专利名称：使用固定化转化酶从甘蔗汁中生产转化糖浆的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用固定化转化酶将甘蔗汁或其浓缩物转化为转化(葡萄糖-果糖)糖浆的方法。
背景技术：
转化糖浆由于其甜度和液体形式而广泛用于食品业的不同环节，如软饮料和烘焙业。由于糖浆提供的加工优势而使糖浆相对于结晶糖是优选的。由于转化糖浆的甜度和以液体形式存在及与42和55(数字表示果糖含量占总糖含量的重量百分比)果糖玉米糖浆的相似性，转化糖浆在软饮料生产中是高度需求的。目前，占世界范围生产的总糖量的60-62％的精制糖来自甘蔗及其它非甘蔗糖源。每年有1920万公顷甘蔗及其它非甘蔗糖源被种植，产生平均14200万吨的结晶糖。在2002年，墨西哥是世界上第六大生产国[FAO 2003]，原糖产量为大约520万吨。然而，最近由于葡萄糖和高果糖玉米糖浆以及其它非甘蔗糖源的海外厂商的价格竞争，制糖业处于财政金融压力之下。因此，需要揭示更有效的方法以精制甘蔗汁及生产转化糖浆，这是在商业和战略上均有吸引力的产物。另外，对现有的甘蔗榨汁设备进行改进和修改对有效生产转化糖浆而不消除设备生产蔗糖的能力将是有益的。
在过去的几十年间，食品和生物技术业在多种方法中越来越多地使用固定化酶。固定化酶技术的主要优势是由于生物催化剂的回收和再应用能力而使得生产成本较低及生产能力得以改良，这尤其适于高产量连续生产。另外，固定化酶更稳定，并且产物由于酶的作用而可以基本上没有痕量杂质，这使得易于纯化所得产物(Messing 1975，Rosevear 1984)。
固定化酶的一个缺点是由于底物杂质所致的酶失活而导致其生产寿命可能降低。特别是甘蔗原汁含有大量转化酶抑制剂如蛋白质及其它可溶及不可溶的含氮化合物，酚类，黄酮类化合物，花色素苷，蜡和矿物质(Clarke and Godshall 1988，Donovan 1993)。
在常规的甘蔗糖精制方法中，甘蔗原汁通常是经石灰处理，除去气泡并澄清(通常通过沉降除去悬浮的固体)，将所得半精制的甘蔗汁或熔化液通过澄清纯化(通过加入石灰和二氧化碳而碳酸化或者通过加入石灰和磷酸而磷酸化)及脱色(Clarke and Godshall 1988，Donovan1993)。然而，这种常规的处理对于使用固定化转化酶的转化步骤是不充分的制品。在转化之前增加进一步精制的步骤使得这种方法的经济学不可取甚至被禁止。预先对底物充分纯化对于保证更有效地使用固定化转化酶反应器是重要的。一种方法(Donovan et al.，美国专利No.6,406,548；Monclin 1995美国专利No.5,468,300)提出通过超滤、超速离心和纳米过滤对含有蔗糖的甘蔗汁进行过滤。所得甘蔗汁可用于蒸发或结晶操作中，产生白色结晶糖。Monclin的美国专利No.5,468,300描述了一种从甘蔗中生产糖的方法，不使用常规的精制方法而是使用超速离心或超滤法及通过吸附除去脱色剂(discolorant)。另外，Monclin应用了粘性改良剂。南非公布的专利申请No.ZA200107964也提出使用微量过滤、超滤和阴离子交换作为精制甘蔗汁的步骤或者在其结晶为蔗糖之前浓缩。但是这些参考文献无一提出通过使用固定化转化酶反应器将由此精制的甘蔗汁转化为转化糖浆。
具有固定化转化酶的酶反应器能生产转化糖溶液。转化酶(β-D-呋喃果糖苷酶果糖水解酶EC 3.2.2.26)将蔗糖水解为果糖和葡萄糖。蔗糖也可以通过酸水解而转化为葡萄糖和果糖。从蔗糖中生产葡萄糖-果糖溶液的工业规模的方法通常使用酸水解，这种方法由于仅可以成批或半连续方法中实践而因此是昂贵的。另外，在pH2-3进行的酸水解产生含有糖醛及其它不需要的有色化合物的低质量的转化糖浆。先前还未报道过在连续方法特别是从甘蔗原汁中开始的方法中使用精制和蔗糖转化方法，并适合工业规模应用以生产转化糖浆。
已经描述了制备固定化酶的许多方法及为了其它目的应用这些方法，如Nystrom的美国专利No.3,935,068；Long的美国专利No.3,935,069；Amotz等的美国专利No.3,980,521；Monsan的美国专利No.4,405,715；Morimoto等的美国专利No.4,543,330；Sutthoff的美国专利No.4,110,164；Leuba等的美国专利No.4,918,016；Harder等的美国专利Nos.5,314,814和5,405,764；及Kasumi等(1977)和Tsumura等(1978)所述的方法和应用。Messing(1975)和Rosevear(1984)报道了与在溶液中使用的酶相对比，固定化酶的催化活性维持较长时间。但是再一次，这些参考文献无一提出调整这些技术以适于从甘蔗汁中生产转化糖浆的方法，更无一在工业规模上进行实践。
Martinez在美国专利No.6,013,491中描述了制备并使用附着于纤维状纤维素支持物的酵母将蔗糖转化为葡萄糖和果糖的方法，Ramos Lazcano在美国专利No.5,270,177中描述了使用重组酵母株从蔗糖中生产葡萄糖-果糖糖浆的方法。当柱用化学化合物处理时，一些支持系统使得转化酶活性可以再生(Torres et al.2003)。
发明概述本发明的一个目的是提供从甘蔗原汁中生产转化(葡萄糖-果糖)糖浆的新方法。本发明的一个更特殊的目的是提供了从甘蔗原汁中生产转化糖浆的连续方法，这种方法可以大规模经济地实施。
首先优选对不需要现有常规处理(如一或多种石灰化，除去气泡及通过碳酸化或磷酸化或沉降而澄清)的甘蔗原汁进行精制，以除去可以妨碍所述酶或者降低含有固定化酶床的反应器的性能和效力的固体以及可溶物质。
这些纯化步骤在所有连续单元操作(continuous unit operation)中均可优选组合使用(i)至少两个过滤步骤和(ii)阴离子交换而进行。所述汁然后在含有固定化转化酶床的柱中可以经生物酶化转化为转化糖浆。过滤步骤可包括粗略过滤(例如颗粒过滤)和精细过滤(例如微量过滤)组合，或者微量过滤(粗略)和超滤(精细)组合，或者所有三种过滤组合，或者其中一或两种过滤组合另一种过滤步骤。唯一的限制是应首先使用粗略过滤器，并且过滤步骤不应使用非常精细的过滤器以至于滤出作为终产物中希望的组成成分或组成成分前体的糖分子(如果糖或葡萄糖或蔗糖)。因此，过滤步骤不应滤出分子量为400或更低(相应于大小为0.003μm)的物质。优选地，所述两阶段过滤步骤应保留分子量为4000或者甚至更高例如为10,000kDa的物质，因此可以使用较低严格性的膜技术和较低花费的过滤系统。尤其当不应用超滤时，优选应进行巴氏灭菌步骤。巴氏灭菌步骤可任选甚至当应用超滤时也进行。巴氏灭菌步骤是否需要也依赖于汁提取和完成两阶段过滤步骤之间的时间延迟。巴氏灭菌优选与浓缩组合应用。
精制的甘蔗汁在进入酶转化阶段之前被部分浓缩(优选直至约50-55°白利(Brix))对于本方法是有益的。这意味着浓缩步骤在即将进行酶转化之前进行，或者在该方法的较早期进行，例如与阴离子交换步骤同时进行，或者在两个这种步骤之间进行(例如浓缩阴离子交换步骤的输出物的所有或部分回流部分)，或者在阴离子交换之前(在所有过滤步骤的最后)或者在完成过滤之前进行(在前一个和后一个过滤步骤之间)。浓缩步骤可以与巴氏灭菌步骤有益地组合进行。
进一步优选对部分浓缩的(或未浓缩的)过滤的甘蔗汁在酶转化步骤之前再进行另一次阴离子交换纯化步骤，或者对精制的甘蔗汁的回流部分在再进行阴离子交换步骤之前进行浓缩(或进一步浓缩)。
本发明的起始物优选是在压榨甘蔗之后获得的原(即新鲜提取的未加工的)甘蔗汁。优选在全部连续程序中使用固定化转化酶将甘蔗原汁转化为转化糖浆。在进行转化之前，将所述甘蔗汁进行精制以除去固体和抑制或失活或阻碍生物酶转化步骤性能的物质(可溶和不可溶的物质)。便利地，第一固体杂质级分可以在至少两个阶段中通过过滤程序如颗粒过滤或微量过滤而除去。第二固体杂质级分和第一可溶杂质级分可以通过第二种过滤技术如微量过滤(或超滤)而除去。最优选地，微量过滤和超滤均可以应用，事实上在这个顺序中，任选进一步组合首先进行普通的颗粒过滤步骤。之后，可以使用充填有阴离子交换树脂的柱除去另外的可溶杂质。
在一个典型优选实施方案中，从甘蔗中提取后甘蔗汁的糖含量为15-23°白利。甘蔗提取的92-96％的糖含量是蔗糖。反过来，糖占据甘蔗汁固体含量的75-92％。将甘蔗汁至少一次经过装备了0.2μm膜的微量过滤单元和装备了分子量截断值为10000道尔顿的膜的超滤单元。微量过滤和超滤步骤还除去了许多微生物，剩下微生物负载(load)减少的汁。根据除去杂质同时使糖的损失最小的能力来选择这些纯化步骤。将所得超滤的(半纯化的)甘蔗汁至少一次经过充填有阴离子交换树脂的柱，所述阴离子交换树脂对酚和含氮杂质具有强亲和性，如Diaion WA 30(Sigma Aldrich St Louis Missouri)树脂。选择这些纯化步骤以除去杂质而不是糖。
在另一个优选实施方案中，将甘蔗原汁首先使用通过颗粒不超过250μm或者甚至100mesh的颗粒过滤器(筛(sieve))进行过滤以除去那些固体颗粒。(为此可以使用HONIRON(Jeanerette，Louisiana)Self Cleaning Rotary Screen)。优选将这个阶段形成的汁进行巴氏灭菌，优选同时进行部分浓缩至例如40-50°白利，然后通过至少一次较细滤器(finer filter)优选微过滤膜设备进行精细过滤。将经过微量过滤形成的汁进行阴离子交换。这个实施方案的优点是相对昂贵的超滤步骤用相对便宜的、优选颗粒过滤组合巴氏灭菌的系列步骤代替，后者降低了微生物负载，因为(与超滤不同)普通过滤不能除去细菌或其它微生物。
在这点上，如果浓缩步骤已经较早进行，则对精制的甘蔗汁可以部分或进一步浓缩(直至大约50-55°白利)。最终转化糖浆产物应为68°白利或更高(典型直至大约70°)，以阻碍微生物产生及降低运输成本。可以将过滤步骤之后优选经过一次阴离子交换柱后的甘蔗汁浓缩直至70°白利(优选大约50-55°白利)，使用常规蒸发器如甘蔗或糖浆行业通常使用的蒸发器进行浓缩，而仍然可以通过阴离子交换柱纯化。经处理的甘蔗汁在经过充填了固定化转化酶床反应器之前可优选进一步精制(例如通过一或多个额外的阴离子交换柱精制)。在蒸发期间，所有杂质均被浓缩，如果希望，浓缩物可以有利地经过相同或不同的阴离子树脂柱一或多次。一些实验室规模测试示出这个额外的、浓缩后阴离子交换精制步骤使得在经过一次阴离子交换柱后浓缩为50-55°白利的甘蔗汁中残余的酚进一步降低42％，残余的蛋白质降低24％，然后再进行第二个阴离子交换步骤。这个额外的步骤产生颜色更淡的糖浆，并且进一步延长了转化反应器中固定酶的半衰期。或者，或者除了多个阴离子交换步骤之外，经阴离子交换处理的汁的回流部分在送回该阴离子交换柱之前进行浓缩。
在进入酶水解柱之前，经阴离子交换处理的任选浓缩的甘蔗汁优选具有如下数值糖含量如果未浓缩为15-25°白利，如果浓缩则直至大约50°白利；蔗糖含量占总糖含量重量的92-96％；残余的(溶解的)非糖固体含量低于重量的1％；残余的(溶解的)酚类化合物含量53.24ppm；
残余的矿物质含量占重量的0.08％或更低。
确信本发明的方法也极大地降低了甘蔗汁中黄酮类化合物、花色素苷和蜡的含量。
可以调节反应器条件和流速以达到转化超过90％。重要的是获得至少90％的转化，否则残余的蔗糖可以结晶并降低糖浆的质量。转化酶的最佳作用条件是pH 4.5-6.0及温度45-60℃，因此优选转化步骤在温度和pH控制下进行。所得转化糖浆可以使用常规蒸发器进一步浓缩(典型地浓缩为70°白利)、调节其pH(至4.0-5.0范围)、或者使用如上述阴离子柱或者另外的吸附方式如应用活性炭的系统而进一步精制。导致体积缩小及白利含量增加的浓缩具有阻碍微生物发生及降低运输成本的作用。额外的转化后处理将除去残留的蛋白质和残余的不希望的有色化合物。
另一方面，本发明涉及一种装置，其包含进行前述连续单元操作的设备，即微量过滤单元，与微量过滤单元串联并位于其下游的超滤单元，以接受微量过滤的汁并产生超滤的汁，有或无回流能力的阴离子交换柱(回流的流体从该柱流出，任选接着作为输入物进入浓缩阶段，输出物被送回该柱)，接受超滤汁并产生阴离子交换处理的甘蔗汁的阴离子交换柱，及安装在固体支持物上的含有转化酶的柱反应器。
本发明的优势包括可使用易于适合商业规模的方法有效并连续地实现向转化糖浆转化不受限制的能力，以及酶的寿命延长及不间断柱反应器操作的能力，因此改良了生产效力。
本发明的其它目的、特征和优势通过以下的详细描述而更易于理解。
附图简述
图1是本发明的生产转化糖浆的方法的流程图。
图2是本发明生产转化糖浆的另一种方法的流程图。
图3是根据保温时间绘制的天然和修饰的转化酶的剩余活性的图示。
图4是使用不同的透析膜回收的修饰的转化酶(2U/ml)的图示。
发明详述在一个实施方案中，本发明涉及一种新的转化糖浆生产方法，该方法利用通过常规提取方法获得的甘蔗原汁进行。本发明包括第一阶段(甘蔗原汁的纯化及任选部分浓缩)和第二阶段(使用固定化转化酶对精制的甘蔗汁进行酶转化及任选进一步浓缩所得转化糖浆，如图1所示)。在通过常规的提取方法(除了用以除去粗固体的沉降步骤以外，可以并且优选地省略用以除去粗固体从而改善透明度及除去颜色的捣碎、用石灰处理和/或其它常规精制步骤)获得甘蔗原汁之后，将汁过滤并经阴离子交换纯化以准备用于转化步骤。在转化步骤之后可进行额外的精制步骤。
对甘蔗汁进行除去固体的操作，如微量过滤和超滤或者颗粒过滤和微量过滤以除去细小的不溶解的杂质及可溶杂质的明显的第一级分。特别优选微量过滤单元装备直径0.2μm的滤膜，随后超滤单元装备分离分子量高于10000道尔顿的杂质(相应于大小大于0.005μm)的膜。如前所述，较低分子量截断值是可以接受的，只要其不导致糖分子滞留也不导致不必要的装备和程序成本增加即可。(如本文所用，“基本保留甘蔗汁中含有的糖”是指保留汁中最初糖含量的至少85％，优选至少90％)。连续进行的这两种分离技术显著降低了(典型为90％以上)最初甘蔗原汁中不溶性蛋白质含量，如用Biuret技术(Gornall et al，1949)所确定。或者，可以组合使用通过滤器(例如100mesh)的颗粒过滤及随后立即进行上文所述的微量过滤方法。优选地，在第一个和第二个过滤步骤之间将汁进行巴氏灭菌并任选同时浓缩为例如35-50°白利。在不应用超滤的实施方案中，巴氏灭菌步骤是特别有益的。
这些步骤的每一个均可以进行一次以上，从而更好地除去固体。然而，即使在经过这种复杂固体耗尽技术(solid depletion technique)之后，甘蔗汁产物仍含有对转化酶和/或反应器性能具有不利影响的可溶成分。为此，将部分精制的甘蔗汁进一步进行阴离子交换步骤以减少不需要的可溶成分。可以使用多种多样的阴离子交换材料，例如二乙氨乙基纤维素、苯乙烯、丙烯酸和琼脂糖。从成本考虑，优选琼脂糖；优选纤维素，因其提供良好的性能和低成本双重优势。
除去不需要的可溶成分可以优选通过阴离子交换柱实现，该柱对酚类和含氮化合物具有强亲和性。这个阴离子交换步骤被证实可高效澄清汁及进一步除去不需要的化合物以准备用于酶转化。
巴氏灭菌可以在低如61.5℃的温度或者在较高的温度例如72℃进行。应注意不要对转化糖浆的质量有不利影响，因此转化后应使用较低浓度和巴氏灭菌温度。
实施例1特别参考图1，在提取阶段1中使用常规技术提取甘蔗。将原提取物101(特征示于表1)以12.0L/小时的流速在最大30psi压力下降条件下流经A/G Technology生产的QSM-04SAP型号的Quick StanBenchtop系统，该系统含有微量过滤单元(图1中的2)，装备了0.2μm滤膜，由此产生具有表1第2列所示特征的微量过滤甘蔗汁201。杂质202主要是蛋白质、肽、酚类及其它有色化合物。然后将微量过滤甘蔗汁201在最大30psi压力下降条件下进行超滤，使用A/GTechnology生产的型号QSM-04SAP装置(图1中3所示)进行，由此产生超滤的甘蔗汁301。杂质302主要是蛋白质、肽、酚类及其它有色化合物。然后将超滤的甘蔗汁301用于阴离子交换柱(图1中4)，在pH5.5条件下使用购白Sigma Aldrich(St.Louis Missouri)的玻璃柱，弱阴离子交换树脂(Diaion WA 30)进行。该树脂的平均颗粒大小为16-50μm，其是用烷基胺激活的有孔树脂，交换能力为1.5meq/ml(Supelco)。将该树脂预先用pH调节为5的0.05M磷酸钠溶液处理。用于充填树脂的玻璃柱的长度为30cm，内径为2.5cm。将长度为15cm的充填树脂床用乙酸钠缓冲液处理直至流出溶液的pH为4.5。将超滤的甘蔗汁经过该柱一次。在这个步骤中，除去了大约50％的酚类化合物，这是根据Folin Ciocalteau分析程序(Swain and Hillis 1959)估计的。
经阴离子交换处理的甘蔗汁401具有表1列中所示的特征。
在这点上，全部的流体401可以在浓缩阶段(图1中5)中浓缩并经过相同的阴离子交换柱，或者可以对其回流部分流体401A浓缩，之后送回相同的柱(图1中流体501)，根据浓缩的回流流体的杂质含量可以在中间点(intermedian point)送回该柱。或者，可以浓缩流体401并使其经过第二个阴离子交换柱(未示出)。将浓缩物501再经过阴离子交换柱4(或者将其经过另一个阴离子交换柱)除去额外的可溶杂质，产生进一步纯化的流体(在图1中未单独示出)。然后将流体401供给柱反应器(图1中6)。
实施例2转化酶(Grade VII，Catalog number I 4504，Sigma Aldrich，St.Louis，Missouri)通过简单吸附固定在脱乙酰壳多糖珠(Chitopearl BCW 3505，Wako Chemicals USA，Inc.)上。该珠大小为350-390μm，离子交换能力为0.2-0.3meg/ml，比表面为150-200m2/g。将该脱乙酰壳多糖珠用蒸馏水和0.02M乙酸钠溶液(pH 4.5)洗涤3次。将转化酶以大约2,000酶单位/g珠加入该脱乙酰壳多糖珠中，将所得悬浮液在室温搅动保持60分钟。过滤该溶液并将含有固定化转化酶的脱乙酰壳多糖珠用0.02M乙酸钠溶液(pH 4.5)洗涤一次。
固定在脱乙酰壳多糖珠上的酶用于充填长度为20cm、内径为16mm的套层柱(Type XK-16 Pharmacia)中。将固定化酶支持物系统的长度调节为120mm。将锆珠置于该珠的顶部和底部。锆用作惰性材料以避免柱支持物丧失。在商业运作中，使用特殊的筛盘(meshtrays)代替锆或其它惰性材料。通过该柱套层流行加热的水而将该柱平衡在50℃温度。将50-55°白利的精制的甘蔗汁浓缩物401以调节至滞留时间(residence time)为10分钟的流速用泵通过该柱。底物和产物中糖的量使用二硝基水杨酸(dinitrosalicilate acid)比色方法及通过装备了折光率检测仪的高效液相层析确定。在这些条件下，95％以上的蔗糖被转化为葡萄糖和果糖(转化糖浆)。产物流中葡萄糖与果糖的比率是1∶1。产物流601的其它特征示于表1。最后，将转化糖浆产物601在蒸发器7中浓缩为68-70°白利，任选进一步精制以符合工业的特殊需要。这些最后的调节可以使用常规单元操作和精制技术如使用充填了活性炭过滤器的吸附柱进行以改善糖浆颜色。
实施例3这个实施例是本发明的另一个优选实施方案的连续方法的批次模拟(batch wise simulation)。特别参考图2，在提取阶段21使用常规技术提取甘蔗。在第一个过滤阶段22中，首先将具有表2所示特征的原提取物1001在大气压下经过筛No.100(100目)。通过过滤器收集相对粗的固体杂质2002并弃去。将第一次过滤的汁2001在步骤23中在61.5℃进行第一次巴氏灭菌0.5小时(或者在较高温度，例如72℃较短时间，例如15秒)同时蒸发浓缩至50°白利。将经巴氏灭菌/浓缩的汁3001经过装备了泵(E-trac WFCHT，Inverter生产)的微量过滤滤筒24(2800cm2，CFP-2E-6A，由Amersham BiosciencesBuckinghamshire，UK生产)，该滤筒具有孔径为0.2μm的膜，在13psi压力下运行以除去细小的固体颗粒(细小的灰烬，有色化合物)以及降低酵母和细菌负载及弃去高分子量蛋白质(分子量大约＞100kD)(4001)。
在使用6-8小时后定期将微量过滤单元用0.2M NaOH在50℃洗涤两次再生。NaOH需要用水洗掉(洗涤3次)或者用1N HCl中和。
微量过滤的汁，精细过滤的流体4002，代表两个阶段过滤的中间产物。这个中间产物的特征示于表2。该中间产物仍具有不需要的深褐色，这表明还存在酚类及其它有色化合物。
然后将中间产物4002在步骤25中进行阴离子交换将其充填在装备了Whatman DE52阴离子交换树脂微粒的500ml(450ml工作体积)柱的顶部，交换能力为0.88-1.08meq/g(Whatman，New York，USA)。在加入中间产物4002之前，使用磷酸钠缓冲液将柱平衡为pH5。
从该柱中形成的阴离子交换产物5001具有表2所示特征。除去的杂质5002包括酚酸及其它有色化合物，剩下淡黄色澄清的产物5001。这些步骤也降低了抑制转化酶的含氮化合物的含量，但在这个然后将阴离子交换产物5001在步骤27中进行酶水解，使用其中转化酶(得自酿酒酵母(Saccharomyces cereviciae)的MaxivertL10000，活性为10,000U/ml，DSM，France)固定在用作支持物的ChitopearlsTM上的柱进行。如实施例4所述完成支持物与酶的充填。
将柱保持在60℃，pH 5，在阴离子交换产物通过柱时发生向转化糖浆进行的转化。在其它支持物中选择ChitopearlsTM部分是因为其效力、低成本和低操作成本，部分是因为其具有一些离子交换能力，可进一步改良糖浆的颜色。从催化柱中产生无色液体7001。
在转化酶用尽后(由于断续使用总共7天的结果导致微生物生长所致)，将支持物如上述用1N NaOH洗涤以洗脱转化酶，用蒸馏水洗涤3次及负载新鲜的酶。支持物具有较长的使用寿命，在不得不更换之前可以清洁，负载新鲜的酶并再使用几次。限制细菌生长可延长转化酶的使用天数。
得自该催化柱的转化糖浆具有表2所示特征。
在酶转化之后，转化糖浆可以浓缩为68-70°白利。转化后浓缩可以在60℃在真空蒸发器中进行以避免由于高温作用导致的转化糖浆产生颜色。
就在转化之前进行的转化前浓缩将产生40-50°白利的产物(为此，这可以将如图2所示的部分或全部阴离子交换柱产物，流体5001A，进行步骤26，并将浓缩的流体5002回送至步骤25的顶部或步骤25中未示出的中间点)。所述程序中浓缩阶段的不同位置具有不同的优点和缺点。转化前浓缩可以用降低的体积工作并且由于溶质的高度浓缩而降低微生物生长的速度；然而，溶液的粘性增加将通过引起增加的压力下降而对微量过滤(及如果有的话对超滤)膜的性能具有负面影响。
实施例4酶固定将于50mM磷酸盐缓冲液pH5中的2500U/mL转化酶(MaxinvertL10,000，DSM，France)溶液根据Hsieh(2000)所报道的方案修饰。将30mg转化酶(412U/mg)溶解于29ml的50mM磷酸盐缓冲液pH 5.0中，与1ml的30mM高碘酸钠在4℃在黑暗中混合3小时。未反应的高碘酸钠通过加入0.2ml乙二醇并混合30分钟而除去。所得高碘酸氧化的转化酶对50mM磷酸盐缓冲液pH 6.0进行透析。图3(预先在相同温度保温的天然和修饰的转化酶(2U/ml)在55℃在1M蔗糖pH6.0中随着保温时间的剩余活性图示)示出了修饰的转化酶具有比天然酶更高的活性，并且修饰步骤增加了酶的使用寿命。例如，天然酶在6小时内丧失其75％的初始活性，而修饰的酶延长至27小时。
在修饰程序期间，使用透析以消除修饰需要的反应物(高碘酸钠和乙二醇)。透析可以使用10kDa分子量截断值膜进行(可以使用更高分子量截断值膜，例如25kDa)。图4(通过10kDa、15kDa和25kDa分子量截断值的不同透析膜回收的修饰的转化酶(2U/ml)在55℃在1M蔗糖溶液pH6中的活性图示)所示结果表明修饰的酶的活性不受透析膜类型的影响。
使用修饰的酶进行进一步的实验以选择最便利的用于固定的支持物。为此使用Alumina，Sephabeads和ChitopearlsTM。选择脱乙酰壳多糖珠作为酶固定支持物，因为其易于制备，使用其便宜及其制备快于其它常用的支持物。另外，脱乙酰壳多糖珠具有更长的使用寿命并且使用更少的酶而固定方法是有效的。最后，如实施例3所述，这个支持物具有一些离子交换能力，可进一步改良产生的糖浆的透明颜色。
在固定之前，将ChitopearlsTMBCW 3505(Fuji Spinning Co.，Ltd，Japan)用蒸馏水洗涤3次。轻轻倒出过量的水，将40g(50ml)的ChitopearlsTM充填在长30cm、内径1.5cm的玻璃柱中(50ml工作体积)，该柱在两端装备了温度套层和mesk-and-cloth可通透帽。修饰的转化酶通过简单吸附而固定，即将酶溶液经过该柱以达到1000-3000IU/g浓度。在使用之前，将50mM NaH2PO4，pH 5缓冲液通过该柱直至流出溶液pH为5。运行温度固定在60℃。固定化酶用于将测试溶液(含有34-50％蔗糖的蔗糖水溶液)转化为转化糖浆。转化率高，从100％开始。在持续运转3天后，转化仍高于80％。另外，由于ChitopearlsTM的离子交换性质，因此所得转化糖浆几乎是晶体清澈的(L＝66.14，a*＝0.39，b*＝2.11)。当增加糖浓度时未观测到压力下降中有明显差异，因为ChitopearlsTM的大小和形状允许容易地流经该柱，表明可以使用更浓缩的汁。在这种规模中，流速固定在5-12ml/分钟的范围。
实施例5离子交换对脱色的作用将微量过滤的甘蔗汁经过一个弱阴离子交换树脂(WhatmanDE52，预先溶胀的微粒阴离子交换树脂Whatman，New York，USA)以除去酚类化合物和蛋白质。
在使用之前，Whatman DE52预先溶胀的微粒阴离子交换树脂通过加入50mM NaH2PO4，pH 5缓冲液激活，直至达到完全水合。一旦树脂水合及准备使用，将其40g充填在长15cm、内径2cm的塑料柱中(工作体积50ml)，该柱装备了底部过滤器。使用蠕动泵将微量过滤的甘蔗汁流速(向下)固定在8ml/分钟。2L微量过滤的甘蔗汁的有色化合物使用40g树脂除去，产生淡黄色半透明液体。颜色参数利用Minolta色度计使用白色标准作为背景和D65光源测定。CIELa*b*参数(色空间坐标)表明在离子交换后样品颜色更明亮，L值从34.02变化为63.72。微红色也降低，a*值从+3.92变化至-2.85。这个柱使用2倍床体积(100ml)的1N NaOH溶液及随后2倍床体积的去离子水和2倍床体积的NaH2PO450mM，pH 5缓冲液再生。残余的NaOH(100ml，1.0N)通过用HCl 1N中和而消除。
实施例6在试验厂规模的蔗糖转化将转化酶如实施例2所述固定在ChitopearlsTM中，并充填进长70cm、内径7cm的玻璃柱中(2700ml工作体积)，该玻璃柱在两端装备了热交换套层和可通透的帽。在使用之前，将50mM NaH2PO4，pH5缓冲液经过该柱直至流出溶液的pH为5。使用热水将运转温度固定在60℃。初始流出液被转移直至稳定。该系统首先用32°白利蔗糖溶液使用离心泵(Fasco，Model 71632363)以9.6L/小时进行测试。滞留时间为14秒，平均总转化率为96.0％。转化糖浆中果糖和葡萄糖的浓度使用Miller(1959).G.L.，Anal Chem.，1959，31426-428报道的二硝基水杨酸(DNS)比色方法确定。
实施例7在试验厂规模不用巴氏灭菌或超滤从甘蔗汁中生产转化糖浆使用常规技术提取甘蔗汁，包括用机械压榨机压榨甘蔗。在测试期间将每批2L的甘蔗原汁根据需要人工通过No.100(Tylerequivalent 100)筛，以除去可影响进一步加工程序的粗固体颗粒。固体(包括灰烬、石头和有机物)由筛截留，而预过滤的甘蔗汁经过其，在贮液器中收集以进一步加工。这个实施例也在图2中例证，但既不进行巴氏灭菌也不进行任选的浓缩(无步骤22)。这个实施例7中不同流体的代号不是指进行不同实验的具有表2所示特征的流体。
然后将第一次过滤的甘蔗汁通过装备了泵(E-Trac WFCHT ACInverter)的微量过滤膜(Amersham Biosciences，CFP-2-E-6A)精细过滤。该单元由0.2μm的2800cm2微量过滤膜组成。流入和流出压力分别保持在13和0psi，泵的速度保持在200RPM。在这些条件下，通过滤筒(cartridge)的流速为900L/小时，而保留的甘蔗汁(4001)流速为895.2L/小时，将其再循环至从取甘蔗汁的贮液器中。微量过滤的甘蔗汁(4002)的平均流速为4.8L/小时，将其收集在贮液器中以进一步加工。在使用后，该膜需要在50℃用20L的NaOH 0.2N洗涤以除去附着在表面上的所有固体及消毒。残余的NaOH(20，0.2N)通过用4L的1NHCl中和而消除。该微量过滤设备不具有足够的能力，应使用更大的装置。但是这是本领域内最佳的。
将微量过滤的甘蔗汁(4002)流经充填了如实施例5所述预处理的Whatman DE52树脂(1350cc工作体积)的长70cm、内径7cm的玻璃柱。将微量过滤的汁(4002)通过蠕动泵(Stenner 170DM5)的作用以平均1.1L/小时的流速用泵抽吸，产生从流出单元流出的淡黄色半透明液体(5001)，将其收集在贮液器中以进一步加工。甘蔗汁的色度改变使用CIELa*b*分值(Minolta色度计)确定，产生的参数如下从输入甘蔗汁的L*41.7，a*+6.75，b*+24.42转变为流出物的L*61.17，a*-1.52，b*+14.94。
运行时间根据甘蔗中酚类化合物的含量及由于汁从顶部向底部流动出现的压力下降差异所致树脂对柱的向下压缩而定。这表明需要优化树脂的类型，转变为更有效的一种树脂候选是Dowex 66，由Sigma Aldrich，St.Louis，Missouri，U.S.A生产，或者甚至是在转化步骤中应用的ChitopearlsTM，其具有一定的离子交换能力并且可以更好地经受住柱的压力。使用所述条件的平均运行时间是5小时，更长的运行时间因为树脂交换能力的逐步丧失而产生具有更多量的酚类化合物的产物，影响光学性质。可以使用一些阴离子柱以半持续运行，一旦树脂达到饱和则更换为另一个。树脂的饱和可以间接通过测定流出物的CIELa*b*参数而确定。在树脂由于酚类化合物饱和而丧失其大部分离子交换能力后，将其如实施例3所述用NaOH 1.0N再生。
将经离子交换处理的甘蔗汁(5001)经过实施例6所述的酶转化柱(27)。离子交换处理的甘蔗汁实际上通过可调节的流动离心泵(Fasco，Model 71632363)的作用向上流动。当流经该柱的甘蔗汁流动固定在12L/小时(滞留时间为10.5秒)时，平均总转化为89.7％，当其固定在6L/小时(滞留时间为21秒)时，平均总转化为98.0％。将转化糖浆收集在贮液器中以进一步加工。
在转化后，转化糖浆(7001)可以使用装备了真空泵的蒸发器浓缩。蒸发器荷载20°白利转化糖浆直至达到运转体积。在负载后，关闭批次蒸发器并启动。设定蒸发器运转平均温度为55℃，压力为-0.9，这个条件根据蒸发器的特性在一定时间内达到。转化糖浆流入速度通过蒸发器控制系统自动调节，同时浓缩的液体以同样的流速流出。蒸发器中转化糖浆浓缩直至达70°白利。糖浓度(°白利)用折射计确定(如SPER SCIENTIFIC，0％-80％)。
在其实施方案中，本发明包括如下步骤使用置于充填床反应器中(固定的、活动的或流态的)固定化转化酶转化甘蔗汁/浓缩物(优选预先去除杂质，如上述，使用至少两阶段过滤组合除去大于0.2μm的杂质，优选除去甚至大于0.005μm的那些)。一些报道(Akgol et al.，2001，Bahar and Tuncel 2002，D′Souza and Godbole 2002，Tanrisevenand Dogan 2001，Tumturk et al.，2000and Torres et al.，2003)示出了将转化酶固定在不同支持物上的不同方式。原则上任何前述方式均可以用于进行成本限制。本领域熟知其它转化酶固定技术和支持物，并见于背景章节中所述专利文献所描述。
有多种多样的基于吸附、诱捕(entrapping)、包囊化(encapsulating)、离子交换、交联和共价结合的固定支持系统。最普遍使用的支持系统应用琼脂、藻酸盐、脱乙酰壳多糖、多种聚合物、聚丙烯酰胺、纤维素、取代的纤维素、果胶、碳和氧化铝(Akgol et al.，2001，Bahar and Tuncel 2002，D′Souza and Godbole 2002，Rosevear1984，Tanriseven and Dogan 2001 and Tumturk et al.，2000)作为支持物。戊二醛和聚乙烯亚胺对于将酶固定在固体支持物上并将它们负载在柱中是最常用和有效的试剂(Avrameas et al.，1969 and Torres et al.，2003)。
有具有不同程度活性的不同来源的转化酶。转化酶已经成功地固定在不同的系统中。优选来自酵母的具有2000IU/g比活性的GradeVII转化酶。重要的是优化条件以使得更有效地应用酶反应器。应主要考虑的程序参数是运转温度和pH。优选的温度范围是45-60℃，优选的pH范围是4.5-6.0。最佳温度是50℃，最佳pH是4.5。优选的支持物是具有如下特征范围的氧化铝脱乙酰壳多糖和丙烯酰胺大小350-590μm，比表面150-200m2/g。
为了论证本发明的效力，测试了三种不同的固定支持物诱捕，吸附和交联。吸附固定技术是最简单的。任选地，转化糖浆产物可以进一步浓缩，可以通过常规蒸发达到至少68°白利实现和/或进一步精制，如果需要则通过使用上述条件在阴离子交换柱上和/或在活性炭柱上吸附而除去残余的蛋白质、酚类及不需要的有色化合物。
全部方法均可以按比例扩大并使用现有的自动控制设备和仪器自动进行。本发明方法的优势是(i)以完全连续的流水线方法运行的能力，从原甘蔗提取直至转化糖浆产物；(ii)使用减少数目的单元操作和/或更有效的单元操作实现转化糖浆产物的能力。换句话说，原则上可以获得精制的蔗糖，将其溶解于水并加样于固定化转化酶反应器中转化为转化糖浆，这种方法的全部成本(精制蔗糖的成本加上将其转化为转化糖浆的成本)是不令人满意的，事实上是不容许的。相似地，可以加上所述常规的精制步骤及对甘蔗汁进行预处理后再进行除去固体/可溶物步骤，这种预处理不是必需的，而且这个步骤的加入必须在进行其所增加的成本和其产生的收益之间达到平衡。
尽管本发明已经示出并描述了一些优选的实施方案，但本领域技术人员在如权利要求书所要求的、本发明的精神和范围内可以对本发明做多种改变和修改。以下所引用和列出的所有文献均以其全文并入参考(不包括网站)。
参考文献Akgol，S.，Kacar，Y.，Denzli，A.，and Arica，M.Y.Hydrolysis ofsucrose by invertase immobilized onto novel magnetic poly(vinyl alcohol)microspheres.Food Chem.74281-288，2001。
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表1通过微量过滤、超滤和阴离子交换树脂相继纯化的甘蔗汁的特性n.m.＝未通过分析方法测定
aL＝亮度(lightness)；a*(+)＝红色；a*(-)＝绿色；b*(+)＝黄；b*(-)＝蓝；E(颜色指数(color index))＝(L2+a2+b2)1/2b
表2通过颗粒过滤、微量过滤和阴离子交换相继纯化的甘蔗汁的特性n.m.＝未通过分析方法测定
bL＝亮度；a*(+)＝红色；a*(-)＝绿色；b*(+)＝黄；b*(-)＝蓝；E(颜色指数)＝(L2+a2+b2)1/2b
权利要求
1.一种从甘蔗原汁中生产转化糖浆产物的方法，包括如下步骤(a)将甘蔗汁进行微量过滤以从所述汁中除去第一固体杂质级分，从而产生微量过滤的甘蔗汁；(b)将微量过滤的甘蔗汁进行超滤以从所述微量过滤的汁中除去第二固体杂质级分及从所述微量过滤的汁中除去第一可溶杂质级分，从而产生超滤的甘蔗汁；(c)将超滤的甘蔗汁经过阴离子交换柱以从所述超滤的甘蔗汁中除去第二可溶杂质级分，从而产生阴离子交换处理的甘蔗汁；(d)将所述阴离子交换处理的甘蔗汁与固定化转化酶接触，以将所述处理的汁中含有的至少90％的蔗糖转化为葡萄糖与果糖的混合物，从而产生所述转化糖浆产物。
2.权利要求1的方法，其中在进行至步骤(d)之前将步骤(c)至少重复一次。
3.权利要求1的方法，其进一步包括如下步骤(e)在进行至步骤(d)之前浓缩所述阴离子交换处理的汁。
4.权利要求2的方法，其进一步包括如下步骤(e)在进行至步骤(d)之前浓缩所述阴离子交换处理的汁。
5.权利要求4的方法，其中在进行所述步骤(c)一次后立即进行所述步骤(e)。
6.权利要求1的方法，其中在所述步骤(a)中进行微量过滤的甘蔗汁是在从甘蔗中提取后及在所述步骤(a)之前未经任何加工处理的甘蔗原汁。
7.权利要求1的方法，其中在所述步骤(a)中进行微量过滤的甘蔗汁在其从甘蔗中提取后仅进行了沉降或离心步骤以除去粗固体。
8.权利要求1的方法，其进一步包括如下步骤(f)进一步精制所述步骤(d)中产生的转化糖浆产物。
9.权利要求1的方法，其进一步包括如下步骤(g)浓缩所述步骤(d)中产生的转化糖浆产物。
10.权利要求1的方法，其进一步包括如下步骤(h)浓缩所述步骤(d)中产生的转化糖浆产物；及(i)进一步精制所述步骤(d)中产生的转化糖浆产物。
11.权利要求1的方法，其中进行所述步骤(a)的甘蔗汁的糖含量为在大约16-23°白利之间，其中至少90％是蔗糖。
12.权利要求11的方法，其中在所述步骤(d)中产生的转化糖浆产物的糖含量在大约50°-大约70°白利的范围内，其中至少90％是果糖和葡萄糖的混合物。
13.权利要求11的方法，其中在进行所述步骤(d)之前，经阴离子交换处理的汁的固体含量基于糖含量不高于大约1％；酚含量不高于大约130ppm；蛋白质含量不高于大约15ppm；及矿物质含量基于糖含量不高于大约0.08％。
14.权利要求3的方法，其中在进行所述步骤(d)之前，浓缩的经阴离子交换处理的汁的糖含量为大约50°白利。
15.权利要求1的方法，所述步骤(c)中将经阴离子交换处理的汁的回流部分在送回该阴离子交换柱之前被浓缩。
16.权利要求1的方法，其中所述步骤(d)是在受控的pH和温度条件下进行的。
17.权利要求1的方法，其中所述步骤(a)-(d)的至少一个步骤是作为连续单元操作进行的。
18.权利要求17的方法，其中所述(a)-(d)所有步骤均是作为连续单元操作进行的。
19.一种从甘蔗原汁中生产转化糖浆产物的方法，包括如下步骤(a)将甘蔗汁进行第一次过滤以从所述汁中除去第一固体杂质级分，从而产生第一次过滤的甘蔗汁；(b)将第一次过滤的甘蔗汁进行精细过滤以从所述第一次过滤的汁中除去第二固体杂质级分及从所述第一次过滤的汁中除去第一可溶杂质级分，从而产生精细过滤的甘蔗汁；(c)将精细过滤的甘蔗汁经过阴离子交换柱以从所述精细过滤的甘蔗汁中除去第二可溶杂质级分，从而产生阴离子交换处理的甘蔗汁；(d)将所述阴离子交换处理的甘蔗汁与固定化转化酶接触，以将所述处理的汁中含有的至少90％的蔗糖转化为葡萄糖与果糖的混合物，从而产生所述转化糖浆产物。
20.权利要求19的方法，其中在进行至步骤(d)之前将步骤(c)重复至少一次。
21.权利要求19的方法，其进一步包括如下步骤(e)在进行步骤至(d)之前浓缩所述阴离子交换处理的汁。
22.权利要求19的方法，其中所述步骤(a)中进行第一次过滤的甘蔗汁在其从甘蔗中提取后仅进行了沉降或离心步骤以除去粗固体。
23.权利要求19的方法，其进一步包括如下步骤(f)进一步精制在所述步骤(d)中产生的转化糖浆产物。
24.权利要求19的方法，其进一步包含浓缩在所述步骤(d)中产生的转化糖浆产物的步骤(g)。
25.权利要求19的方法，其中进行所述步骤(a)的甘蔗汁的糖含量在大约16°-23°之间，其中至少90％是蔗糖，且其中所述步骤(d)中产生的转化糖浆产物的糖含量在大约50°-大约70°白利的范围内，其中至少90％是果糖和葡萄糖的混合物。
26.权利要求25的方法，其中在进行所述步骤(d)之前，经阴离子交换处理的汁的固体含量基于糖含量不高于大约1％；酚含量不高于大约130ppm；蛋白质含量不高于大约15ppm；且矿物质含量基于糖含量不高于大约0.08％。
27.权利要求21的方法，其中在进行所述步骤(d)之前，浓缩的、经阴离子交换处理的汁的糖含量为大约40-50°白利。
28.权利要求19的方法，其中所述步骤(c)中，经阴离子交换处理的汁的回流部分在返回阴离子交换柱之前被浓缩。
29.权利要求19的方法，其中所述步骤(d)是在受控的pH和温度条件下进行的。
30.权利要求19的方法，其中所述步骤(a)-(d)的至少一个步骤是作为连续单元操作进行的。
31.权利要求19的方法，其中所述第一次过滤步骤(a)包括将所述汁经过具有不大于100Mesh US(100Tyler)的网的颗粒过滤器。
32.权利要求31的方法，其中所述精细过滤步骤(b)包括微量过滤。
33.权利要求19的方法，其中所述第一次过滤步骤(a)包括微量过滤。
34.权利要求33的方法，其中所述精细过滤步骤包括存留限度为10,000kDa分子量的超滤。
35.权利要求19的方法，其进一步包括如下步骤(j)在步骤(b)之前将步骤(a)的所述第一次过滤的甘蔗汁蒸发浓缩至35°-55°白利的范围。
36.权利要求35的方法，其中步骤(j)是在大约61.5°-大约72℃的巴氏灭菌温度进行足够时间以对所述第一次过滤的汁进行巴氏灭菌。
37.权利要求35的方法，其中步骤(a)包括颗粒过滤，步骤(b)包括微量过滤。
38.权利要求19的方法，其中步骤(a)包括颗粒过滤，步骤(b)包括微量过滤。
39.权利要求19的方法，其中步骤(a)包括颗粒过滤，步骤(b)包括微量过滤，随后进行超滤。
40.一种从甘蔗原汁中生产转化糖浆产物的方法，包括如下步骤(i)将甘蔗汁进行具有至少两个阶段的过滤程序，第一个阶段和精制阶段，以除去汁中的杂质并同时基本上保留糖；(ii)将过滤的甘蔗汁进行阴离子交换以从所述过滤的甘蔗汁中除去在过滤程序中未除去的可溶杂质，从而产生经阴离子交换处理的甘蔗汁；(iii)将所述经阴离子交换处理的甘蔗汁与固定化转化酶接触，以将所述处理的汁中含有的至少90％的蔗糖转化为葡萄糖和果糖的混合物，从而产生所述转化糖浆产物。
全文摘要
本发明涉及一种新方法，其中首先将甘蔗原汁通过许多步骤精制，然后使用充填了固定化转化酶的反应器经生物酶转化为精制的转化糖浆或者葡萄糖－果糖浓缩液。所述精制步骤优选包括第一次过滤(颗粒过滤或微量过滤)，然后第二次过滤(微量过滤或超滤)，然后至少一次经过充填阴离子交换树脂的柱。精制的蔗糖汁可以任选经浓缩和/或巴氏灭菌，之后经过充填了固定化转化酶的反应器以将蔗糖转化为葡萄糖－果糖。
文档编号C13B20/14GK1914329SQ200480035027
公开日2007年2月14日 申请日期2004年9月29日 优先权日2003年9月29日
发明者塞尔西奥·R.·塞尔纳-萨尔迪维亚, 马尔科·A.·里托-帕洛马雷斯 申请人:蒙特雷高等理工学院