专利名称：：利用多瘤病毒和eb病毒序列的啮齿动物表达系统的制作方法
技术领域：
：本发明涉及蛋白质表达系统，特别是哺乳动物蛋白质表达系统。具体地，本发明提供蛋白质生产能力增强的啮齿动物细胞系。本发明也涉及真核克隆和表达载体及相关方法，特别涉及能高水平表达目的蛋白质的DNA载体。本发明允许表达载体在哺乳动物细胞中长期保持游离型。
背景技术：
：整个说明书中现有技术的任何讨论决不应当被认为承认这种现有技术是本领域中广泛已知的或是普通常规知识的一部分。在重组蛋白生产中，宿主细胞的选择非常重要。可获得许多重组蛋白的表达系统，包括细菌、酵母、真菌、昆虫、植物和哺乳动物细胞。每种宿主细胞对重组蛋白表达的适宜性显著不同，并且影响产物形成和所产生的最终蛋白质随后的分离/纯化。表达系统(如细菌)不能产生特定种类的蛋白质，这些蛋白质需要翻译后修饰(如糖基化)才能具有生物活性。此外，为了具有生物活性，许多治疗性蛋白质需要复杂的翻译后修饰如糖基化。文献已经很完备地记录了使用哺乳动物表达系统产生治疗性重组蛋白。哺乳动物细胞具有进行真正的蛋白质折叠和复杂的翻译后修饰的能力，这是许多蛋白质的治疗活性所必需的。同样地，许多宿主细胞系已被管理部门批准用于生产治疗性蛋白质。表达系统(如人细胞系293和PER.C6)已被建议作为生产重组治疗性蛋白质的宿主。这些细胞系是通过用5型腺病毒(ad5)的早期转化区(E1)转化人胚胎肾细胞(293)和人胚胎视网膜细胞(PER.C6)产生的。由于细胞系(如293和PER.C6)表达Ad5E1区，因此它们能互补已通过缺失E1而被削弱的缺陷性Ad5载体的生长。然而，与Ad5转化的细胞相关的调节的重要性是它们能在免疫缺陷的动物(如裸鼠)中形成肿瘤。因此，使用Ad5转化的细胞具有潜在的致癌风险，即将用于重组蛋白的细胞底物的致瘤成分传递到受治疗的受试者中的风险。常规使用中国仓鼠卵巢细胞系生产生物药物蛋白质。许多特性使得CHO细胞成为非常适合作为宿主细胞可在CHO细胞中达到高产物水平；它们提供无传染性或病毒样颗粒的安全的生产系统；它们已被广泛表征；使用无血清培养基，它们能在生物反应器中悬浮生长到高细胞密度；已描述了用于在CHO细胞中扩增基因的表达系统(DHFR、GS和金属硫蛋白(MT)；Page和Sydenham，1991，Baker等，2001以及Bailey等2002)。细胞系CHO-K1已形成产生具有改良特性的多种CHO细胞系衍生物的基础，改良的细胞系如超级CHO细胞系(Pak等1996)。超级CHO细胞来自通过基因工程改造来表达编码转铁蛋白和生长因子(IGF-1)的基因的CHO-K1细胞。多瘤病毒多瘤病毒是包括猿猴病毒40(SV40)和小鼠多瘤病毒的小DNA肿瘤病毒家族。多瘤病毒已作为研究哺乳动物基因表达、DNA复制和肿瘤发生的模型(Griffin，1982)。COS-1细胞系支持含有SV40复制起点的质粒的游离型复制(Gluzman，1981)并通过用编码野生型T抗原的SV40病毒的复制起点缺陷型突变体转化CV1细胞产生(Gluzman，1981)。病毒是宿主特异性的并且能在它们的允许宿主细胞中繁殖。SV40病毒可在猴细胞(CV1)中繁殖。Py是小鼠病毒并能在小鼠和一些啮齿动物中繁殖。多瘤的大T抗原是一种具有酶活性并能与细胞蛋白质相互作用的多功能蛋白质。它能结合DNA并且具有两个核定位信号。它与病毒DNA复制起点上的几个五聚体序列(GAGGC)特异性相互作用。大T抗原也具有DNA解旋酶活性。解旋酶活性对于病毒DNA复制至关重要并需要有功能的ATP酶活性以及结合多瘤病毒DNA的能力。多瘤病毒DNA在感染细胞内的复制需要特异性功能病毒DNA复制起点、大T抗原和一组已知作为允许宿主因子的细胞蛋白质，即DNA复制仅需要的病毒蛋白质是大T抗原。病毒DNA复制不同于细胞DNA复制，因为在S期期间病毒起点可激发多次，而细胞DNA复制被严紧控制，以避免在一个细胞周期中基因组的任何区域被复制超过一次。Heffernan和Dennis在1991年的研究(Heffernan和Dennis，1991)成功地证明了表达病毒大T抗原的CHO细胞中真核表达载体的用途。然而，显示目的蛋白质的瞬时表达仅持续48-72小时。质粒不能在细胞中稳定地保持并且当细胞进行分裂时被迅速降解或者丢失。Gassmann等(Gassmann等1995地在小鼠胚胎干细胞中检查了DNA的游离型复制和稳定保持，以及在美国专利No.2002/0146689中描述了基于多瘤病毒的质粒的用途和染色体外复制对大T抗原表达的依赖。我们已观察到基于Py的表达载体(含有DNA复制的Py起点的质粒)如基于SV40的载体能在细胞内复制多次并且能获得高拷贝数。与在转染后的几天内质粒复制压倒并最终杀死宿主细胞的COS细胞表达系统不同，用含有Py起点的质粒转染的CHO-T细胞不复制到这种程度。推测这是由于CHO细胞对PyDNA复制的半允许性质所致。在该系统中，含有Pyori的质粒DNA在转染的3天内由于降解和/或细胞分裂而丢失并且丧失重组基因的表达。这将瞬时蛋白质生产的最大时间限制到最多3天。游离型载体理论上，基因治疗是将矫正的遗传材料递送到细胞中以减轻疾病的症状或者纠正缺陷基因。基因治疗的最佳载体需要1)高水平和稳定表达目的基因，2)高转染效率，3)不整合到染色体DNA中以避免影响细胞自身的DNA，以及4)没有可能导致继发癌的转化特征。不能获得满足所有这些标准的载体。已证明通过非病毒载体介导的系统的基因转移是一种安全并简单的，但相对低效的基因递送方法。当前可获得的许多系统都利用来自逆转录病毒和腺病毒的病毒载体。已大量研究了使用非整合病毒构建有效的基因递送载体的用途。特别是，已考虑了基于EBV的表达载体。EB病毒获得不影响细胞基因组的高表达水平的一种方法是使用在染色体外复制的游离型质粒载体。其在细胞中长期在染色体外复制的游离型载体，是研究克隆基因的表达和基因治疗的有用工具，例如，EB病毒(EBV)来源的质粒。EB病毒(EBV)是人γ疱疹病毒。游离型复制和核停留都需要的病毒元件是EBV基因的顺式作用复制起点(oriP)和与oriP区相互作用的EBV核抗原1(EBNA-1)。以细胞核中低拷贝数DNA附加体保持含有oriP和EBNA-1序列的质粒并且在灵长动物细胞中每个细胞周期复制一次。EBNA1的染色体结合活性保证在有丝分裂期间分离到子代细胞。基于EBV的载体主要在灵长动物细胞中使用。由于以前认为不可能在动物(如小鼠)以及培养物(如CHO细胞)中测试EBV载体，因此EBV来源的载体不能在包括小鼠和仓鼠的绝大多数啮齿动物细胞中复制构成了基因治疗的严重缺陷。特别是，CHO细胞不支持EBV病毒DNA复制。以前在啮齿动物细胞中使用EBV来源的载体的研究已证明仅一些啮齿动物细胞(C6和L6)能复制含有EBVoriP并编码EBNA-1的质粒(Mizμguchi，H.Hosono，T.，Hayakawa.(2000))，并且仅持续有限的时间(即＜5天)。仅当在表达载体中插入人DNA序列的不明确的大片段(21Kb)时，可能在CHO细胞中进行复制(KrysanP.J.和MicheleCalos.(1993))。由于这种表达载体影响潜在的治疗性产物产生的性质不稳定且不明确，因此这种大质粒构建体不易进行基因转移研究。因此，需要能稳定的游离型复制并保持而不含随机的人DNA大片段的表达载体。已使用游离型载体来增加稳定转染的频率并且在许多细胞类型中获得可靠的转基因表达。然而，已证明以前描述的游离型载体(例如基于EB病毒(EBV)或SV40大T抗原的游离型载体)在宿主细胞范围和长期培养的保持方面都有限制(Piechaczek等(1999)；以及Heffernan和Dennis(1991))。最近，已描述了用于快速生产产量多达20mg/L的大量重组蛋白的大规模瞬时蛋白质生产方法(Durocher等2002；Girard等2002；Meissner等2001；Jordan等1998)。这种大规模的瞬时表达使用转化的人胚胎肾(HEK293)细胞和那些经过改造表达EB病毒(EBV)核抗原1(EBNA-1)的细胞。同样地，需要改进的哺乳动物表达系统，其可用于蛋白质的生产，特别是重组的治疗性蛋白质的生产并且也能用于人基因治疗模型。由于常规使用啮齿动物细胞(例如CHO、BHK、NS0)生产重组蛋白治疗剂，因此具有能在这些细胞中进行质粒复制并保持工作的表达系统是有利的。在可能用于最终生物加工的同一宿主细胞类型中，在产物产生阶段的早期迅速产生重组蛋白的能力显然是有利的。也需要提高转染效率的表达系统，其导致更高的重组蛋白表达。此外，也需要能在哺乳动物细胞中游离型复制和保持长期稳定的游离型的克隆/表达载体。本发明的目的是克服或改进至少一种现有技术的缺点，或者提供有用的备选方案。发明概述根据第一个方面，本发明提供包括啮齿动物细胞的蛋白质表达系统，该啮齿动物细胞包含编码多瘤大T抗原(PyLT)或其功能等效物的基因。根据第二个方面，本发明提供包括啮齿动物细胞和载体的蛋白质表达系统，该载体包含多瘤病毒的DNA复制起点或者其功能等效物，其中所述细胞适于目的蛋白质的表达。根据第三个方面，本发明提供包括啮齿动物细胞的蛋白质表达系统，该啮齿动物细胞包含编码多瘤大T抗原(PyLT)或其功能等效物的基因，和/或编码EBV核抗原1(EBNA-1)或其功能等效物的基因。本领域技术人员很清楚，当提及细胞“包含”一种基因时，该基因可能在细胞的基因组内或包含在载体内。在一个实施方案中，目的蛋白质是治疗性蛋白质。在另一个实施方案中，目的蛋白质是单克隆抗体。在另一个实施方案中，目的蛋白质适于用作疫苗。根据第四方面，本发明提供组成性表达大T抗原蛋白质或其功能等效物的啮齿动物细胞。因此，在第五方面，本发明提供包括啮齿动物细胞的表达系统，其中该啮齿动物细胞包含(a)含有编码目的蛋白质的基因的载体，(b)引起载体DNA复制的手段以及(c)EB病毒家族(EBV)的oriP和EBNA-1基因或其功能等效物。优选表达系统是稳定的游离型复制系统。本领域技术人员很清楚，在本发明申请的上下文中，术语“稳定的”指目的蛋白质的表达超过48小时。优选地，表达目的蛋白质的质粒的复制和保留持续3周以上。优选通过大T抗原或其功能等效物与多瘤病毒的复制起点或其功能等效物的相互作用引起DNA复制。更优选从整合到啮齿动物细胞基因组内的基因表达大T抗原或其功能等效物。不受理论束缚，啮齿动物细胞中大T抗原或其功能等效物的表达可能有助于将DNA转移到啮齿动物的核内。本领域技术人员很清楚在啮齿动物细胞中引起DNA复制的手段可能瞬时地或组成型地在啮齿动物细胞中呈现。本领域技术人员很清楚可以从整合到啮齿动物细胞染色体中的基因中表达EBNA-1基因或其功能等效物，或者其可在啮齿动物细胞内瞬时表达。优选大T抗原或其功能等效物的表达为啮齿动物细胞提供功能益处。这种益处包括(但不限于)转染率增加；编码目的蛋白质基因的表达增强；啮齿动物细胞作为单一细胞悬浮培养物在无蛋白质的培养基中生长的能力；以及细胞对凋亡发作的抗性。根据第六方面，本发明提供在啮齿动物表达系统中使用的表达载体，该表达载体包括一个或多个病毒元件并且包括至少一个病毒DNA复制起点，其中所述元件来自多瘤病毒和/或EB病毒(EBV)。优选地，病毒元件包括多瘤病毒的复制起点(oriPV)和/或EBV的复制起点和/或EBV的核抗原(EBNA-1)。优选地，载体能在啮齿动物细胞中游离型复制并且长期稳定地保持为游离型。根据第七方面，本发明提供生产目的蛋白质的方法，包括在促进所述蛋白质表达的条件下培养啮齿动物细胞，该啮齿动物细胞包括(a)位于载体上的编码目的蛋白质的基因、其引起载体的DNA复制的手段，和(c)来自EB病毒家族(EBV)的一个或多个病毒元件，并回收所述蛋白质。根据第八方面，本发明提供生产重组蛋白的方法，包括在促进所述蛋白质表达的条件下培养CHO-K1细胞并任选地回收所述蛋白质，其中CHO-K1细胞包含编码多瘤大T抗原(PyLT)或其功能等效物的基因和根据本发明的表达载体。根据第九方面，本发明提供根据本发明方法所产生的蛋白质。根据第十方面，本发明提供药物组合物，包括根据本发明方法生产的蛋白质以及可药用载体。根据第十一方面，本发明提供用根据本发明的载体转化的宿主细胞。优选宿主细胞是啮齿动物来源的细胞，包括(但不限于)CHO细胞。根据第十二方面，本发明提供在啮齿动物细胞中提高凋亡抗性的方法，包括在细胞中表达多瘤大T抗原或其功能等效物。根据第十三方面，本发明提供在啮齿动物细胞中保持载体为游离型的方法，包括在所述载体上包含EBV的复制起点或其功能等效物和/或EBV的核抗原(EBNA-1)或其功能等效物。根据第十四方面，本发明提供包括啮齿动物细胞的蛋白质表达系统，该啮齿动物细胞包含编码多瘤大T抗原(PyLT)或其功能等效物的基因，其中啮齿动物细胞不是CHO细胞。本领域技术人员很清楚，本发明也可以包含通常在克隆和表达载体中具有的一个或多个特征。这些组件可包括(但不限于)可选择的标记(例如编码抗生素抗性的基因)、允许很容易地将片段亚克隆到其它载体中的多克隆位点(多接头区)、允许产生所克隆产物的单链拷贝的噬菌体复制起点，以及跨越克隆位点、产生用于鉴定宿主细胞的很容易检测到的表型的基因，所述携带宿主细胞具有插入片段(例如LacZα片段或EGFP)的载体(Sambrook等2001)。在本发明的上下文中，术语“目的蛋白质”包括任何肽或蛋白质。因此，该术语包括(但不限于)胰岛素、α干扰素、乙型肝炎病毒表面抗原、GM-CSF、G-CSF、血液凝集因子VIII、红细胞生成素、链激酶、人生长激素、松弛素、凝乳酶、白细胞介素、肿瘤坏死因子以及卵泡刺激因子。在本发明的上下文中，术语“啮齿动物”包括(但不限于)小鼠、仓鼠、海狸、荷兰猪、大鼠、沙土鼠、水豚、豪猪、灰鼠、花栗鼠、旅鼠、土拨鼠、囊地鼠或松鼠。在本发明的上下文中，术语“功能等效物”包括(但不限于)由于一个或多个核苷酸缺失、插入或突变而与野生型不同的元件，所述缺失、插入或突变不管是单独还是组合，都不会使元件丧失对于本发明对本发明而言的功能。术语“功能等效物”也包括在种系发生上与在本说明书中举例说明的病毒元件相关并因此具有相同功能性的元件，或者在种系发生在与本说明书举例说明的病毒元件无关但与说明书中举例的那些元件执行相同功能的元件。除非上下文明确要求，否则在整个说明书和权利要求中，“包括”等将被解释为包含的意思，与除外或耗尽的意思相反；也就是说，为“包括，但不限于”的意思。附图简述图1在本研究中使用的质粒载体A.pBK-CMV-LT编码Py大T抗原的表达质粒。CMV启动子驱动PyLT的表达。Kan/Neo基因在哺乳动物细胞中赋予G418抗性，在细菌细胞中赋予卡那霉素抗性。B.pGEM-T-PyOri通过使用ClaI限制性末端的Pyori的PCR扩增构建。用TaqDNA聚合酶的末端A的PCR扩增允许将PCR片段一步克隆到pGEM-T-Easy载体中。C.pEBV(A)和pEBYd2EGFP在本研究中将商品载体pCEP4重新命名为pEBV。其编码基因EBNA-1和命名为OriP的EB病毒的DNA复制起点。D.pPyOri和pPyOri-d2EGFP通过将PyOri克隆到之前经消化去除EBNA1和OriP的pEBV载体中而构建。该载体代表CHO-T细胞中游离型复制的阳性对照。E.pEBV-PyOri和pEBV-PyOri-d2EGFP通过将PyOri克隆到pEBV中构建的表达载体。F.pBasic和pBasic-d2EGFP通过缺失EBNA1和OriP，从亲本质粒pEBV构建pBasic。G.pPyOriLT分别从pPyLT-1(ATCC)和pPyA3-1(ATCC)中分离多瘤病毒大T抗原和Py起点并克隆到pNK中，一种编码EGFP受体的专有载体(Bailey等1999)。图2用pBK-CMV-LT转染的CHO细胞中Py大T抗原的免疫荧光检测未转染的CHOK1(A)，用pBK-CMV-LT转染的CHOK1细胞(B)。将细胞在光学显微镜(上方)和在UV下(底部)观察。图3表达大T抗原的CHO-T克隆的频率分布通过对Py大T抗原表达的免疫荧光染色，分析92个克隆。在指定的区域中(8×12平方厘米)记录大T表达的荧光百分率。图4质粒复制的Southern印迹分析将报告质粒(5μgpNK-Ori-EGFP)转染到CHO-T克隆中，将2.5μgpNK-Ori-EGFP和2.5μgpCMV-大T抗原共转染到CHOK1中(瞬时复制的+Ve对照)，将5μgpPoly-M2.6-EGFP转染到CHOK1中(第二个+Ve对照)。转染后48小时，通过Hirt提取法提取低分子量DNA。通过用DpnI和Spel两种酶消化，其后使用p32标记的EGFP探针进行Southern印迹杂交，来测量pNK-Ori-EGFP和pPoly-M2.6-EGFP的甲基化状态作为复制的间接测定。由于质粒含有一个Spel位点，哺乳动物复制的DpnI抗性的pNK-Ori-EGFP和pPoly-M2.6-EGFP质粒似乎是线性质粒，由于质粒含有不只一个DpnI位点，细菌复制的DpnI敏感的pNK-Ori-EGFP和pPoly-M2.6-EGFP质粒似乎是小片段。在上面的Southern印迹中，泳道1为细菌复制的质粒的对照(用DpnI和SpeI消化的pNK-Ori-EGFP质粒)；泳道2-4为以不同浓度上样的哺乳动物复制的质粒的对照(用SpeI消化的pNK-Ori-EGFP质粒，泳道2为25ng，泳道3为50ng以及泳道4为75ng)泳道25为细菌的+Ve对照(用pNK-Ori-EGFP转染的CHOK1)；泳道26为哺乳动物的+Ve对照(用pNK-Ori-EGFP和pCMV大T抗原共转染的CHOK1)；泳道27为哺乳动物的+Ve对照(用pPoly-M2.6-EGFP转染的CHOK1)；泳道28为-Ve对照(CHOK1)。使用光密度测定法、BABS、UNSW、定量复制的DNA带。图5(1)染色体外DNA的Southern印迹分析使用经过改良的Hirt提取法(Hirt1967)分离染色体外的DNA。通过对仅在其识别位点被甲基化时才进行切割的DpnI的抗性检测质粒复制。从大肠杆菌dam+株纯化的DNA是DpnI的底物，而在哺乳动物细胞中进行一轮或多轮DNA复制的质粒DNA则抗DpnI切割。(2)质粒pPyOri-EGFP的复制。表达Py大T抗原的CHO细胞能支持pPyOri-EGFP的复制。如材料和方法中所述，使用甲基化特异性限制酶切消化通过Hirt法提取的DNA来区分未复制的DNA(A)和复制的DNA(B)。图6在存在和缺乏Py大T抗原时EGFP在转染的CHO细胞中的表达。EGFP表达定义为荧光细胞的百分数乘以它们的平均相对荧光单位(RFU)。图7生长动力学CHO-T(A)和CHOXL99(B)在Excell302培养基中的生长动力学。在具有50ml培养物的250ml旋转器中进行批培养。将细胞以3×105细胞/ml接种在Excell302培养基中并且每天进行细胞计数。在该研究中，CHO-T细胞的倍增时间是21.23小时，峰细胞密度是2.85×106细胞/ml。CHOXL99细胞的倍增时间是20.01小时，峰细胞密度是2.75×106细胞/ml。图8构建来用于比较CHO细胞中表达效率的载体。在图1中显示了详细的质粒图。图9A.GFP在CHO-T细胞中的表达。Facs分析显示当用杂合质粒pEBVPyOri-d2EGFP转染时，表达GFP的细胞数量显著高于用pPyOri-d2EGFP、pEBV-d2EGFP或pBasic-d2EGFP转染的CHO-T细胞。B.GFP表达随时间的均值。在转染的CHO-T细胞(表达多瘤病毒大T抗原的CHO细胞)库中，使用pEBVPyOri-d2EGFP表达GFP的细胞的数量增加，而其它库显示数量和表达都降低。图10通过选择研究长期稳定的游离型的保持(表达d2EGFP细胞的百分率)用5μgpEBV-d2EGFP、pPyOri-d2EGFP、pEBV-PyOri-D2EGFP和pBasic-d2EGFP质粒转染CHO-T(A)、CHOXL99(B)和HEK293(C)细胞。转染后48小时用潮霉素(400μg/ml)选择细胞。进行FACS分析以测量表达GFP细胞的百分率。图11在用非复制的和复制的表达载体瞬时转染的CHO-T细胞中重组蛋白的产量。在6孔板中，用所指的表达质粒转染CHO-T细胞(A)和CHOXL99细胞(B)。转染后，以总体积2ml，5×106细胞/ml的密度接种细胞。使用细胞计数器测定细胞计数并且使用台盼蓝法测定存活率。使用ELISA(Roche)测定HGH浓度。图12在用编码hGH的A)pBasic-和B)pPyEBV载体转染的CHO-T细胞的批研究或重组蛋白产量。转染细胞并接种到100ml旋转烧瓶中。使用细胞计数器测定细胞计数并使用台盼蓝法测定存活率。使用hGHELISA试剂盒(Roche)测定产物浓度。正方形总的细胞数；三角形总的存活细胞数；圆形hGH产量。图13在用pPyEBV/PyOri-HGH转染的CHO-T细胞中HGH的产率。A.转染后，在100ml旋转烧瓶中接种总体积50ml、5×105细胞/ml密度的细胞。使用细胞计数器测定细胞计数并使用ELISA(Roche)测定存活率。B.随时间累积的蛋白质浓度。C.通过计算累积的蛋白质浓度的变化除以累积的细胞数量的变化，测定特异性产率。计算批运行期间的特异性产率。测定最大特异性产率。图14在CHO细胞中大T的表达模拟丁酸钠的效应。用载体pNK-d2EGFP转化CHO和CHO-T细胞。PNK载体允许通过添加金属选择性激活由载体编码的目的蛋白质的表达。CHO-T细胞模拟丁酸钠效应，通过激活EGFP基因表达来表达大T抗原。发明描述现在将通过实施例并参考附图的方式描述本发明的优选实施方案。下面的实施例描述了能在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中长期瞬时生产重组蛋白的哺乳动物表达系统的形成。该表达系统包括1)亲本CHO-K1细胞系的具有Py的大T抗原基因(Py)的衍生物和2)由一个或多个用于游离型复制和/或保持质粒稳定的病毒元件构成的DNA表达载体，细胞衍生物中转染了上述表达载体。开发称为CHO-T的表达Py大T抗原的CHO-K1细胞系，用于大规模瞬时生产重组的治疗性蛋白质。CHO-T细胞系的若干优点使其特别适于生产治疗性蛋白质。CHO-T是充分表征的CHO-K1的衍生物，其在无蛋白质的培养基中以单细胞悬液方式生长。由于大T的组成型表达及其引发含有Pyori的质粒DNA复制的能力，因此该细胞系显示转基因表达和蛋白质产量都提高。使用绿色荧光蛋白(GFP)和人生长激素(hGH)作为报告基因以证明转基因的表达。用含有PyDNA复制起点的pPyOri表达载体或者含有EB病毒(EBV)的oriP和EBNA-1蛋白的pEBV表达载体，或者既含有Py起点也含有EBVoriP和EBNA-1的pEBV-PyOri表达载体转染细胞。结果表明pPyOri和pEBV-PyOri载体都能够在CHO-T细胞中游离型复制。在包含杂合载体pEBV/PyOriGFP或pEBV/PyOriHGH的细胞中，基因表达明显比用pPyOriGFP或pPyOriHGH转染的细胞有所延长。使用pEBV/PyOri的基因表达的延长和提高是组合质粒复制、游离型保持和在细胞分裂期间质粒分离的结果。基于Py的表达载体和CHO-T细胞提供用于生产重组蛋白的有效的CHO表达系统。包括表达载体pEBV/PyOri和CHO-T细胞的杂合表达系统在工业应用中对于重组蛋白的大规模瞬时生产特别有用。实施例1材料和方法细胞和培养基在含有10％FBS的DMEMCOONSF12中生长CHO-K1(ATCCCCL61)。使CHO-T细胞适应在无血清培养基(Excell302；JRHBiosciences，Kansas)和无蛋白质的培养基(Excell325；JRHBiosciences，Kansas)中悬浮生长。在Excell302中生长XL99细胞(适于在无血清培养基(NeilKitchen1999)中悬浮生长的悬浮CHO-K1细胞系)。NS0-T使用NS0细胞(非分泌性小鼠骨髓瘤细胞)(ECACC85110503)转染编码多瘤病毒大T抗原的质粒。NS0的电穿孔使用ChuG等1987年描述的适当的方案进行NS0细胞的电穿孔。简言之，将1-1.5×107NS0细胞生长到对数生长中期并使用10μgpBK-CMV-大T抗原质粒在250V以15毫秒方形波脉冲进行电穿孔。转染48小时后将细胞在G418(400μg/ml)中进行选择。NS0的脂质转染根据生产商的说明，使用lipofectamine2000试剂(Invitrogen)进行脂质转染。简言之，在室温下在Optimem培养基中制备DNA和lipofectamine2000的浓度并孵育5分钟。在添加到24孔板内悬浮于500μl中的5×105个细胞前，将DNA和lipofectamine2000混合并一起再孵育20分钟。然后在24或48小时后使用FACS(CytomationMoFlo细胞计数器)分析细胞。转染使用NucleobondAX柱(Macherey-Nagel，Duren，德国)制备转染级的DNA。使用分析型凝胶电泳、限制性酶切消化和分光光度法独立分析DNA的浓度和纯度。如下转染悬浮细胞在6孔板(例如，Iwaki，东京，日本)中进行转染。对数生长中期的细胞用1xPBS(磷酸缓冲盐水137mMNaCl、2.7mMKCl、4.3mMNa2HPO4·7H2O、1.4mMKH2PO4)洗涤一次，然后以0.75×106细胞/ml在Opti-MEM培养基中重悬浮。用5μg质粒和10-15μlLipofectamine2000(LifeTechnology)转染1.5×106细胞。转染后12小时将细胞在2mlExce11302培养基中重悬浮并用所需的选择试剂进行处理。染色体外DNA的分离和Southern印迹杂交将对数生长中期的细胞用1xPBS洗涤一次并以0.93×106细胞/ml在Opti-MEM培养基(LifeTechnologyInc)中重悬浮。然后在6孔板中用5μg(质粒)和10μlLF20000转染2ml重悬浮的培养物。转染6小时后，添加2mlExce11302培养基。转染后24-48小时收获细胞并根据Hirt提取技术(Hirt，1967)分离低分子量DNA。简言之，收获细胞并用1xPBS洗涤，然后在1ml0.6％SDS/0.01MEDTA(pH7.5)中重悬浮。在室温下将这种细胞悬液培养20分钟后，向细胞中添加250μl5MNaCl并轻轻混合。然后将得到的混合物在4℃过夜培养。通过在15,000g离心30分钟收集上清液。将上清液样品首先用酚氯仿抽提两次，然后用氯仿抽提。通过乙醇沉淀分离DNA并在20-30μl的TE缓冲液(pH8)中重悬浮。染色体外DNA的分离和复制分析在转染24、48和72小时后使用改良的Hirt提取法(Hirt1967)分离染色体外的DNA。简言之，细胞用PBS洗涤并与0.6％SDS(w/v)/10mMEDTA溶液孵育20分钟。然后添加NaOH到终浓度为1M，使反应在4℃过夜进行。将样品在Eppendorf离心机中离心20分钟。随后用酚∶氯仿∶异戊醇(两次，SigmaAldrich，St.Louis，MO，USA)抽提和用氯仿(SigmaAldrich)抽提一次，DNA用纯乙醇沉淀，然后在TE(10μl)中重悬浮。在37℃，将用Hirt法提取的DNA用溶于50mMNaCl、10mMTris-HCl和1mM二硫苏藓糖醇的SpeI和DpnI(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA，USA)消化2小时，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳1小时。根据Ausubel，1997的方法进行Southern杂交。简言之，将细胞在脱嘌呤液(0.25MHCl)中浸泡30分钟，在变性液(1.5MNaCl/0.5NNaOH)中浸泡20分钟并中和(2MTris-HCL/2MNaCl)20分钟。然后使用真空印迹装置将DNA转移到20XSSC中的硝酸纤维素膜上。在杂交烤箱中于80℃焙烤前，使膜在室温下干燥30分钟。在添加32P标记的EGFP探针(Clonetech)前，将膜在(5XSSC/5XDenharts/0.5％SDS、100μg/ml鲑精DNA(Invitrogen))中于68℃预杂交6小时。在68℃孵育12小时后，在室温下将膜在50ml2SSC/0.1％/SDS中洗涤一次，在室温下用50ml1XSSC/0.1％SDS洗涤一次以及在68℃用0.1％XSSC/0.1％SDS(w/v)洗涤一次，共20分钟，其后将膜与放射自显影胶片曝光，使用Biorad-525光密度计对DNA定量。载体构建pGEM-T-PyOri使用表1中所示的PyOri-ClaI-AS(反义)和PyOri-ClaI-S(正义)引物，从pPyA3-1(ATCC)中通过PCR扩增548bp的PyDNA复制起点(PyOri)，构建pGEM-T-PyOri。然后将扩增的DNA克隆到线性化的pGEM-TEasy载体(Invitrogen)中。在图1显示pGEM-T-PyOri质粒图。表1用于扩增pPyA3-1质粒中PyOri的引物pBasic通过用ClaI消化pCEP-4(Invitrogen)并将缺乏EBNA-1和OriP的片段再连接，构建pBasic。PpvOri通过分离pGEM-T-PyOri(在GM2163(dam-ve)细菌中生长)中的ClaI片段(第9到541位核苷酸)并将其与使用ClaI(第1位核苷酸)线性化并用小牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化的pBasic质粒(在GM2163(dam-ve)细菌中生长)连接，构建pPyOri。PpyOriLT分别从pPyLT-1(ATCC)和pPyA3-1(ATCC)中分离多瘤病毒大T抗原和Py起点并克隆到编码EGFP报到分子的pNK载体中。pEBV-PvOri通过将pGEM-T-PyOri(在GM2163(dam-ve)细菌中培养)中的ClaI(第9到541位核苷酸)片段与用ClaI(第5939位核苷酸)线性化并用CIAP去磷酸化的pCEP-4质粒(Invitrogen)连接，构建pEBV-PyOri。pEBV-d2EGFP、pPvOri-d2EGFP、pEBV-PvOri-d2EGFP和pBasic-d2EGFP通过从pCMV-d2EGFP(Clonetech，USA)中分离作为KpnI(889位核苷酸)到NotI(1806位核苷酸)片段的编码不稳定的EGFP蛋白d2EFGP的DNA并将其与KpnI(pEBV中第625位核苷酸、pPyOri中第4875位、pEBV-PyOri中第4875位以及在pBasic质粒中第4875位核苷酸)和NotI(在pEBV中第648位核苷酸、在pPyOri中第4898位、在pEBV-PyOri中第4898位以及在pBasic质粒中第4898位核苷酸)消化的pEBV、pPyOri、pEBV-PyOri和pBasic质粒连接，构建pEBV-d2EGFP、pPyOri-d2EGFP、pEBV-PyOri-d2EGFP和pBasic-d2EGFP。pEBV-hGH、pPvOri-hGH、pEBV-PvOri-hGH和pBasic-hGH从pCBhGH(Bailey等2002)中消化编码人生长激素(hGH)的DNA序列并连接到pBasic、pPyOri、pEBV-PyOri以及pEBV的KpnI位点中。流式细胞术分析在安装了Summit3.0软件和以200mW操作的氩离子激光并在光调整模式中调到488nm的CytomationMoFlo细胞计数器(Cytomation，FortCollins，CO)上采集所呈现的所有数据。使用前向角和侧向散射光闸(gating)鉴定存活的总数，而使用前向角和脉冲宽度的散射闸排除双联体。使用525-nm短波通过二色镜分离eGFP荧光。在使用510/23波段通过滤波器的FL4上检测eGFP发射(其最大发射在508nm)。也使用555nm长波通过二色镜将eGFP发射反射到FL1进行比较分析，但是无论使用525nm短波通过或者555nm长波通过二色镜，在平均荧光强度中都没有记录到有显著有关的差异(数据未显示)。有时使用1.3ND滤波器将eGFP荧光强度减少到第4个对数10以下。调整PMT电压以确保与未转染的对照相关的自身荧光在第一个对数10内被描述成高斯分布。将分析维持在不超过每秒600个细胞的事件率，每个样品获得总计20,000个事件。相对于对照比较性评估处理样品的平均荧光数据。免疫荧光染色和大T抗原表达的检测免疫荧光染色前一天，将CHO-T细胞用EDTA/PBS分开，并以3×105细胞/孔接种在含有无菌1/1cm玻璃盖片的经过处理的6孔平板内的组织培养物中。一旦细胞达到≥90％的汇合，将它们用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤一次，并在冰上用1ml2％甲醛/0.1％TritonX100固定30分钟。然后将细胞用PBS冲洗三次并在每次洗涤之间在室温下孵育5分钟。细胞用2ml1xPBS/10％FBS封闭22分钟，随后添加25μlAb-1(Py大T抗原的单克隆抗体，1μg/mlOncogeneResearch产品，SantaCruz)在室温下孵育1小时。如上所述将细胞用PBS洗涤3次。将细胞在室温下与25μl偶联FITC的ANTI-RATIgG(整个分子)(1∶32稀释)(Sigma)在黑暗中孵育1小时。如上所述将细胞洗涤3次。然后将细胞于黑暗中在PBS中孵育，直到在荧光显微镜下观察。HGH测定和蛋白质定量使用ELISA试剂盒(Roche)从条件培养基中测量HGH。实施例2CHO细胞中的游离型复制将表达载体pPyOriLT(图1G)转染到CHO细胞中以证明游离型复制。因此，pPyOriLT含有PyOri并编码PyLT(两种必需的病毒元件)并在许可性CHO细胞因子存在时足以引发质粒DNA复制。监测质粒DNA复制3天。根据如上所述的Hirt提取技术从转染的细胞中纯化低分子量DNA(图6(1))。通过对仅在其识别位点被甲基化时才进行切割的DpnI的抗性检测质粒复制。从大肠杆菌dam+株纯化的DNA(泳道1到4)是DpnI的底物(泳道5)，而在哺乳动物细胞中进行一轮或多轮DNA复制的质粒DNA抗DpnI切割(泳道11-20)。如在图6(2)中所示，在第三天，转染后非复制的DNA(DpnI敏感的)的总量从每个细胞7000个拷贝迅速下降到每个细胞1000个拷贝以下。这些结果表明尽管CHO细胞支持PyOriLT的游离型复制，但是转染后不久质粒DNA的迅速下降将瞬时基因表达的时间限制到3到4天。实施例3(a)CHO-T细胞系的产生从ATCC中获得Py大T抗原的cDNA并克隆到表达载体pBK-CMV(Clonetech)中。使用表达质粒pBK-CMV-LT(图1)转染CHO-K1(ATCC，CCL61)。将细胞在G418(400μg/ml)中选择两周。通过如在图2中所示的免疫荧光染色进一步证实Py大T抗原的表达。使用MoFlo细胞计数器(Dako-Cytomation，FortCollins，Colorado，USA)通过荧光激活细胞分选术分离单个细胞。分离如在图3中所示的几个大T抗原水平有变化的克隆。扩增21个具有不同大T抗原表达水平的克隆并如在图4的Southern印迹中所示测试它们支持含有Pyori的质粒(pNK-Ori-EGFP)的DNA复制的能力。将pNK-Ori-EGFP转染到CHO-T克隆中。通过上述Hirt抽提法提取低分子量DNA。测量pNK-Ori-EGFP的甲基化状态作为复制的间接分析。纯化通过Hirt法提取的DNA并用DpnI和SpeI消化，其后进行Southern印迹杂交。使用含有32P标记的EGFP构成的探针检测质粒DNA。哺乳动物细胞中的复制导致质粒抗核酸内切酶DpnI的消化，而非复制的质粒DNA对DpnI消化敏感并导致大量小片段，其取决于质粒中i位点的数量。结果表明通过抗DpnI消化，证明许多CHO-T克隆(图4；泳道5到24)能支持含有Pyori的DNA的复制。选择克隆P1-C11(图4，泳道11；CHO-T)用于以下部分描述的进一步研究。(b)NS0-T细胞系的产生为了提供易于制备水平的大T抗原(LT)用于之后含有Py-ori质粒的瞬时转染，通过pCMV-LT的稳定整合产生稳定的NS0-T细胞系。在该方法中质粒可能迅速复制到高拷贝数而不浪费时间等待LT表达。使用电穿孔获得稳定整合。简言之，电穿孔三种培养物，它们分别不含DNA(阴性对照)、含有pEGFP-C1质粒(阳性对照)或含有pCMV-LT质粒(pLT)。然后将细胞进行选择(G418)培养以确定是否已稳定整合pLT上携带的新霉素抗性基因。记录三周期间培养物的存活率以确定这个事实。24小时后使用荧光激活细胞分选仪(FACS)获得阴性和阳性对照样本。这用于确定电穿孔步骤后是否任何质粒DNA已成功地进入细胞。阳性对照显示EGFP荧光而阴性对照不显示(数据未显示)。转染后阳性对照、阴性对照和pLT培养物的存活率都立即下降，2天后恢复。4天后阳性培养物的存活率达93％。含有阴性对照和pLT的培养物在前7天相互之间都有类似的曲线。然而阴性对照在第一个两天不象pLT培养物那样降低那么多。第二天后每个培养物的存活率都迅速降低。15天后阴性对照的存活率达0％，而含有pLT的样品在转染后9天存活率下降到2％，转染后21天恢复到88％(数据未显示)。实施例4CHO-T细胞的生长特性悬浮生长使CHO-T细胞系(克隆P1-C11)适于在无血清培养基(Exce11302)和无蛋白质培养基Exce11325中悬浮生长。CHO-T细胞能以高度繁殖的方式悬浮生长，这使得其非常适于大规模生产。哺乳动物细胞中生物药物的生产已从附着培养物转移到悬浮培养物。悬浮培养物操作相对简单并且容易扩大。悬浮细胞能达到每体积培养基中更高的生物量用以提高产率。此外，使用悬浮细胞，可在生物反应器中提供均相条件，其将允许精确监控和控制操作参数(如温度、溶解的氧和pH)。因此这将允许以长时间的持续方式轻而易举地产生并收获更多的产物。该特点优于用附着细胞生产蛋白质。不依赖血清CHO-T细胞可在无蛋白质的合成培养基中培养并生长到高细胞密度。因此，由于在培养物中缺乏人或动物蛋白质，提高了安全性。通过将细胞在使用50ml培养基的250ml旋转烧瓶中培养，进行生长动力学研究。将CHO-T细胞的生长与CHOXL99(也适应悬浮生长的CHO-K1细胞系)进行比较。将细胞以3×105细胞/ml接种到Exce11302培养基中，每天计数细胞共8天或者直到存活率降到50％以下。结果显示于图8中。与峰存活细胞密度为2.75×106细胞/ml、倍增时间为20.01小时的CHOXL99相比，CHO-T细胞的峰存活细胞密度为2.85×106细胞/ml，倍增时间为21.23小时。实施例5含有Pyori的表达载体在CHO-T中的复制哺乳动物细胞内的质粒复制需要下列三个元件1)DNA复制的病毒起点，2)相关的病毒反式作用蛋白质以引发DNA复制，以及3)许可性宿主特异性蛋白质。我们已在表达系统中组合了这些元件，其中该系统由含有Pyori的表达载体、反式作用的病毒蛋白质和大T构成，在允许Py复制的宿主细胞系CHO-K1中组成型表达。将质粒pPyOri-EGFP转染到CHO-T细胞中，通过使用上述甲基化特异性DpnI酶消化法测定经历一轮或多轮DNA复制的质粒DNA的量，对质粒DNA复制监控3天。如在图5中所示，转染后非复制的DNA的总量一直下降，而复制的DNA的总量在第2天增加，但是以后下降(如在图5B中所示)。这些研究表明pPyOri-EGFP在表达Py大T抗原的CHO细胞中复制几次，结果每个细胞中产生高拷贝数，如所示从第1天的500个拷贝增加到第2天的3000个拷贝。图6证明了质粒拷贝数量增加后EGFP表达也增加。类似地，第3天质粒拷贝数量降低后基因表达也降低(图5&6)。转染后不久，质粒DNA降低以及因而重组基因表达也降低将含有Pyori的载体在瞬时表达系统中的使用限制到3-4天。因此，需要扩大瞬时基因表达窗。为了这个目标，我们研发了不仅能在CHO细胞中复制，而且也能以附加体稳定保持质粒的游离型载体，其极大地延长了蛋白质在转染细胞中的瞬时表达时间。选择EB病毒元件(EBNA-1和OriP)以补助基于Pyori的质粒复制。EBV载体通过含有OriP序列的高亲和力的基质附着区锚定到核基质中(Jankelevich等1992；Mattia等1999)。OriP与起点结合蛋白EBNA1的相互作用是EBV载体在灵长动物细胞中复制、保持和分离所必需的(Lupton和Levine1985；Polvino-Bodnar和Schaffer1992；Yates等1984)。基于EBV元件的游离型载体已广泛用于转基因表达(Sclimenti，C.R.，1998)。EBVoriP和EBNA1共同使病毒DNA在细胞中保持稳定的游离型。这两个序列是必需的，并且足以使EBV载体在包括人、猴和狗的多种建立的细胞中保持和复制(SclimentiC.R.，1998)。然而，由于CHO细胞对EBV病毒繁殖的非许可性，因此不知道EBV载体是否能在CHO细胞中复制。设计并构建如在图8中描述的含有Pyori和/或EBV元件的四个质粒。质粒pEBV含有DNA复制的EBV起点(OriP)顺式作用序列并编码EB核抗原1(EBNA1)。质粒pPyOri含有Pyori而无EBV序列。质粒pEBV-PyOri含有OriP、EBV的EBNA1以及Py的ori。质粒pBasic缺乏EBV和Py病毒元件。将报道基因d2EGFP或hGH克隆到在组成型CMV启动子的控制下的所有上述质粒中。详细的质粒图显示于图1中。pPvEBV载体的保留和分离将CHO-T、CHOXL99和人胚胎肾(HEK)293细胞的分别用编码标记蛋白EGFP的单一质粒构建体转染并在含有浓度为400μg/ml的潮霉素的培养基中选择。转染后通过流式细胞术分析培养物以确定表达GFP的细胞的百分率(图9A)和相对的平均荧光(RFU)(图9B)。CHO-T细胞显示当用pEBV-PyOri-d2EGFP转染时，表达GFP的细胞的百分率整体增加(图10A)。图10A显示当用pEBV-PyOri-d2EGFP转染时，转染的CHO-T细胞库经历表达EGFP细胞的百分率增加，在11到15天之间效果最显著。然而，用pEBV-d2EGFP、pPyOri-d2EGFP或pBasic-d2EGFP转染的CHO-T细胞显示表达GFP的细胞不随着时间变化而增加(图10A)。相反，转染的CHOXL99(图10B)和转染的HEK(图10C)不显示表达GFP的细胞增加(除了最初pEBV-PyOri-d2EGFP在CHOXL99细胞中增加)。这些结果表明含有pEBV-PyOri-d2EGFP的CHO-T细胞的数量开始增加，推测这是由于质粒复制(大T抗原引发从Pyori的复制)和质粒的保持及分离(EBNA-1和OriP的相互作用)(Lupton和Levine，1985)。其它质粒构建体中没有观察到这种情况。尽管pPyOri-d2EGFP能在CHO-T细胞中游离型复制，但是随着时间的变化荧光细胞的数量降低，可能是由于通过降解和细胞分裂丧失了质粒DNA(图10C和10E)。不支持含有PyOri构建体的CHOXL99细胞(由于缺乏大T抗原)展示当用pEBV-PyOri-d2EGFP转染并在潮霉素中选择8天时荧光细胞增加，但是然后便降低(图10B)。直到这时还明白这种观测结果的原因。HEK293细胞展示高转染率(图10C)。然而，对于所有测试的构建体来说，荧光细胞的数量都迅速下降。该研究不能证实pEBV-d2EGFP和pEBV-PyOri-d2EGFP在HEK293细胞中复制，尽管由于EBNA-1和OriP的相互作用以及在许可性HEK细胞系中存在宿主特异性因子，而预计这些质粒能在HEK293细胞中进行DNA复制。实施例6使用CHO-T细胞和CHOXL99细胞在瞬时转染中产生hGH在用编码人生长激素基因(hGH)的四种表达载体中的每一种转染的CHO-T和CHOXL99细胞中测定蛋白质产生。如上所述转染细胞，并以3×105细胞/ml的密度接种到6孔微量滴定板中。将细胞培养多达8天而不添加新鲜培养基。每天记录细胞数量、细胞存活率和HGH产率。如在图11中所示，对于每组转染，转染的细胞都达到大约3.5-4×106细胞/ml的峰细胞密度。用不能在CHO-T细胞中复制的载体(pBasic-hGH、pEBV-hGH和CHOXL99细胞中的所有载体)转染的细胞的蛋白质产量大约为1μg/mlhGH或更少，而在用pPyOri-hGH转染的CHO-T细胞中产量稍微高些。相反，含有表达载体pEBV-PyOri-hGH的CHO-T细胞其蛋白质产量超过6μg/ml。这些结果表明高水平的瞬时蛋白质产生可能是由于质粒复制和分离导致拷贝数量增加所致。尽管质粒pPyOri-hGH能在CHO-T细胞中复制，但是这些培养物导致终产物的产量仅2mg/L。这些数据表明产物浓度的差异不是仅简单地由于质粒复制所致。转染的CHO-T细胞和CHO细胞两者的总的和存活的细胞密度相似，表明游离型复制对这些细胞的生长没有不利影响。hGH的规模化瞬时生产已出现用于快速生产毫克量重组蛋白的大规模转染哺乳动物细胞(Jordan等1998；Schlaegar等1999；Wurm和Bernard，1999；Durocher等2002)。测试本发明的表达系统(CHO-T细胞系和DNA表达载体pEBV-PyOri)用于hGH的大规模蛋白质生产。用能复制的表达载体pPyEBV-hGH或不能复制的载体pBasic-hGH转染细胞。以5×105细胞/ml的浓度接种细胞并以100ml的总体积在旋转培养烧瓶中培养。如在图12中所示，两种培养物都达到相似的最大存活细胞数，存活率一直保持在总细胞数量的90％以上直到接种4天后，随后存活率迅速下降，推测是由于营养耗尽。在Basic-hGH(A)和pPyEBV-hGH(B)的转染子中产物产量分别是10mg/L和30mg/L。在用pEBV-OriPy-hGH转染的CHO-T细胞中产率增加是由于质粒复制和分离。在随后的半连续批试培养中，使用培养基更换策略(每48小时更换50％)以扩大培养物的存活率。图13显示从在用pEBV-OriPy-hGH瞬时转染的CHO-T细胞获得的生长谱和产率，作为接种后培养基置换饲养策略的结果。尽管所达到的最大存活细胞密度类似于在以前的批研究中所获得的那些最大存活细胞密度，但是饲养策略允许长期提高细胞存活率而不经历急剧下降。使用这种策略，维持了细胞存活率并使累积的蛋白质产量达到75mg/L的浓度，计算的最大的特异性产率为7.8pg/细胞/天。这种饲养策略推定允许连续的细胞分裂和因此的质粒复制。因此，质粒复制、保持和分离共同导致重组基因表达能力增加以及产物产量提高。实施例7大T抗原可抑制凋亡的开始如在图7中所示，CHO-T和CHOXL99细胞存活率的比较显示CHO-T细胞的细胞存活率超过亲本细胞系XL99的存活率。表达大T抗原的CHO细胞也可能显示抗凋亡的有益效果。真核细胞培养已变成十亿美元的工业，在几十年的时间生产了有重要商业价值的产品。然而，真核细胞比细菌更脆弱，并且由于程序化细胞死亡或凋亡，与环境显著相关的大规模培养常常导致显著水平的细胞死亡。在典型的生物反应器结构中，凋亡最常见的原因之一是细胞培养基中缺乏营养物或特异性存活因子。已进行了许多研究以确定可提高在商业相关的生物技术方法中使用的细胞系的存活率和产率的营养策略。通过延长细胞的存活，可提高有价值的蛋白质(如单克隆抗体)的产量，因为蛋白质生产主要是存活细胞群的功能。凋亡干预的机理类似所描述的E1B19kDa蛋白的机理。已证实多瘤病毒LT可克服p53诱导的导致程序化细胞死亡或凋亡的生长停滞(Rodier等，(2000))。其通过结合并使Rb蛋白失活来实现。实施例8丁酸钠比较表达大T抗原的CHO细胞提高了基因表达。不受理论的束缚，认为由于表达大T的CHO细胞模拟丁酸钠的基因活化效应，因此类似的机理可能是原因。丁酸钠是组蛋白脱酰酶(HDAC)抑制剂，推定其通过灭活细胞成视网膜细胞瘤蛋白Rb而增加基因表达(Buquet-Fagot等(1996)，Luo等，(1998)，以及Struhl(1998))。常常在生产过程中使用丁酸钠以增加重组基因表达和蛋白质生产率。然而，添加丁酸钠也导致细胞生长停滞以及凋亡的开始；因此，仅在生产过程的最后阶段添加。CHO-T细胞中大T抗原的组成型表达模拟丁酸钠的效应以增加基因表达而不导致生长停滞；因而可在整个生产过程中使用以始终如一地产生高特异性的生产率(图14)。在CHO-T细胞中提高转染率当用携带多瘤病毒ori序列的质粒转染时，CHO-T细胞(稳定表达多瘤病毒大T抗原PyLT的CHO-K1细胞)提供增强转基因表达的机制。不希望受理论束缚，认为由于在PyLT上存在核定位信号(NLSs)，与CHO相比提高了CHO-T细胞的转染率。已知NLS通过它们与核输入机构的相互作用，参与外源蛋白质有效转运到核内(Nagasaki等(2003)，Dean.(1997))。已证明质粒DNA-NLS肽缀合物可增加质粒DNA的表达效率。含有多瘤ori序列的质粒DNA含有PyLT结合的许多PyLT结合位点。讨论本工作描述了在CHO细胞中不仅能进行游离型复制而且能保留附加体的哺乳动物表达系统。该表达系统由载体pEBV-OriPy和CHO-T细胞构成，并被设计成用于重组蛋白的大规模瞬时生产，所述重组蛋白用于早期产物产生目的。目前，使用瞬时表达系统规模生产重组蛋白的最成功的实例已使用适应悬浮的转化的人胚胎肾HEK293(EBNA)宿主细胞，其经过改造来表达EBNA-1。与含有OriP复制起点的质粒载体组合，本系统能够使游离的质粒DNA保持在核内并进行自主复制(Langle-Rouault等1998；Sclimenti和Calos1998；VanCraenenbroeck等2000)。已在批式生产方法中使用HEK293(EBNA)细胞用于从瞬时转染库中获得各种重组蛋白，产量达20mgL-1(Durocher等2002；Girard等2002；Meissner等2001)。一直没有利用至少与HEK293(EBNA)系统同样有效的瞬时表达系统在CHO细胞中大规模瞬时生产。众所周知不同的宿主细胞类型赋予不同的翻译后修饰，其可能显著影响治疗性重组蛋白的性质。由HEK293和CHO细胞所产生的相同的重组蛋白可能在体外具有不同的生物学活性(Haack等1999)。例如，已知HEK293细胞在N-聚糖加工方面与CHO细胞不同(VanCraenenbroeck等2000；Yates等1984)。在将可能用于最终生物加工的同一宿主细胞类型中，在产物筛选/产生的早期阶段瞬时产生重组蛋白的能力显然是有利的。基于EB的载体不能在CHO细胞自主复制。在本研究中，我们已经证明如果通过PyOri和PyLT的相互作用进行复制，那么可极大地提高瞬时基因表达。与PyLT相互作用的啮齿动物多瘤病毒DNA复制起点导致在CHO细胞中染色体外的质粒复制。通过EBNA-1和OriP的相互作用确保转染的DNA保持在核中并分离到子代细胞中。多瘤病毒和EBV序列两者的组合导致在转染的细胞内基因拷贝数量增加并维持CHO细胞中的基因表达和蛋白质生产。我们已经展示这里所描述的表达系统在转染10天内可产生多达75g/L的重组蛋白。结论稳定复制并长期在细胞内保留的染色体外的载体是研究基因表达、DNA复制、修复、重组以及其它细胞加工的有用工具，对于基因治疗具有潜在的重要性。以前一直不能将这种载体用于啮齿动物细胞，即使这些细胞是在理解哺乳动物系统的生物学中常用的细胞。游离载体有若干优点首先，插入的目的基因不被干扰或者受调节限制，而这常常在整合到细胞DNA的过程中发生；其次，插入的异源基因的存在不导致细胞自身重要区域的重排或中断；第三，游离载体在细胞核中以多个拷贝持续存在，无论何时提供必需的病毒反式作用因子都导致目的基因的扩增；最后，使用游离载体常常导致比使用染色体整合的质粒有更高的转染效率。哺乳动物细胞中基于pEBVPyOri载体诱导的长期复制和增强的转基因表达是快速生产足够用于结构和功能分析以及高通量筛选的重组蛋白的有用工具。结合基因转移机制(如阳离子脂质)，本表达系统提供用于基因治疗和用于基因转移实验的实验模型。尽管参考具体的实施例已描述了本发明，但是本领域技术人员将会意识到本发明可包括许多与这里所描述的本发明的一般原则和精神一致的其它形式。参考文献Bailey，C.G.，Baig，M.，Gray，P.P.和Sunstrom，N.A.(1999)Arapidselection/amplificationprocedureforhigh-levelexpressionofrecombinantproteininametal-amplifiablemammalianexpressionsystem.SO-BiotechnologyTechniques.13(9).615-619.Bailey，C.G.，Tait，A.S.和Sunstrom，N.A.(2002)High-throμghputclonalselectionofrecombinantCHOcellsusingadominantselectableandamplifiablemetallothionein-GFPfusionprotein.Biotechnology&Bioengineering80，670-6.Baker，K.N.，Rendall，M.H.，Hills，A.E.，Hoare，M.，Freedman，R.B.和James，D.C.(2001)MetaboliccontrolofrecombinantproteinN-glycanprocessinginNS0andCHOcells.Biotechnology&Bioengineering.73，188-202.Buquet-Fagot，C.，Lallemand，F.，Charollais，R.H.和Mester，J.(1996)Sodiumbutyrateinhibitsthephosphorylationoftheretinoblastomageneprodnctinmousefibroblastsbyatranscription-dependentmechanism.JournalofCellularPhysiology.166，631-6.Chu，GHayakawa，H和Berg，P1987.ElectroporationfortheefficienttransfectionofmammaliancellswithDNA.Nucl.AcidsTes151311-1326.Cole，C.N.(1996)PolyomavirinaeThevirusesandtheirreplication.Lippincott-RavenPhiladelphia.Dean，D.A.(1997)ImportofplasmidDNAintothenucleusissequencespecific.ExperimentalCellResearch.230，293-302.Durocher，Y.，Perret，S.，Kamen，A.(2002).High-levelandhigh-throμghputrecombinantproteinproductionbytransienttransfectionofsuspension-growinghuman293-EBNA-1cells.NucleicAidsResearch.30(2)E9.；1Gahn，T.A.和Schildkraut，C.L.(1989)TheEpstein-Barrvirusoriginofplasmidreplication，oriP，containsboththeinitiationandterminationsitesofDNAreplication.Cell58，527-35.Gassmann，M.，Dohoho，G.hBerg，P.(1995)Maintenanceofanextrachromosomalplasmidvectorinmouseembryonicstemcells.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica92，1292-6.Girard，P.M.D.，Baumgartner，G.，Bourgeois，M.，Jordan，M.，Jacko，B.，和Wurm，F.M.(2002)100Liter-transienttransfection.Cytotechnology3815-22.Gluzman，Y.(1981)SV40-transformedsimiancellssupportthereplicationofearlySV40mutants.Cell.23，175-82.Griffin，B.E.(1982)StructureandgenomicorganizationofSW0andpolyomavirus.ColdspringharborlaboratoryNewyork.Haack，A.，Schmitt，C.，Poller，W.，Oldenburg，J.，Hanfland，PI，Brackmann，H.H.，和Schwaab，R.(1999)AnalysisofexpressionkineticsandactivityofanewB-domaintruncatedandfμll-lengthFVIIIproteininthreedifferentcelllines.AnnalsofHematology78(3)111-116.Hefiernan，M.和Dennis，J.W.(1991)PolyomaandhamsterpapovaviruslargeTantigen-mediatedreplicationofexpressionshuttlevectorsinChinesehamsterovarycells.NucleicAcidsResearch.19，85-92.Hirt，B.(1967)SelectiveextractionofpolyomaDNAfrominfectedmousecellcμltures.JournalofMolecμlarBiology.26，365-9.Jankelevich，S.，Kolman，J.L.，Bodnar，J.W.和Miller，G.，(1992)AnuclearmatrixattachmentregionorganizestheEpstein-BarrviralplasmidinRajicellsintoasingleDNAdomain.EMBOJournal.11(3)1165-76Kiefi，E.(1996)Epstein-BarrVirusanditsReplication.Lippincott-RavenPhiladelphia.Kitchen，N.(1998)AdaptationofCHO-K1tosuspensiongrowth.Krysan，P.J.和Calos，M.P.(1993)Epstein-Barrvirus-basedvectorsthatreplicateinrodentcells.Gene.136，137-43.Langle-Rouaμlt，F.，Patzel，V.Benavente，A.，Taillez，M.，Silvestre，N.，Bompard，A.，Sczakiel，G.，Jacobs，E.和Rittner，K.(1998)Upto100-foldincreaseofapparentgeneexpressioninthepresenceofEpstein-BarrvirusoriPsequen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高啮齿动物细胞凋亡抗性的方法，包括在细胞中表达多瘤大T抗原或其功能等效物。35.权利要求34的方法，其中多瘤大T抗原由啮齿动物细胞组成性表达。36.权利要求34的方法，其中多瘤大T抗原由啮齿动物细胞瞬时表达。37.保持载体在啮齿动物细胞中为游离型形似的方法，其包括在所述载体中含有EBV的复制起点和/或EBV的核抗原1——EBNA-1或其功能等效物。38.包含啮齿动物细胞的蛋白质表达系统，该啮齿动物细胞包含编码多瘤大T抗原(PyLT)或其功能等效物的基因，其中该啮齿动物细胞不是CHO细胞。全文摘要本发明涉及蛋白质表达系统，特别是涉及利用多瘤病毒和EB病毒元件的啮齿动物细胞表达系统。本发明利用多瘤病毒的大T抗原和复制起点以及EBV的EBV核抗原1(EBNA－1)和EBV复制起点。本发明提供蛋白质生产能力提高的啮齿动物细胞系。本发明也涉及真核细胞克隆和表达载体以及相关的方法，特别是涉及能高水平表达目的蛋白质的DNA载体。本发明允许表达载体在哺乳动物细胞中长期保持为游离型。本发明也涉及提高啮齿动物细胞凋亡抗性的方法，其包括表达多瘤大T抗原。文档编号C12N15/85GK1910287SQ200480032915公开日2007年2月7日申请日期2004年9月9日优先权日2003年9月9日发明者N-A·松斯特伦,R·库纳普拉朱申请人:艾塞特生物技术有限公司