专利名称：二恶英检测的方法
技术领域：
本发明涉及二恶英类污染物的检测，更具体涉及一种有效的快速定量检测二恶英类污染物的生物检测方法。
多氯代二苯并二恶英(PCDDs)和多氯代二苯并呋喃(PCDFs)， 由于它们在化学结构和毒理学上的相似性，在国际上均被统称为二恶英类化合物，简称二恶英(Dioxin)。由于这类化合物具有强烈的毒性和高度的化学稳定性，使之成为举世瞩目的重要环境污染物。由于二恶英异色体多达210种，毒性差异大而且在环境和食品中通常以超痕量水平存在，因此二恶英检测被视为现代分析的难点。目前，最为准确有效的分析方法为同位素稀释-有机溶剂提取-多层色谱柱纯化-高分辨色谱质谱仪(HRGC-Ms)检测。然而，建立这一套方法不仅需要购买昂贵的高分辨色谱质谱联用仪，而且还存在样品分析过程冗长、费时且成本高等问题，无法满足各种环境样品和进出口食品中二恶英快速定量筛选的需要，也不符合我国国情。因此，有必要建立一套符合我国国情而于推广的对二恶英污染物进行快速定量检测的方法。在我国利用化学方法检测二恶英，其费用最低为5000元/样品，用化学方法，一个人一次最多只能分析5个样品，而且操作复杂，所需时间为一个星期。
本发明的目的是提供了一种二恶英检测的方法，方法易行，操作简便，能快速、灵敏、准确地检测在食品中二恶英污染物的定量筛选。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施根据二恶英的致毒机制，即与Ah受体高度结合，并专一性地诱导细胞内某种特异性酶的特点，建立离体条件下测定二恶英的生物方法。通过测定酶的活力可定量测定样品中的二恶英的毒性当量，从而用之作为二恶英污染的监测，此外，以最毒二恶英异构体2，3，7，8-TCDD为模型化合物，利用标准曲线对样品中的二恶英进行定量并用化学方法对生物检测结果进行确认，将更进一步证明本生物检测方法的准确性和可靠性。
其检测步骤是①细胞培养使细胞长成致密的单层；②将细胞以一定密度接种在试剂盒中；③在试剂盒分别加入100μl含有样品提取液和二恶英标准溶液的培养基，培养72小时；④去除培养基，在试剂盒中加入荧光底物ERF(7-乙氧基-3-异吩恶唑酮)反应1小时；⑤加入乙醇终止反应，测定荧光产物RF(7-羟基-3-异吩恶唑酮)的荧光强度并计算酶活；⑥绘制剂量-效应二恶英标准曲线，并由此计算出样品中二恶英类化合物的毒性浓度。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果方法易行，操作简单，检测费用低，其费用只需100元/样品，可用于大批样品的检测，所需时间为24-72小时，可广泛应用于环境样品和食品中二恶英污染物的快速定量筛选。
实施例首先是将生物样品冷冻干燥后研磨成粉末，称取1-5g样品粉末，用甲苯索氏抽取24小时，再将提取液浓缩近干后，过一根三明治柱，收集洗脱液并浓缩近干；其次是细胞培养，使细胞长成致密的单层；第三是将细胞以一定密度接种在试剂盒中，在试剂盒中分别加入100μl含有生物样品提取液和二恶英标准的培养基，培养72小时；第四是去除培养基，在试剂盒中加入荧光底物A反应1小时；第五是加入试剂B终止反应，测定荧光产物C的荧光强度并计算酶活第六是绘制剂量-效应二恶英标准曲线，并由计算出样品中二恶英类化合物的毒性浓度。
湖北鸭儿湖地区严家湖各个氧化塘中自鲢鱼肝脏中二恶英的检测将本发明的生物检测方法应湖北鸭儿湖地区严家湖各个氧化塘中自鲢鱼肝脏中二恶英的检测，并与国际上的标准化学方法相比较，发现利用生物方法检测的结果与化学方法分析的结果具有很好的相关性和一致性(见表1)。从高浓度的1#塘鱼肝到低浓度的4#塘鱼肝，浓度相差很大，而生物检测方法都可以将这些结果很好的反映出来，说明生物检测方法测定生物样品中二恶英具有良好的准确性和可靠性。
表1 湖北鸭儿湖地区严家湖各个氧化塘中自鲢鱼肝脏中二恶英的化学分析和生物检测结果
权利要求
1.一种二恶英检测的方法，该方法包括下列步骤A、将生物样品冷冻干燥后研磨成粉末，称取粉末，甲苯索氏抽提24小时；B、细胞培养，使细胞长成致密的单层；C、将细胞接种在试剂盒中，在试剂盒中分别加入100μl含有样品提取液和二恶英的培养基，培养72小时；D、去除培养基，在试剂盒中加入荧光底物为7-乙氧基-3-异吩恶唑酮，反应1小时；E、加入乙醇终止反应，测定荧光物为7-羟基-3-异吩恶唑酮的荧光强度并计算酶活；F、绘制剂量-效应二恶英曲线，计算出样品中二恶英类化合物的毒性浓度。
全文摘要
本发明公开了一种二恶英检测的方法,其步骤是将生物样品冷冻干燥后研磨成粉末;细胞培养,再将细胞接种在试剂盒中,在试剂盒中加入样品提取液和二恶英的培养基;然后去除培养基,在试剂盒中加入荧光底物为7－乙氧基－3－异吩恶唑酮,反应1小时;加入乙醇终止反应,测定荧光物为7－羟基－3－异吩恶唑酮的荧光强度并计算酶活;绘制二恶英曲线,计算出样品中二恶英类化合物的毒性浓度。本发明方法易行,操作简便,检测费用低,可广泛应用于环境样品和食品中二恶英污染物的快速定量筛选。
文档编号G01N33/52GK1341859SQ0011600
公开日2002年3月27日 申请日期2000年9月7日 优先权日2000年9月7日
发明者吴文忠, 黎雯, 徐盈 申请人:中国科学院水生生物研究所