领域技术人员熟知的技术检测经扩增的分子。得到的扩增的TYRO3亚家族核酸水平可与样品在只含有TYRO3亚家族核酸正常水平如正常细胞或组织条件下扩增预期的水平(例如健康软骨细胞中的水平)比较，以确定任一TYRO3亚家族核酸是否提高了表达的水平。
在此种检测方案的一个优选的实施方案中，从目的RNA分子合成cDNA分子，例如通过反转录合成。然后cDNA中的序列可用作核酸扩增反应的模板，如PCR的模板。此种测定法的反转录和扩增步骤中用作合成起始试剂的核酸反应物(例如引物)优选选自在此描述的TYRO3亚家族核酸序列或者为其片段。核酸反应物的长度优选为至少约9-30个核苷酸。扩增反应可使用例如放射性标记或荧光标记的核苷酸进行，以便于检测。备选地，可制备足够的扩增产物，以使产物可通过常规的溴化乙锭或其他染色方法显现。
本发明的TYRO3亚家族基因表达测定法也可原位进行，即直接在固定和/或冷冻的患者组织的组织切片上进行，从而无需核酸纯化。TYRO3亚家族核酸试剂可用作此种原位方法的探针或引物。见例如Nuovo，《PCRIn Situ HybridizationProtocols And Application》，Raven Press，NY(1992)。另外，如果可获得足量的适当细胞，可进行标准的Northern分析，以通过检测TYRO3亚家族mRNA的水平测定TYRO3亚家族基因表达水平。
TYRO3亚家族成员基因产物的检测本发明的诊断和预后方法也包括这样的方法，其包括检测TYRO3亚家族成员蛋白质或其他多肽的水平并包括其功能保守变体和片段的水平。例如，完全的野生型或突变体TYRO3(或Axl或cMer)基因产物的抗体或TYRO3基因产物的功能保守变体或肽片段的抗体可用作诊断和预后试剂。此类试剂可用于例如检测TYRO3基因产物合成或表达水平的异常或用于检测TYRO3亚家族基因产物的结构、表达时间或生理位置的异常。如在此描述的抗体和免疫测定法对于评价治疗功效(例如对OA的治疗功效)也具有重要的体外应用。例如，抗体或抗体片段可用于体外筛选可能的治疗化合物，以确定化合物对TYRO3表达或TYRO3多肽生产的影响。可鉴定对异常TYRO3亚家族相关病症具有有益作用的化合物并可使用此类测定法确定此类化合物的有效治疗剂量。
作为一个实例，抗体或抗体片段可用于例如通过使用荧光标记抗体结合光学显微镜、流式细胞仪或荧光检测技术的免疫荧光技术检测TYRO3亚家族基因产物、该基因产物的变体或其片段的存在。
在特别优选的实施方案中，抗体或其片段也可在组织水平上使用，例如在原位检测TYRO3亚家族成员基因产物的免疫荧光或免疫电子显微术中使用。原位检测可通过去从患者中取下组织学标本(例如组织样品)并对其应用本发明的标记抗体或此种抗体的片段完成。抗体或抗体片段优选通过用标记的抗体或抗体片段覆盖生物样品来应用。通过使用此种方法，就可能不仅检测到例如TYRO3亚家族基因产物的存在，也可以检测所检查组织中基因产物的分布。本领域熟知的多种组织学方法(例如染色方法)可由本领域的技术人员容易地修改而以恰当的实验完成此种原位检测。
可用于鉴定基因产物的免疫测定法一般包括在能与目的基因产物特异结合的可检测标记抗体存在的条件下孵育生物试样(例如组织提取物)，其中所述的目的基因产物包括例如其功能保守变体或肽片段。然后可通过本领域已知的大量技术中的任一种检测结合的抗体。
治疗方法和药物组合物TYRO3亚家族成员核酸和多肽、其调节剂(例如激动剂、拮抗剂、抑制剂)和其特异抗体也可用于治疗方法和组合物中用作药物，例如在治疗、预防或减轻与异常(优选为提高的)TYRO3表达水平相关的疾病和紊乱(例如OA)中用作药物，或用于加工药物制剂。
因此，在特定优选的实施方案中，本发明的治疗方法包括施用包含一种或多种化合物或调节剂的药物组合物，其中所述的化合物或调节剂为例如调节(如抑制)TYRO3亚家族成员表达或活性的化合物或调节剂，例如与本发明的TYRO3亚家族成员核酸或多肽结合的化合物、调节TYRO3亚家族成员基因表达的化合物和/或干扰或调节TYRO3亚家族成员核酸或多肽与结合配偶体(如TYRO3亚家族成员特异性配体，例如PROS1或GAS6)结合的化合物。
在另一个优选的实施方案中，本发明的治疗方法可包括一种或多种细胞定向疗法(cell targeted therapy)，其指导化合物(例如药物、药物前体、毒素或细胞毒素)到表达TYRO3亚家族成员核酸或多肽的细胞中。
抑制方法在备选的实施方案中，本发明提供了通过调节(例如增加或降低)TYRO3亚家族成员基因或其基因产物的表达或活性来治疗与TYRO3亚家族成员基因或基因产物异常表达或活性相关的疾病或病症(例如OA)的方法和组合物。此类方法可只包括施用一种或多种调节例如TYRO3、AXL或cMer基因表达、合成或活性的化合物。优选施用这些一种或多种化合物直到病症的一种或多种症状消除或至少减轻时。
可表现调节目的TYRO3亚家族成员核酸的活性、表达或合成能力的化合物为反义分子。可设计此类分子以降低或抑制野生型核酸和多肽或者另外可作用于突变核酸或多肽。反义分子也可用于抑制配体核酸的表达。
反义RNA和DNA分子通过与靶mRNA分子杂交直接阻断mRNA的翻译并阻止蛋白质翻译。反义方法包括设计与靶基因mRNA互补的寡核苷酸。反义寡核苷酸将与互补靶基因mRNA转录物结合并阻止翻译。绝对互补性虽然为优选但为不必。如在本文中使用的“反义”广义地包括RNA-RNA相互作用、三螺旋相互作用、核酶和RNA酶H介导的捕获。反义核酸分子可由重组基因编码以在细胞中表达(见例如U.S.专利No.5,814,500和5,811,234)或者备选地其可以合成方法制备(见U.S.专利No.5,780,607)。
与核酸部分“互补”的序列指具有能与核酸杂交并形成双链体的充分互补性的序列。核酸杂交的能力依赖于序列互补性的程度和反义核酸的长度。然而一般地杂交核酸越长，其越可含有更多的碱基错配并仍可形成稳定的双链体(或在三旋方法中的三链体)。可容忍的错配程度可容易地确定，例如通过使用测定杂交复合体解链温度的标准方法来确定。
在一个优选的实施方案中，与TYRO3亚家族成员基因非编码区互补的寡核苷酸可用于反义方法中以抑制内源TYRO3亚家族成员mRNA分子的翻译。反义核酸优选长度至少6个核苷酸，更优选长度至少约6-50个核苷酸。在具体的实施方案中，寡核苷酸可为长度至少10个，至少15个，至少20个，至少25个或至少50个核苷酸。
一般优选的为首先进行体外研究，以量化反义寡核苷酸抑制基因表达的能力。优选这些研究使用区分反义基因抑制和寡核苷酸非特异性生物作用的对照。还优选这些研究比较靶RNA或蛋白质的水平与体内对照RNA或蛋白质的水平。此外，可以预想使用反义寡核苷酸获得的结果与使用对照寡核苷酸获得的结果的比较。优选对照寡核苷酸与检测寡核苷酸长度相同并且仅与反义序列不同的寡核苷酸的核苷酸序列为阻止与靶mRNA序列特异杂交所必需。
但是可使用与靶基因编码区序列任何部分互补的反义核苷酸，那些与转录区、非反义区互补的为最优选。
反义分子优选递送给体内表达靶基因的细胞，如软骨细胞。已经发展许多递送反义DNA或RNA到细胞中的方法。例如，反义分子可以直接注射到组织位点中(例如直接注射到肿瘤中)，或者可设计经修饰的反义分子以作用于目的细胞，例如可全身性施用连接到特异结合靶细胞表面上表达的受体或抗原的肽或抗体的反义分子。
优选的实施方案获得足够抑制内源mRNA翻译的胞内反义核酸分子浓度。例如，一个优选的方法使用重组DNA构建体，其中反义寡核苷酸置于强pol III或pol II强启动子控制之下。使用此种构建体转染靶细胞会引起足够数量单链RNA的转录，这些RNA会与内源靶基因转录物形成互补碱基对从而阻止靶基因mRNA的翻译。例如可引入上述载体以使其为细胞摄入并指导反义RNA的转录。此种载体可保持游离或成为与染色体整合，只要其可转录以产生目的反义RNA。此类载体可通过本领域的重组DNA技术方法标准构建。载体可为用于哺乳动物细胞中复制和表达的质粒、病毒或本领域已知的其他载体。可通过任何本领域已知的启动子在特定细胞类型(如在造血细胞)中表达编码反义RNA的序列。例如上面所讨论的与重组体TYRO3亚家族成员核酸表达相关的启动子的任何一种也可用于表达TYRO3亚家族成员反义核酸。
除了反义技术，RNA适体(见Good等，Gene Ther.，第4卷，45-54页(1997))、双链RNA(WO 99/32619)、核酶(见Cech，Amer.Med Assn.，第260卷，3030页(1988)；Cotton等，EMBO J.，第8卷，3861-3866页(1989)；Grassi和Marini，Ann.Med.，第28卷，499-510页(1996)和Gibson，CancerMetast.Rev.，第15卷，287-299页(1996))和/或三螺旋DNA(见Gee等，《Molecular and Immunologic Approaches》，Huber和Carr编辑，FuturaPublishing Co.，Mt.Kisco，NY(1994))可根据本领域技术人员熟悉的方法用于调节靶核酸的活性、表达或合成。
另外，小干扰RNA(siRNA)分子也可用于抑制目的多肽或配体的表达。RNA干扰为施用外源短RNA双链体的方法，其中一条链与靶mRNA的编码区对应。见Elbashir等，Nature，第411页，494-498页(2001)。一旦进入细胞，siRNA分子不仅引起外源RNA双链体的降解，也导致具有相同序列的单链RNA的将解，这包括内源信使RNA。因此，siRNA可能比常规反义RNA方法更有效，因为此技术被认为通过催化机制作用。
优选的siRNA分子一般长度大于约19个核苷酸并包含TYRO3亚家族成员或其配体的核酸序列。递送siRNA到靶细胞中的有效策略包括上述递送反义核酸方法中的任何一种。例如siRNA可使用物理或化学转染通过转导引入细胞中。另外，可使用例如多种允许功能siRNA或其前体转录的PolIII启动子表达盒在细胞中表达SiRNA。见例如Scherr等，Curr.Med.Chem.，第10卷，No.3，245-256页(2003)；Turki等，Hum.Gene Ther.，第13卷，No.18，2197-2201页(2002)和Cornell等，Nat.Struct.Biol.，第10卷，No.2，91-92页(2003)。
药物制剂本发明治疗方法中所用的组合物可例如以治疗有效剂量在体外或离体施用给细胞培养物，或者更优选在体内施用给个体，以治疗与异常TYRO3亚家族基因表达和/或活性相关的疾病或病症(如OA)。例如与本发明的TYRO3亚家族基因或基因产物结合的化合物(包括上述此类筛选测定法中鉴定的化合物)可被施用给细胞或个体以抑制基因或基因产物的表达和/或活性。本发明因此提供了药物制剂以用作例如治疗与异常TYRO3亚家族基因表达或活性相关的病症(包括OA)的治疗化合物。
术语“治疗有效剂量”和“有效剂量”指足够引起治疗反应的化合物数量。在化合物(例如药物或毒素)以复合体(例如与特异性抗体一起)施用的实施方案中，术语“治疗有效剂量”和“有效剂量”可指足够引起治疗反义的复合体数量。治疗反应可为使用者(例如临床医师)认为是对治疗有效反应的任何反应。这样治疗反应一般为疾病和病症一种和多种症状的减轻。在药物制剂用于治疗OA的优选实施方案中，治疗反应可为观察到的软骨降解数量的降低，例如治疗中患者活检组织中观察到的软骨降解数量的降低。
化合物的毒性和治疗效果可通过标准药学方法确定，例如在细胞培养测定法中或使用实验动物确定LD50和ED50。参数LD50和ED50为本领域所熟知并分别指对群体的50％致死的化合物剂量和群体的50％治疗有效的化合物剂量。毒性和治疗效应的剂量比例称为治疗指数并可表示为比例LD50/ED50。优选表现大的治疗指数的化合物。
虽然可使用表现毒副作用的化合物，然而，在这些情况下特别优选使用特异引导此类化合物到受影响组织位点的递送系统，以使对其他细胞、组织或器官的潜在破坏最小化，并降低副作用。
从细胞培养测定法或动物研究获得的数据可用于制备一系列用于人类的药剂。用于本发明治疗方法的化合物的剂量优选在包括ED50浓度但具有较小或无毒性(例如低于LD50浓度)的循环浓度范围内。任何应用中所用的具体剂量可在此范围内变化，其依赖于这些因素，如所使用的具体药剂形式、所用的给药途径、个体(例如患者)的情况等等。
治疗有效剂量最初可从细胞培养测定法中估计并在动物模型中表示，以获得包括IC50的循环浓度范围。化合物的IC50浓度为达到症状半最大抑制的浓度，例如细胞培养测定法中测定的。然后使用此信息可更精确地确定用于特定个体(如人类患者)的适当剂量。
可常规地通过如高效液相色谱法(HPLC)或气相层析之类的技术在个体如患者中测量质膜中的化合物。
根据本发明使用的药物组合物可使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂以常规方式配制。
因此，化合物和其生理上可接受的盐类和溶化物可为吸入和吹入(通过嘴或鼻)给药或者口腔、含服、肠胃外或直肠给药配制。
为口腔给药，药物组合物可采用例如通过常规方法利用可药用赋形剂制备的片剂或胶囊形式，如结合剂，例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯酮或羟丙基甲基纤维素；填充剂，例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙；润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石粉或硅石；崩解剂，例如马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠；或者湿润剂，例如十二烷基硫酸钠。片剂可用本领域熟知的方法包被。口腔给药的液体制剂可采用例如溶液、糖浆剂或悬浮液形式，或者可以使用前与水或其他适当载体组合的干燥产物提供。此类液体制剂可通过常规方法利用可药用赋形剂制备，如悬浮剂，例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂；乳化剂，例如卵磷脂或阿拉伯胶；非水性载体，例如杏仁油、油酯、乙醇或分级植物油；防腐剂，例如甲基或丙基对羟苯酸或山梨酸。制剂也可适当地含有缓冲盐、着色剂、调味剂和甜味剂。
口腔给药的制剂可适当地配制，以提供活性化合物的控制释放。为口腔含服给药，组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂形式。为吸入给药，根据本发明使用的化合物一般以喷雾剂形式递送，其中所述的喷雾剂使用适当的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适当气体，通过增压包装或喷雾器给药。在增压烟雾剂的情况下，单位剂量可通过提供阀门以递送测定的数量确定。吸入器或吹入器中使用的例如凝胶胶囊或药筒可配制含有化合物和适当粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
化合物可配制以通过注射而肠胃外给药，例如快速浓注或连续输注。注射制剂可以单位剂量形式与附加防腐剂一起提供，例如在安培瓶中或多剂量容器中提供。组合物可采用油性或水性载体的悬浮液、溶液或乳液形式并可含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，活性成分可为使用前与适当载体(例数灭菌无热原水)组合的粉末形式。
化合物也可以直肠组合物配制，如栓剂或保留灌肠剂，其含有例如常规栓剂基质，如可可脂或其他甘油酯。
除了前述制剂之外，化合物也可以贮藏酮制品配制。这样长效作用的制剂可通过植入使用，例如皮下或肌肉内施用；或通过肌内注射施用。这样，例如化合物可与适当多聚或疏水材料配制，例如可接受的油中的乳剂、离子交换树脂或微溶衍生物(例如微溶盐)。
如果需要，组合物可在包装或配药装置中提供，其可含有包含活性成分的一种或多种单位剂形。包装可例如包含金属或塑料薄片，如泡包装。包装或配药装置可与施用说明书一起提供。
本发明说明书中引用和讨论了大量参考文献，包括专利、专利申请和多种出版物。提供此类参考文献的引用和/或讨论仅为阐明本发明的说明书并不认为任何此种参考文献为在此描述的本发明的“现有技术”。本说明中所有引用和讨论的参考文献(包括GenBank或其他公共数据库存储的生物序列的参考)在此以相同程度全文引入为参考，就如同每一参考单独引用为参考一样。
实施例本发明也以下列实施例方式说明。然而本说明书中任何地方这些或其他实施例的使用仅用作说明并绝非限制本发明或任何例举术语的范围。同样本发明不限于任何在此描述的特定优选实施方案。一旦阅读本说明，本领域的技术人员确实可明白本发明多种修改和改变并可不偏离其实质和范围进行改变。
实施例1OA标志基因使用下列材料和方法进行下述实施例
从全长cDNA克隆制备质粒DNA在96深孔板(Qiagen，Valencia，CA)上培养含有pCMVSport6载体中全长TYRO3 OA cDNA的菌液，每孔含有1.0mL Terrific肉汤(Sigma，St.Louis，MO)和氨苄青霉素(40μg/mL)。培养物最初在37℃300转/分振荡培养24小时，再接种到新板中再培养过夜以确保所有孔中的细菌一致生长。根据生产商描述的标准方案用Biorobot 8000(Qiagen，Valencia，CA)从细菌中分离质粒DNA。
全长cDNA克隆的GATEWAYTM转移为在RT-PCR测定法中检测TYRO3，使用GATEWAYTM平台(Invitrogen，Carlsbad，CA)将TYRO3 cDNA从pCMVSport6载体转移到逆转录病毒载体。
如下进行GATEWAY BP反应。简要地，1.0μL(100-120ng)质粒DNA在冰上加入到微量滴定孔中，其中含有1μL(100-120ng)pDONR 201输入载体(entry vector)(Invitrogen，Carlsbad，CA)、1μL BP反应缓冲液(Invitrogen，Carlsbad CA)、1μL tris-EDTA和1μL BP Clonase酶混合物(Invitrogen，Carlsbad，CA)。微量滴定板于25C孵育3小时。
将由0.25μL 0.75M NaCl、1.0μL(100-120ng)线性化逆转录病毒载体和1.5μL LR Clonase酶混合物(Invitrogen，Carlsbad，CA)组成的GATEWAY LR反应混合物加入到BP反应中。此研究中使用的逆转录病毒载体含有杂合CMV/Moloney鼠白血病病毒5’LTR、Moloney鼠白血病病毒3’LTR和逆转录病毒包装ψ位点，并根据常规方法构建。相同的载体也可商业购买(Clontech)。样品彻底混合并于25℃再孵育2小时。加入蛋白酶K溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA)的十分之一体积(0.8μL，2mg/mL)并于37℃孵育10分钟。
40μL最大效力的DH5α细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)在冰上等分加入平底96孔板(Qiagen，Valencia，CA)的孔中。然后在孔中加入1μL的LR反应混合物并于冰上孵育30分钟。细胞于42℃热激30秒，置于冰上1-2分钟，并在每孔中加入65μL S.O.C.培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)。96孔板于37℃振荡孵育1小时。含有具40μg/mL zeocin的LB琼脂(Invitrogen，Carlsbad，CA)的微量滴定孔中加入35μL最终转化混合物并于37C生长过夜。
单克隆接种到96孔板中的1mL Terrific肉汤/zeocin(40μg/mL)中并在旋转振荡器中300转/分生长过夜。根据生产商描述的标准方案用Biorobot 8000(Qiagen，Valencia，CA)分离质粒DNA。
上清液的产生在含10％FBS(Invitrogen，Carlsbad，CA)的无抗生素DMEM中转染之前16-24小时将GP2-293包装细胞《BD Biosciences Clontech，PaloAlto，CA)接种(5×104个细胞/孔)到96孔PDL板(BD BiosciencesClontech，Palo Alto.CA)中。通过在96孔板中总体积25μL的OPTIMEM(Invitrogen，Calsbad，CA)中混合150ng GATEWAYTM构建体和150ng包膜质粒，使GATEWAYTM构建体与包膜载体pVPack-VSV-G(Stratagene，La Jolla，CA)共转染到包装细胞中。在单独的板上，25μLOPTIMEMTM与1μL Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)混合。此第二溶液室温孵育5分钟，然后混合两种溶液。加入到细胞中前允许DNA-lipofectamine复合体形成20分钟。转染操作后16-24小时，用含抗生素的完全培养基替换该培养基。转染后的24小时和48小时收集含病毒上清液的培养物。
转导进初级软骨细胞初级软骨细胞(从关节置换手术获得的软骨组织分离，MullenbergHospital，Plainfield，NJ)转导前24小时在两个96孔板中以1.1×104个细胞/孔接种。转导时用100μL病毒上清液和100μL补充20mM HEPES和16μg/mL聚凝胺的完全培养基替代培养基。细胞于32℃在吊桶式转头中1000g离心1.5小时。16-24小时后用新鲜培养基替代此培养基，细胞再孵育48小时。
RNA分离和RT-PCR根据生产商的说明书使用BioRobot 8000(Qiagen，Valencia，CA)和Qiagen RNeasy 96 Biorobot试剂从合并的两个96孔板中分离总细胞RNA。依照Qiagen(Valencia，CA)发表的标准方案使用柱上DNase I消化，以消除污染的基因组DNA。用High-CapacIty cDNA Archive kit(PE AppliedBiosystems，Foster City CA)使用随机引物在100μL反应体积中合成第一链cDNA。在384孔板中于ABI Prism 7900HT序列检测系统(AppliedBiosystems，Foster City，CA)上进行实时PCR(RT-PCR)。使用Biomek FX移液器(liquid hardling robot)分开cDNA模板和PCR混合物。20μL反应含有5μL cDNA、200nM正向和反向引物和SYBR Green PCR MasterMix(Applied Biosystems，Foster City，CA)。默认的循环程序(95℃ 10分钟和95℃、15秒的40个循环60℃ 1分钟)之后是离解阶段，其中产生解链曲线以确认PCR产物的特异性和不含引物二聚体。
下面表I说明了本领域技术人员熟悉的代表性OA“标志基因”。具体而言，此测定法中所用的每一“标志基因”为软骨细胞中OA相关的基因。也提供了每一标志基因代表性核苷酸序列的GenBank登录号。
RT-PCR实验使用表I说明的引物(在默认参数和反应条件下用Primer Express软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)设计)以扩增每一所列基因。此外，选择基因GAPDH(GenBank登录号AJ 005371)作为标准化所有样品的广泛表达的“持家基因”。
表I.检测OA标志基因的RT-PCR引物
ROX染料(Applied Biosystems，Foster City，CA)用作参比荧光(passivereference)以标准化非PCR相关的荧光信号波动。基因表达的改变根据生产商的说明书(Applied Biosystems，Foster City，cA)使用对照Ct方法计算，其中所述的对照Ct方法使用校准样品，即所有其他样品都与之比较的样品。校准样品的值标准化为1.0以便所有其他样品的表达水平按所测量的校准样品表达水平的倍数定义。为进行此实施例描述的RT-PCR实验，不含cDNA插入的逆转录病毒载体用作校准样品。简要地，与校准mRNA的数量相关的靶mRNA的数量根据公式2-ΔΔCT计算，其中Ct＝域值循环(扩增目标的数量达到固定域值的循环#)。
细胞处理为优化RT-PCR条件和确认此检测中所选的标志，关节置换术中获得的来源于膝关节软骨的人关节软骨细胞用含10％FBS(Invitrogen，Carlsbad，CA)的DMEM培养基置于96孔板中(11,000个细胞/孔)。两天后在无血清培养基中用IL-1(5ng/mL；Peprotech，UK，London)和OSM(50ng/mL)或PDGF(50ng/mL)或TGF-β(50ng/mL)处理细胞过夜。OSM、PDGF和TGF-β从R&D系统(Minneapolis，MN)购买。从这些细胞中分离RNA并使用上述方法通过RT-PCR评价。
ELISA细胞培养物上清液中MMP13和IL-6蛋白质的水平使用Amersham(Piscataway，NJ)的人MMP13ELISA系统和R&D Systems(Minneapolis，MN)的人IL-6ELISA系统根据生产商的标准方案测定。
结果为鉴定可用于治疗OA的药物靶，观察候选基因过量表达的软骨细胞对若干种已知OA遗传标记的影响。下面表Ⅱ概括了代表性OA标志基因和相关OA特征。
表II.OA标志基因
候选基因(在这种情况下为TYRO3)转染到软骨细胞中和评价表达对OA标志基因的影响之前，确认使用特定OA标志基因的引物和RT-PCR条件。这通过测定用多种已知诱导OA特征的化合物处理的软骨细胞中OA标志基因表达的改变来完成。
具体而言，用以上材料和方法中所述的多种已知能诱导软骨细胞中OA特征的细胞因子和生长因子处理人关节软骨细胞。见Tardif等，Arthritis Rheum.，第42卷，No.6，1147-1158页(1999)和Smith等，ArthritisRheum.，第34卷，No.6，697-706页(1991)。然后使用在此描述的引物进行RT-PCR以确定是否有一个或多个标志基因表达的可检测的变化。下面表III概括了通过用(i)IL-1和OSM、(ii)TGF-β和(iii)PDGF处理软骨细胞介导的每一个标志基因mRNA水平的代表性变化。表达水平表示为未处理软骨细胞中测量的标准化表达水平的倍数，即mRNA水平的“成倍变化”。
表III中的数据表明预期对已知诱导软骨细胞中OA特征的处理产生反应多种OA标志基因的表达水平发生了改变。因此，这些数据验证了所用引物和方法的有用性。
表III.处理的软骨细胞中标志基因表达的变化
为进一步验证RT-PCR测定法，组成性活性的基因产物AKT/PKB(GenBank登录号NPL-001907)通过逆转录病毒介导的基因转移(如实施例1中所述的方法)在软骨细胞中过量表达。已知此基因生化途径的活化诱导软骨细胞中的可聚蛋白聚糖-1和MMP-13。转导48小时和72小时后使用常规方法收获细胞RNA，通过RT-PCR检测MMP-13和可聚蛋白聚糖-1mRNA表达的变化。AKT/PKB过量表达引起可聚蛋白聚糖-1的12倍诱导和MMP-13的9倍诱导(数据未显示)。
实施例2TYRO3
如果存在的话，为确定TYRO3在OA中具有的作用，全长TYRO3cDNA转染到初级人关节软骨细胞(HAC)中并通过RT-PCR分析引起的对这些细胞中OA遗传标记表达产生的影响，并与未转化细胞中测量的那些标志基因表达水平比较。
结果表明TYRO3基因的转染有效地诱导至少四个OA标志基因的表达，这表明TYRO3参与了OA的疾病过程(见下面表IV)。
表IV.TYRO3诱导多个OA遗传标记
为验证TYRO3诱导这些“标志基因”编码的多肽提高的表达，通过ELISA测量用TYRO3 cDNA转化的软骨细胞中MMP-13蛋白质水平。结果表明，如通过ELISA在细胞上清液中测量的，TYRO3过量表达确实引起MMP-13蛋白质分泌的诱导(数据为显示)。
实施例3GAS6此实施例描述了研究GAS6诱导软骨细胞中OA标志基因能力的实验，所述的GAS6为与TYRO3亚家族成员结合并活化TYRO3亚家族成员的配体。
使用下列材料和方法进行下述实施例免疫组织化学分析正常或OA人膝软骨的完整厚度外植体在含5％FBS的DMEM中培养。软骨用4％多聚甲醛固定并用石蜡包埋，以切成5微米的切片。组织切片放于载玻片上，在甲苯中去石蜡，在连续梯度的乙醇中水化然后在PBS和0.2％的过氧化物酶中洗涤。用正常血清或BSA封闭组织切片30分钟之后，切片用2μg/mL GAS6的初级抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN的山羊抗人重组抗体)或人TYRO3抗体(人TYRO3胞外结构域的山羊抗体R&D Systems，Minneapolis，，MN)室温孵育1-2小时或4℃过夜。此TYRO3抗体不与Axl或cMer交叉反应。
在PBS中对切片进行3次5分钟的洗涤之后，进行再次的10分钟封闭反应。切片用稀释的生物素化二级抗体孵育30分钟。在PBS中洗载玻片3次并用vectastain ABC-AP(Vector Labs，Burlingame，CA)或基于过氧化物酶的Elite ABC系统(Vector Labs，Burlingame，CA)孵育30分钟。洗载玻片并用碱性磷酸酶底物溶液(Vector Labs，Burlingame，CA)或用3，3-二氨基联苯(DAB)底物孵育切片4-20分钟。用水漂洗载玻片，用稀释的苏木精或甲基绿复染，在梯度乙醇中或三次变化的1-丁醇、hemo-de中水化并用Refrax封固剂(mounting medium)(Anatech Ltd.，Battle Creek，MI)包埋(mounted)。通过用免疫前血清或免疫球蛋白替代初级抗体进行阴性对照。
重组GAS6的产生为产生GAS6蛋白质，内部克隆(in-house clone)样品的全长GAS6DNA克隆使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据生产商推荐的方案转染到293H细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。编码GAS6多肽的优选的GAS6 cDNA序列和蛋白质序列可从GenBank分别以登录号NM_00820(SEQ ID NO28)和NP_000811(SEQ ID NO29)获得。GAS6蛋白质由转化细胞分泌到上清液中并在转染后72小时收集。
软骨细胞处理软骨细胞置于24孔板中并用直线或连续稀释的含重组GAS6蛋白质的293H细胞上清液处理过夜。分离总RNA并根据上面实施例1中所述的RT-PCR方法进行RT-PCR以检测可聚蛋白聚糖-1、MMP-13和iNOS的表达。另外，根据上述ELISA的材料和方法对蛋白质MMP-13或IL-6进行ELISA。
结果TYRO3和GAS6在人关节疾病中过量表达使用免疫组织化学直接在正常和OA的人软骨组织中检测TYRO3和GAS6水平，以确定TYRO3和其配体GAS6是否在人关节疾病中确实过量表达。结果表明TYRO3和GAS6在软骨中存在而不在正常人软骨组织中存在。此外，培养的OA患者的中间和深层软骨细胞表现TYRO3和GAS6增加的免疫染色(数据未显示)。这些数据支持OA软骨细胞在体内由于(至少是)TYRO3和GAS6增加的表达而以自分泌形式活化的结论。因此，TYRO3和GAS6为体内重要的OA介质并可用作例如治疗此类病症的药物靶。
GAS6诱导OA标志基因和基因产物为确定内源TYRO3是否可使用重组GAS6活化和此类活化是否引起OA标记的标志基因(蛋白酶和炎症介质)的诱导，用上述表达GAS6的293H细胞上清液处理软骨细胞。如通过RT-PCR所测定的，结果表明此种处理引起可聚蛋白聚糖-1、MMP-13和iNOS的诱导。相反，用空载体转染的293H细胞上清液不诱导这些基因。ELISA实验也表明用含GAS6的上清液处理软骨细胞也诱导IL-6蛋白质的表达(数据未显示)。
这些实验的结果表明用GAS6处理软骨细胞不仅诱导OA标志基因的表达，像TYRO3一样，GAS6也在OA软骨细胞中以提高的水平表达。
实施例4TYRO3的抑制降低OA标志基因的表达此实施例描述了使用特异抑制软骨细胞中TYRO3基因表达的RNA干扰的实验。
下面的实施例使用下列材料和方法初级人关节软骨细胞(从膝关节置换术获得的软骨组织中分离Mullenberg hospital，Plainsfield，NJ)在转染前24小时以30-50％汇合(大约1.5×104个细胞/孔)接种。清洗细胞一次以去除痕量的抗生素并在每孔中加入350μL OPTIMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)。加入3μL 20μMsiRNA双链体(Dharmacon，Lafayette，CO)到50μL Opti-MEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。在单独的管中稀释3μL Oligofectamine(Invitrogen，Carlsbad CA)到12μL Opti-MEM中并孵育9分钟。混合siRNA双链体溶液和oligofectamine溶液并再孵育20分钟。调节余下溶液的体积到100μL并加入到软骨细胞中，以使每孔中寡核苷酸双链体的终浓度为133nM并且Oligofectamine浓度为0.67％。
细胞用转染培养基孵育16小时，此时培养基转换为溶于含抗生素(Invitrogen，Carlsbad，CA)的DMEM(Invitrogen，Carsbad，CA)的10％热灭活血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)。细胞再孵育48小时以沉默靶基因。然后细胞在含10％铁并添加小牛血清(Omega Scientific，Tarzana，CA)的DMEM中用IL-1或TNF(分别为5ng/mL和50ng/mL)攻击16小时。收集培养基并测定MMP-13的产生(MMP-13 ELISA系统，Amersham，Piscataway，NJ)。从细胞沉淀中分离RNA(Qiagen RNeasy，Valencia，CA)通过上述RT-PCR测量所选基因的信息水平。
使用了下列siRNA寡核苷酸序列
*来源于pGL3载体(Promega，Madison，WI)。
结果RNA干扰为可选择性抑制特定基因的转录后表达的方法，以便评估一个和多个特定基因在细胞内的功能。在这些实验中，化学合成的双链21聚体被递送到细胞中。这些寡聚物活化引起特定mRNA高度特异降解的正常细胞过程。
在此实施例中，siRNA如上所述施用给OA软骨细胞以抑制TYRO3表达。如在使用TYRO3特异siRNA之后48小时测量TYRO3 mRNA水平一样，通过RT-PCR测量IL-6和MMP-1的mRNA水平，已知两个基因的表达在软骨细胞中上调(见Vincenti等，Arthritis Res.，第4卷，No.3，157-164页(2002)；Bau等，Arthritis Rheum.，第46卷，No.10，2648-2657页；Flannery等，Matrix Biol.，第18卷，No.3，225-237页(1999)和Mengshol等，Arthritis Rheum.，第43卷，No.4，801-811页(2000))。结果表明IL-6和MMP-13的基础表达水平都随着TYRO3的表达有效降低。作为阴性对照OA软骨细胞也用特异抑制萤光素酶基因的siRNA处理，其中所述的萤光素酶基因一般不在软骨细胞中表达。同预期一样，如RT-PCR确定的，施用此萤光素酶特异的siRNA不抑制TYRO3、IL-6或MMP-13。
还有其他实验表明沉默TYRO3具有的对IL-1介导的OA软骨细胞作用的影响。具体而言，如上所述用TYRO3特异的siRNA处理软骨细胞然后用IL-1或TNF处理。通过RT-PCR测量MMP-13和IL-6的mRNA水平。数据表明TYRO3的siRNA抑制有效抑制通常由TNF和/或IL-1诱导的MMP-13和IL-6mRNA的表达。这些发现通过软骨细胞中MMP-13蛋白质的ELISA测量得到正证实。再次，TYRO3的抑制有效抑制通常由IL-1和/或TNF诱导的MMP-13蛋白质分泌，这表明TYRO3信号可能在调节软骨细胞中分解代谢酶的IL-1和/或TNF诱导中有重要作用。这暗示TYRO3信号在OA发病机理中的重要作用。
实施例5AXL、cMer和OA如上所解释的，TYRO3与两个其他受体酪氨酸激酶Axl和cMer具有相当的序列和结构同源性，并且这3个基因包含受体酪氨酸激酶亚家族。因此，除了TYRO3之外，也预期Mer和Axl可用于本发明的组合物和方法中，例如用于诊断和/或治疗、预防或减轻OA或作为本身可用于诊断和/或治疗OA的化合物的药物靶。
已知至少两个Axl基因的剪接变体，其中一个(在此称为“Axl变体2”或“Axlv2”)缺少一个或多个其他Axl剪接变体中存在的外显子(外显子10)。代表性的Axlv2核酸序列可从GenBank登录号NM_001699获得，在本文以SEQ ID NO30提供。由SEQ ID NO30的Axlv2核酸编码的代表性Axlv2多肽包含可从GenBank登录号NP_001690获得的氨基酸序列并在本文中列于SEQ ID NO31。已知另一个Axl剪接变体，本文称为“Axl变体1”或“Axlv1”。代表性的Axlv1核酸包含本文中列于SEQ ID NO32和GenBank登录号NM_021913中的核苷酸序列。此核酸编码包含GenBank登录号NP_068713(SEQ ID NO33)中所列氨基酸序列的Axlv1多肽。
使用与前述用于TYRO3的相同方法的实验中(见上面实施例)，软骨细胞中Axlv1核酸(内部cDNA文库)增加的表达增加了Agg-1和MMP-13mRNA的表达，分别为约12和15倍。类似地，软骨细胞中Axlv2核酸(内部cDNA文库)增加的表达增加了这些相同OA“标志”基因的表达，即增加Agg-1和MMP-13的表达，分别为约3倍和8倍。
此外，Axl和cMer siRNA(Dharmacon，Lafayette，CO)(根据实施例4使用的方法递送到软骨细胞中)封闭了软骨细胞中IL-1介导的可聚蛋白聚糖-1和MMP-13mRNA的诱导，这表明此受体酪氨酸激酶亚家族的全部3个成员可能在OA发病机理中具有重要作用。
像这样，cMer和AXL(包括变体)可根据本发明的方法和组合物以与TYRO3(和其变体)相同的方式用于本发明的方法和组合物中，因此认为此类用途为本发明的一部分。
序列表<110>C·S·库马尔<120>作用于酪氨酸激酶以诊断和治疗骨关节炎的方法和组合物<130>3491/OM582USO<140>待获得<141>Herewith<160>35<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>3949<212>DNA<213>人<400>1gcggtggcgc gggagcggcc ccggggaccc cgcgctgctg acggcggcga ccgcggccgg 60aggcgggcgc gggtctcgga ggcggtcgcc tcagcaccgc cccacgggcg gccccagccc120ctcccgcagc cctcctccct cccgctccct tcccgccgcc tcctccccgc cctcctccct180cctcgctcgc gggccgggcc cggcatggtg cggcgtcgcc gccgatggcg ctgaggcgga240gcatggggcg gccggggctc ccgccgctgc cgctgccgcc gccaccgcgg ctcgggctgc300tgctggcggc tctggcttct ctgctgctcc cggagtccgc cgccgcaggt ctgaagctca360tgggagcccc ggtgaagctg acagtgtctc aggggcagcc ggtgaagctc aactgcagtg420tggaggggat ggaggagcct gacatccagt gggtgaagga tggggctgtg gtccagaact480tggaccagtt gtacatccca gtcagcgagc agcactggat cggcttcctc agcctgaagt540cagtggagcg ctctgacgcc ggccggtact ggtgccaggt ggaggatggg ggtgaaaccg600agatctccca gccagtgtgg ctcacggtag aaggtgtgcc atttttcaca gtggagccaa660
aagatctggc agtgccaccc aatgcccctt tccaactgtc ttgtgaggct gtgggtcccc720ctgaacctgt taccattgtc tggtggagag gaactacgaa gatcggggga cccgctccct780ctccatctgt tttaaatgta acaggggtga cccagagcac catgttttcc tgtgaagctc840acaacctaaa aggcctggcc tcttctcgca cagccactgt tcaccttcaa gcactgcctg900cagccccctt caacatcacc gtgacaaagc tttccagcag caacgctagt gtggcctgga960tgccaggtgc tgatggccga gctctgctac agtcctgtac agttcaggtg acacaggccc1020caggaggctg ggaagtcctg gctgttgtgg tccctgtgcc cccctttacc tgcctgctcc1080gggacctggt gcctgccacc aactacagcc tcagggtgcg ctgtgccaat gccttggggc1140cctctcccta tgctgactgg gtgccctttc agaccaaggg tctagcccca gccagcgctc1200cccaaaacct ccatgccatc cgcacagatt caggcctcat cttggagtgg gaagaagtga1260tccccgaggc ccctttggaa ggccccctgg gaccctacaa actgtcctgg gttcaagaca1320atggaaccca ggatgagctg acagtggagg ggaccagggc caatttgaca ggctgggatc1380cccaaaagga cctgatcgta cgtgtgtgcg tctccaatgc agttggctgt ggaccctgga1440gtcagccact ggtggtctct tctcatgacc gtgcaggcca gcagggccct cctcacagcc1500gcacatcctg ggtacctgtg gtccttggtg tgctaacggc cctggtgacg gctgctgccc1560tggccctcat cctgcttcga aagagacgga aagagacgcg gtttgggcaa gcctttgaca1620gtgtcatggc ccggggagag ccagccgttc acttccgggc agcccggtcc ttcaatcgag1680aaaggcccga gcgcatcgag gccacattgg acagcttggg catcagcgat gaactaaagg1740aaaaactgga ggatgtgctc atcccagagc agcagttcac cctgggccgg atgttgggca1800aaggagagtt tggttcagtg cgggaggccc agctgaagca agaggatggc tcctttgtga1860aagtggctgt gaagatgctg aaagctgaca tcattgcctc aagcgacatt gaagagttcc1920tcagggaagc agcttgcatg aaggagtttg accatccaca cgtggccaaa cttgttgggg1980
taagcctccg gagcagggct aaaggccgtc tccccatccc catggtcatc ttgcccttca2040tgaagcatgg ggacctgcat gccttcctgc tcgcctcccg gattggggag aaccccttta2100acctacccct ccagaccctg atccggttca tggtggacat tgcctgcggc atggagtacc2160tgagctctcg gaacttcatc caccgagacc tggctgctcg gaattgcatg ctggcagagg2220acatgacagt gtgtgtggct gacttcggac tctcccggaa gatctacagt ggggactact2280atcgtcaagg ctgtgcctcc aaactgcctg tcaagtggct ggccctggag agcctggccg2340acaacctgta tactgtgcag agtgacgtgt gggcgttcgg ggtgaccatg tgggagatca2400tgacacgtgg gcagacgcca tatgctggca tcgaaaacgc tgagatttac aactacctca2460ttggcgggaa ccgcctgaaa cagcctccgg agtgtatgga ggacgtgtat gatctcatgt2520accagtgctg gagtgctgac cccaagcagc gcccgagctt tacttgtctg cgaatggaac2580tggagaacat cttgggccag ctgtctgtgc tatctgccag ccaggacccc ttatacatca2640acatcgagag agctgaggag cccactgcgg gaggcagcct ggagctacct ggcagggatc2700agccctacag tggggctggg gatggcagtg gcatgggggc agtgggtggc actcccagtg2760actgtcggta catactcacc cccggagggc tggctgagca gccagggcag gcagagcacc2820agccagagag tcccctcaat gagacacaga ggcttttgct gctgcagcaa gggctactgc2880cacacagtag ctgttagccc acaggcagag ggcatcgggg ccatttggcc ggctctggtg2940gccactgagc tggctgacta agccccgtct gaccccagcc cagacagcaa ggtgtggagg3000ctcctgtggt agtcctccca agctgtgctg ggaagcccgg actgaccaaa tcacccaatc3060ccagttcttc ctgcaaccac tctgtggcca gcctggcatc agtttaggcc ttggcttgat3120ggaagtgggc cagtcctggt tgtctgaacc caggcagctg gcaggagtgg ggtggttatg3180tttccatggt taccatgggt gtggatggca gtgtggggag ggcaggtcca gctctgtggg3240ccctaccctc ctgctgagct gcccctgctg cttaagtgca tgcattgagc tgcctccagc3300
ctggtggccc agctattacc acacttgggg tttaaatatc caggtgtgcc cctccaagtc3360acaaagagat gtccttgtaa tattcccttt taggtgaggg ttggtaaggg gttggtatct3420caggtctgaa tcttcaccat ctttctgatt ccgcaccctg cctacgccag gagaagttga3480ggggagcatg cttccctgca gctgaccggg tcacacaaag gcatgctgga gtacccagcc3540tatcaggtgc ccctcttcca aaggcagcgt gccgagccag caagaggaag gggtgctgtg3600aggcttgccc aggagcaagt gaggccggag aggagttcag gaacccttct ccatacccac3660aatctgagca cgctaccaaa tctcaaaata tcctaagact aacaaaggca gctgtgtctg3720agcccaaccc ttctaaacgg tgacctttag tgccaacttc ccctctaact ggacagcctc3780ttctgtccca agtctccaga gagaaatcag gcctgatgag ggggaattcc tggaacctgg3840accccagcct tggtggggga gcctctggaa tgcatggggc gggtcctagc tgttagggac3900atttccaagc tgttagttgc tgtttaaaat agaaataaaa ttgaagact 3949<210>2<211>890<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Leu Arg Arg Ser Met Gly Arg Pro Gly Leu Pro Pro Leu Pro1 5 10 15Leu Pro Pro Pro Pro Arg Leu Gly Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ala Ser20 25 30Leu Leu Leu Pro Glu Ser Ala Ala Ala Gly Leu Lys Leu Met Gly Ala35 40 45Pro Val Lys Leu Thr Val Ser Gln Gly Gln Pro Val Lys Leu Asn Cys50 55 60
Ser Val Glu Gly Met Glu Glu Pro Asp Ile Gln Trp Val Lys Asp Gly65 70 75 80Ala Val Val Gln Asn Leu Asp Gln Leu Tyr lle Pro Val Ser Glu Gln85 90 95His Trp Ile Gly Phe Leu Ser Leu Lys Ser Val Glu Arg Ser Asp Ala100 105 110Gly Arg Tyr Trp Cys Gln Val Glu Asp Gly Gly Glu Thr Glu Ile Ser115 120 125Gln Pro Val Trp Leu Thr Val Glu Gly Val Pro Phe Phe Thr Val Glu130 135 140Pro Lys Asp Leu Ala Val Pro Pro Asn Ala Pro Phe Gln Leu Ser Cys145 150 155 160Glu Ala Val Gly Pro Pro Glu Pro Val Thr Ile Val Trp Trp Arg Gly165 170 175Thr Thr Lys Ile Gly Gly Pro Ala Pro Ser Pro Ser Val Leu Asn Val180 185 190Thr Gly Val Thr Gln Ser Thr Met Phe Ser Cys Glu Ala Hi s Asn Leu195 200 205Lys Gly Leu Ala Ser Ser Arg Thr Ala Thr Val Hi s Leu Gln Ala Leu210 215 220Pro Ala Ala Pro Phe Asn Ile Thr Val Thr Lys Leu Ser Ser Ser Asn225 230 235 240
Ala Ser Val Ala Trp Met Pro Gly Ala Asp Gly Arg Ala Leu Leu Gln245 250 255Ser Cys Thr Val Gln Val Thr Gln Ala Pro Gly Gly Trp Glu Val Leu260 265 270Ala Val Val Val Pro Val Pro Pro Phe Thr Cys Leu Leu Arg Asp Leu275 280 285Val Pro Ala Thr Asn Tyr Ser Leu Arg Val Arg Cys Ala Asn Ala Leu290 295 300Gly Pro Ser Pro Tyr Ala Asp Trp Val Pro Phe Gln Thr Lys Gly Leu305 310 315 320Ala Pro Ala Ser Ala Pro Gln Asn Leu His Ala Ile Arg Thr Asp Ser325 330 335Gly Leu Ile Leu Glu Trp Glu Glu Val Ile Pro Glu Ala Pro Leu Glu340 345 350Gly Pro Leu Gly Pro Tyr Lys Leu Ser Trp Val Gln Asp Asn Gly Thr355 360 365Gln Asp Glu Leu Thr Val Glu Gly Thr Arg Ala Asn Leu Thr Gly Trp370 375 380Asp Pro Gln Lys Asp Leu Ile Val Arg Val Cys Val Ser Asn Ala Val385 390 395 400Gly Cys Gly Pro Trp Ser Gln Pro Leu Val Val Ser Ser His Asp Arg405 410 415
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Tyr Pro Gly Val Gln Asn His Glu Met Tyr Asp Tyr Leu Leu His Gly805 810 815His Arg Leu Lys Gln Pro Glu Asp Cys Leu Asp Glu Leu Tyr Glu Ile820 825 830Met Tyr Ser Cys Trp Arg Thr Asp Pro Leu Asp Arg Pro Thr Phe Ser835 840 845Val Leu Arg Leu Gln Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ser Leu Pro Asp Val850 855 860Arg Asn Gln Ala Asp Val Ile Tyr Val Asn Thr Gln Leu Leu Glu Ser865 870 875 880Ser Glu Gly Leu Ala Gln Gly Pro Thr Leu Ala Pro Leu Asp Leu Asn885 890 895Ile Asp Pro Asp Ser Ile Ile Ala Ser Cys Thr Pro Arg Ala Ala Ile900 905 910Ser Val Val Thr Ala Glu Val His Asp Ser Lys Pro His Glu Gly Arg915 920 925Tyr Ile Leu Asn Gly Gly Ser Glu Glu Trp Glu Asp Leu Thr Ser Ala930 935 940Pro Ser Ala Ala Val Thr Ala Glu Lys Asn Ser Val Leu Pro Gly Glu945 950 955 960Arg Leu Val Arg Asn Gly Val Ser Trp Ser His Ser Ser Met Leu Pro965 970 975
Leu Gly Ser Ser Leu Pro Asp Glu Leu Leu Phe Ala Asp Asp Ser Ser980 985 990Glu Gly Ser Glu Val Leu Met99权利要求
1.鉴定用于治疗OA的化合物的方法，其包括a)使测试化合物与反应混合物接触，所述反应混合物包含(i)受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族的多肽成员，和(ii)该多肽的配体，其中反应混合物的条件允许多肽与配体结合形成结合复合体；b)检测在测试化合物存在下反应混合物中形成结合复合体的水平；c)比较在测试化合物存在下反应混合物中形成结合复合体的水平和该测试化合物不存在下反应混合物中形成结合复合体的水平，其中测试化合物存在下形成结合复合体水平的下降表明测试化合物可用于治疗OA。
2.根据权利要求1的方法，其中所述受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族多肽成员选自TYRO3、Axl和cMer。
3.鉴定用于治疗骨关节炎的化合物的方法，其包括a)使测试化合物与反应混合物接触，其中所述的反应混合物包含(i)TYRO3多肽；和(ii)TYRO3配体，其中反应混合物的条件允许TYRO3多肽与TYRO3配体结合形成结合复合体；b)检测在测试化合物存在下反应混合物中形成结合复合体的水平；c)比较在测试化合物存在下反应混合物中形成结合复合体的水平与该测试化合物不存在下反应混合物中形成结合复合体的水平，其中测试化合物存在下形成结合复合体的水平降低表明测试化合物可用于治疗OA。
4.根据权利要求3的方法，其中TYRO3多肽包含SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列。
5.根据权利要求3的方法，其中TYRO3配体选自PROS1和GAS6多肽。
6.根据权利要求5的方法，其中GAS6多肽包含SEQ ID NO3中所列的氨基酸序列。
7.鉴定患有骨关节炎的个体的方法，其包括a)检测来源于个体的生物试样的编码受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族多肽成员的核酸；并且b)比较个体中所述核酸的水平与未患骨关节炎的个体中该核酸的水平，其中来源于个体的所述生物试样中该核酸水平的提高表明个体患有OA。
8.根据权利要求7的方法，其中所述受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族多肽成员选自TYRO3、Axl和cMer。
9.根据权利要求7的方法，其中所述生物试样包括选自软骨细胞、软骨、滑膜液和血清的生物材料。
10.鉴定患有骨关节炎的个体的方法，其包括a)检测来源于个体的生物试样中的TYRO3核酸；并且b)比较个体中TYRO3核酸的水平与未患OA的个体中TYRO3核酸的水平，其中来源于个体的所述生物试样中TYRO3核酸水平的提高表明个体患有OA。
11.根据权利要求10的方法，其中TYRO3核酸编码具有SEQ ID NO2中所列氨基酸序列的多肽。
12.根据权利要求10的方法，其中TYRO3核酸包含SEQ ID NO1中所列的核苷酸序列。
13.根据权利要求10的方法，其中所述生物试样包括选自软骨细胞、软骨、滑膜液和血清的生物材料。
14.鉴定患有骨关节炎的个体的方法，其包括a)在来源于个体的生物试样中检测TYRO3受体酪氨酸激酶亚家族多肽的水平；并且b)比较个体中所述多肽的水平与未患OA的个体中该多肽的水平，其中来源于个体的所述生物试样中该多肽水平的提高表明个体患有OA。
15.根据权利要求14的方法，其中所述受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族多肽选自TYRO3、Axl和cMer。
16.根据权利要求14的方法，其中所述生物试样包括选自软骨细胞、软骨、滑膜液和血清的生物材料。
17.鉴定患有骨关节炎的个体的方法，其包括a)检测来源于个体的生物试样中的TYRO3多肽；并且b)比较个体中TYRO3多肽的水平与未患OA个体中TYRO3多肽的水平，其中来源于个体的所述生物试样中TYRO3多肽水平的提高表明个体患有OA。
18.根据权利要求17的方法，其中TYRO3多肽包含SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列。
19.根据权利要求15的方法，其中所述生物试样包括选自软骨细胞、软骨、滑膜液和血清的生物材料。
20.鉴定患有骨关节炎的个体的方法，其包括a)检测来源于个体的生物试样中编码受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族多肽成员配体的核酸；并且b)比较个体中所述核酸的水平与未患OA的个体中该核酸的水平，其中来源于个体的所述生物试样中该核酸水平的提高表明个体患有OA。
21.根据权利要求20的方法，其中所述受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族多肽成员选自TYRO3、Axl和cMer。
22.根据权利要求20的方法，其中所述生物试样包括选自软骨细胞、软骨、滑膜液和血清的生物材料。
23.鉴定患有骨关节炎的个体的方法，其包括a)检测来源于个体的生物试样中编码TYRO3配体的核酸；并且b)比较个体中所述核酸的水平与未患骨关节炎个体中该核酸的水平，其中来源于个体的所述生物试样中该核酸水平的提高表明个体患有OA。
24.根据权利要求23的方法，其中TYRO3配体选自PROS1和GAS6。
25.根据权利要求23的方法，其中TYRO3配体包含SEQ ID NO3中所列的氨基酸序列。
26.根据权利要求23的方法，其中该编码TYRO3配体的核酸包含SEQ ID NO4中所列的核苷酸序列。
27.根据权利要求23的方法，其中所述生物试样包括选自软骨细胞、软骨、滑膜液和血清的生物材料。
28.鉴定患有OA的个体的方法，其包括a)检测来源于个体的生物试样中受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族成员配体的水平；并且b)比较个体中所述配体的水平与未患有OA的个体中该配体的水平，其中来源于个体的所述生物试样中该配体水平的提高表明个体患有OA。
29.根据权利要求25的方法，其中所述受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族成员选自TYRO3、Axl和cMer。
30.根据权利要求25的方法，其中所述生物试样包括选自软骨细胞、软骨、滑膜液和血清的生物材料。
31.根据权利要求25的方法，其中所述配体选自PROS1和GAS6。
32.根据权利要求25的方法，其中所述配体包含SEQ ID NO3中所列的氨基酸序列。
33.根据权利要求25的方法，其中编码该配体的核酸包含SEQ IDNO4中所列的核苷酸序列。
34.鉴定患有骨关节炎的个体的方法，其包括a)检测来源于个体的生物试样中TYRO3配体的水平；b)比较个体中所述TYRO3配体的水平与未患骨关节炎的个体中该TYRO3配体的水平，其中来源于个体所述生物试样中该TYRO3配体水平的提高表明个体患有OA。
35.根据权利要求34的方法，其中TYRO3配体选自PROS1和GAS6。
36.根据权利要求34的方法，其中TYRO3配体包含SEQ ID NO3中所列的氨基酸序列。
37.根据权利要求34的方法，其中编码该TYRO3配体的核酸包含SEQ ID NO4中所列的核苷酸序列。
38.根据权利要求34的方法，其中所述生物试样包括选自软骨细胞、软骨、滑膜液和血清的生物材料。
全文摘要
本发明公开了包括TYRO3、Axl、cMer的受体酪氨酸激酶亚家族成员和其配体(如GAS6)为发展治疗、预防或减轻OA的新疗法的适当靶点。本发明还涉及治疗和/或减轻OA的方法和因此包含调节剂的药物组合物，其中所述的调节剂对受体酪氨酸此亚家族成员和相关配体的表达和活性有抑制作用。本发明还涉及鉴定对OA具有治疗效用的化合物的方法，这包括鉴定例如能抑制这些多肽活性和/或表达的化合物。
文档编号C12Q1/48GK1774634SQ200480010247
公开日2006年5月17日 申请日期2004年4月16日 优先权日2003年4月18日
发明者S·达乌蒂, C·S·库马尔, B·J·拉塔里奥 申请人:诺瓦提斯公司