专利名称：一种检测二恶英类化学物质的生物芯片方法
技术领域：
本发明涉及环境化学和分析生物技术领域，具体涉及一种检测二恶英类化学物质的生物芯片方法。
背景技术：
二恶英类化学物质在环境中广泛存在，为高滞留性和高生物富集的环境污染物，因其毒性极高，近年来一直受到环境界的高度关注，对其检测方法的研究也已成为当今环境研究领域的前沿课题。二恶英类化学物质的监测属于痕量多组分分析，要求检测方法必须具有较高的灵敏度。由于高分辨气质联用法具有高选择性、高分辨率及高灵敏度等特点，近年来已被公认为二恶英类化学物质的标准分析方法。然而，要建立这种方法，需要购买高分辨气质联用仪和一系列同位素标样，而且试样分离、净化步骤繁琐，使得这一工作在大多数实验室不能开展，难以适应环境监督管理和监测工作的需要。
毒理学研究表明，大多数二恶英及其结构类似物都具有致癌、致畸和致突变性。从致毒机制上讲他们属于非基因毒性致癌物，都对生物体内的芳烃化合物受体蛋白(aryl hydrocarbon receptor，缩写为AhR)具有高度亲和能力，从而能专一性地结合特定的DNA序列并诱导机体的特异基因表达。依据这一原理已经发展了检测特异基因表达产物及对AhR受体活化程度进行直接检测等生物分析方法。然而，这些采用细胞或动物培养的生物检测法仍需要一定条件，同时培养时间多达24-72小时，整个过程多达几天，不能进行快速、大量检测。
荧光信号检测方法是应用最多的芯片信号检测方法，普通的荧光扫描仪可以在半径100微米的区域内检测到10-18mol荧光分子，符合高密度高通量的芯片信号检测的要求。利用这一技术的优越性，结合毒理学研究的结果，使得发展一种可以用于快速大量检测二恶英类化学物质的荧光检测芯片方法成为可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测二恶英类化学物质的生物芯片方法，为环境监测部门提供有效快速的准确检测二恶英类化学物质，以形成与化学分析相互补充的多层次二恶英类化学物质监测体系。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施哺乳动物的芳烃化合物受体蛋白(aryl hydrocarbon receptor，缩写为AhR)存在于细胞胞浆中，可被环境中的二恶英及其结构类似物激活、结合后转移至核，与AhR核转移因子(ARNT)蛋白结合，形成可以特异性结合一段特殊的DNA序列——Dioxin-responsiveelement(DRE)序列的AhR/ARNT异二聚体。根据这一原理，结合T7核酸聚合酶可以催化去除5’单核苷酸的特性，在DRE序列中标记花青染料分子(Cy5)，通过AhR与ARNT蛋白在二恶英存在下与DRE结合而阻碍T7核酸聚合酶对标记有Cy5的DNA探针的降解，使得荧光强度的多少与二恶英类化学物质的含量成正比，来检测二恶英类化学物质的含量。其步骤是1、含有DRE序列的探针分别设计巯基修饰和Cy5荧光修饰序列分别为5‘(SH)-TTTTTTTTTTGGCTCTTCTCACGCAACTCCG-3’，5’-CGGAGTTGCGTGAGAAGAGCC(Cy5)-3’。
2、探针的退火将上述DNA探针溶解于超纯水(MiliQ)中，终浓度为10-20μM。90-96℃处理5-10min，50-60℃退火20-30min后，稀释使用。
3、探针的固定退火后的探针加入巯基化修饰的玻片，利用疏基与巯基之间相互作用形成二硫键的特异作用使探针在12-16℃下过夜或35-37℃一小时固定，形成探针阵列，即得到所需要的芯片。
4、提取含有AhR和ARNT受体蛋白的Balb/c小鼠肝脏胞液。
5、将Balb/c小鼠肝脏胞液与各浓度(50，10，5，1，0.5，0.1pg/μl)的2，3，7，8-四氯代二苯并-对-二恶英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，缩写为2，3，7，8-TCDD)混合，16-22℃避光作用1-2小时后，将样品与HEDGK buffer(25mM HEPES，1mM EDTA，1mM DTT，10％Glycerol，180mM KCl)混合，加入固定有探针的玻片上，20-25℃避光反应1-2小时。
6、芯片的洗涤用溶液TNT(10mM Tris-HCL，pH7.5；150mM NaCl，0.05％Tween20)室温(20-25℃)避光漂洗芯片5分钟，再用溶液TNW(10mM Tris-HCL，pH7.5；150mM NaCl)室温(20-25℃)避光漂洗芯片两次，洗去非特异性结合的蛋白质，然后风干玻片。
7、在片的酶切反应在芯片的反应区域上加T7核酸外切酶，20℃避光作用4小时。
8、芯片的洗涤用溶液TNT(10mM Tris-HCL，pH7.5；150mM NaCl，0.05％Tween20)室温(20-25℃)避光漂洗芯片5分钟，再用溶液TNW(10mM Tris-HCL，pH7.5；150mM NaCl)室温(20-25℃)避光漂洗芯片两次，洗去非特异性结合的蛋白质，然后风干玻片。
9、Cy5的荧光检测采用GenePix 4000B荧光扫描仪(美国Axon公司)检测芯片的荧光值，二恶英类化学物质的存在使得AhR/ARNT蛋白与探针结合并阻碍T7核酸外切酶的对末端Cy5标记的单核苷酸的消化，从而荧光值的强弱和二恶英类化学物质含量的多少直接相关，并进一步通过荧光强度的数值确定待测样品中二恶英的含量。对2，3，7，8-TCDD的检测范围是0.1pg/μl至10pg/μl。
本发明与其他二恶英类化学物质检测技术相比，具有以下优点和效果利用AhR与ARNT蛋白在二恶英类化学物质存在下与DRE结合时阻碍T7核酸外切酶对DRE序列的降解，通过Cy5荧光值的强度来检测二恶英类化学物质的含量，应该比现在广泛采用的同样基于二恶英及其结构类似物的致毒机理发展的检测特异基因表达产物及其衍生的方法具有更好的检测灵敏度，而且操作简单，所需时间大大缩短。加之采用荧光检测方法的高灵敏度和芯片的高通量数据生产特性，能够发展成为适合于大量样品的筛选和特定条件下的监督管理的二恶英类化学物质生物检测方法。因此，生物检测法具有快速、简便、检测成本低等特点，且检测灵敏度高，非常适合于大量样品的筛选和特定条件下的监督管理，应用前景广泛。
图1.在固定探针为20fmol/dot，AhR/ARNT过量的情况下，检测不同浓度的2，3，7，8-TCDD含量对荧光值的影响。结果说明如下每个样品重复两个点，1，DMSO阴性对照；2，阳性对照；3-8分别是不同浓度的2，3，7，8-TCDD样品的检测结果，依次为50，10，5，1，0.5，0.1pg/μl。点样量均为每点0.2μl。结果显示，没有加入2，3，7，8-TCDD样品的点，几乎没有荧光，被T7核酸外切酶完全降解；加入2，3，7，8-TCDD的点有荧光，说明2，3，7，8-TCDD的存在的确可以使AhR/ARNT蛋白与探针结合并阻碍T7核酸外切酶对探针的降解；随着加到反应点上的2，3，7，8-TCDD含量的增加，点的亮度增加。
图2.在固定探针为20fmol/dot，AhR/ARNT过量的情况下，探针荧光强度和待检样品中2，3，7，8-TCDD浓度的对应关系。结果显示，探针荧光强度随着待检样品中2，3，7，8-TCDD浓度的增加而增强，并在2，3，7，8-TCDD的浓度达到50pg/μl时达到饱和。说明在固定探针为20fmol/dot，AhR/ARNT过量的情况下，对2，3，7，8-TCDD的检测上限至50pg/μl。
图3.利用荧光探针对样品中2，3，7，8-TCDD含量检测的线性曲线。结果显示，在固定探针为20fmol/dot，AhR/ARNT过量的情况下，荧光探针可对2，3，7，8-TCDD的含量进行检测的范围为0.1pg/μl至10pg/μl。
具体实施例方式
一种检测二恶英类化学物质的生物芯片方法，包括以下步骤1、含有DRE序列的探针分别设计巯基修饰和Cy5荧光修饰序列分别为5‘(SH)-TTTTTTTTTTGGCTCTTCTCACGCAACTCCG-3’，5’-CGGAGTTGCGTGAGAAGAGCC(Cy5)-3’。巯基修饰的目的是使探针能够利用巯基间的特异作用固定在巯基修饰的玻片上。
2、探针的退火将上述DNA探针溶解于MiliQ水中，终浓度为10-20μM。90-96℃处理5-10min，50-60℃退火20-30min后，稀释使用。
3、探针的固定退火后的探针加入巯基化修饰的玻片，利用巯基与巯基之间形成二硫键的特异作用使探针在12-16℃下过夜或35-37℃一小时固定，形成探针阵列，即得到所需要的芯片。
4、提取含有AhR和ARNT受体蛋白的Balb/c小鼠肝脏胞液。
5、将Balb/c小鼠肝脏胞液与各浓度(50，10，5，1，0.5，0.1pg/μl)的2，3，7，8-四氯代二苯并-对-二恶英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，缩写为2，3，7，8-TCDD)混合，16-22℃避光作用1-2小时后，将样品与HEDGK buffer(25mM HEPES，1mMEDTA，1mM DTT，10％Glycerol，180mM KCl)混合，加入固定有探针的玻片上，20-25℃避光反应1-2小时。
6、芯片的洗涤用溶液TNT(10mM Tris-HCL，pH7.5；150mM NaCl，0.05％Tween20)室温(20-25℃)避光漂洗芯片5分钟，再用溶液TNW(10mMTris-HCL，pH7.5；150mM NaCl)室温(20-25℃)避光漂洗芯片两次，洗去非特异性结合的蛋白质，然后风干玻片。
7、在片的酶切反应在芯片的反应区域上加T7核酸外切酶，20℃避光作用4小时。
8、芯片的洗涤用溶液TNT(10mM Tris-HCL，pH7.5；150mM NaCl，0.05％Tween20)室温(20-25℃)避光漂洗芯片5分钟，再用溶液TNW(10mMTris-HCL，pH7.5；150mM NaCl)室温(20-25℃)避光漂洗芯片两次，洗去非特异性结合的蛋白质，然后风干玻片。
9、Cy5的荧光检测采用GenePix 4000B荧光扫描仪(美国Axon公司)检测芯片的荧光值，并进一步通过荧光强度的数值确定待测样品中二恶英的含量。对2，3，7，8-TCDD的检测范围是0.1pg/μl至10pg/μl。
10、结果分析荧光强度特异性地随着待检样品中2，3，7，8-TCDD浓度的增加而增强(图1、2)，，而且在2，3，7，8-TCDD浓度为0.1pg/μl至10pg/μl范围内具有较好的线性(图3)，因此可以根据荧光值的强度变化确定待测样品中二恶英类化学物质的含量。
权利要求
1.一种检测二恶英类化学物质的生物芯片方法，它包括下列步骤A、含有DRE序列的探针分别设计巯基修饰和Cy5荧光修饰序列分别为5‘(SH)-TTTTTTTTTTGGCTCTTCTCACGCAACTCCG-3’，5’-CGGAGTTGCGTGAGAAGAGCC(Cy5)-3’；B、探针的退火将A步骤探针溶解于超纯水中，终浓度为10-20μM，90-96℃处理5-10min、50-60℃退火20-30min后，稀释使用；C、探针的固定退火后的探针加入巯基化修饰的玻片，利用巯基与巯基之间形成二硫键的特异作用使探针在12-16℃下过夜或35-37℃一小时固定，形成探针阵列，得到所需要的芯片；D、提取含有AhR和ARNT受体蛋白的Balb/c小鼠肝脏胞液；E、将Balb/c小鼠肝脏胞液与浓度为50，10，5，1，0.5，0.1pg/μl的2，3，7，8-四氯代二苯并-对-二恶英混合，加入固定有探针的玻片上，20-25℃避光反应1-2小时；F、芯片的洗涤用溶液TNT在室温下避光漂洗芯片5分钟，再用溶液TNW于室温下避光漂洗芯片两次，洗去非特异性结合的蛋白质，然后风干玻片；G、在片的酶切反应在芯片的反应区域上加T7核酸外切酶，20℃避光作用4小时；H、芯片的洗涤与F步骤相同；I、Cy5的荧光检测采用GenePix 4000B荧光扫描仪检测芯片的荧光值，二恶英类化学物质的存在使得AhR/ARNT蛋白与探针结合并阻碍T7核酸外切酶的对末端Cy5标记的单核苷酸的消化，并通过荧光强度的数值确定待测样品中二恶英的含量，对2，3，7，8-TCDD的检测范围是0.1pg/μl至10pg/μl。
全文摘要
本发明公开了一种检测二恶英类化学物质的生物芯片方法。其步骤是首先，在玻片上固定末端Cy5荧光标记的含DRE序列的探针，加入从小鼠肝细胞提取的胞液与2，3，7，8－TCDD的混合液，则胞液中含有的AhR/ARNT蛋白可与DRE序列结合，再加入T7核酸外切酶，由于AhR/ARNT蛋白与DRE序列的结合阻碍了T7核酸外切酶对末端Cy5标记的单核苷酸的消化，使得2，3，7，8－TCDD的含量与荧光强度呈正相关，最后检测Cy5荧光分子的荧光值，根据荧光值的多少来确定样品中二恶英类化学物质的含量。本发明能快速准确的检测二恶英，检测成本低，应用前景广泛。
文档编号C12Q1/68GK1731150SQ200510019330
公开日2006年2月8日 申请日期2005年8月23日 优先权日2005年8月23日
发明者周亚凤, 张先恩, 游璠, 黄智 , 乔岩梅, 张治平 申请人:中国科学院武汉病毒研究所