专利名称：处理有机工业废水功能菌qx－5的分子检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及SCAR(sequence characterizedamplified region)标记的筛选、片段分离克隆和分子检测。
背景技术：
QX-5是一种用于处理多种有机工业废水的短杆菌，申请者已应用于高浓度酿酒废水和生物农药发酵废水处理工程中。目前检测其在反应系统中的含量的方法是采用传统的纯培养技术，此方法步骤烦琐，工作量大，难以应用于实际废水处理工程中微生物功能菌株的快速、准确的监测。
近年来，一些渐为成熟的分子生物学技术在环境微生物学得到广泛应用，使人们可以避开传统的分离培养过程而直接探讨自然界中微生物的种群结构及其与环境的关系，弥补了传统的微生物生态学方法的不足。我们应用RAPD技术，寻找能处理多种有机废水的功能菌QX-5的DNA特异片段，并根据菌株检测的实际需要，将RAPD标记转化为稳定可靠的SCAR标记，该标记可用于快速、准确地鉴别和监测有机工业废水生物处理系统中的功能菌QX-5。
发明内容
本发明的第一方面为设计了一种用于扩增QX-5短杆菌特异性DNA的引物，其核苷酸序列如下上游引物5′TGCCGAGCTGAATAAGTATCC 3′下游引物5′GAAAAACGGAGCGGCGATTGAGC 3′本发明的第二方面为分离研究出了QX-5短杆菌的特异性DNA片段，其具有如下(1)或(2)所列的核苷酸序列(1)838bpTGCCGAGCTGAATAAGTATCCAATGAATAAGGCAATGATGGCATCAATCGATAATAAAATCATCGTCCCGATATTGAATTGCGCTATTAATTCTTTCGTATCAAAAGAAAATAAATATTTTCCGATGGAAGGGTCCTTAAATCCGATG
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(2)826bpTGCCGAGCTGAATAAGTATCCAATGAATAAGGCAATGATGGCATCAATCGATAATAAAATCATCGTCCCGATATTGAATTGCGCTATTAATTCTTTCGTATCAAAAGAAAATAAATATTTTCCGATGGAAGGGTCCTTAAATCCGATGAAGTAGCTGTATTCCTTACCCTTTCCATTTTTCCCTCCAGCATAGATCGTCGACATCAATTGCTTATCTTTATATTTATGTAAGTTTACAATTTCTATAGGTGTGTATTTGCTCTTTATGCCTTTAGGTGCTAGTGCTTGATAGACGTCTTGTCCATTTTCGTCTAATATTTGAATCCACGCATTTTGTTGTTTTAAGGCTTGCTGTCCTTCTTTACTCACAGTGATATTTTGATCAGACAAGGTGATGTATTGTTCAAATGTTCTTGTGAAGGTTTCCGGCGTATTTTCTTCGTTTTGCTGACTGCTGGCTTGTAGTACAAGCCATATCATGAATCCAAATAAGTTAATAAAGACCGTGATAATGGTCACGATAATGACAGAGACCATGTATCTGCCCTGTTAATCGCCATTTCATCCTTACGCATCCTTTACGACGAATTTATAGCCCAAGCCCCTTTGACCGTCACGAGAAATTCTGGTGTAGATGGGGGAATGTTCTATTTTTCCCCGCAGTCTTCGTATATGAACCATTACCGTATTATCAGAA
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本发明的第三方面为将上述引物和DNA特异片段用于处理有机工业废水的功能菌QX-5的鉴别和监测。
下面结合附图及具体实施方式
，对本发明作进一步说明。
图1是随机引物OPA02扩增结果电泳图。其中M表示分子量标记；泳道1～10分别对应于菌株QX-1，QX-2，QX-3，QX-4，QX-5，FA-1，FA-2，FA-3，S-1，S-2。泳道5显示出的约800bp片段为特异性片段。
图2为全长838bp的OPA02-838核苷酸序列图，其中下画线部分为随机引物OPA02序列所在位置，斜体部分为SCAR标记引物所在位置。
图3是利用特异引物对QX-5进行PCR扩增的结果图。其中第1泳道对应于含特异片段pMD18-T-vector克隆；第2泳道对应于QX-5基因组DNA扩增；第3泳道为1μL QX-5菌液直接扩增结果；第4泳道为对照QX-1基因组DNA的扩增结果。
图4是SCA02-826标记在QX-5、不同菌株基因组DNA及处理废水污泥中总DNA进行PCR扩增各种培养物的菌液PCR验证结果。其中，泳道1对应于E.coli JM109的扩增，泳道2对应于重组质粒扩增，泳道3对应于QX-1扩增，泳道4对应于QX-4的扩增，泳道5对应于QX-5的扩增，泳道6对应于QX-5菌液的扩增，泳道7对应于焦化废水降解菌B1的扩增，泳道8对应于焦化废水降解菌B2的扩增，泳道9对应于脱氰菌H-1的扩增，泳道10对应于脱氰菌H-2的扩增，泳道11对应于脱氮菌N-1的扩增，泳道12对应于脱氮菌N-2的扩增，泳道13对应于石油降解菌S-1的扩增，泳道14对应于石油降解菌S-2的扩增，泳道15对应于未投放QX-5的焦化废水污泥的扩增，泳道16对应于未投放QX-5的含氮废水污泥的扩增，泳道17对应于投放QX-5的发酵废水污泥的扩增，泳道18对应于投放QX-5的酿酒废水污泥的扩增，泳道19对应于未投放QX-5的油脂化工废水污泥的扩增，泳道20对应于QX-1～QX-5纯培养混和物的扩增，泳道21对应于QX-1～QX-4纯培养混和物的扩增，泳道22对应于FA-1～FA-3纯培养混和物的扩增，泳道23对应于不含QX系列细菌的其它纯培养混和物的扩增。
具体实施例方式
1.材料降解多种有机酸、糖类、醇类的功能菌株QX-5，短杆细菌，已应用于酿酒废水、发酵废水等处理工程。对照菌株QX-1、QX-2、QX-3、QX-4为杆菌，亦为降解多种有机酸、糖类、醇类的功能菌株；S-1、S-2为杆菌，为降解石油的功能菌；FA-1、FA-2、FA-3为处理油脂化工废水功能菌黄钧，白 威，李毅军.3株油脂化工废水降解菌的分离鉴定.应用与环境生物学报，1999，5(Suppl)74-76.；B-1、B-2为杆菌，为焦化废水降解菌；N-1、N-2为杆菌，为脱氮菌；H-1、H-2为球菌，为脱氰菌。以上所有菌株均由中国科学院成都生物研究所环境室保存，并可从中国科学院成都生物研究所购买得到。焦化废水污泥、含氮废水污泥、发酵废水污泥、酿酒废水污泥、油脂化工废水污泥取自本研究所示范工程。
2.RAPD分析细菌基因组DNA提取采用赛百盛公司“SBS树脂基因组DNA快速提取试剂盒”。采用Operon公司10碱基引物A和B共2套40条引物(OPA01～OPA20，OPB01～OPB20)，PCR(Biomitra)扩增。反应总体积50uL，组分如下1U TaqDNA聚合酶(TaKaRa)，1×Buffer，3mM MgCl2，200μMd NTPS，0.2μM引物和25ng模板DNA。扩增条件预变性94℃3min；45个循环94℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min。
3.引物筛选及QX-5特异DNA片段筛选用1.3％琼脂糖凝胶电泳分离基因组DNA的扩增产物，5V/cm稳压电泳，溴化乙锭染色，在凝胶成象系统(Bio-rad，GDS8000)上观察扩增结果并记录，照相。选取20个带型较为清晰，且具有特异性扩增带的引物，进行重复性实验。结果电泳条带得到重复扩增。其中OPA-02(TGCCGAGCTG)的扩增产物在QX-5样品中存在特异DNA扩增片段，带型清晰，即QX-5比其他材料在大约800bp有1条特异扩增带，用该引物重复扩增4次，均获得稳定的结果，如图1所示。
4.RAPD特异扩增产物的克隆和测序用胶回收试剂盒(V-gene生物技术有限公司)对图1所示约800bp片段回收、纯化，克隆到pMD 18-T Vector载体(TAKARA)上，转化大肠杆菌JM109，方法见分子克隆实验指南(第二版)J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇著，金冬雁等译.科学出版社，1992，16-66。经PCR扩增筛选阳性克隆，并测序。测序结果表明片段长度838bp，命名为OPA02-838，结果如图2所示。
5.GenBank Blast比对分析测序结果进入http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/比对分析。序列比对结果，表明没有同源片段。其中只有218～350bp和487～837bp与Bacillusamyloliquefaciens部分基因组及Bacillus subtilis bacillomycin D部分基因组分别有80％和83％同源。因此表明该片段是1新的片段，可以作为QX-5的分子标记。
6.SCAR标记及其引物的设计RAPD分子标记理论上检测范围可以覆盖整个基因组，而且不需要对被检测物种的基因组序列事先了解，这一特点对于遗传背景知之甚少的材料研究尤为有利。在国内该技术主要应用于高等生物，特别是植物的种质鉴定及系统分类研究等，而应用于原核生物材料的报道较少。本研究利用RAPD技术的优点，同时克服其稳定性差的缺点把RAPD标记转换成稳定可靠的SCAR标记。
按照RAPD产物OPA02-838片段的碱基序列，参考Paran的方法Paran I，Michelmore RW.Development of a sequence characterized amplified region(SCAR)based markers linked to downy mildew resistance gene sinlettuce.TheorAppl Genet，1993，85985-993，并考虑到PCR引物设计的基本原则C.W.迪芬巴赫，G.S.德维克斯勒著，黄培堂等译.PCR技术实验指南.科学出版社，1998，117-173.，应用引物设计软件Primer 5在该片段两端设计了1对SCAR引物。序列如下上游引物5′TGCCGAGCTGAATAAGTATCC 3′下游引物5′GAAAAACGGAGCGGCGATTGAGC 3′上游引物的5′端都包含了原来的RAPD引物OPA02的序列5′TGCCGAGCTG 3′。扩增片段长度826bp，命名为SCA02-826。
用这对SCAR引物对QX-5基因组DNA、T-vector重组子、及其菌液进行PCR扩增，扩增出826bp特异亮带，如图3所示
7.分子检测以纯培养物及各种不同生物处理废水的混合培养物(含有或不含QX-5菌株)总DNA，进行PCR扩增，以验证SCAR标记。PCR反应在Biometra PCR仪上进行。反应总体积50uL，组分如下1U TaqDNA聚合酶(TaKaRa)，1×Buffer，3mM MgCl2，200μM d NTPS，0.2μM引物和25ng模板DNA。反应条件为95℃4min；35个循环94℃30s，55℃30s，72℃30s；终延伸72℃10min。本实验也采用直接以菌液作为模板替代基因组DNA用于PCR检测。
应用QX-5特异的分子标记，通过PCR反应，快速有效地检测了靶菌。
SCA02-826在QX-5中表现出对QX-5的特异性。用此标记对其他细菌特别是污水处理系统中的菌群的特异性进行了检测。用这对SCAR引物对QX-5、不同菌株基因组DNA及处理废水污泥中总DNA进行PCR扩增。只有在含有QX-5的样品中才能扩增出与阳性对照片段大小一致的片段，而在其他不含QX-5的样品中均没有扩增。结果表明SCA02-826对QX-5有稳定的特异性，RAPD标记已成功转化为稳定的SCAR标记，并可以用于处理有机工业废水的功能菌QX-5的鉴别和监测。图4所示。
QX-5短~1.TXTSEQUENCE LISTING<110>中国科学院成都生物研究所<120>处理有机工业废水功能菌QX-5的分子检测<130>/<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>838<212>DNA<213>微生物<400>1tgccgagctg aataagtatc caatgaataa ggcaatgatg gcatcaatcg ataataaaat 60catcgtcccg atattgaatt gcgctattaa ttctttcgta tcaaaagaaa ataaatattt120tccgatggaa gggtccttaa atccgatgaa gtagctgtat tccttaccct ttccattttt180ccctccagca tagatcgtcg acatcaattg cttatcttta tatttatgta agtttacaat240ttctataggt gtgtatttgc tctttatgcc tttaggtgct agtgcttgat agacgtcttg300tccattttcg tctaatattt gaatccacgc attttgttgt tttaaggctt gctgtccttc360tttactcaca gtgatatttt gatcagacaa ggtgatgtat tgttcaaatg ttcttgtgaa420ggtttccggc gtattttctt cgttttgctg actgctggct tgtagtacaa gccatatcat480gaatccaaat aagttaataa agaccgtgat aatggtcacg ataatgacag agaccatgta540tctgccctgt taatcgccat ttcatcctta cgcatccttt acgacgaatt tatagcccaa600gcccctttga ccgtcacgag aaattctggt gtagatgggg gaatgttcta tttttccccg660cagtcttcgt atatgaacca ttaccgtatt atcagaaccg aagaaatcct ctccccaaac720cgtttgataa agcgtttctt tactgatgac gcgattcgga tgctgcaaga aataagtcat780caacataagt tctttcggag tgagctcaat cgccgctccg tttttcgtca gctcggca 838<210>2<211>826<212>DNA<213>微生物<400>2tgccgagctg aataagtatc caatgaataa ggcaatgatg gcatcaatcg ataataaaat 60catcgtcccg atattgaatt gcgctattaa ttctttcgta tcaaaagaaa ataaatattt120tccgatggaa gggtccttaa atccgatgaa gtagctgtat tccttaccct ttccattttt180ccctccagca tagatcgtcg acatcaattg cttatcttta tatttatgta agtttacaat240ttctataggt gtgtatttgc tctttatgcc tttaggtgct agtgcttgat agacgtcttg300tccattttcg tctaatattt gaatccacgc attttgttgt tttaaggctt gctgtccttc360tttactcaca gtgatatttt gatcagacaa ggtgatgtat tgttcaaatg ttcttgtgaa420ggtttccggc gtattttctt cgttttgctg actgctggct tgtagtacaa gccatatcat480gaatccaaat aagttaataa agaccgtgat aatggtcacg ataatgacag agaccatgta540tctgccctgt taatcgccat ttcatcctta cgcatccttt acgacgaatt tatagcccaa600gcccctttga ccgtcacgag aaattctggt gtagatgggg gaatgttcta tttttccccg660
QX-5短~1.TXTcagtcttcgt atatgaacca ttaccgtatt atcagaaccg aagaaatcct ctccccaaac720cgtttgataa agcgtttctt tactgatgac gcgattcgga tgctgcaaga aataagtcat780caacataagt tctttcggag tgagctcaat cgccgctccg tttttc 826<210>3<211>21<212>DNA<213>微生物<400>3tgccgagctg aataagtatc c 21<210>4<211>23<212>DNA<213>微生物<400>4gaaaaacgga gcggcgattg agc 2权利要求
1.处理有机工业废水的功能菌QX-5的DNA特征片段，其具有如下所列的核苷酸序列TGCCGAGCTGAATAAGTATCCAATGAATAAGGCAATGATGGCATCAATCGATAATAAAATCATCGTCCCGATATTGAATTGCGCTATTAATTCTTTCGTATCAAAAGAAAATAAATATTTTCCGATGGAAGGGTCCTTAAATCCGATGAAGTAGCTGTATTCCTTACCCTTTCCATTTTTCCCTCCAGCATAGATCGTCGACATCAATTGCTTATCTTTATATTTATGTAAGTTTACAATTTCTATAGGTGTGTATTTGCTCTTTATGCCTTTAGGTGCTAGTGCTTGATAGACGTCTTGTCCATTTTCGTCTAATATTTGAATCCACGCATTTTGTTGTTTTAAGGCTTGCTGTCCTTCTTTACTCACAGTGATATTTTGATCAGACAAGGTGATGTATTGTTCAAATGTTCTTGTGAAGGTTTCCGGCGTATTTTCTTCGTTTTGCTGACTGCTGGCTTGTAGTACAAGCCATATCATGAATCCAAATAAGTTAATAAAGACCGTGATAATGGTCACGATAATGACAGAGACCATGTATCTGCCCTGTTAATCGCCATTTCATCCTTACGCATCCTTTACGACGAATTTATAGCCCAAGCCCCTTTGACCGTCACGAGAAATTCTGGTGTAGATGGGGGAATGTTCTATTTTTCCCCGCAGTCTTCGTATATGAACCATTACCGTATTATCAGAACCGAAGAAATCCTCTCCCCAAACCGTTTGATAAAGCGTTTCTTTACTGATGACGCGATTCGGATGCTGCAAGAAATAAGTCATCAACATAAGTTCTTTCGGAGTGAGCTCAATCGCCGCTCCGTTTTTCGTCAGCTCGGCA。
2.权利要求1所述的处理有机工业废水的功能菌QX-5的DNA特征片段，其具有如下所列的核苷酸序列TGCCGAGCTGAATAAGTATCCAATGAATAAGGCAATGATGGCATCAATCGATAATAAAATCATCGTCCCGATATTGAATTGCGCTATTAATTCTTTCGTATCAAAAGAAAATAAATATTTTCCGATGGAAGGGTCCTTAAATCCGATGAAGTAGCTGTATTCCTTACCCTTTCCATTTTTCCCTCCAGCATAGATCGTCGACATCAATTGCTTATCTTTATATTTATGTAAGTTTACAATTTCTATAGGTGTGTATTTGCTCTTTATGCCTTTAGGTGCTAGTGCTTGATAGACGTCTTGTCCATTTTCGTCTAATATTTGAATCCACGCATTTTGTTGTTTTAAGGCTTGCTGTCCTTCTTTACTCACAGTGATATTTTGATCAGACAAGGTGATGTATTGTTCAAATGTTCTTGTGAAGGTTTCCGGCGTATTTTCTTCGTTTTGCTGACTGCTGGCTTGTAGTACAAGCCATATCATGAATCCAAATAAGTTAATAAAGACCGTGATAATGGTCACGATAATGACAGAGACCATGTATCTGCCCTGTTAATCGCCATTTCATCCTTACGCATCCTTTACGACGAATTTATAGCCCAAGCCCCTTTGACCGTCACGAGAAATTCTGGTGTAGATGGGGGAATGTTCTATTTTTCCCCGCAGTCTTCGTATATGAACCATTACCGTATTATCAGAACCGAAGAAATCCTCTCCCCAAACCGTTTGATAAAGCGTTTCTTTACTGATGACGCGATTCGGATGCTGCAAGAAATAAGTCATCAACATAAGTTCTTTCGGAGTGAGCTCAATCGCCGCTCCGTTTTTC。
3.一种用于权利要求1或权利要求2所述的处理有机工业废水的功能菌QX-5的DNA特征片段的扩增引物，其核苷酸序列如下上游引物5′TGCCGAGCTGAATAAGTATCC 3′下游引物5′GAAAAACGGAGCGGCGATTGAGC 3′
4.权利要求1或权利要求2所述的DNA片段或权利要求3所述的引物，在对处理有机工业废水的功能菌QX-5的鉴别和监测中的应用。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及处理有机工业废水功能菌QX－5的分子标记。筛选出QX－5的DNA特征片段，设计了PCR扩增引物，将该特征片段转换成稳定可靠的SCAR标记。该标记可用于快速、准确地鉴别和监测有机工业废水生物处理系统中的功能菌QX－5。
文档编号C12Q1/68GK1986812SQ20051002236
公开日2007年6月27日 申请日期2005年12月23日 优先权日2005年12月23日
发明者黄钧, 马欣荣, 李毅军, 刘华玲 申请人:中国科学院成都生物研究所