专利名称：Dna荧光毛细生物传感器及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于DNA荧光毛细分析(DNA-FCA)的DNA荧光毛细生物传感器(DNA-FCBS)及其制备方法，属于生物化学和分子生物学分析领域。本发明适用于医药、卫生、农林等生物样品的基因检测。
背景技术：
目前DNA检测方法主要是利用DNA芯片和DNA传感器。DNA芯片分析的实质是在很小面积的基片表面进行有序的点阵，排列一系列可寻址的识别分子，根据碱基互补的原则，用精密的扫描仪或CCD摄像技术对靶DNA进行识别。DNA芯片的特点是一次能测量多个靶DNA，但有非特异杂交的可能，耗时长，制作成本高，检测仪器昂贵，难以普及。
光纤DNA生物传感器是DNA生物传感器中最新技术，主要是在石英光纤表面用化学法或物理法固定DNA探针或cDNA，然后将固定有DNA探针的光纤一端浸入到溶液中与荧光标记的靶DNA杂交；也可将DNA探针固定在光导纤维的末端上，然后将若干条固定有DNA探针的光导纤维合成一束，形成一个光纤DNA传感器微阵列，光纤的另一端耦合到荧光显微镜中，来自荧光显微镜的激光通过光纤传导，使靶DNA上的荧光标记物被激发产生荧光，所产生的荧光信号仍经光纤返回到荧光显微镜中，由CCD成像，获得DNA杂交的图谱。但是，光纤DNA传感器的不足是，一端的裸露部分易折断，DNA探针的固定量和结合靶DNA量较小，产生的荧光信号弱，检测灵敏度低，稳定性较差，检测仪器复杂、昂贵。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于DNA荧光毛细分析(DNA-FCA)的DNA荧光毛细生物传感器(DNA-FCBS)及其制备方法，解决现有技术所存在的问题。
本发明的测定原理是根据两条DNA单链碱基互补的原则，用已知序列的DNA探针分子检测互补的靶DNA分子，根据靶DNA分子上荧光标记物质的荧光强度定量和定性靶DNA分子，或者利用嵌入型荧光染料对与DNA探针分子互补结合形成的双链DNA分子进行标记，然后进行荧光检测，达到对靶DNA分子定性和定量的目的。
本发明用于DNA-FCA的DNA-FCBS如图1所示，其特征是它包括毛细管、多聚赖氨酸、DNA探针；使用时，用DNA-FCBS和一个固定座替代常规荧光分析中的试液槽，将其置于荧光分析仪光路中。利用DNA-FCBS可实施DNA-FCA，实施基因的测定及研究。
本发明的DNA-FCBS材质可以是石英玻璃、光学玻璃或透明塑料，其长度为3～5cm，容量为2～10μL，内径为0.14～0.90mm，外径为0.55～1.20mm，壁厚为0.10～0.25mm；它的内孔可以是圆形、也可以是矩形，矩形时边长为0.25～0.45mm，壁厚为0.10～0.25mm；固定化DNA浓度为10～100μmol/L。
本发明DNA-FCBS中可改变DNA探针种类，制成不同用途的DNA-FCBS和DNA荧光毛细生物测试盒。
本发明DNA-FCBS中可以固定一种DNA探针，也可同时固定两种以上的DNA探针。
本发明DNA-FCBS可直接用于已商品化的各种荧光分析仪。
本发明DNA-FCBS制备方法包括以下步骤1)毛细管的化学修饰利用毛细现象将0.2％多聚赖氨酸吸入毛细管内，在室温下，置于旋转混合仪上使其反应1h，使多聚赖氨酸共价结合在毛细管的内壁上。
2)DNA探针固定化用无菌二次蒸馏水洗掉毛细管内游离的多聚赖氨酸之后，吸入10～100μmol/L的DNA探针溶液10μL，在42℃下置于旋转混合仪上，使其进行共价结合反应30min；然后在80℃下毛细管干燥1h，再迅速吸入预冷的固定液(甲醇∶乙酸＝3∶1)，放置5min；用无菌二次蒸馏水洗出毛细管内固定液，排空后，重复加热(80℃)步骤和预冷固定步骤3次，每步骤5min，最后用0.2％十二烷基硫酸钠(SDS)和无菌二次蒸馏水各清洗1次。
3)化学修饰基团的封闭将固定有DNA探针的毛细管浸泡在含龟鱼精DNA的预杂交液中6～12h，封闭未结合的多聚赖氨酸，制成DNA-FCBS；最后，将DNA-FCBS保存在-20℃的冰箱内备用。
本发明的基本技术参数为Cy5标记的靶DNA测定范围在0.1～1.0μmol/L，检出限为1.7pmol，相对标准偏差RSD＜4.60％，DNA探针固定浓度为10-100μmol/L；杂交反应时间1～2h，杂交反应温度45℃，解链温度为95～97℃，DNA-FCBS可重复使用6次。
本发明的优点和积极效果是1)可用DNA-FCBS替代常规的荧光试液槽，实现DNA-FCA法；2)DNA-FCBS中可单独固定一种DNA探针，也可同时固定两种以上的DNA探针，进行两个以上靶DNA的同时测定；3)可改变DNA-FCBS中的DNA探针种类，制成不同用途的DNA-FCBS和DNA荧光毛细生物测试盒；4)DNA-FCBS可直接用于已商品化的各种荧光分析仪；5)DNA探针在DNA-FCBS中固定化后可以重复使用，能节约大量的贵重试剂，降低实验成本；6)操作简便，便于携带和保存，可用于各种生物样品中DNA测定，能产生巨大的经济效益。
图1本发明DNA-FCBS结构示意中S样品、1毛细管、2多聚赖氨酸、3DNA探针图2实施例2是用本发明DNA-FCBS测定DNA得到的标准曲线图具体实施例结合附图对本发明的实施例作进一步描述实施例1本实施例是用合成的100μmol/L寡核苷酸序列5′-GAAA CCTG TTTG TTGG ATAC-3′作为DNA探针，按上述方法固定于毛细管内表面，制成DNA-FCBS。
测定时，用DNA-FCBS吸入33μmol/L靶核苷酸序列5′-GTATCC AACAAACA GGTTTC-3′溶液10μL，在45℃下使其杂交反应90min；之后对形成的双链DNA用溴乙啶(EB)染色；用0.2％SDS和二乙酯焦碳酸(DEPC)水洗出DNA-FCBS内游离的EB染色液；用RF-5000荧光光度仪在激发波长526nm，发射波长584nm处测定，得到的结果是杂交前后荧光强度的平均值为74.01±14.12，统计学分析结果t＝4.1106，p＜0.05，杂交前后有显著性差异。
实施例2本实施例是用本发明DNA-FCBS吸入1μmol/L Cy5标记的靶核苷酸序列5′-GTATCCAACAAACA GGTTTC-3溶液10μL，在45℃下使其杂交反应90min；用0.2％SDS和DEPC水洗出DNA-FCBS内游离的靶核苷酸；用RF-5000荧光光度仪在激发波长646nm，发射波长664nm处测定，结果如表1所示；杂交前后荧光强度的平均值为61.66±18.22，统计学分析结果t＝6.7684，0.005＜P＜0.01，杂交前后有高度显著性差异。
表1.
实施例3本实施例是在杂交时间为90min、杂交温度为45℃的实验条件下，用本发明DNA-FCBS吸入一系列不同浓度的Cy5标记靶核苷酸溶液，用RF-5000荧光光度仪在激发波长646nm，发射波长664nm处测定，结果如图2所示。Cy5标记的靶核苷酸浓度在0.1～1μmol/L的范围内和荧光强度有良好的线性关系y＝139.73x+39.613，相关系数为0.9985，检出限1.7pmol。
实施例4本实施例是考察本发明DNA-FCBS的精密度和再生性。在杂交温度45℃、杂交时间90min、解链温度95℃，解链时间4min的实验条件下，用本发明DNA-FCBS反复吸入1μmol/LCy5标记靶DNA试样，用RF-5000荧光光度仪在激发波长646nm，发射波长664nm处多次测定，其结果如表2所示。
可以看出，DNA-FCBS可重复利用6次，第7次后荧光强度明显降低；6次重复测定的荧光强度平均值为172.93，标准差为9.47，相对标准偏差为5.5％。
表2.
权利要求
1.用于DNA荧光毛细分析(DNA-FCA)的DNA毛细生物传感器(DNA-FCBS)，其特征是它包括毛细管(1)、多聚赖氨酸(2)、DNA探针(3)，利用DNA-FCBS可实施DNA-FCA，实施基因的测定及研究。
2.如权利要求1所述的DNA-FCBS，其特征是毛细管(1)的材质可以是石英玻璃、光学玻璃或透明塑料，长度为3～5cm，容量为2～10μL，内径为0.14～0.90mm，外径为0.55～1.20mm，壁厚为0.10～0.25mm；毛细管(1)的内孔可以是圆形、也可以是矩形，矩形时边长为0.25～0.45mm，壁厚为0.10～0.25mm；固定化DNA探针浓度为10～100μmol/L。
3.如权利要求1所述的DNA-FCBS，其特征是可改变DNA-FCBS中的DNA探针(3)种类，制成不同用途的DNA-FCBS和DNA荧光毛细生物测试盒。
4.如权利要求1所述的DNA-FCBS，其特征是可以在DNA-FCBS中固定一种DNA探针(3)，也可同时固定两种以上的DNA探针(3)。
5.如权利要求1所述的DNA-FCBS，其特征在于可直接用于已商品化的各种荧光分析仪。
6.如权利要求1所述的DNA-FCBS制备方法，其特征在于包括以下步骤1)毛细管的化学修饰利用毛细现象将0.2％多聚赖氨酸吸入毛细管(1)内，在室温下，置于旋转混合仪上使其反应1h，使多聚赖氨酸共价结合在毛细管(1)的内壁上。2)DNA探针固定化用无菌二次蒸馏水洗掉毛细管内游离的多聚赖氨酸(2)之后，吸入10～100μmol/L的DNA探针(3)溶液10μL，在42℃下置于旋转混合仪上，使其进行共价结合反应30min；然后在80℃下毛细管(1)干燥1h，再迅速吸入预冷的固定液(甲醇∶乙酸＝3∶1)，放置5min；用无菌二次蒸馏水洗出毛细管(1)内固定液，排空后，重复加热(80℃)步骤和预冷固定步骤3次，每步骤5min，最后用0.2％十二烷基硫酸钠和无菌二次蒸馏水各清洗1次。3)化学修饰基团的封闭将固定有DNA探针(3)的毛细管(1)浸泡在含龟鱼精DNA的预杂交液中6～12h，封闭未结合的多聚赖氨酸(2)，制成DNA-FCBS；最后，将DNA-FCBS保存在-20℃的冰箱内备用。
全文摘要
本发明公开了一种DNA荧光毛细生物传感器(DNA－FCBS)及其制备方法。属于生化分析领域。DNA－FCBS是用交联剂将DNA探针固定于毛细管内制成，它包括毛细管、多聚赖氨酸、DNA探针；它可实现DNA的定性和定量测定。用DNA－FCBS吸入含靶DNA样品液，进行杂交和染色反应后，置于荧光仪中，根据荧光强度定量靶DNA；改变DNA－FCBS内探针种类，可以测定不同的靶核甘酸；在DNA－FCBS内同时固定多种探针，可以同时测定多种靶核甘酸；DNA－FCBS也可制成各种DNA荧光毛细生物测试盒；本发明重现性好、操作简便，可实现微量化、快速化测定；可使基因检测达到普及化和实用化。
文档编号C12Q1/68GK1824797SQ20051002241
公开日2006年8月30日 申请日期2005年12月28日 优先权日2005年12月28日
发明者李永生, 高秀峰 申请人:四川大学