专利名称：一种快速测定废水处理系统中功能菌含量的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种废水处理系统中功能菌的快速测定方法。
背景技术：
废水生物处理系统中活性污泥的微生物种群组成，很大程度决定该系统的处理效果高平平，赵立平.TGGE分析焦化废水处理系统活性污泥细菌种群动态变化及多样性.生态学报，2003，23(10)1963-1969.。研究微生物群落组成的传统方法是以纯培养技术为基础，但此方法鉴定的微生物只占群落总数的0.1％～10％Torsvik V，Ovreas L.Microbial Diversity and CommunityStructure in Two Different Agricultural Soil Communities.Microb.Ecol，1998，36303-315.，而容易培养的分离物并不总是生态学上的优势种余利岩，姚天爵.微生物生态学研究方法的新进展.微生物学通报，2001，28(1)89-93.，造成对许多重要的微生物生态系统中种群结构认识很不全面。
近年来，一些渐为成熟的分子生物学技术在环境微生物学得到应用Bernard L，Courties C，Duperray C，et al.A new approach to determine thegenetic diversity of viabale and active bacteria in aquatic ecosystems.Cytometry，2001；43(4)314-321，如分子标记技术、凝胶电泳技术、克隆技术、原位杂交技术等，使人们可以避开传统的分离培养过程而直接探讨自然界中微生物的种群结构及其与环境的关系，弥补了传统的微生物生态学方法的不足。
但是应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)这一分子生物学方法对废水生物处理系统中功能菌的定量检测，还未见报道。
发明内容
本发明目的在于以废水处理系统中功能菌的DNA特异片段作为检测的靶序列，应用荧光定量聚合酶链反应体外扩增，建立一种操作简单，能够快速、准确检测废水处理系统中功能菌含量的技术，其具体检测步骤如下第一步，特异DNA片段的选择。根据处理不同废水的功能菌株，选择适合的DNA特异片段。
第二步，提取总DNA。提取废水生物处理系统中微生物的总DNA，并用核酸测定仪测定其含量(μg/mL)。
第三步，引物和探针的设计合成。根据选定的功能菌的DNA特异序列和引物探针设计合成原则，设计合成一对功能菌特异的引物和一条Taqman探针。
第四步，标准曲线制定。用已知初始拷贝数的靶DNA模板按10倍梯度进行稀释，制成标准模板系列，进行实时荧光定量PCR。将引物、探针、耐热DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等混匀成反应体系，在定量热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环和荧光检测，进行25-45个热循环。在此过程中，荧光定量PCR仪与含控制分析软件的计算机连接，进行自动读取各个反应管的每个循环后的荧光值和绘制荧光变化曲线，读取每个反应的Ct值(样品管中荧光强度增加到某一特定阈值(threshold)时的扩增循环数)。以Ct值为纵坐标、标准模板起始拷贝数的对数值为横坐标作图，得到该样品的标准曲线。如果其相关系数大于0.96，则作为检测用标准曲线，对应的反应体系作为检测样品用的反应体系。
第五步，功能菌样品的荧光定量PCR测定。采用与获得标准曲线相同的反应体系，对各个样品分别进行荧光定量PCR扩增，测定样品的Ct值。
第六步，功能菌含量计算。根据样品的Ct值和标准曲线，计算功能菌含量。利用以下公式计算Nx＝N0×YCto-Ctx其中Nx为扩增管x的靶基因的起始拷贝数，即被检测的功能菌个数。
N0为标准曲线上的一点所对应的拷贝数。
Y为扩增效率，由公式Y＝101/ΔCt(ΔCt＝靶DNA每稀释10倍，平均增加的Ct值数)计算获得；相当于Ct值减少1个循环对应的模板DNA的增加的倍数。
Ctx为扩增管x的靶基因的Ct值。
Ct0为标准曲线上靶基因拷贝数为N0时的Ct值。
废水生物处理系统中功能菌数(个/mL)＝被检测靶基因拷贝数(个/mL)。
由此可以反映功能菌在废水生物处理系统中的生态地位。
第七步，试剂盒的装配。依据上述方法步骤，将引物、探针、制定标准曲线用的功能菌不同稀释倍数的DNA系列模板、耐热DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水，以及操作步骤说明书、计算公式等装配成废水处理系统功能菌检测试剂盒，可以方便应用于实际检测中。
下面结合
和具体实施方式
，对本发明作进一步说明。
图1为QX-5基因梯度稀释模板荧光定量PCR动力学曲线。
图2为QX-5基因荧光定量PCR标准曲线R2＝1。
具体实施例方式
有机工业废水生物处理系统中，功能菌QX-5含量的测定。
1、材料菌株大肠杆菌菌株E.coli JM109和QX-5。
活性污泥样本A，B，C，D，E，F，G；其中A、B、C、D、E样品中投加有QX-5，对照F，G样品中没有投加QX-5。
2、样本总DNA的提取和检测取不同的活性污泥1mL，采用赛百盛公司“SBS树脂基因组DNA快速提取试剂盒”提取，分别提取其DNA，得活性污泥DNA样本A，B，C，D，E，F，G。用紫外分光光度计测定每个样本的DNA浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳、染色、观察其纯度并根据DNAMaker判别DNA分子的大小及一致性。
3、引物设计根据申请者已克隆的QX-5的特异DNA序列(已申请发明专利)分别设计其特异引物和探针，序列如下上游引物5′CCTGTTAATCGCCATTTCAT 3′下游引物5′GAAACGCTTTATCAAACGGTT 3′探针5′FAM-CAAGCCCCTTTGACCGTCACGAG-TAMRA 3′序列如下5 ′-ACCATGTATCTGC CCTTACGCATCCTTTACGACGAATTTATAGCC AAATTCTGGTGTAGATGGGGGAATGTTCTATTTTTCCCCGCAGTCTTCGTATATGAACCATTACCGTATTATCAGAACCGAAGAAATCCTCTCCCCA TTTACTGATGACGCGATTCGGATGCTGCAAGAAATAAGTCATCAACATAAGTTCTTTCGGAGTGAGCTCAATCGCCGCTCCGTTTTTCGTCAGCTCGGCA-3′4、标准曲线制作首先制备标准品DNA将经过测序验证过的含有靶DNA的质粒经过分光光度计测定浓度，并根据其分子量换算成质粒拷贝/μL。用TE稀释成5×105拷贝/μL，5×104拷贝/μL，5×103拷贝/μL，5×102拷贝/μL，5×10拷贝/μL等5个浓度梯度，制成标准品DNA。
然后自每个稀释模板中取样2μl样品，分别加入总体积30μL的反应体系中，进行实时荧光定量PCR。扩增体系为1U TaqDNA聚合酶，1×Buffer，0.3mmol/L MgCl2，200μmol/L d NTPS，0.3μmol/L引物，0.3μmol/L探针和2μL模板DNA。扩增程序预变性94℃3min；94℃变性20s，52℃退火30s，60℃延伸40s；于60℃时检测收集荧光；共40个循环。分析每个标本的扩增曲线，获得其Ct值。40循环的扩增反应结束后，系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数(DRn)进行分析，绘制每一反应管的扩增动力学曲线。根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈值(threshold)时的扩增循环数(Ct值)。并根据各稀释度的Ct值绘制标准曲线。若相关系数大于0.96，认为拟合满意。
5、荧光定量PCR扩增检测分别用QX-5特异引物对上述提取获得的DNA标本进行荧光定量PCR扩增，30μL扩增体系组分如下1U TaqDNA聚合酶，1×Buffer，0.3mmol/LMgCl2，200μmol/L d NTPS，0.3μmol/L引物，0.3μmol/L探针和2μL模板DNA。扩增程序预变性94℃3min；94℃变性20s，52℃退火30s，60℃延伸40s；于60℃时检测收集荧光；共40个循环。分析每个标本的扩增曲线，获得其Ct值。
6、测定结果本试验获得的QX-5基因荧光定量PCR标准曲线R2＝1。见图1、图2。
根据标准曲线，由公式Y＝101/ΔCt计算出Y＝1.78。
采用公式Nx＝N0×YCto-Ctx，根据每一个反应的Ct值计算出每个扩增管中功能菌特异基因的拷贝数，即获得单位体积活性污泥中功能菌QX-5的个数为活性污泥A每毫升含8.4×108个QX-5，活性污泥B每毫升含3.6×108个QX-5，活性污泥C每毫升含3.0×106个QX-5，活性污泥D每毫升含1.3×108个QX-5，活性污泥E每毫升含1.7×107个QX-5，活性污泥F和G不含QX-5。结果见表1。
再根据每个标本的DNA浓度计算出每μg混合DNA中功能菌特异基因的拷贝数，即获知废水处理生物系统中功能菌的相对含量，从而反映功能菌QX-5在废水生物处理系统中的生态地位。
结果表明，通过对功能菌特异片段进行荧光定量PCR测定，可以快速、准确、有效地检测废水处理系统中功能菌的含量。
依据上述方法步骤，将QX-5引物、探针、制定标准曲线用的不同稀释倍数的DNA系列模板、耐热DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水，以及操作步骤说明书、计算公式等装配成试剂盒，命名为有机工业废水处理系统功能菌QX-5检测试剂盒，应用于实际投放了功能菌QX-5的废水生物处理系统中QX-5的检测中。
表1.不同活性污泥样本Ct值和QX-5拷贝数
权利要求
1.一种快速测定废水处理系统中功能菌含量的方法，包括功能菌特异DNA片段的选择，微生物总DNA的提取，引物和探针的设计合成，标准曲线制定，功能菌样品的荧光定量PCR测定，功能菌含量计算、试剂盒的装配等步骤。
2.根据权利要求1所述的快速测定废水处理系统中功能菌含量的方法，其特征是所述荧光定量PCR测定是将含有功能菌特异引物和探针、耐热DNA聚合酶、dNTP底物、待检测模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等的反应体系在荧光定量PCR仪上进行反复的高温、低温、中温热循环和荧光检测而达到目的DNA片段大量扩增和荧光信号的检测记录与分析，获得待检测模板DNA序列的定量结果。
3.根据权利要求1所述的快速测定废水处理系统中功能菌含量的方法，其特征是所述引物和探针的设计是依据不同功能菌特异DNA序列进行设计和合成。
4.根据权利要求1所述的快速测定废水处理系统中功能菌含量的方法，其特征是所述功能菌含量的计算是根据被测样品中功能菌个数等于被检测靶基因拷贝数进行的。
5.根据权利要求1所述的快速测定废水处理系统中功能菌含量的方法，其特征是所述试剂盒是依据本发明所述功能菌特异DNA体外扩增技术，将引物、探针、制定标准曲线用的功能菌不同稀释倍数的DNA系列模板、耐热DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水，以及操作步骤说明书、计算公式等装配而成，用于废水处理系统功能菌的快速检测。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种快速测定废水处理系统中功能菌含量的方法，包括功能菌特异DNA片段的选择，微生物总DNA的提取，引物和探针的设计合成，标准曲线制定，功能菌样品的荧光定量PCR测定，功能菌含量计算、试剂盒的装配等步骤。该方法操作简单，能够快速准确检测废水中功能菌的含量。
文档编号C12Q1/02GK1987428SQ200510022360
公开日2007年6月27日 申请日期2005年12月23日 优先权日2005年12月23日
发明者黄钧, 马欣荣, 李毅军 申请人:中国科学院成都生物研究所