专利名称：生物红细胞体积长期稳定的处理方法
技术领域：
本发明涉及医用配制品，尤其涉及含有生物血红细胞的医用配制品，特别涉及制备血液细胞分析中所用含血红细胞的质控物。
背景技术：
红细胞体积的长期稳定在生物学研究中具有非常大的应用价值。以血液细胞分析仪为例，仪器的质量控制、校准都需要使用体积准确稳定的细胞例子实现，而红细胞是生物血液中含量最大的成分，其影响能力往往是白细胞粒子的1000倍，在体积参数的控制中是最关键的因素。血液细胞分析仪可以分析细胞的数量、体积、血红蛋白等多个信息，如果体积参数测试不准确，则会导致很多相关参数的测试错误，对临床诊断工作造成极大影响，比如对于红细胞的血红蛋白浓度、含量等与贫血治疗特别相关的参数就影响非常明显，所以必须建立可靠的质量控制体系和校准体系。实现质量控制和校准体系所使用的材料主要依靠质控物和校准物进行。质控物和校准物本身是变化很小的多种粒子混合体。其中类白细胞粒子和类血小板粒子多为完全固定的细胞粒子或者塑料微球等物质，含量不高，并且不用与仪器的溶血素(表面活性剂)进行反应。质控物、校准物更多的细胞成分为红细胞。红细胞必须保持与溶血素的反应能力，否则就会表现出与类白细胞一样的物理化学性质，成为1000倍数量级的假白细胞粒子而干扰测定，这点是红细胞与白细胞存在的一个重大差别。所以对红细胞的要求如下必须保持与仪器溶血素的反应能力，不可以成为假白细胞粒子干扰其他参数测定；必须保持体积的长期稳定，在质控物和校准物要求的有效期内平均红细胞体积变化微小；现有的红细胞处理技术，关于体积稳定的内容非常稀少，可供参考的有中国专利ZL94192671公开的一种细胞的制备和稳定化方法，而关于质控物的制备技术，有较多的文献记载，如中国专利申请99116350公开的一种血液学细胞三分类全血质控物，美国专利申请号为20030104631的文件公开了一种血液质控的制备方法，美国专利US 6514763公开的一种血液质控物及其制备方法，US 4704364公开的一种血白细胞三分类质控组合物及其制备方法和用途，更多的知识集中在如何保护红细胞的生理活性以及白细胞的处理上。我们通过长期收集资料，总结出红细胞的常见处理技术，分为使用固定试剂和固定方法进行处理以及使用红细胞的各种保存试剂技术两个大类。固定技术常见各种醛类、酸类、酯类、酮类和放射线等技术；保存试剂技术多为血库和生物免疫类的的试剂保存技术。这些技术在制备质控物这个应用领域中，存在以下缺陷固定的红细胞如果强度过高则容易产生和白细胞一样的性质，特别是不会被表面活性剂溶解或不完全溶解；如果固定程度不足则红细胞体积和其他参数的稳定性不足，不满足长期稳定性要求；使用保存技术保存的红细胞可以具备或部分具备生理活性，可以在短期内保持参数的稳定性，但随着测试时间的延长，红细胞内外条件产生变化，将出现失效情况。
可见，如何才能简单、快速地对红细胞进行处理，使得它能够在保持与仪器溶血素的反应能力，不会成为假白细胞粒子干扰其他参数测定的同时，保持体积的长期稳定，在质控物和校准物要求的有效期内平均红细胞体积变化微小，现有技术并没有提供现成的解决方案。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于避免上述现有技术的不足之处，而提出一种能够保持与仪器溶血素的反应能力，并且在要求的有效期内平均红细胞体积变化微小的红细胞处理办法。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案是，提出一种生物红细胞体积长期稳定的处理方法，用于制备血液细胞分析用质控物和标准物，包括步骤(1).将红细胞的代谢终止或减低；(2).稳定红细胞膜的磷脂成分处理；(3).稳定红细胞膜蛋白质的处理。
所述步骤(2)用到化学试剂，该化学试剂的有效成分包括锰酸、镉酸、铬酸、苦味酸或与这些酸相对应的金属盐类物质。
所述步骤(3)用到化学试剂，该化学试剂的的有效成分包括醛类物质。
所述步骤(1)用到化学试剂，该化学试剂的有效成分包括步骤(2)所用化学试剂的有效成分，还包括步骤(3)所用化学试剂的有效成分。
所述步骤(1)、(2)和(3)融合为一步完成，而处理过程中也只用到一种化学试剂，该化学试剂中包含有效成分的锰酸、镉酸、铬酸、苦味酸或与这些酸相对应的金属盐类物质和有效成分的醛类物质，并用基础试剂将PH值控制在7.1至8.5，整个处理过程在室温下进行，处理过程控制在30分钟到3个小时内。
所述生物红细胞为人红细胞、动物红细胞或多个体的混合样本。
所述金属盐类物质优选浓度为0.02％～0.5％的重铬酸钾。
所述醛类物质为甲醛、聚甲醛、戊二醛、烯醛或多种醛类的混合物，这里多种醛类的混合物指包含有至少两种醛类物质的混合物；优选浓度为0.02％～0.3％的甲醛。
同现有技术相比，本发明的生物红细胞体积长期稳定的处理方法，为简单、快速地实现红细胞的体积长期稳定，以保证血液细胞分析结果有效提供了可能。
图1为采用本发明生物红细胞体积长期稳定的处理方法进行质控物制备的流程示意图。
具体实施例方式
本发明生物红细胞体积长期稳定的处理方法，用于制备血液细胞分析用质控物和标准物，包括步骤(1).将红细胞的代谢终止或减低；(2).稳定红细胞膜的磷脂成分处理；(3).稳定红细胞膜蛋白质的处理。
通过长期研究我们认为，红细胞的代谢过程在短期内对红细胞的稳定性有帮助，可以尽量维持红细胞的各种参数的稳定性，但在离体后目前还缺乏长期提供模拟体内环境的保存方法，所以经过较长期保存后，红细胞的代谢必然会失去平衡，此时代谢对红细胞的保存作用将是消极的，会很快导致红细胞溶血等迹象发生。根据这个分析结果，可以推断如果对红细胞体积稳定性有长期的要求则最好将红细胞代谢终止或者减缓，这样体积的稳定性可以通过合适的固定和保存技术实现。
根据生物红细胞膜的机构分析，除了大量的磷脂内容外，还有大量的蛋白成分，而且在红细胞膜内侧还存在一层支架蛋白，由此，可以设想以下处理路线使用化学处理方法将红细胞代谢终止或者减低；使用膜固定试剂作用于磷脂，稳定磷脂成分；使用蛋白固定试剂作用于膜蛋白，稳定蛋白质成分；使用中性或者碱性环境控制化学物质彼此间的反应和处理红细胞膜的速度，使整个过程更温和更充分，同时避免过度反应出现完全固定情况，保留与表面活性剂的反应特性；可以使用室温反应条件进行处理，加速红细胞的代谢终止或者减缓过程，并缩短反应时间，尽量保证细胞膜的完整性。
需要说明的是，为了制备质控物，还要涉及诸如使用合适的保存试剂保存得到强化的红细胞，使其的稳定期尽量加长。由于本发明只涉及红细胞的处理，在这里对保存试剂的有关内容不进行展开讨论。
处理过程减少了红细胞生物学特性差异，可以将不同样本混合在一起增加样本的总体积，满足更多的应用要求。
使细胞的代谢终止或减低可以有很多化学和物理方法，考虑到处理过程本身使用了化学试剂，而且试剂中无细胞代谢的主要营养成分，所以处理过程本身也是红细胞代谢的终止或减低过程。
作用于红细胞膜的固定试剂常见的有锇酸、锰酸、镉酸、铬酸、苦味酸或与这些酸对应的金属盐类物质，考虑到锇酸毒性强不予采用，其他物质不同程度都可以改善红红细胞的稳定性，这里主要以重铬酸钾为例进行介绍。
作用于蛋白质的固定试剂比较多，特别是醛类有非常长期的应用，调整不同的反应条件都可以配合重铬酸钾类金属盐类在红细胞处理方面进行应用，这里以甲醛与重铬酸钾配合为例进行介绍。
对于处理条件，经过长期研究，得到以下注意事项反应要充分，而且要快，由此，可以选用室温反应，这样也可降低对环境的要求；反应时间不可以太长，温度越高，则处理时间的越短，处理时间超过3小时并不会带来更好的稳定效果，相反对于一些样本红细胞的伤害更大；避免酸性环境，酸性环境可能会使反应速度过快，对细胞损伤加强，由此，可以选用中性偏碱环境。
本发明方法采用的技术和现有的技术路线的出发点完全不同，主要体现在如下方面文献上对于红细胞的保存更多是集中在如何增强红细胞的活性，保留代谢能力，而本发明方法方面则对红细胞代谢进行终止或者减低，从而避免了红细胞体积变化的细胞代谢因素，将体积的稳定性更多受控于处理和保存环节；传统的细胞膜固定多不对细胞膜上磷脂进行处理，因为处理磷脂会带来细胞伤害，损伤免疫学特征，而本发明方法主要要求细胞体积稳定，所以使用磷脂处理试剂，加强了细胞膜的稳定性，同时磷脂依旧可以被表面活性剂所溶解导致细胞溶解；本发明方法使用了传统醛类固定试剂，但浓度很低，主要作用是稍微固定强化细胞蛋白质成分，这样可以减少由于蛋白质变化带来的体积影响。同时由于浓度很低不会出现对表面活性剂的抵抗作用；本发明方法操作方法简单快速，可以在室温下进行，缩短了化学试剂对细胞膜的作用时间，对细胞膜的完整性有良好的作用，而其他固定方法要么完全固定，要么低温长时间，效果都不良好；本发明方法的特点还在于，当使用过程中混入测试用试剂(这种情况常常发生)时，所制备的细胞悬浮物的各项参数(尤其是红细胞体积)可以保持稳定。
下面，具体描述本发明的处理过程，以及所用化学试剂。
本发明方法的处理过程，是在室温下进行；由于基础试剂含有防腐剂和抗生素，不需要严格无菌环境；但不可以存在过高的粉尘干扰，以免落入样本内形成假的细胞粒子干扰；处理过程中的离心条件以上清清晰，无过多细胞悬浮，无溶血迹象等条件为准。
试剂配制基础试剂和处理试剂配制如以下例子柠檬酸钠1-10g叠氮钠 1-5g氯化钾 0.1-5g硫酸钠 0.5-2g青霉素 0.1-2g链霉素 0.1-2g新霉素 0.1-2g琼脂糖或纤维素 1g/10-500万氯化钠 1-8g加蒸馏水1L以上试剂渗透压使用氯化钠调节为300mOsm，该值是以人红细胞为例，其他动物根据动物种类不同进行调节。使用Hcl和NaOH调节Ph值为7.1～8.5，然后使用上面的基础试剂配制以下处理试剂重铬酸钾 0.02～0.5％甲醛 0.02～0.3％再次使用Hcl和NaOH调节Ph为7.1～8.5。
血液样本处理血液样本使用生理盐水洗涤2次以上，离心条件以上清清澈无过多悬浮细胞为准。多个体混合样本需要洗涤后再混合，防止血型差异的凝集。如果需要单类纯红细胞制品可以进行过滤、离心等措施去白细胞和血小板。然后样本使用基础试剂洗涤2次以上，去上清留压积红细胞备用。
洗涤后样本处理取处理试剂和样本压积红细胞按照X∶1的体积比例混合摇匀，其中X的值不小于1。放置于室温下静置不小于30分钟的时间，并且一般不超过3小时，然后再次使用生理盐水洗涤2次，基础试剂洗涤2次，压积红细胞使用其他保存试剂再次洗涤2次以上，最后使用其他的保存试剂摇散悬浮，按照需要稀释分装后于2～8度低温保存。
样本的变化过程刚刚加工完毕的红细胞会存在一个变化时期，本方法的这个过程一般在30天以内，然后红细胞进入稳定期，按照临床使用的进口质控物变化参数为参比，稳定时间可以在90天以上。
处理流程图如图1所示，整个质控物制备的处理过程包括准备工作、红细胞预处理、红细胞处理和红细胞后期处理。本发明方法主要涉及到红细胞处理过程中的使用处理试剂处理红细胞。
本发明进行了大量的试验测试工作，我们将部分测试结果介绍如下红细胞参数的稳定期变化情况，稳定性测试包括整个稳定期的变化情况和批次内瓶间差异情况，有效期内日间变化情况，测试稳定期变化情况的方法如下(1)加工完毕的样本分装后放置2～8度冰箱保存；(2)留取1支样本每日或者隔日进行连续测试，记录结果；测试方法如下A.样本从冰箱取出后放置室温15分钟使其复温到室温；B.样本使用混匀器混匀3分钟；C.样本上机测试；D.样本返回2～8度冰箱保存，整个过程在20分钟到120分钟不等。
(3)连续测试观察变化期情况；(4)30天后进入稳定期，可以开始其他样本进行测试；(5)进入稳定期后的测试根据以下原则开启新样本进行测定A.样本测试耗尽或者剩余样本不足；B.样本红细胞分布开始明显变化；C.样本变化测试结果开始变大。
(6)新开启样本和第1支一样进行连续测定。
样本的日间变化，如表1所示
总计X95.4077 95.72596.5955 96.85 97.064796.396SD 0.59944 0.73854 0.49036 0.579660.532610.77341CV 0.62830.77152 0.50764 0.598510.548720.80233天数 30.93156.02657.64 40.557 36.36 120.57最小值2004-9-1 9:21 第2支94.6最大值2004-10 21 0:00 第5支98.5最大绝对差异 3.9测试系统深圳迈瑞公司BC-3000血球仪及原厂试剂测试地点北京从上述结果，可以看出以下结论样本加工完毕后存在变化期，需要放置一定时间后才会逐步稳定；样本进入稳定期后每个样本自身的变化很小，而且开瓶测试的周期也比较长，均在30天以上，如果只选取前14天的测试结果进行计算，那么变化会更小；测试的结果为整个系统表达的差异情况，即包含了仪器的精密度和稳定性、试剂稳定性、温度、环境等等可能变化条件。特别是温度在120天的稳定期内变化从28度到16度，说明样本本身的变化会更小。
瓶间差异情况和室温稳定性样本的瓶间差异是指储存的一批样本中瓶与瓶之间的差异。从表1和图1已经体现出不同时期的变化情况，这里指相同时间情况下开启的5支样本的测试情况，如表2所示
测试系统深圳迈瑞公司BC-3000plus血球仪及原厂试剂 测试地点深圳*对照(产地美国)质控未进行瓶间差测定，仅作为日间参考从上述结果，可以看出以下结论按照本发明方法处理的样本瓶间差异很小，和一支样本本身的变化接近；按照本发明方法处理的样本在室温(25度)下可以稳定48小时；按照本发明方法处理的样本对少量的混入的试剂无明显的反应，稳定性良好；按照本发明方法处理的样本参数变化和对照商品质控(产地美国)产品接近；结合表1可以看出按照本发明方法处理的样本对测试体系差异、地点差异和操作人员差异反应不明显。
本发明方法除可用于上述血红细胞的处理，还可扩展使用于任何其它意在保存细胞(包括血小板)，对细胞进行灭活处理的技术领域，比如对非人源性的白细胞或红细胞及血小板的处理；意在稳定细胞形态和体积的处理；制备稳定的单组分的细胞(包括血小板)悬浮物，这种悬浮物可以用作数量测量或体积测定的标准品或质控品或其它用途；制备稳定的单组分的细胞(包括血小板)悬浮物，这种悬浮物可以用作数量测量或体积测定的标准品或质控品或其它用途，同时可以保留红细胞内含的血红蛋白的与测定试剂的正常反应能力。
本发明主要思路在于从将红细胞的代谢终止或减低、稳定红细胞膜的磷脂成分处理和稳定红细胞膜蛋白质的处理三方面着手来保持红细胞的体积长期稳定。基于这些思路而对本发明所公开之最佳实施例进行没有创造性的简单替换、更改，或是作进一步的发明，都属于本发明之实施。
权利要求
1.一种生物红细胞体积长期稳定的处理方法，用于制备稳定的细胞悬浮物，其特征在于，包括步骤(1).将红细胞的代谢终止或减低；(2).稳定红细胞膜的磷脂成分处理；(3).稳定红细胞膜蛋白质的处理。
2.如权利要求1所述的生物红细胞体积长期稳定的处理方法，其特征在于所述步骤(2)用到化学试剂，该化学试剂的有效成分包括锰酸、镉酸、铬酸、苦味酸或与这些酸相对应的金属盐类物质。
3.如权利要求1所述的生物红细胞体积长期稳定的处理方法，其特征在于所述步骤(3)用到化学试剂，该化学试剂的的有效成分包括醛类物质。
4.如权利要求1至3任一所述的生物红细胞体积长期稳定的处理方法，其特征在于所述步骤(1)用到化学试剂，该化学试剂的有效成分包括步骤(2)所用化学试剂的有效成分。
5.如权利要求4所述的生物红细胞体积长期稳定的处理方法，其特征在于所述步骤(1)用到化学试剂的有效成分，还包括步骤(3)所用化学试剂的有效成分。
6.如权利要求5所述的生物红细胞体积长期稳定的处理方法，其特征在于所述步骤(1)、(2)和(3)融合为一步完成，而处理过程中也只用到一种化学试剂，该化学试剂中包含有效成分的锰酸、镉酸、铬酸、苦味酸或与这些酸相对应的金属盐类物质和有效成分的醛类物质，并用基础试剂将PH值控制在7.1至8.5，整个处理过程在室温下进行，处理过程控制在30分钟到3个小时内。
7.如权利要求6所述的生物红细胞体积长期稳定的处理方法，其特征在于所述生物红细胞为人红细胞、动物红细胞或多个体的混合样本。
8.如权利要求6所述的生物红细胞体积长期稳定的处理方法，其特征在于所述金属盐类物质优选浓度为0.02％～0.5％的重铬酸钾。
9.如权利要求6所述的生物红细胞体积长期稳定的处理方法，其特征在于所述醛类物质为甲醛、聚甲醛、戊二醛、烯醛或多种醛类的混合物。
10.如权利要求9所述的生物红细胞体积长期稳定的处理方法，其特征在于所述醛类物质优选浓度为0.02％～0.3％的甲醛。
全文摘要
一种生物红细胞体积长期稳定的处理方法，用于制备血液细胞分析用质控物和标准物，包括步骤(1).将红细胞的代谢终止或减低；(2).稳定红细胞膜的磷脂成分处理；(3).稳定红细胞膜蛋白质的处理。所述步骤(2)所用化学试剂的有效成分包括锰酸、镉酸、铬酸、苦味酸或与这些酸相对应的金属盐类物质，所述步骤(3)所用化学试剂的有效成分包括醛类物质，而所述步骤(1)所用化学试剂包括步骤(2)和(3)所用化学试剂的有效成分。所述步骤(1)、(2)和(3)融合为一步完成，并只用到一种化学试剂，pH值控制在7.1至8.5，在室温下进行，处理过程控制在30分钟到3个小时内。本方法为简单、快速地实现红细胞的体积长期稳定，以保证血液细胞分析结果有效提供了可能。
文档编号C12N5/08GK1824770SQ20051003334
公开日2006年8月30日 申请日期2005年2月25日 优先权日2005年2月25日
发明者张晖, 徐祖越, 刘牧龙 申请人:深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司