在体内具有延长的半衰期和增强的红细胞生成活性的重组人EPO-Fc融合蛋白的制作方法

专利名称：在体内具有延长的半衰期和增强的红细胞生成活性的重组人EPO-Fc融合蛋白的制作方法
技术领域：
本申请涉及人促红细胞生成素融合蛋白。 背景
人促红细胞生成素(EPO)(造血生长因子家族的成员)主要在成 人肾脏和胎儿肝脏中作为对于由于减少的血氧可获得性引起的组织缺 氧的响应而合成[l]。 EPO的主要功能是对骨髓中的某些红细胞(RBC) 祖细胞和前体细胞直接作用以刺激血红蛋白的合成和成熟RBC的产 生。其还控制RBC的增殖、分化和成熟。已产生了具有天然发生的EPO 的氨基酸序列的重组EPO,并且被批准用于治疗与肾功能衰竭、癌症 和其他病理状态相关的贫血症[2]。除了其红细胞生成特性外，近来的 研究报导[3]表明，EP0还对非骨髓细胞例如神经元起作用，这暗示EPO 在中枢神经系统(CNS)和其他器官/系统中的其他可能的生理/病理功 能。因为已在许多不同的器官中发现EPO受体，因此EPO可具有多种 生物学效应，例如用作抗凋亡剂。
人EPO是分子量为30.4千道尔顿的糖蛋白。糖类占其总质量的大 约39%。 EPO基因位于染色体7qll-22上，并且横跨具有5个外显子和4个内含子的5. 4kb区域[4]。 EP0的前体由193个氨基酸组成。通过 翻译后修饰而进行的前导序列和最后的氨基酸Arg的切割产生了具有 165个氨基酸的成熟EP0。糖基化(在Asn24、 Asn38、 Asn83处的3 个N联位点和在Serl26处的一个0联位点)在EPO的生物合成、三级 结构和体内生物学活性中起着至关重要的作用[5]。 EPO通过给合至促 红细胞生成素受体(分子量为72-78千道尔顿的糖基化且礴酸化的跨 膜多肽)来发挥功能。该结合触发所述受体的同源二聚化，这导致几 个信号转导途径的激活JAK2/STAT5系统、G-蛋白、钙通道和激酶。 对于获得最佳受体激活需要两个分子的EP0蛋白同时结合一个受体分 子[6]。
作为第一个被批准用于人类治疗的造血生长因子，重组人EP0 (rHuEP0)已被用于治疗由慢性肾衰竭、癌症(主要是化疗相关的贫 血)、自身免疫疾病、AIDS、手术、骨髄移植和骨髓增生异常综合征 等引起的贫血症。有趣地，近年来的研究已观察到，rHuEPO具有非血 液系统功能，并显示用作用于脑缺血、脑外伤、炎性疾病和神经变性 疾病的神经保护性药物的潜能。
目前，商购可得三种类型的rHuEP0或rHuEPO类似物，即rHuEPO ot、 rHuEP0 P和darbepoetin oc [8]。这三种重组蛋白结合相同的 促红细胞生成素受体，但在结构、糖基化程度、受体结合亲和力和体 内代谢方面不同。自20世纪80年代开始引入rHuEPO-oc以来，临床 医生很快就认识到所述药物的频繁给药/注射要求是个很大的缺点。 静脉内和皮下施用的rHuEP0 ot和rHuEP0 P的平均体内半衰期分别 只有8. 5和17小时[9， 10]。因此患者需要每天1次、每周2次或每 周3次的注射方案，这对患者和卫生保健提供者(health care provider)都产生了负担。因此，对开发具有更长的体内半衰期和/ 或增强的红细胞生成活性的重组EP0类似物存在长久的需要。
在现有技术中已作出了尝试，以遗传改变或化学修饰天然EP0蛋 白的结构从而减慢其体内代谢或提高其治疗特性。例如，EP0分子上 包含唾液酸的糖类的量与其体内代谢和功能活性之间看上去呈正相关性。因此，增加EPO分子的糖含量可导致体内更长的半衰期和增强的 活性[ll， 12]。 Amgen已设计了 rHuEP0类似物darbepoetin ct ，其 包含5个N联糖链(比rHuEPO多两个)。darbepoetin a也称作新 型红细胞生成刺激蛋白(NESP)，并且以商标AranespTM进行销售。 darbepoetin cc与天然人EPO在5个位点(Ala30Asn、 His32Thr、 Pro87Val、 Trp88Asn、 Pro90Thr )上不同,这使得两个额外的N联寡 糖能够附着在天冬酰胺残基位点30和88上。darbepoetin oc以与天 然EP0相同的方式结合EP0受体从而诱导细胞内信号传导，所述信号 传导包括由JAK-2激酶和相同的细胞内分子Ras/MAP-k、 P13-k和 STAT-5引起的酪氨酸磷酸化。由于增加的糖类含量，darbepoetin oc 在动物和人中的的半衰期几乎为rHuEP0-ot的三倍(25.3小时对8.5 小时)[9]。在体内，darbepoetin a ( Aranesp )还似乎展现出相 比天然发生的或重组的人EP0而言增强的生物学活性[13]，并且已被 FDA批准为第二代rHuEP0药物；该药物只需要每周施用1次即可获得 与每周注射2至3次rHuEP0相同的治疗效果[10， 14， 15]。
延长EPO的半衰期的其他努力已集中在通过化学缀合聚乙二醇 (PEG化)等来增加EPO蛋白的分子量。PEG化的EPO具有大得多的分 子量，并受到保护而免于被从循环中清除，从而具有更长的血浆半衰 期[16]。然而，PEG化可能改变蛋白的结构，从而导致EPO部分的功 能和特异性的不可预期的改变。还存在通过其他方法，例如将EPO分 子连接至载体蛋白(人白蛋白)，或者使用连接肽(3至17个氨基酸) 或经化学交联剂形成两个完整EPO分子的同源二聚化，来增加EPO的 分子量的报道U7， 18， 19， 20]。尽管所有这些方法已在延长EPO的 半衰期和增加其活性中获得一定的成功，但在本申请所描述的融合蛋 白中将EP0分子与人免疫球蛋白(IgG)的Fc片段相结合获得了独特 的优点。
人免疫球蛋白IgG由4个通过二硫键共价连接的多肽(轻链和重 链的两个相同拷贝)组成。通过木瓜蛋白酶来蛋白水解IgG分子产生 两个Fab片段和一个Fc片段。所述Fc片段由通过二硫键连接在一起的两个多肽组成。每个多肽，从N至C末端，由铰链区、CH2结构域 和CH3结构域组成。所述Fc片段结构在所有亚型的人免疫球蛋白中几 乎相同。IgG是人血液中最丰富的蛋白之一，其在组成了人血清中总 免疫球蛋白的70至75%。 IgG在循环中的半衰期在所有5种类型的免 疫球蛋白中是最长的，并且可达到21天。
已成功地将现代生物工程技术用于产生由治疗性蛋白质片段例如 细胞因子和可溶性受体与人IgG的Fc片段组成的融合蛋白[21， 22， 23: 24]。这些融合蛋白具有显著更长的体内半衰期，而同时保持其生物学 和治疗性质。到目前为止，已成功地开发出两种包含Fc片段的融合蛋 白作为生物药物，并经FDA批准用于治疗类风湿性关节炎和慢性斑块 状银屑病[25， 26]。
在现有技术中已显示，通过化学交联或通过多肽连接的两个EPO 分子的二聚体展现出增强的体内活性和延长的半衰期[17， 19]。所述 增强的活性可能是由于所述EPO二聚体与一种受体的更有效的结合而 产生的，和所述延长的体内半衰期可能是由于所述二聚体蛋白的大小 更大而引起的。然而，化学交联过程不是有效的且难以控制。此外， EP0 二聚体中的连接肽可能改变EP0分子的三维结构，并且所述肽本 身可能刺激体内的免疫原性应答。这些缺点削弱了 EPO二聚体的治疗 潜能，特别是由于肾病患者中的EP0替代疗法是终生进行时尤其如此。
因此产生了对于具有显著更长的体内半衰期和增强的体内红细胞 生成活性但不具有增加的免疫原性特性的EP0类似物的需要。
发明概述
根据本发明，描述了包含连接至免疫球蛋白肽部分的人促红细胞 生成素肽部分的重组融合蛋白。所述融合蛋白具有相比天然发生的或 重组的天然人促红细胞生成素而言延长的体内半衰期。在本发明的一 个实施方案中，所述蛋白的体内半衰期为天然人促红细胞生成素的至 少三倍。所述融合蛋白还展现出相比天然人促红细胞生成素而言增强的红细胞生成生物活性。
在本发明的一个实施方案中，所述免疫球蛋白肽部分是Fc片段， 例如IgGl片段。所述Fc片段包含CH2和CH3结构域和铰链区。所述 EP0肽部分直接连接至铰链区。优选地，所述铰链区的长度为至少9 个氨基酸。在一个实施方案中，所述EPO肽部分具有临近其C末端的 半胱氨酸残基，并且所述铰链区包含位于最靠近所述EP0肽部位的半 胱氨酸残基。优选地，这两个半胱氨酸残基间隔至少12个氨基酸。在 一个实施方案中，所述EP0肽部分可包含直接连接至免疫球蛋白部分 的完整EP0分子(即在EP0和免疫球蛋白部分之间没有插入外来肽连 接体)。
本发明还涉及包含多个单元的本发明融合蛋白的多聚体蛋白构建 体。例如，两个融合蛋白可装配为二聚体，其中所迷蛋白的铰链区通 过二硫键连接。所述二聚体具有IgG分子的一般形状，并且比游离的 EP0分子更稳定。
本发明还涉及编码所述融合蛋白的核酸和氨基酸序列，以及用于 产生所述融合蛋白的经转染的细胞系和方法。本发明进一步包括包含 所述融合蛋白的药物组合物，和使用所述融合蛋白和/或所述药物组合 物(例如在需要治疗的受试者中刺激红细胞生成)的方法。
附图简述
在举例说明本发明的各种实施方案但不希望以限定性方式解释的 附图中


图1A是示意图，其显示了本发明的重组人EP0-Fc融合蛋白 (rHuEP0-Fc)的一般结构。
图1B是序列表，其显示了 rHuEPO-Fc蛋白的核苷酸序列和推导的 氨基酸(aa)序列。DM的总长度为1281bp。在所述推导的蛋白质序 列中的426个氨基酸包括信号肽的27个aa和完整rHuEP0-Fc蛋白的 399个aa。所述完整的rHuEP0-Fc蛋白由人EPO结构域(166aa)以及人IgGl的Fc片段的铰链区(16aa，加下划线的)和CH2和CH3结构域 (217aa)组成。计算出的成熟rHuEP0-Fc融合蛋白的多肽的分子量为 44. 6kDa，其由18. 5kDa (41. 4%)的EP0片段和26. lkDa (58. 6%)的IgGl Fc片段组成。同源二聚体由铰链区内的两个半胱氨酸残基(加框的) 通过两个二硫键形成。在成熟融合蛋白的残基172 (即铰链区的第6 个氨基酸)处，天然的半胱氨酸残基被甘氨酸(粗体)置换。
图2是示意图，其显示了用于插入编码rHuEPO-Fc融合蛋白的多 肽的DNA序列和用于转染表达所述rHuEP0-Fc融合蛋白的CH0细胞的 哺乳动物表达质粒pCDl的结构和特征。
图3是SDS-PAGE图像，其显示了通过SDS-PAGE分析显示的在非 还原条件下纯rHuEP0-Fc蛋白的二聚体形式和在还原条件下纯 rHuEPO-Fc蛋白的单体形式的大小。在非还原条件下，在8y。Bis-Tris 凝胶上，从表达rHuEP0-FC的培养的CH0细胞系的上清液中纯化出的 rHuEPO-Fc蛋白主要以二聚体形式存在并且具有大约180 kDa的分子 量。在打断二硫键的还原条件(100 mM 二硫苏糖醇，DTT)下，所述 二聚体分成两个相同的分子量为75 kDa的单体单元。
图4A和4B所示的图显示了在通过每周3次皮下注射(s.c.) rHuEPO-Fc或rHuEP0进行处理的正常小鼠中血红蛋白(Hb )水平的剂 量依赖性增加。每个点代表所述组(6只小鼠)的平均Hb水平。第0 天的水平代表处理前的Hb水平。A:用rHuEPO-Fc处理的小鼠。B:用 天然rHuEPO处理的小鼠。
图5A和5B所示的图显示了在通过每周1次皮下注射(s.c.) rHuEPO-Fc或rHuEP0进行处理的正常小鼠中血红蛋白(Hb )水平的剂 量依赖性增加。每个点代表所述组(6只小鼠)的平均Hb水平。第0 天的水平代表处理前的Hb水平。A:用rHuEPO-Fc处理的小鼠。B:用 天然rHuEPO处理的小鼠。
图6A和6B所示的图显示了在通过静脉内注射(i. v. ) 12. 5pg/kg rHuEPO-Fc或rHuEP0进行处理的正常小鼠中血红蛋白(Hb )水平的增 加。每个点代表所述组(6只小鼠)的平均Hb水平。第0天的水平代表处理前的Hb水平。A:每周l次处理的小鼠。B:每周3次处理的小鼠。
图7所示的图显示了在通过每周l次皮下注射rHuEP0-Fc、rHuEP0 或darbepoetin-oc (缩写为Darbe.)进行处理的并切除了 5/6的肾的 大鼠中血红蛋白(Hb)水平的剂量依赖性增加。每个点代表所述组的 平均Hb水平。正常对照是用栽体溶液进行注射的正常大鼠。模型对照 是用载体溶液进行注射的并切除了 5/6的肾的大鼠。第0周的水平代 表处理前的Hb水平。*:处理后的周数。
图8所示的图显示了在通过每两周1次皮下注射rHuEP0-Fc、 rHuEP0或darbepoetin-a (缩写为Darbe.)进行处理的并切除了 5/6 的肾的大鼠中血红蛋白(Hb)水平的剂量依赖性增加。每个点代表所 述组的平均Hb水平。正常对照是用载体溶液进行注射的正常大鼠。模 型对照是用载体溶液进行注射的并切除了 5/6的肾的大鼠。第0周的 水平代表处理前的Hb水平。*:处理后的周数。
图9所示的图显示了在通过每两周1次静脉内注射62. 5pg/kg rHuEPO-Fc或darbepoetin-a (缩写为Darbe.)进行处理的并切除了 5/6的肾的大鼠中血红蛋白(Hb)水平的剂量依赖性增加。每个点代 表所述组的平均Hb水平。正常对照是用载体溶液进行注射的正常大 鼠。模型对照是用载体溶液进行注射的并切除了 5/6的肾的大鼠。第 O周的水平代表处理前的Hb水平。*:处理后的周数。
图10A-10C显示了 rHuEP0-Fc、 rHuEP0和darbepoet in-ct在以 用不同剂量和方案进行处理的并切除了 5/6的肾的大鼠中刺激CFU-E 和BFU-E集落形成的效力比较。rHuEP0-Fc和darbepoietin-ct (缩 写为Darbe.)处理显示出相似的刺激CFU-E和BFU-E集落形成的剂量 依赖性效力，而rHuEP0的效力较低。A,每周l次皮下注射。B,每两 周1次皮下注射。C，每两周1次静脉内注射。
图11所示的图显示了在对猕猴静脉内注射5 p g/kg rHuEP0-Fc或 rHuEP0后rHuEP0-Fc和rHuEP0的血清水平(5只猴子的平均水平)。
图12是序列表，其显示了野生型rHuEPO-FcC蛋白的核苷酸序列和推导的氨基酸(aa)序列。除了天然的野生型半胱氨酸存在于成熟
的融合蛋白的残基172 (即，铰链区的第6个氨基酸)处之外，所述 序列的细节与图1中所示的相同。
图13所示的图显示了在通过每周3次皮下注射(s. c. ) rHuEP0-Fc (本发明的突变型融合蛋白)、rHuEPO-FcC (野生型融合蛋白)和 rHuEP0进行处理的正常水鼠中血红蛋白(Hb )水平的剂量依赖性增加。 每个点代表所述组(8)的平均Hb水平。正常对照是用载体溶液进行 注射的正常小鼠。第O天的水平代表处理前的Hb水平。
图14所示的图显示了在通过每周1次皮下注射(s.c.) rHuEP0-Fc、 rHuEP0-FcC和rHuEPO进行处理的正常水鼠中血红蛋白 (Hb)水平的剂量依赖性增加。每个点代表所述组(8)的平均Hb水 平。正常对照是用载体溶液进行注射的正常小鼠。第0天的水平代表 处理前的Hb水平。
发明详述
在整个下列描述中显示了特定的详细内容以便更全面地理解本发 明。然而，可实施本发明而不采用这些细节。在其他情况下，未详细 显示或描述熟知的元素以避免不必要地使本发明模糊不清。因此，本 说明书和附图被认为是举例说明性的而不是限制性的。
本申请涉及具有红细胞生成特性的新型融合蛋白。所述融合蛋白， 此处称为rHuEPO-Fc，包括重组连接至免疫球蛋白Fc片段的人促红细 胞生成素(EPO)分子。如在下面进一步讨论的，所述融合蛋白可以为 由两个相同的多肽亚基组成的二聚体形式。在图1A中示意性地显示的 实施方案中，每个多肽亚基，从N末端至C末端，由人EPO分子的多 肽序列以及人免疫球蛋白IgGl的Fc片段的铰链区、CH2结构域和CH3 结构域的多肽序列组成。所述两个多肽亚基通过各自铰链区之间的二 硫键连接在一起从而形成所述二聚体结构。因此，所述二聚体具有与 IgG分子相同的一般形状，并且展示出比在下面实施例中所讨论的游离的EP0分子更好的稳定性。
正如对于本领域技术人员来说将会是显然的，完整的免疫球蛋白
的铰链区为所述蛋白提供了用于有效的抗原-抗体结合的足够的柔性。 类似地，在本发明中，在rHuEP0-Fc融合蛋白的设计包括了铰链区以 保持其柔性，尤其是当融合蛋白以二聚体形式存在时。如下面所描述 的，这允许所述rHuEP0-Fc融合蛋白的EP0部分与EP0受体的正常结 合，从而激活EP0生物学功能。据认为rHuEP0-FC融合蛋白的二聚体 形式通过提供两个EP0分子而能够诱导EP0受体的最佳激活(例如， 通过促进受体交联)。
正如在下面所示的实施例中所证明的，使用重组DNA技术已经成 功地合成了所述rHuEP0-Fc融合蛋白。已显示，在小鼠、大鼠和灵长 类动物的研究中，所述融合蛋白展示出相比天然发生的或重组的天然 人EP0而言延长的体内半衰期和增强的红细胞生成特性。如本专利申 请中所用的，术语"天然人促红细胞生成素"和"天然人EP0"是指 具有未修饰的野生型结构的EP0。正如本领域技术人员将会认识到的， 天然人EP0可天然地发生或重组产生(例如rHuEP0 a )。术语"天 然人EP0"不包括rHuEP0类似物，例如darbepoetin oc，其中EPO 结构已被明显修饰，例如通过高糖基化(hyperglycosylation)。
本发明的rHuEP0-Fc融合蛋白的核酸序列显示于SEQ. ID. No. 1 中。相应的推导的氨基酸序列显示于SEQ. ID. No. 2中。完整的 rHuEPO-Fc融合蛋白的长度为399个氨基酸。如图IB中所示的，完整 的rHuEP0-Fc融合蛋白由EPO结构域(166个氨基酸)、铰链区(16 个氨基酸，加下划线的)以及CH2和CH3结构域(217个氨基酸)组 成。由27个氨基酸组成的信号或前导肽序列也显示于图IB中。信号 肽在rHuEPO-Fc的合成过程中被切割。包含信号肽或前导肽的 rHuEP0-Fc的核酸和氨基酸序列分别显示于SEQ. ID. No. 3和SEQ. ID. No. 4中。
如图IB和SEQ. ID. No. 2中所最佳显示的，EPO结构域在氨基 酸编号161处具有接近其C末端的半胱氨酸残基。铰链区在氨基酸编号178和181 (在图IB中用框标示)处包含2个半胱氨酸残基。所述 铰链区半胱氨酸残基在上述同源二聚体的多肽亚基之间形成二硫键。 天然发生的人IgGl片段的铰链区也在铰链区部分的残基编号6 (从N 末端测量的)处具有半胱氨酸。在本发明中，铰链部分的半胱氨酸残 基6已被非半胱氨酸残基置换。特别地，在图IB和SEQ. ID. No. 2 的实施方案中，所述氨基酸半胱氨酸已被甘氨酸(在rHuEP0-Fc的氨 基酸残基172处，所述残基相应于铰链区的残基6)置换。正如对于 本领域技术人员来说将是显然的，其他非半胱氨酸残基也可在该位置 上置换半胱氨酸以避免二硫键的形成。
由于在残基172处的氨基酸置换，铰链区的第一个半胱氨酸残基 (在残基178处)与EPO结构域的上述半胱氨酸残基(在残基161处) 相隔17个氨基酸。本发明者认为，EP0结构域的半胱氨酸残基161与 铰链区的第一个半胱氨酸残基之间的最小间隔应当为至少12个氨基 酸，从而使得能够成功地装配rHuEP0-Fc的同源二聚体和/或使得EP0 受体能够结合rHuEPO-Fc的同源二聚体。即，如果残基172是半胱氨 酸残基，则在例如在半胱氨酸残基161和172之间可能形成不想要的 二硫键。这可能改变EPO分子的三维结构，从而导致无生物学活性或 生物学活性减少。
在本发明的一个实施方案中，将EP0结构域直接连接至融合蛋白 的Fc片段部分。通过避免提供外来连接体肽，rHuEP0-Fc融合肽的优 选三维结构得到保持，并且使触发不希望的免疫原性应答的风险减少 至最低。Fc片段的铰链区的长度优选为至少9个氨基酸，并且长度优 选地在大约10至20个氨基酸的范围内。
实施例
下列实施例将进一步更详细地举例说明本发明，尽管将会认识到 本发明不限于所述特定的实施例。1.编码HuEPO-Fc的融合蛋白的重组质粒pCdEpo-Fc的构建
通过使用下列oligo引物(QIAGEN Inc., US)的重叠PCR来产生
编码rHuEPO-Fc多肽的氨基酸序列的全长DNA分子 EF5: 5" -ccggaattcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcct-3 ，，
EF3: 5 ， -ttttccttttgcggccgcttatttacccggagacagggagag-3 ，； EFL5: 5 ， -aggcctgcaggacaggggacagagttgagcccaaatctggtgaca-3 ，； EFL3: 5 ，-tgtcaccagatttgggctcaactctgtcccctgtcctgcaggcct-3'
上述引物的序列分别列于SEQ. I.D. No. 5-8中。 分别将EcoR I和Not I位点导入EF5和EF3中。为了在哺乳动物 细胞中最佳地表达HuEPO-Fc蛋白，还将Kozak序列(GCCACCATGG )导 入EF5中。EFL5和EFL3是由Epo的3'末端DNA序列(23bp)和IgGl 铰链的5'末端DNA序列(22bp)组成的互补序列。
首先，分别地，使用引物EF5和EFL3通过PCR( Plat inumTaq DNA Polymerase High Fidelity)从包含全长人EPO cDNA的质粒p9E中 扩增出0. 6 kb的EPO DNA片段，使用引物EF3和EFL5从包含全长人 IgGl cDNA序列的质粒pD中扩增出0. 7 kb的Fc片段(p9E和pD来自 本发明者自已的实验室)。然后纯化这两种片段，并将其以等量混合。 使用所述混合物作为模板，通过引物EF5和EF3扩增出1. 3kb的全长 rHuEPO-Fc腿。用EocR I和Not I (New England Biolab Inc. US) 消化经纯化的1.3 kb片段，然后将其克隆入经EcoR I/Not I消化的 哺乳动物表达栽体pCDl (图2)中。所得的重组载体称为pCdEpo-Fc， 并通过DNA测序来验证所插入的编码HuEPO-Fc蛋白的氨基酸序列的核 酸序列。
2. rHuEPO-Fc表达细胞系的建立
将具有二氢叶酸还原酶(dhfr )缺陷的中国仓鼠卵巢细胞 (CH0/dhfr—， ATCC No. CRL-9096 )用作用于rHuEP0-Fc表达的宿主细 胞，所述中国仓鼠卵巢细胞经FDA批准用于生物物质的生产。
4吏用Lipofectamine (Gibco， Cat. No: 18292-037， USA)，用重组栽体pCdEpo-Fc转染CH0-dhfr—细胞。通过ELISA (Roche, Cat. No: 1-693 417， Canada )就EPO活性来测定来自所选克隆的培养物的 上清液。在不断增加的氨甲蝶呤(MTX)的压力下进一步筛选阳性克隆。 选择一个具有最高rHuEPO-Fc蛋白表达的细胞系作为表达rHuEPO-Fc 的CHO细胞系，并且使其逐渐地适应无血清培养基(CD CHO培养基， Gibco， Cat. No: 10743-029， USA)。该表达rHuEPO-Fc的CHO细胞 系用于产生rHuEPO-Fc蛋白。
3. rHuEPO-Fc蛋白的纯化
首先通过A蛋白亲和层析(Amersham， Cat. No: 17-0402-01， Canada)来分离上清液中所包含的rHuEPO-Fc蛋白分子，所述上清液 从培养表达rHuEPO-Fc的CHO细胞的无血清培养基中收集。通过在 HiLoad 16/60 Superdex 200pg柱(Amersham, Cat. No: 17-1069-01， Canada)中进行凝胶过滤来进一步纯化所述分离的蛋白。如通过电泳 所测定的，rHuEPO-Fc蛋白的纯度超过98yo。
4. 纯rHuEPO-Fc蛋白的大小的测定
首先，进行SDS-PAGE以确定纯rHuEPO-Fc蛋白的大小。如图3中 所示，在非还原条件下，在8%Bis-Tris凝胶上看到具有大约180kDa 的分子量的单一条带，这测量了存在有二硫键的蛋白的总体大小。这 表明，大多数rHuEPO-Fc蛋白分子以二聚体形式产生，如根据所述融 合蛋白的设计所预期的。当在打断二硫键的还原条件(lOOmM 二硫苏 糖醇，DTT)下进行SDS-PAGE分析时，只鉴定了具有75Kda的分子量 的条带，这与估计的HuEP0-铰链区-CH2-CH3的单个多肽链的分子量相 一致。
通过质镨(MALDI-TOF-MS)测定的具有糖基化的纯rHuEPO-Fc融 合蛋白的精确分子量是111099道尔顿(lll.lKda)。在该测定法中， 只观察到单一蛋白峰，表明所述纯化的rHuEPO-Fc蛋白几乎具有100% 的纯度。通过蛋白质序列分析测定纯rHuEPO-Fc蛋白的N末端的15个氨基酸为APPRLICDSRVLERY。这与天然人EP0多肽的前15个氨基 酸的序列相一致，并验证了所述纯化的rHuEPO-Fc蛋白确实具有根据 编码rHuEP0-Fc融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列所预测的正确且完 整的EPO分子序列。
5.在正常小鼠中rHuEPO-Fc的增强的红细胞生成活性 进行在小鼠中的体内实验以验证rHuEPO-Fc蛋白的红细胞生成活 性的保持，和测定其与rHuEPO和darbepoetin-ot相比的功效。为了 进行比较，在本发明的所述动物实验中使用的3种EP0 (我们的 rHuEPO-Fc、 rHuEPO (即天然人EPO)和darbepoetin-ct )的所有剂 量是基于摩尔基础的单独的EPO分子部分的量。对于rHuEPO-Fc蛋白， 如通过EPO的氨基酸重量在整个rHuEPO-Fc分子的总氨基酸重量中的 比例(399个aa中166个aa)所计算的，EPO部分贡献了 41.4%的总 rHuEPO-Fc分子量。那么就将rHuEPO-Fc的EPO量确定为rHuEPO-Fc 蛋白总量的41.4%。
将rHuEPO-Fc (母液浓度0. 5mg/ml， 98. 6%的纯度)和天然人 rHuEPO (即具有天然的人EPO结构)(6000IU/0. 5ml，由Kirin Brewery Co. ， Japan生产)在载体溶液(2. 5mg/ml的人血清白蛋白、 5.8mg/ml柠檬酸钠、0. 06mg/ffll柠檬酸和5. 8mg/ml氯化钠， pH5. 5-5. 6 )中稀释。根据其活性/数量比例来计算总计的rHuEPO剂量。 将BALB/c小鼠(6至8周龄，体重18-22g，雄性和雌性数目相等，购 自Experiment Animal Center, A醒S， China)随机分组，每组6只。 用一种剂量(O. 1、 0.5、 2.5、 12.5、 62.5jig/kg)、 一种注射途径(通 过尾静脉的静脉内注射(i.v.)或皮下注射(s.c.))和一种注射方 案(每周3次或每周l次)的一个组合来处理各组小鼠。用等体积的 栽体溶液注射对照组小鼠。所述处理持续3周，并且总观察时间为5 周。在处理前于每周的笫4天和第7天测量外周血样品(尾静脉)， 进行5周。通过吸光测定法将Hb测量为指数。根据各组的数据来计算 平均值土SD,并在不同组之间进行f检验。每周3次给小鼠施用EPO,条件是所述EP0具有正常的红细胞生 成活性，这将诱导红细胞生成的饱和刺激。如图4中所示，每周3次 通过皮下注射进行处理的这两个组即使在2. 5 n g/kg的剂量上也具有 显著提高的Hb水平。该实验证明，rHuEP0-Fc展示出与rHuEP0—样 有效的体内红细胞生成活性。处理组中Hb水平的提高是剂量依赖性 的。但是，在12.5MgAg rHuEPO-Fc的剂量上在小鼠中诱导了 Hb水 平的饱和提高，而只有在62. 5|Ltg/kg rHuEP0的剂量上才获得了相似 的Hb水平的饱和提高。由2. 5yg/kg rHuEPO-Fc诱导的Hb水平的提 高也大于由2. 5pg/kg rHuEP0所诱导的提高。这些结果暗示，由 rHuEP0-Fc产生的红细胞生成刺激比rHuEP0更有效。
通过将皮下注射次数減少至每周1次来进一步探究rHuEP0-Fc的 红细胞生成效力。如图5中所示，经rHuEPO-Fc处理的组在12.5或 62.5|ig/kg的剂量上显示出剂量依赖性的Hb水平的提高。12.5和 62. 5 n g/kg rHuEPO的剂量还都诱导了相似程度的Hb水平的提高，所 述程度远低于由62. 5jug/kg的rHuEPO-Fc所诱导的程度。这强有力地 表明，rHuEPO-Fc具有增强的体内红细胞生成活性。据推测这是由于 所述rHuEPO-Fc蛋白中二聚体EPO分子导致的延长的rHuEPO-Fc的体 内半衰期或改善的EPO受体结合/激活，或两者的组合效应。
当每周3次或每周1次静脉内施用相同剂量(12. 5jug/kg)的 rHuEPO-Fc或rHuEPO时，对于所有处理组均观察到Hb水平的提高(图 6)。然而，每周1次静脉内施用rHuEPO-Fc诱导了更大、更持久的 Hb水平的提高，其可在处理结束后持续更长的时间。该数据进一步支 持了，与具有天然发生的EPO蛋白的结构的rHuEPO相比，所述 rHuEPO-Fc蛋白具有增强的红细胞生成特性。
6. rHuEPO-Fc在切除5/6的肾的大鼠中的增强的红细胞生成活性 正常小鼠中的实验证明了 rHuEPO-Fc具有增强的体内红细胞生成 活性。为了进一步观察rHuEPO-Fc在刺激红细胞生成中的功效，在具 有实验性肾脏贫血(通过切除5/6的肾脏来产生)的大鼠中进行药效动力学研究。将rHuEPO-Fc的功效与rHuEPO和darbepoetin-ot (60 jug/ml， lot. No. N079,由Kirin Brewery Co. ， Japan生产)的功
效进行比较。
在本发明中使用Wistar大鼠(雄性和雌性的数目相等，体重 160-180g， 购自 Vitalriver Experiment Animal Inc., Beijing, China. Licence No. SCXK1 1-00-0008 )来建立由于通过两步骤肾切 除术产生的肾功能衰竭而形成的贫血症模型[27]。通过在无菌条件下 的两次分开的手术对全身麻醉的大鼠实施5/6的肾切除术。在切除2/3 的左肾后，让大鼠恢复20天。然后小心地切除右肾。施用抗生素以在 每次手术后预防感染。最终切除总共5/6的肾脏组织。肾切除的大鼠 逐渐发生肾功能不全和贫血症。在肾切除术后50天大鼠进入稳定的贫 血状态，然后将其随机分组(9只/组)以开始施用EPO。用一种剂量
(2.5、 12.5、 62. 5ug/kg)、 一种注射途径(通过尾静脉的静脉内注 射或皮下注射)和一种注射方案(每周l次或每两周l次)的一个组 合来处理各组大鼠。用体积的栽体溶液注射对照组和模型组的大鼠。 所述处理持续4周，总观察时间为6周。
每周1次皮下施用的rHuEP0-Fc的所有剂量(2. 5、 12. 5、 62. 5
U g/kg )都诱导了相比未接受EP0处理的模型对照组而言Hb水平的剂 量依赖性提高。每周1次皮下施用的12. 5和62. 5 jag/kg的rHuEP0 或darbepoetin也诱导了 Hb水平的提高。在用12. 5或62. 5 n g/kg rHuEP0-Fc处理的两个组中增加的Hb水平都分别显著高于用12. 5或 62. 5 y g/kg rHuEP0处理的组。在用62. 5 m g/kg rHuEPO-Fc处理的组 中的Hb水平也稍微比在用62. 5 jag/kg darbepoetin处理的組中的Hb 水平高。在停止处理后，在用62. 5jjg/kg rHuEP0-Fc处理的组中的 Hb水平的降低比正常对照组和模型对照组慢得多，并且直至观察结束 时(在处理后两周)都保持了比正常对照组和模型对照组高的Hb水平， 从而表明更强和/或延长的红细胞生成刺激作用(概括于图7中)。
对于每两周1次的皮下注射处理，只施用12. 5或62. 5 m g/kg的 所述三种EP0 (图8 )。与模型对照组相比，12. 5 u g/kg rHuEP0仅仅增加Hb的水平，并且与正常对照组相比，在经62. 5jag/kg rHuEPO 处理的组中的弱红细胞生成应答不能将Hb水平恢复至正常水平。以 12. 5或62. 5 y g/kg的剂量用rHuEPO-Fc或darbepoetin进4亍处理i秀 导了显著的Hb水平的提高，其高于正常对照组，这表明rHuEPO-Fc 和darbepoetin都产生有效的贫血状况的改正。就功效而言，在相同 剂量的rHuEP0-Fc和darbepoetin之间未观察到显著差异。62. 5 p g/kg的高剂量导致红细胞生成的持续增加，直至观察结束时(处理后 2周)。这进一步暗示，rHuEPO-Fc和darbepoetin展示出长效地刺激 体内红细胞生成的特性，该特性反过来可转化成在临床上减少对患者 的施用频率。
尽管已批准darbepoetin用于临床应用(该应用具有较不频繁的 注射以增加患者的顺应性和减少卫生保健提供者的工作负担)，但这 些实验数据强烈地表明本发明中公开的rHuEPO-Fc具有至少相似的潜 在益处。如上所述，darbepoetin,作为包含额外的糖化合物(增加的 糖基化)的人EP0分子的突变型类似物，可能具有增加的诱导体内免 疫发生的风险，所述免疫发生是由于改变的三维结构引起的。只有长 期观察经历使用darbepoetin进行治疗的患者才可作出对 darbepoetin的免疫原性风险的决定性回答。相反地，没有修饰EPO 分子部分的rHuEP0-Fc的糖含量与天然人EPO相同或非常相似。在本 发明者的純rHuEP0-Fc蛋白中的唾液酸的量为大约10.0 mmol/mmol EP0，这与报导的rHuEPO的参数一致。无外来氨基酸/连接肽的 rHuEP0-Fc的Fc部分代表了人IgGl的一般结构，并且在理论上不会 导致免疫原性应答。如果在临床上被批准，rHuEP0-Fc可能为患者(尤 其是需要长期施用的患者)提供比目前可获得的rHuEPO和EP0类似物 更好的选择。
每两周l次进行静脉内注射后，rHuEP0-Fc和darbepoetin ( 62. 5 Mg/kg)都能够在具有肾脏贫血症的大鼠中诱导相同的、远高于正常 对照大鼠中的正常Hb水平的Hb水平增加(图9)。这进一步证明了 由rHuBP0-Fc产生的红细胞生成的持续刺激作用，因为darbepoetin的功效已在临床上得到证明。
来自骨髓细胞的细胞培养实验的数据显示rHuEPO-Fc、 rHuEPO和 darbepoetin都刺激了 CFU-E和BFU-E的形成，所述骨髓细胞是在处 理(每周1次或每两周1次皮下或静脉内施用)后从切除了 5/6的肾 的大鼠中收集的。rHuEPO-Fc和darbepoetin的效力相似，并且比 rHuEPO强(图10)。
在处理组和模型对照组中血液urinonitrogen (BUN)和肌酐 (Crea)水平相似。所有处理组中的血清Fe水平比模型对照组高。病 理学检查观察到所有经EPO处理的小鼠的骨髓和脾脏中红细胞(RBC) 相关细胞的分布增加。
7.猕猴中rHuEPO-Fc的药物动力学研究
如上所述，本发明者以下列方式设计了 rHuEPO-Fc:融合蛋白的 EPO部分保持天然EPO的功能特性(例如刺激红细胞生成)，和人IgGl 的Fc片段使得融合蛋白能够在循环中稳定存在，从而延长了其体内半 衰期。上述动物研究已证明，与rHuEPO相比，rHuEPO-Fc的红细胞生 成活性得到增强。本发明者还进行了药物动力学研究以确定相比 rHuEPO而言的rHuEPO-Fc的体内半衰期。使用灵长类动物来产生数据， 因为它们在生物学上与人类非常相似。
研究设计是基于文献报导的，并且按照药物动力学的一般指导来 进行实验。分别用5 n g/kg rHuEPO-Fc或rHuEPO静脉内注射两组猕猴， 每组5只猴子(3-5kg，购自Experiment Animal Center, AMMS， China )。 在注射之前和注射之后0.017、 0.167、 0.5、 1、 2、 4、 8、 12、 24、 48、 96、 168、 240小时采集血液样品。通过离心收集血清，并通过使 用人促红细胞生成素酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒(购自R&D Systems, Minneapolis, MN )来测定血清rHuEPO-Fc或rHuEPO水平。 通过静脉内注射的rHuEPO-Fc和rHuEPO的平均半衰期(tl/2 )分别是 35. 24+/-5. 15小时和8. 72+/-1. 69小时(概括于图11中)。
为了观察rHuEPO-Fc的生物利用度，将5 ug/kg rHuEPO-Fc皮下注射给5只猕猴。在注射前和注射后l、 2、 5、 8、 10、 12、 15、 24、 48、 72、 96、 168、 240小时采集血液样品，并通过R&D试剂盒来测定 rHuEPO-Fc的血清水平。对于皮下注射，生物利用度指数计算为 35. 71+/-5. 37% 。这与报导的在慢性肾功能衰竭患者中的 darbepoetin-ot ( Aranesp )的生物利用度数据相一致[9， 15〗。
该数据证明，rHuEPO-Fc在灵长类动物中具有显著延长的半衰期， 并且rHuEPO-Fc的体内半衰期为由Kirin Beer Brewing Co. of Japan 生产的rHuEPO的至少4倍。延长的体内半衰期可能有助于rHuEPO-Fc 的增强的红细胞生成活性。
8. rHuEPO-Fc在食蟹猴(#acaca尸asc/c"/ar/s)中的免疫原性 如上面所指明的，在rHuEPO-Fc融合蛋白的设计中要注意有意地 避免或最小化rHuEPO-Fc融合蛋白的免疫原性特性的改变。本发明者 避免了在融合蛋白中包含/加入任何外来氨基酸或连接肽序列。图IB 的实施方案的所发明的HuEPO-Fc融合蛋白只包含天然EPO蛋白和人 IgGl的Fc片段(铰链区、CH2、 CH3)的多肽序列，并且在理论上不 诱导免疫原性应答和抗rHuEPO-Fc蛋白抗体的产生。正如本领域技术 人员将会认识到的，具有备选的结构的其他实施方案也包括在本发明中。
进行下列灵长类动物研究以观察rHuEPO-Fc蛋白的免疫原性。每 周3次用5yg/kg纯化的rHuEPO-Fc皮下注射10只食蟹猴(雄性/雌 性=5/5，大约5岁，雄性平均体重为4. 0± 0. 3kg，雌性为2. 9 ± 0. 4kg, 购自Laboratory Animal Center, AMMS， China)，进行4周，并用 等体积的载体溶液注射两只食蟹猴作为对照动物。每周采集血清1次， 进行5周(处理后1周)，并使用纯化的rHuEP0-Fc ( 5 jj g/ml )作为 包^皮抗原通过ELISA就抗rHuEPO-Fc的特异性抗体对其进行测试。此 外，还在实验期间测定了外周血中的RBC计数和Hb水平。所得的数据 显示，尽管在经rHuEP0-Fc处理的食蟹猴中观察到被刺激的红细胞生 成的增加(平均RBC数目从4. 74 x 107ml增加至6. 67 x 109/ml，并且平均Hb水平从12. 2g/dl增加至13. 7g/dl)，但rHuEP0-Fc不能诱导 可检测的抗融合蛋白的特异性抗体。这些结果表明，rHuEP0-Fc融合 蛋白不在灵长类动物中引起免疫原性。
9. rHuEPO-Fc在正常小鼠中的急性毒性研究
为了评估rHuEP0-Fc融合蛋白的安全性，在动物中进行急性毒性研九。
分别用过量的纯化的rHuEP0-Fc (雄性=13. 3 mg/kg，雌性=13. 2 mg/kg)或等体积的载体溶液通过其尾静脉来静脉内注射2组BALB/c 小鼠(n-20，等数目的雄性和雌性，5-6周龄，雌性平均体重为15.8 ±0. 4g，雄小生为15.9±0. 6g， 购自 Chinese Academy of Medicine, China) l次。除了观察注射后的即时反应外，每天监控和记录一般行 为和状态、活动性、进食和排便模式以及变化，进行14天。在笫7 天和第14天还对所有小鼠称重。在注射后第15天，对小鼠的主要器 官进行解剖检查。如果观察到器官的任何不寻常的改变或可疑的改变， 则进行病理学检查。
在所述2个组中的所有小鼠在注射后都没有明显的即时反应。在 14天的时期内，未观察到行为、活动性、进食和排便模式的明显改变。 此外，在测试期间两组小鼠的重量都稳定地增加，并且在注射后第7 天或第14天在2个組之间未发现明显的差异。在脑、肺、心脏、肝脏 和肾脏组织中未检测到异常的或病理性的改变。这些结果表明，施用 远比对于展示正常红细胞生成功能所需的量多的过量rHuEPO-Fc是安 全的，并且无显著的毒性效应。
10. 野生型和突变型EPO融合蛋白的比较 还进行了用于比较野生型和突变型EP0蛋白的研究。如上所述，
在一个实施方案中，本发明包括在氨基酸残基172处的单个氨基酸突 变(C172G)。为了进行比较，还制备了在残基172处具有半胱氨酸氨 基酸的野生型融合蛋白(图12)。以与上述实施例1至3中相同的方法制备了所述野生型融合蛋白。关于重组质粒的构建，使用下列oligo 引物(QIAGENInc. ， US)(与实施例1中的引物相比，EFL5w和EFL3w
中改变的氨基酸以粗体标示)
EF5: 5 ，-ccggaattcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcct-3 ，；
EF3: 5 ，掘ccttttgcggccgcttatttacccggagacagggagag-3 ，.
EFL5w: 5 ，誦aggcctgcaggacaggggacagagttgagcccaaatcttgtgaca-3 ，.
EFL3w: 5 ，-tgtcacaagatttgggctcaactctgtcccctgtcctgcaggcct-3'。
引物EFL5w和EFL3w的序列分别列于SEQ. I.D. No. 9-10中。 进行在小鼠中的体内实验以将野生型融合蛋白(此处称为 rHuEPO-FcC)的红细胞生成活性与突变型融合蛋白(即上述的本发明 rHuEPO-Fc蛋白)和与重组人EPO ( rHuEPO )进行比较。为了进行比较， 用于该实施例的所述三种蛋白(即rHuEPO-Fc、 rHuEPO-FcC和rHuEPO ) 的所有剂量是基于摩尔基础的单独的EPO分子部分的量。对于 rHuEPO-Fc和rHuEPO-FcC蛋白，如通过EPO的氨基酸重量对整个 rHuEPO-Fc和rHuEPO-FcC分子的总氨基酸重量的比例(即399个aa 中166个aa)所计算的，EPO部分贡献了总分子量的41. 4%。
将rHuEPO-Fc (母液浓度:300jLig/ml ) 、 rHuEPO-FcC (母液浓度: 90Mg/ml)和具有天然人EPO结构的rHuEPO ( 6000IU/0. 5ml，由 Kirin Brewery Co. ， Japan生产)在栽体溶液(2. 5mg/ml人血清白 蛋白，5. 8mg/ml柠檬酸钠，Q. 06mg/ml柠檬酸和5. 8mg/ml氯化钠， pH5. 5-5. 6 )中稀释。根据其活性/数量比例来计算总计的rHuEPO剂量。 将BALB/c小鼠(9至10周龄，体重18-22g,雄性和雌性数目相等， 购自Experiment Animal Center, AMMS， China)随机分组，每组8 只。用一种剂量(2. 5、 12.5、 62.5jLig/kg)、 一种注射途径(s. c.) 和一种注射方案(每周3次或每周1次)的一种组合来处理各组小鼠。 用等体积的载体溶液注射对照组小鼠。所述处理持续26天。在处理前 以及在处理的第2、 6、 9、 13、 16、 19、 22和26天釆集用于测量的外 周血样品(尾静脉)。通过吸光测定法将Hb测量为指数。根据各组的 数据来计算平均值土SD,并在不同组之间进行,检验。如图13中所示，以每周3次的间隔施用所有三种EP0蛋白刺激了 红细胞生成。在2. 5 ju g/kg或12. 5 ju g/kg的剂量上，rHuEPO-Fc诱导 了比rHuEPO更高的Hb水平的提高。最高的Hb水平的提高通过12.5 Mg/kg剂量的rHuEP0-Fc获得。如由经rHuEPO-FcC处理的组中的显 著更低的Hb水平的提高所表明的，2. 5ug/kg和12.5yg/kg剂量的 rHuEPO-FcC诱导了相比等剂量的rHuEPO和rHuEP0-Fc而言弱得多的 红细胞生成。事实上，12. 5Mg/kgrHuEP0-FcC诱导了相比2. 5jug/kg rHuEPO而言更低的Hb水平的提高。这些结果暗示，与具有天然EPO 分子序列的rHuEPO相比，rHuEPO-FcC削弱了体内红细胞生成活性。 相反地，本发明的rHuEPO-Fc融合蛋白展示出更强的红细胞生成功能。 以每周3次的间隔施用所述三种EPO蛋白大大地排除了所述蛋白的半 衰期差异的影响。
通过减少皮下注射次数至每周一次来进一步评估rHuEPO-Fc和 rHuEPO-FcC的红细胞生成效力。如图14中所示，在12. 5 yg/kg或62. 5 ju g/kg的剂量上，与经rHuEPO处理的组相比，经rHuEPO-Fc处理的 组显示更高的Hb水平的提高。相反地，与由rHuEPO所诱导的Hb水平 的提高相比，rHuEPO-FcC诱导了弱得多的Hb水平的提高。例如，在 大多数时间点上，12. 5yg/kg rHuEPO诱导了相比62. 5 n g/kg rHuEPO-FcC而言更高的Hb水平的提高。这进一步表明，通过减少施 用次数至包括半衰期的影响，rHuEPO-FcC展示出相比具有天然EPO分 子序列的rHuEPO和本发明的rHuEPO-Fc融合蛋白而言弱得多的体内红 细胞生成功能。
总之，这些结果证明，与具有天然EPO分子序列的rHuEPO相比， 由人EPO和人Fc片段(铰链、CH2和CH3)的天然分子序列融合形成 的rHuEPO-FcC展示出弱得多的体内红细胞生成功能。特别地，所述 rHuEPO-FcC融合蛋白的红细胞生成活性低于天然EPO分子的红细胞生 成活性的1/5。这表明，EPO分子和人Fc片段的天然序列之间的融合 削弱了 EPO分子的功能特性。通过在Fc片段的铰链区中于第一个半胱 氨酸残基处进行单个氨基酸替代，包含天然EPO分子序列和突变型Fc片段的本发明的rHuEP0-Fc融合蛋白显示出相比天然EP0分子而言更 强的体内红细胞生成功能。该数据暗示，野生型Fc片段的铰链区中的 第一个半胱氨酸残基不知何故干扰了 EP0分子，可能是由于使EPO分 子的结构发生改变而导致的，并且这反过来削弱了 EPO分子在刺激红 细胞生成中的功能特性。
正如依据上述公开内容而对于本领域技术人员来说将是显然的， 在本发明的实施中可能进行许多改变和修饰，但不背离其精神或范围。参考文献
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权利要求
1.包含直接连接至人IgG Fc片段的人促红细胞生成素分子的重组融合蛋白，其中所述融合蛋白具有相比天然发生的或重组的天然人促红细胞生成素而言延长的体内半衰期。
2. 权利要求l的蛋白，其中所述蛋白的半衰期为所述天然人促 红细胞生成素的至少3倍。
3. 权利要求2的蛋白，其中所述蛋白的半衰期为所述天然人促 红细胞生成素的至少4倍。
4. 权利要求2的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有相比所述天 然人促红细胞生成素而言增强的红细胞生成生物活性。
5. 权利要求l的融合蛋白，其中所述Fc片段是IgGl片段。
6. 权利要求5的融合蛋白，其中所述Fc片段包含铰链区和CH2 和CH3结构域。
7. 权利要求6的融合蛋白，其中所述铰链区的长度为至少9个 氨基酸。
8. 权利要求l的融合蛋白，其中所述蛋白具有SEQ. I.D. No. 2 中所示的氨基酸序列或基本上与其同源的序列。
9. 包含多个权利要求1的融合蛋白的多聚体蛋白构建体。
10. 权利要求9的多聚体蛋白构建体，其中所述结构是二聚体。
11. 包含多个多肽的多聚体蛋白，所述多肽各具有SEQ. I.D. No. 2中所示的氨基酸序列或基本上与其同源的序列。
12. 权利要求ll的蛋白，其中所述蛋白是二聚体。
13. 权利要求12的蛋白，其中所述二聚体在所述多肽的铰链结 构域之间包含二硫键。
14. 权利要求ll的蛋白，其中所述多肽中的每一个具有大约75 kDa的分子量。
15. 权利要求12的蛋白，其中所述二聚体具有大约180 kDa的 分子量。
16. 包含权利要求1的蛋白以及药物学上可接受的载体、佐剂或 稀释剂的药物组合物。
17. 编码与SEQ. I.D. No. 2具有至少90%的氨基酸序列同一性 的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有相比天然人促红细胞生成素 而言延长的体内半衰期。
18. 重组DNA分子，其包含SEQ. I.D. No. 1中所示的核酸序列 或基本上与其同源的序列。
19. 用权利要求18的重组DNA分子转染的细胞系。
20. 权利要求19的细胞系，其中所述细胞系是CHO细胞系。
21. 产生权利要求1的蛋白的方法，其包括培养用权利要求18 的DNA分子转染的细胞系和纯化由其编码的多肽。
22. 在哺乳动物中刺激红细胞生成的方法，其包括给所述哺乳动 物施用权利要求1的蛋白。
23. 权利要求22的方法，其中所述哺乳动物是灵长类动物。
24. 权利要求23的方法，其中所述灵长类动物是人。
25. 在哺乳动物中刺激红细胞生成的方法，其包括给所述哺乳动 物施用权利要求16的药物组合物。
26. 权利要求25的方法，其中所述哺乳动物是灵长类动物。
27. 权利要求26的方法，其中所述灵长类动物是人。
28. 权利要求22的方法，其中当静脉内或皮下施用时，在所述 哺乳动物中所述蛋白的半衰期为天然人EPO的至少3倍。
29. 权利要求28的方法，其中当静脉内或皮下施用时，在所述 哺乳动物中所述蛋白的半衰期为天然人EP0的至少4倍。
30. 重组融合蛋白，其包含(a) 具有临近其C末端的半胱氨酸残基的促红细胞生成素肽部 分；和(b) 包含铰链区的免疫球蛋白肽部分，其中位于最靠近所述促红细胞生成素肽部分处的所述铰链区的至少12个氨基酸。
31. 权利要求30的融合蛋白，其中促红细胞生成素肽部分是完 整的人促红细胞生成素分子。
32. 权利要求30的融合蛋白，其中所述免疫^l蛋白肽部分是包 含所述铰链区和CH2和CH3结构域的人IgG Fc片段。
33. 权利要求32的融合蛋白，其中所述IgG Fc片段是IgGl片段。
34. 权利要求32的融合蛋白，其中所述铰链区直接偶联至所述 促红细胞生成素肽部分。
35. 权利要求32的融合蛋白，其在所述铰链区和所述促红细胞 生成素肽部分之间包含肽连接体。
36. 权利要求30的融合蛋白，其中所述铰链区的长度为至少9 个氨基酸。
37. 权利要求36的融合蛋白，其中所述铰链区在从所述铰链区 的N末端开始测量的第6位氨基酸处具有非半胱氨酸残基。
38. 权利要求37的融合蛋白，其中所述非半胱氨酸残基是中性 氨基酸。
39. 权利要求38的融合蛋白，其中所述非半胱氨酸残基是甘氨酸。
40. 权利要求36的融合蛋白，其中所述铰链区是在从所述铰链 区的N末端开始测量的第6位氨基酸处具有非半胱氨酸残基的人Fc 片段变体。
41. 权利要求34的融合蛋白，其中所述铰链区具有SEQ. I.D. No. 5中所示的氨基酸序列，或与其具有至少90%序列同一性并且在从所述 铰链区的N末端开始测量的第6位氨基酸处具有非半胱氨酸残基的序列。
42. 权利要求30的融合蛋白，其中当给哺乳动物施用时，所述 蛋白的半衰期为以相同方式给所述哺乳动物施用的天然人促红细胞生 成素的至少3倍。
43. 权利要求42的融合蛋白，其中当给哺乳动物施用时，所述 蛋白的半衰期为以相同方式给所述哺乳动物施用的天然人促红细胞生 成素的至少4倍。
44. 权利要求42的融合蛋白，其中所述哺乳动物是人。
45. 包含第一和第二融合蛋白的二聚体，所述融合蛋白中的每一 个为权利要求30中所定义的，其中所述第一融合蛋白的所述铰链区通 过二硫键结合至所述第二融合蛋白的所述铰链区。
46. 包含多个经连接的融合蛋白的多聚体蛋白构建体，所迷融合 蛋白中的每一个为权利要求30中所定义的。
47. 包含SEQ. I.D. No. 1中所示的核酸序列的重组DNA分子。
48. 包含一对多肽的二聚体，所述多肽中的每一个具有SEQ. I.D. No. 2中所示的氨基酸序列。全文摘要
描述了包含连接至免疫球蛋白肽部分的人促红细胞生成素肽部分的重组融合蛋白。所述融合蛋白具有相比天然发生的或重组的天然人促红细胞生成素而言延长的体内半衰期。在本发明的一个实施方案中，所述蛋白质的体内半衰期为天然人促红细胞生成素的至少3倍。所述融合蛋白还展现出相比天然人促红细胞生成素而言增强的红细胞生成生物活性。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含人促红细胞生成素(EPO)分子的完整肽序列和人免疫球蛋白IgG1的Fc片段的肽序列。在所述融合蛋白中的Fc片段包含人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2和CH3结构域。所述EPO分子可直接连接至Fc片段以避免外来肽连接体，并当在体内施用时减少免疫原性应答的风险。在一个实施方案中，所述铰链区是在第6位氨基酸处具有非半胱氨酸残基的人Fc片段变体。本发明还涉及编码所述融合蛋白的核酸和氨基酸序列，以及用于产生所述融合蛋白的经转染的细胞系和方法。本发明进一步包括包含所述融合蛋白的药物组合物，和使用所述融合蛋白和/或所述药物组合物(例如在需要治疗的受试者中刺激红细胞生成)的方法。
文档编号A61K38/18GK101321870SQ200780000439
公开日2008年12月10日 申请日期2007年1月25日 优先权日2006年1月27日
发明者刘龙斌, 瑞 张, 静 徐, 勇 杜, 王海涛 申请人:诺瓦根控股公司