具有延长的循环半衰期的n-糖基化的人生长激素的制作方法

专利名称：具有延长的循环半衰期的n-糖基化的人生长激素的制作方法
技术领域：
本发明涉及新颖的具有至少一个N-糖基化基序(N-X-S/T)的人生长激素(hGH) 变体，所述N-糖基化基序不存在于野生型hGH中。本发明的hGH变体具有延长的循环半衰 期，可用作将从增加的hGH水平受益的疾病状态的蛋白治疗剂。
背景技术：
人生长激素(hGH)是含有2个二硫桥、长度为191个氨基酸、分子量为22 kDa的蛋 白。二硫键连接第53位和第165位以及第182位和第189位。hGH在促进生长、维持正常机 体组成、合成代谢和脂类代谢中起关键作用(Barnels K, Keller U. Clin. Endocrinol. Metab.10, 337 (1996))。它还对中间代谢具有直接作用，所述中间代谢例如减少的葡萄 糖摄取、增加的脂解、增加的氨基酸摄取和蛋白合成。该激素还对其它组织发挥作用，包括 脂肪组织、肝、肠、肾、骨骼、结缔组织和肌肉。已经生产了重组hGH，且可商业得到，例如健 豪宁 (Pharmacia Up john)、Nutropin 和普兰品 (Genentech)、优猛茁 (Eli Lilly)、 Serostim (Serono)和诺展 (Novo Nordisk)。另外，在N-末端具有额外的甲硫氨酸残 基的类似物也已经面市，例如Somatonorm (Pharmacia Upjohn/Pfizer)。一般而言，低于正常水平的hGH导致生长相关的缺陷。例如，hGH通过增加氮保留 和刺激骨骼肌生长，维持正常机体组成。儿童的生长激素缺乏导致侏儒症，其可以通过外源 性施用hGH予以有效治疗。还认为，降低的hGH水平可能引起衰老表现，这包括减少的瘦体 重、脂肪组织块的扩大和皮肤的收缩。现有的hGH治疗方案需要每天皮下注射。每周更少注射的给药方案将是有益的。 已经发现了几个增加蛋白半衰期的原则，但是它们的适用性随不同蛋白而异，这部分地因 为不同的蛋白通过不同的途径和机理清除。通过在野生型蛋白的未被糖基化的氨基酸位置处添加N-聚糖，可以增加一些蛋 白的半衰期(Sinclair 和 Ellliott, J Pharm Sci. 94, 1626 (2005)) N-聚糖被生 产蛋白的真核细胞添加到该蛋白上。随着初生蛋白从核糖体向内质网易位，真核细胞的 细胞N-糖基化机制会识别N-X-S/T基序，并在该基序的N残基处添加聚糖(Kiely等人 J Biol Chem. 251 5490 (1976) ； Glabe 等人 J Biol Chem. 255, 9236 (1980))。因 而，通过引入突变，所述突变将N-糖基化位点添加到蛋白的氨基酸序列上，可以生产糖工 程化的(glycoengineered)蛋白。已经利用该原理获得更长效的第二代促红细胞生成素 (Aranesp , Amgen)，Elliott 等人 Nature Biotechnology 21, 414 Q003)。

发明内容
本发明涉及具有至少一个N-糖基化基序(N-X-S/T)的人生长激素(hGH)变体，所 述N-糖基化基序不存在于野生型hGH中。在一个实施方案中，在真核细胞中表达所述变体， 所述真核细胞提供在所述位点处的N-糖基化，引起具有延长的循环半衰期的hGH变体的表 达。这样的hGH变体可用作将从增加的hGH水平受益的疾病状态的蛋白治疗剂，特别是用于少于每天注射的治疗中，例如每周注射。


图IA是如实施例1所述用于在哺乳动物细胞中表达的编码野生型人生长激素DNA 的核苷酸序列和推论的氨基酸序列。图IB是成熟的hGH的蛋白序列(SEQ ID NO: 1)。图2显示了在用pGB039瞬时转染的HEK293细胞的培养基中通过ELISA测得的重 组野生型人生长激素的产率(实施例2)。图3显示了用来自HEK293细胞的培养基进行的BAF3-GHR细胞试验的结果，所述 HEK293细胞被编码含有使用的N-糖基化位点的人生长激素变体的构建体瞬时转染。在细 菌中生产的重组人生长激素用作标准品，并平行地测试。将测试的人生长激素变体稀释至 10 nM、3 nM、l nM、100 PM、300 PM、30 P MUO PM、3 P MU PM、0.3 PM 和 0.1 PM。使 用GraphPad软件prism)，使用可变斜率，计算描述对数hGH浓度相对于生长响应的趋势 线(实施例5)。图4显示了用来自HEK293细胞的培养基进行的BAF3-GHR细胞试验的结果，所述 HEK293细胞被编码具有超过一个N-糖基化位点的人生长激素变体的构建体瞬时转染。在 细菌中生产的重组人生长激素用作标准品，并平行地测试。将测试的人生长激素变体稀释 至 10 nM、5 nM、l nM、500 P MUOO PM、50 P MUO PM、5 P MU ΡΜ、0·5 PM 和 0.1 P Μ。 使用GraphPad软件prism)，使用可变斜率，计算描述对数hGH浓度相对于生长响应的趋 势线(实施例7)。图5显示了静脉内注射N-糖基化的人生长激素变体L93N+A98N+L101T+G104N (TVL20)或野生型人生长激素的雄性Sprague Dawley大鼠的血浆中的平均人生长激素浓 度相对于时间的关系(实施例10)。图6显示了用来自HEK293细胞的培养基进行的BAF3-GHR细胞试验的结果，所述 HEK293细胞被编码含有使用的N-糖基化位点的人生长激素变体的构建体瞬时转染。在细 菌中生产的重组人生长激素用作标准品，并平行地测试。将测试的人生长激素变体稀释至 10 nM、5 nM、l nM、500 P MUOO PM、50 P MUO PM、5 P MU ΡΜ、0·5 PM 和 0.1 PM。使 用GraphPad软件prism)，使用可变斜率，计算描述对数hGH浓度相对于生长响应的趋势 线(实施例13)。图7显示了用来自HEK293细胞的培养基进行的BAF3-GHR细胞试验的结果，所述 HEK293细胞被编码含有使用的N-糖基化位点的人生长激素变体的构建体瞬时转染。在细 菌中生产的重组人生长激素用作标准品，并平行地测试。将测试的人生长激素变体稀释至 10 nM、5 nM、l nM、500 P MUOO PM、50 P MUO PM、5 P MU ΡΜ、0·5 PM 和 0.1 PM。使 用GraphPad软件prism)，使用可变斜率，计算描述对数hGH浓度相对于生长响应的趋势 线(实施例13)。图8显示了用来自HEK293细胞的培养基进行的BAF3-GHR细胞试验的结果，所述 HEK293细胞被编码具有超过一个N-糖基化位点的人生长激素变体的构建体瞬时转染。在 细菌中生产的重组人生长激素用作标准品，并平行地测试。将测试的人生长激素变体稀释 至 10 nM、5 nM、l nM、500 P MUOO PM、50 P MUO PM、5 P MU ΡΜ、0·5 PM 和 0.1 P Μ。使用GraphPad软件prism)，使用可变斜率，计算描述对数hGH浓度相对于生长响应的趋 势线(实施例15)。图9显示了静脉内注射N-糖基化的人生长激素变体Q49N+E65N+ G104N+R127N+E129T (TVL64)、Q49N+E65N+S71N+L73T+G104N+ R127N+E129T (TVL66)或 Q49N+E65N+S71N+L73T+L93N+G104N+ R127N+E129T (TVL67)或野生型人生长激素的雄性 Sprague Dawley大鼠的血浆中的平均人生长激素浓度相对于时间的关系(实施例17)。图10显示了皮下注射N-糖基化的人生长激素变体Q49N+E65N+ G104N+R127N+E129T (TVL64)、Q49N+E65N+S71N+L73T+G104N+ R127N+E129T (TVL66)或 Q49N+E65N+S71N+L73T+L93N+G104N+ R127N+E129T (TVL67)或野生型人生长激素的雄性 Sprague Dawley大鼠的血浆中的平均人生长激素浓度相对于时间的关系(实施例17)。发明详述
本发明涉及具有延长的半衰期的人生长激素(hGH)变体，其可以用于治疗目的，并提 供了重组表达的携带额外的N-糖基化的人生长激素变体，所述变体具有包含一个或多个 在野生型人生长激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)的氨基酸序列。核酸hGH在特 定氨基酸位置处被突变，且核酸在真核细胞中的重组表达将产生与野生型hGH相比具有延 长的循环半衰期的这些hGH变体的N-糖基化衍生物。由于它的改善的药物代谢动力学性 质，本发明的hGH变体作为将从增加的hGH水平受益的疾病状态的治疗剂是更有用的，因为 与未改变的hGH相比，它会降低给药频率。在本发明上下文中，术语“变体”意在表示特定多肽的天然存在的变体，或特定肽 或蛋白的重组制备的或以其它方式修饰的变体，例如人生长激素(其序列如SEQ ID No. 1 所示)，其中已经通过氨基酸置换、添加、删除、插入或反转修饰了一个或多个氨基酸残基。 为了清楚起见，还可以衍生或以其它方式修饰hGH变体，即通过将任意类型的分子共价结 合到母体多肽上。典型的修饰可以是将酰胺、碳水化合物、烷基、酰基、酯类、聚乙二醇化等 结合到包含人生长激素变体序列的多肽上。具体地，hGH变体还可以携带N-糖基化。hGH 变体可以额外地包含其它突变，它们与在野生型人生长激素中不存在的N-糖基化位点的 引入无关。可以因为多种原因而包含这样的额外突变，例如为了能够通过共价结合如上所 述的任意类型的分子而修饰。在一个实施方案中，本发明提供了 hGH变体，它是包含这样的氨基酸序列的多肽， 所述氨基酸序列与SEQ ID No. 1的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、 例如至少95%、例如100%同一性。如本领域已知的，术语“同一性”是指通过对比序列测得的2个或更多个肽的序 列之间的关系。在本领域，“同一性”还表示通过2个或更多个氨基酸残基的组(strings) 之间的匹配数测得的肽之间的序列相关性程度。“同一性”测量2个或更多个序列中的更 小者与间隙比对(如果存在)之间的同一匹配的百分比，这通过特定数学模型或计算机程 序(即，“算法”)来实现。通过已知的方法，可以容易地计算相关肽的同一性。这些方法 包括、但不限于在下述文献中描述的那些Computational Molecular Biology, Lesk, Α. Μ.,编，Oxford University Press, New York, 1988； Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.,编，Academic Press, New York, 1993 ； Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, Α. Μ.,禾口Griffin, H. G.,编，HumanaPress, New Jersey, 1994； Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987； Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.禾口 Devereux, J.,编，Μ· Stockton Press, New York, 1991 ；和Carillo等人，SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)。优选的测定同一性的方法被设计用于提供测试的序列之间的最大匹配。测定同 一性的方法描述在可公开得到的计算机程序中。优选的测定2个序列之间的同一性的计 算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP (Devereux等人，Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984)； Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)、 BLASTP、BLASTN 和 FASTA (Altschul 等人，J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990))。 BLASTX程序可从美国国立生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLAST Manual, Altschul 等人 NCB/NLM/MH Bethesda, Md. 20894; Altschul 等人，同上)公开得到。 众所周知的Smith Waterman算法也可以用于测定同一性。例如，使用计算机算法GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)，比对要测定序列同一性百分比的2个肽之间它们各个氨基 酸的最佳匹配(通过该算法测得的“匹配跨度”)。间隙开口罚分(将其计算为3 X平均 对角线；“平均对角线”是使用的对比矩阵的对角线的平均值；“对角线”是由特定对比矩阵 分配给每个完美氨基酸匹配的评分或数值)，且间隙延伸罚分(它通常是{分数(1/10)} X间隙开口罚分)、以及诸如PAM 250或BLOSUM 62等对比矩阵，与该算法联合使用。该 算法也使用标准的对比矩阵(关于PAM 250对比矩阵，参见Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure,第 5 卷，±曾刊 3 (1978)；关于 BLOSUM 62 对比矩阵， 参见 Henikoff 等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919 (1992))。肽序列对比的优选参数包括下述的
算法Needleman 等人，J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970)；对比矩阵来自 Henikoff 等人，PNAS USA 89, 10915-10919 (1992)的 BLOSUM 62;间隙罚分12，间 隙长度罚分4，相似性阈值O。GAP程序可与上述参数一起使用。前述参数是使用GAP算法的肽对比的缺省参数 (对于末端间隙，没有罚分)。在一个实施方案中，hGH变体包含具有至少一个N-糖基化基序(N-X-S/T)的氨 基酸序列，所述基序源自选自下述的一个或多个突变S55N、Q69N、E74S、E74T、R77N、I83N、 L93N、A98N、L101S、L101T、G104N、S106N、Y111S、Y111T、I121N、D130N、K140N、T142N、G161S、 G161T 禾口 E186N。在一个实施方案中，hGH变体包含具有至少一个N-糖基化基序(N-X-S/T)的氨基 酸序列，所述基序源自选自下述的一个或多个突变Q69N、R77N、I83N、L93N、A98N、L101T、 G104N、S106N、Y111T、I121N、D130N、K140N、G161T 和 E186N。本发明还包括这样的hGH变体，其包含具有至少一个N-糖基化基序(N-X-S/T)的 氨基酸序列，所述基序源自下述突变组中的一个或多个
L93N、A98N、LlOlT 和 G104N ； L93N、A98N 禾口 G104N;或 L93N、LlOlT 禾口 G104N。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的编码hGH变体的核酸序列，其中所述变 体包含这样的氨基酸序列，该序列包括至少一个N-糖基化基序(N-X-S/T)，所述基序源自 在野生型hGH中不存在的一个或多个突变。本发明提供了分离的编码hGH的核酸序列，所述hGH包含至少一个N-糖基化基序 (N-X-S/T)，所述基序源自选自下述的一个或多个突变S55N、Q69N、E74S、E74T、R77N、I83N、 L93N、A98N、L101S、L101T、G104N、S106N、Y111S、Y111T、I121N、D130N、K140N、T142N、G161S、 G161T 和 E186N。本发明还提供了分离的编码hGH的核酸序列，所述hGH包含至少一个N-糖基化 基序(N-X-S/T)，所述基序源自选自下述的一个或多个突变Q69N、R77N、I83N、L93N、A98N、 L101T、G104N、S106N、Y111T、I121N、D130N、K140N、G161T 和 E186N。此外，本发明提供了分离的编码hGH变体的核酸序列，所述hGH变体包含具有 N-糖基化基序(N-X-S/T)的氨基酸序列，所述基序源自选自下述突变组中的一个或多个
L93N、A98N、LlOlT 和 G104N ； L93N、A98N 和 G104N ；或 L93N、LlOlT 禾口 G104N。另外，本发明提供了包含载体的真核宿主细胞，所述载体具有编码人生长激素变 体的核酸，所述人生长激素变体包含含有至少一个N-糖基化基序(N-X-S/T)的氨基酸序 列，所述基序源自在野生型人生长激素中不存在的一个或多个突变。本发明还包括这样的载体，其包含编码人生长激素变体的核酸，所述人生长激素 变体具有N-糖基化基序(N-X-S/T)，所述基序源自下述突变组中的一个或多个
L93N、A98N、LlOlT和 G104N ； L93N、A98N 和 G104N ；或 L93N、LlOlT 和 G104N。在一个实施方案中，本发明提供了 N-糖基化的人生长激素变体，它在源自如上文 所述的一个或多个突变的一个或多个N-糖基化基序中被糖基化。此外，本发明提供了药物组合物，其包含人生长激素变体和药学上可接受的载体， 所述人生长激素变体包含这样的氨基酸序列，该序列包括至少一个N-糖基化基序(N-X-S/ T)，所述基序源自在野生型人生长激素中不存在的一个或多个突变。前述药物组合物包括 在本公开内容中所述的不同hGH变体中的任一种。在一个实施方案中，本发明提供了治疗需要人生长激素的哺乳动物的方法，所述 方法包括给哺乳动物施用治疗有效量的在本公开内容中所述的人生长激素变体中的任一 种。本发明还包括得到N-糖基化的hGH变体的方法，所述hGH变体包含至少一个 N-糖基化基序(N-X-S/T)，所述基序源自在野生型hGH中不存在的一个或多个突变，所述方 法包括下述步骤(a)用编码所述变体人生长激素的核酸转染能进行N-糖基化且能表达 所述突变型人生长激素的细胞；和(b)表达所述变体人生长激素。本发明提供了人生长激素(hGH)变体，其包含包括在特定氨基酸位置处的至少一 个N-糖基化位点的氨基酸序列；本发明的hGH变体是治疗活性的，且具有与未糖基化的野 生型hGH蛋白相比提高的药物代谢动力学参数和性质。
在一个实施方案中，本发明的hGH变体是已经转染进真核宿主细胞中的外源DNA 序列的表达产物。例如，重组地生产本发明的hGH。重组hGH的生产是本领域熟知的，且可 被本领域技术人员容易地识别(实例US4670393)。在一个实施方案中，本发明提供了重组hGH，其在多肽中具有适当的一个或多个位 点，以得到与野生型hGH相比具有提高的循环半衰期的有活性的N-糖基化的蛋白。使用重 组DNA技术，可以方便地进行本文所述的发明。一般而言，克隆和操作编码hGH的DNA序列，使它可以在方便的宿主中表达。图IA 所示的核苷酸序列编码217个氨基酸的hGH前蛋白(SEQ ID NO 65和66)。N-末端26个 氨基酸构成信号肽，当在真核细胞中生产hGH时，该信号肽在细胞内被切掉。因而，表达由 图IA所示的序列编码的人生长激素的哺乳动物细胞会分泌在图IB中提供的成熟的191个 氨基酸的生长激素(SEQ ID NO 1)。将hGH DNA插入用于转化或转染宿主细胞的适当质粒或载体中。原核生物、真核 生物(例如酵母培养物)或源自多细胞生物的细胞在本领域用于克隆和表达DNA序列。根据本发明使用的适当宿主细胞是能N-糖基化的细胞。N-糖基化是糖部分向 N-X-S/T基序中的天冬酰胺残基上的添加。通过真核细胞的N-糖基化机理连接到天冬酰胺 侧链中的酰胺氮上的这样的糖部分称作N-聚糖。真核细胞(例如哺乳动物细胞)通常能进行这样的N-糖基化。适用于本发明的细胞 系的实例是中国仓鼠卵巢(CHO) (ATCC CCL 61)、幼仓鼠肾(BHK)和293 (ATCC CRL 1573; Graham等人，J. Gen. Virol. 36:59-72，1977)细胞系。另外，许多其它细胞系可以用于 本发明中，包括大鼠H印I (大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1600)、大鼠H印II (大鼠肝细胞 瘤；ATCC CRL 1548) ,TCMK (ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065) ,NCTC 1469 (ATCC CCL 9. 1) ,C0S-1 (ATCC CRL 1650)，DUKX 细胞(Urlaub 和 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)和 CH0-DG44 细胞(UrIaub 等人 Cell 33:405-412，1983)。在 一个实施方案中，用于表达本发明的具有N-糖基化位点的hGH变体的宿主细胞是哺乳动物 细胞。在一个实施方案中，用于表达本发明的具有N-糖基化位点的hGH变体的宿主细胞是 CHO细胞。除了哺乳动物细胞以外，借助于适当的系统例如GlycoFi 0，工程化的酵母细胞 也可以用于表达糖基化的蛋白。 在适合细胞生长和表达hGH变体的条件下，培养用于表达hGH的宿主细胞。具 体地，培养基含有适当的营养物质和生长因子，它们适合用于为所述目的选定的宿主细 胞的生长。适合哺乳动物宿主细胞的培养条件，例如，描述在Mammalian Cell Culture (Mather, J. P.编，Plenum Press 1984)禾口 Barnes 禾口 Sato, Cell, 22:649 (1980)中。 最近，不含动物组分的方法逐渐成为生产生物药物的标准(Butler等人Appl Microbiol Biotechnol 68:283，2005)。此外，选择的培养条件应当允许转录、翻译和在细胞区室之间 的蛋白运输。影响这些过程的一些因素包括、但不限于例如，DNA/RNA拷贝数；稳定RNA的 因子；在培养基中存在的营养物质、添加物和转录诱导物或抑制物；培养的温度、PH和渗透 压；和细胞密度。本领域技术人员可容易地识别前述因素的操纵，以促进在特定载体-宿主 细胞系统中的适当表达。含有源自与宿主细胞相容的物种的复制和控制序列的质粒载体，通常用于表达。载体携带复制位点以及编码目标蛋白的序列，所述目标蛋白能在转化的细胞中提供表型选 择。在克隆hGH基因后，可以使用不同的技术来生产编码修饰的氨基酸序列的变体 DNA。这些技术包括定点诱变(Carter 等人，NuclAcidsRes. 13:4331，1986; Zoller 等人 Nucl Acids Res. 10:6487，1987)、盒式诱变(Wells 等人 Gene, 34:315，1985)、限 制选择诱变(Wells 等人 Philos Trans R Soc. London SerA, 317: 415，1986)或本领 域技术人员公认的其它已知的技术。在一个优选的实施方案中，在本发明中使用定点诱变， 生产具有糖基化位点的hGH。当可操作地连接到适当的表达载体上时，得到糖基化位点hGH 变体。通过利用可操作地连接到编码hGH母体或变体的DNA序列上的适当的信号序列，通 过从表达宿主表达和分泌这样的分子，也可以得到人生长因子(hGH)变体。这样的方法是 本领域技术人员熟知的。本发明还包括可以用于生产hGH多肽的其它方法，例如希望的hGH 变体的体外化学合成(Barany等人，见The Peptides,编.Ε. Gross和J. Meienhofer, Academic Press: New York 1979，第 2 卷，第 3-254 页)。碳水化合物以几种方法连接到糖肽上，其中N-连接到天冬酰胺上和0-连接到丝 氨酸和苏氨酸上是重组糖蛋白治疗剂最相关的。起始蛋白的糖基化的决定因素是基本序列 环境(primary sequence context)，尽管包括蛋白区域和构象在内的其它因素显然具有它 们的作用。N-连接的糖基化发生在共有序列N-X-S/T处，其中X可以是除了脯氨酸以外的 任意氨基酸。在一个优选的实施方案中，忽略包含半胱氨酸或脯氨酸残基的氨基酸置换形 成的N-糖基化位点。 本文所述的hGH类似物包含这样的氨基酸序列，其与未糖基化的野生型hGH相比， 包括至少一个额外的糖基化位点。多肽中引入N-糖基化的位点可以位于序列中的任意位 置。为了防止干扰蛋白结构或折叠，在一个实施方案中，选择一个或多个在蛋白表面上的 N-糖基化位点。此外，也不希望干扰与生长激素受体的结合，因而不希望将N-糖基化位点 引入在人生长激素的结合界面(binding interphase).在一个实施方案中，将一个或多个 N-糖基化基序引入成熟的人生长激素蛋白的一个或几个区域。在一个实施方案中，至少一 个N-糖基化基序(N-X-S/T)源自成熟的hGH (SEQ ID NO 1)的氨基酸残基49_75、93_104 和111-140位中的一个或多个突变。在本发明的其它实施方案中，将至少2个、至少3个、 至少4个或所有N-糖基化基序引入氨基酸残基49-75、93-104和111-140位。在一个实施 方案中，将所有N-糖基化基序引入氨基酸残基49-77、93-104和127-133位。在一个实施方案中，本发明包含这样的人生长激素(hGH)，其包含具有至少一个 N-糖基化基序(N-X-S/T)的氨基酸序列，所述基序源自野生型hGH的一个或多个突变。可 以将N引入离野生型中存在的S或T适当的距离，或可以将S或T (在下面表示为S/T)弓丨 入离野生型中存在的N适当的距离。或者，通过引入N和S/T，可以产生N-糖基化基序。 在一个实施方案中，本发明提供了这样的hGH变体，其包含具有一个或多个N-糖 基化基序(N-X-S/T)的氨基酸序列，所述基序源自选自下述突变/突变对的一个或多个单 突变或双突变K41N、Q49N、S55N、E65T、E65S、E65N、Q69N、E74S、E74T、R77N、I83N、L93N、 A98N、L101S、L101T、G104N、S106N、Y111S、Y111T、I121N、D130N、P133N、K140N、T142N、 G161S、G161T、E186N、R19N+H21S/T、A34N+I36S/T、L45N+N47S/T、I58N+P59F、S62N+R64S/T、 S71N+L73S/T、K115N+L117S/T、R127N+E129S/T、L128N+D130S/T 和 T175N+L177S/T。
在一个实施方案中，本发明提供了这样的hGH变体，其包含具有一个或多个N-糖 基化基序(N-X-S/T)的氨基酸序列，所述基序源自选自下述突变/突变对的一个或多个 单突变或双突变K41N、Q49N、E65T、E65N、Q69N、E74T、R77N、I83N、L93N、A98N、L101T、 G104N、S106N、Y111T、I121N、D130N、P133N、K140N、T142N、T148N、G161T、E186N、R19N+H21S、 A34N+I36S、L45N+N47S、I58N+P59F、S62N+R64T、S71N+L73T、K115N+L117T、R127N+E129T、 L128N+D130T 和 T175N+L177S。 在一个实施方案中，本发明提供了这样的hGH变体，其包含具有一个或多个N-糖 基化基序(N-X-S/T)的氨基酸序列，所述基序源自选自下述突变/突变对的一个或多个 单突变或双突变K41N、Q49N、E65T、E65N、E74T、L93N、A98N、L101T、G104N、Y111T、P133N、 K140N、T142N、G161T、E186N、R19N+H21S、I58N+P59F、S62N+R64T、S71N+L73T、R127N+E129T 和L128N+D130T。如表3、9和10所示，当在HEK293细胞中表达时，这些突变产生功能性的 N-糖基化基序，这通过检测与野生型未糖基化的hGH相比具有减少的迁移率的带来证实。在一个实施方案中，本发明提供了这样的hGH变体，其包含具有一个或多个N-糖 基化基序(N-X-S/T)的氨基酸序列，所述基序源自一个或多个下述突变S55N、Q69N、 E74S、E74T、R77N、I83N、L93N、A98N、L101S、L101T、G104N、S106N、Y111S、Y111T、I121N、 D130N、K140N、T142N、G161S、G161T和 E186N。在一个实施方案中，hGH变体包含具有至少一个N-糖基化基序(N-X-S/T)的氨基 酸序列，所述基序源自一个或多个下述突变Q69N、R77N、I83N、L93N、A98N、L101T、G104N、 S106N、Y111T、I121N、D130N、K140N、G161T 和 E186N。在一个实施方案中，本发明提供了人生长激素变体，其包含至少一个在野生型 人生长激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)，所述基序通过引入选自下述突变/ 突变对的一个或多个突变而产生Q49N、E65N、L93N、A98N、L101T、G104N、S71N+L73T 和 R127N+E129T。在一个实施方案中，hGH变体包含具有至少一个N-糖基化基序(N-X-S/T)的氨基 酸序列，所述基序源自一个或多个下述突变
L93N、A98N、LlOlT和 G104N ； L93N、A98N 和 G104N ；或 L93N、LlOlT 和 G104N。在一个实施方案中，人生长激素变体包含通过引入下述突变而产生的所述N-糖 基化基序(N-X-S/T)中的至少一个:a) 一个或多个选自Q49N、E65N、L93N、A98N、G104N的 突变，和/或b) —个或多个选自S71N+L73T和R127N+E129T的双突变。这样的单个的实施 方案包含包括下面的突变组的人生长激素变体
a)Q49N 和 R127N+E129T，
b)Q49N、E65N 和 G104N，
c)Q49N、L93N 和 R127N+E129T，
d)Q49N、E65N、L93N 和 G104N，
e)Q49N、E65N、G104N 和 R127N+E129T，
f)Q49N、E65N、S71N+L73T、G104N 和 R127N+E129T，
g)Q49N、E65N、S71N+L73T、L93N、G104N 和 R127N+E129T，h)Q49N、E65N、S71N+L73T、L93N、A98N、G104N 和 R127N+E129T，
i)S71N+L73T、L93N、A98N和 G104N， j) L93N、G104N 和 R127N+E129T 和
k) S71N+L73T、L93N、G104N和 R127N+E129T。在另一个实施方案中，hGH变体包含除了上文所述的产生在野生型人生长激素中 不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)的突变以外的修饰和/或第二种突变。在本发明的一个实施方案中，通过将部分(例如，但不限于，PEG、碳水化合物、白蛋 白粘合剂、脂肪酸、烷基链、亲脂基团、维生素、胆酸或间隔物)连接到生长激素化合物的侧 链或主链上，化学地修饰生长激素化合物。这样的修饰可以连接到野生型人生长激素序列 的氨基酸残基上，或连接到通过置换野生型序列的氨基酸而插入的氨基酸残基上。产生氨基酸置换的hGH序列的其它突变还可以直接改变hGH变体的功能 性。在一个实施方案中，hGH变体另外包含抗蛋白水解降解的突变，例如在EP534568和 W02006048777中所述的那些。在宿主中表达期间实现的突变或修饰会消除对后续体外修饰 步骤的需要，并由此缩短生产过程。通过能够将变体从宿主细胞组分或培养基分离的任意方法，可以从培养基纯化 hGH变体。简而言之，从含有宿主细胞的培养基分离hGH变体，所述宿主细胞会干扰变体的 进一步使用，例如，在治疗性hGH的聚乙二醇化中，或在它的诊断应用中。这种分离的一般程序允许离心或过滤培养基或细胞裂解物，以去除细胞碎片。然 后通常将上清液浓缩或稀释至希望的体积，或在适当缓冲液中渗滤，为进一步纯化调节制 备物。hGH变体的进一步纯化通常包括从完整形式分离去酰胺化的和修剪的(clipped)形 式的蛋白。亲和色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法(使用例如，DEAE SEPHAR0SE)、二氧化 硅上的色谱法、反相HPLC、凝胶过滤(使用例如，SEPHADEX G-75)、疏水相互作用色谱法、金 属_螯合物色谱法、超滤/渗滤、乙醇沉淀、硫酸铵沉淀、色谱聚焦和位移色谱法是一些本领 域已知的可以用于纯化hGH变体的技术。 在一个实施方案中，本发明提供了 N-糖基化的人生长激素变体，其在上文所述的 一个或多个突变产生的一个或多个N-糖基化基序中被糖基化。生长激素的效力依赖于它与生长激素受体(GHR)的相互作用。因而，使生产的hGH 变体接触GHR，并测定受体和每种变体之间的相互作用(如果存在的话)，用于进一步分析。 将这些活性与野生型hGH对相同受体的活性进行对比，以确定活性结构域中的哪个氨基酸 残基参与和受体的相互作用。通过本领域熟知的任意方便的体外或体内测定法，测量受体和母体和变体之间的 相互作用。体外测定法可以用于测定GHR和hGH之间的任意可检测的相互作用。这样的检 测可以包括测量色度变化、放射性变化、溶解度变化、增殖诱导能力、通过凝胶电泳和/或 凝胶排阻方法等测得的分子量变化。用于检测hGH的生理效应的体内测定法是例如体重增 加或电解质平衡的变化。一般而言，可以使用任意的体外或体内测定法，只要存在可变的参 数，从而检测受体和目标hGH之间的相互作用的变化。在一个优选的实施方案中，检查在本 发明中通过N-糖基化产生的hGH变体对BAF3-GHR细胞的增殖诱导能力，例如实施例5和13 所述。BAF3-GHR细胞已经在之前的W02006134148中描述，其通过引用并入本文。BAF3-GHR细胞源自IL-3依赖性的鼠前-B淋巴样BAF3细胞系。IL-3会活化JAK-2和STAT，它们还 通过生长激素受体的结合而活化。BAF3-GHR细胞表达人生长激素受体，并对生长激素刺激 做出剂量依赖性的增殖响应。本发明还提供了表达包含N-糖基化位点的人生长激素变体的方法，所述方法包 括下述步骤(a)用编码所述变体hGH的核酸转染能进行N-糖基化并表达所述突变型人生 长激素的细胞；和(b)表达所述变体hGH。在一个实施方案中，所述细胞是真核细胞，例如CH0细胞。本发明的载体当然还 可以在原核细胞中复制。通过使用几种方法，可以将包含在野生型人生长激素中不存在的N-糖基化基序 中的一个或多个N-糖基化的hGH变体与野生型人生长激素区分开。与野生型人生长激素 相比，N-糖基化可能增加变体的分子量。额外地或可选地，N-糖基化可能影响蛋白的等电
点ο本文使用的“等电点”描述了蛋白不带净电荷时的pH。同样地，蛋白中的单个氨基 酸的等电点是该氨基酸不带净电荷时的PH。酸性氨基酸在低于它的等电点的pH具有中性 净电荷，在高于它的等电点的PH具有负净电荷。碱性氨基酸在高于它的等电点的pH具有 中性净电荷，在低于它的等电点的PH具有正净电荷。因而，在任意给定的pH，蛋白的单个 氨基酸的组合电荷以及其它部分(即聚糖)的电荷决定蛋白的净电荷。在低于它们的等电点 的PH，蛋白携带净正电荷。在高于它们的等电点的pH，蛋白携带净负电荷。聚糖链中的唾 液酸具有酸性等电点。因而，向蛋白添加唾液酸化的聚糖链会诱导向更酸性的等电点移动。 成熟的野生型hGH的等电点是5. 27。通常通过等电聚焦测定蛋白的等电点。通过在具有PH梯度的介质中目标蛋白的 电泳，进行等电聚焦。当蛋白到达具有蛋白等电点PH的介质区域时，蛋白的泳动停止，因为 蛋白不再具有净电荷。因而，蛋白变成集中在它的等电点PH处的清晰带。Eap和Baumarm (Eap CB, Baumann P, Electrophoresis 9，650 (1988))描述了该方法的一个实例。在一个实施方案中，使用如上所述的方法制备的人生长激素变体的等电点比野生 型人生长激素更具有酸性。在一个实施方案中，人生长激素变体的等电点低于5. 27、例如低 于5. 0、例如低于4. 5或例如低于4. 0。在一个实施方案中，所述人生长激素变体的等电点 比成熟的野生型hGH的等电点低，例如超过0.2 pH单位、或例如超过0.4 pH单位、例如超 过0.6 pH单位、或例如超过0.8 pH单位、例如超过1.0 pH单位。在一个实施方案中，使用如上所述的方法制备的人生长激素变体具有与野生型人 生长激素相比增加的分子量。通过本领域熟知的几种方法之一，例如SDS-Page或质谱法， 可以测定分子量的增加。在一个实施方案中，这样的分子量增加是由于N-糖基化位点的利用，例如N-聚糖 向人生长激素变体的添加。氨基酸序列的突变可能导致与野生型人生长激素相比分子量的 微小变化。 由于使用糖苷酶(例如肽-N-聚糖酶F (PNGase F-enzyme)或神经氨酸酶)可以 酶促地去除或修饰N-聚糖，通过体外分析可以证实N-聚糖对分子量增加的作用。在一个实施方案中，当用糖苷酶处理时，使用上述方法制备的人生长激素变体 会改变在SDS-PAGE中的迁移率。迁移率变动的检测通常是本领域已知的。经常使用SDS-PAGE,且如实施例5和13所述，容易地检测迁移率变动。代表去除一个N-聚糖的迁移 率移动通常是在2-5 kDa的量级，如果去除超过一个N-聚糖，迁移率移动相应地增加。在 一个实施方案中，所述糖苷酶是肽-N-聚糖酶F或神经氨酸酶。在一个实施方案中，所述移 动是至少1 kDa、例如至少2 kDa、例如至少3 kDa、例如至少5 kDa或例如至少10 kDa。在 一个实施方案中，所述移动是1-10 kDa或2-6 kDa。在一个实施方案中，本发明涉及包含N-糖基化的人生长激素变体的制备物，所述 N-糖基化的人生长激素变体是本文所述的人生长激素变体，所述人生长激素变体已经被一 个或多个N-聚糖糖基化，其中所述N-聚糖已经连接到所述人生长激素变体中的一个或多 个N-糖基化基序(N-X-S/T)上，所述N-糖基化基序在野生型人生长激素中不存在。在本发 明的一个实施方案中，这样的制备物包含至少20%的人生长激素变体是N-糖基化的，这通 过SDS-page凝胶估测。在其它实施方案中，所述制备物中至少25%、例如40%、50%、60%、80% 或90%的人生长激素变体被N-糖基化。在包含本文所述的人生长激素变体的制备物的一 个实施方案中，60-100%的所述人生长激素变体被N-糖基化，例如70-100%、例如80_100%、 例如90 -100%或例如95 -100%。本文在实施例5和13中例证了 N-糖基化含量的估测， 这也可以使用本领域已知的适当扫描设备来进行。对于包含超过一个糖基化基序的生长激 素变体，这样的制备物可以包含具有不同数目的N-聚糖的人生长激素变体。在一个实施方 案中，使用在野生型人生长激素中不存在的所有糖基化基序。在一个实施方案中，在制备物 中包含的至少20%的人生长激素变体包括连接到在野生型人生长激素中不存在的所有所 述糖基化基序上的N-聚糖。在一个实施方案中，所述制备物中的至少25%、例如至少40%、 50%,60%,80%或90%的人生长激素变体在野生型人生长激素中不存在的所有所述糖基化基 序上被N-糖基化。在根据本发明的包含N-糖基化人生长激素变体的制备物的一个实施方 案中，60-100%、例如70-100%、例如80-100%、例如90 -100%或例如95 -100%的所述这种人 生长激素变体在野生型人生长激素中不存在的所有所述糖基化基序上被N-糖基化。 本发明的化合物还发挥生长激素活性，且可以这样用于治疗将从循环生长激素的 量的增加受益的疾病或状态。这样的疾病或状态包括生长激素缺乏(GHD)；特纳综合征； 普-韦综合征(PWS)；努南综合征；唐氏综合征；慢性肾脏疾病，幼年型类风湿性关节炎；囊 性纤维化病，接受HAART治疗的儿童(HIV/HALS儿童)的HIV-感染；短孕龄(SGA)出生的矮 小儿童；除了 SGA以外出生体重非常低(VLBW)的儿童的身材矮小症；骨骼发育不良；软骨 发育不良；软骨发育不全；特发性身材矮小症(ISS)；成年人的GHD ；长骨内的骨折或长骨 的骨折，例如胫骨、腓骨、股骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、matacarpe^matatarsea和趾(指)； 松质骨内的骨折或松质骨的骨折，例如颅骨(scull)、手基底和脚基底；腱或韧带手术(例 如，在手、膝或肩中)后的患者；接受或经历牵拉骨生成术的患者；髋关节或板(discus)置 换、关节盘修复、脊柱融合或假体固定(例如，在膝、髋、肩、肘、腕或颚中)后的患者；其中已 经固定了骨接合材料(例如钉子、螺丝钉和板材)的患者；骨折未连接或连接不正的患者； osteatomia(例如，从胫骨或第一趾)后的患者；移植物植入后的患者；外伤或关节炎造成 的膝盖中的关节软骨变性；特纳综合征患者中的骨质疏松症；男性骨质疏松症；长期透析 的成年患者(AP⑶)；AP⑶中的营养不良有关的心血管疾病；AP⑶中的恶病质的逆转；AP⑶ 中的癌症；AP⑶中的慢性阻塞性肺病；AP⑶中的HIV ；具有AP⑶的老年人；AP⑶中的慢性 肝病，APCD中的疲劳综合征；克罗恩病；受损的肝功能；HIV感染的男性；短肠综合征；向心性肥胖；HIV-有关的脂肪营养不良综合征(HALS)；男性不育；大选择性外科手术、醇/药 物解毒或神经创伤后的患者；老化；虚弱的老年人；骨关节炎；外伤损伤的软骨；勃起功能 障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁；外伤性脑损伤；蛛网膜下出血；出生体重非常低；代谢综 合征；糖皮质激素肌病；或由于儿童中的糖皮质激素治疗而引起的身材矮小症。生长激素 还已经用于加速肌肉组织、神经组织或伤口的愈合；加速或提高向受损伤组织的血流；或 降低受损伤组织的感染速度，所述方法包括给有此需要的患者施用治疗有效量的式I化合 物。本发明因而提供了治疗这些疾病或状态的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用 治疗有效量的根据本发明的生长激素或生长激素化合物缀合物。典型地，施用的变体生长激素的量是在ΙΟ—7 - 10_3 g/kg体重、例如10_6 - 10_4 g/kg体重、例如10_5 - 10_4 g/kg体重的范围内。在一个实施方案中，本发明提供了生长激素或生长激素化合物缀合物在药物生产 中的应用，所述药物用于治疗上述的疾病或状态。本文所述的hGH变体意在用作治疗蛋白。本发明还涉及药物组合物，其包含通过 本文公开的任一种方法修饰的蛋白。在一个方面，这样的药物组合物包含修饰的蛋白，例如 人生长激素(hGH)，其以10_15 mg/ml至200 mg/ml、例如举例来说10_10 mg/ml至5 mg/ml的 浓度存在，且其中所述组合物具有2. 0-10. O的pH。所述组合物另外可以包含缓冲系统、防 腐齐IJ、张度剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，药物组合物是水 性组合物，即包含水的组合物。这样的组合物典型地是溶液或悬浮液。在本发明的另一个 实施方案中，药物组合物是水性溶液。术语“水性组合物”被定义为包含至少50% w/w水的 组合物。类似地，术语“水性溶液”被定义为包含至少50% w/w水的溶液，术语“水性悬浮 液”被定义为包含至少50% w/w水的悬浮液。在一个实施方案中，药物组合物是冷冻干燥的组合物，在使用之前，医生或患者向 其中加入溶剂和/或稀释剂。在一个实施方案中，药物组合物是无需任何事先溶解即可使用的干燥的组合物 (例如冷冻干燥的或喷雾干燥的)。在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含修饰的蛋白(例如hGH变体)的 水性溶液和缓冲剂，其中所述hGH变体以0. l-100mg/ml或更高的浓度存在，且其中所述的 组合物具有约2. O至约10. O的pH。在一个实施方案中，药物组合物的pH选自下述2. O至10. 0，向上按照0. 1分级， 例如2. 1,2. 2,2. 3，以此类推。在一个实施方案中，缓冲剂选自醋酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨 酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、以及三(羟甲基)_氨基甲 烷、N，N-二(羟乙基)甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马 酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些具体缓冲剂中的每一种构成本发明的可选实施方
案。 在一个实施方案中，组合物另外包含药学上可接受的防腐剂。在一个实施方 案中，防腐剂选自苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸 丙酯、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、氯代丁醇、以及硫柳汞 (thiomerosal)、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、氯己定、脱氢醋酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、苄索氯铵、氯苯甘醚(3对氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或其混合物。在一个实施方案中， 防腐剂以0.1 mg/ml至20 mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂以 0. 1 mg/ml至5 mg/ml的浓度存在。在一个实施方案中，防腐剂以5 mg/ml至10 mg/ml的 浓度存在。在一个实施方案中，防腐剂以10 mg/ml至20 mg/ml的浓度存在。这些具体防 腐剂中的每一种构成本发明的可选实施方案。防腐剂在药物组合物中的应用是技术人员众 所周知的。为了方便起见,可参见 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第 20 版，2000。在一个实施方案中，组合物另外包含等渗剂。在本发明的另一个实施方案中，等渗 剂选自盐(例如氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨 酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、醛糖醇(例如甘油(丙三醇)、1，2_丙二醇(丙 二醇)、1，3_丙二醇、1，3_ 丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物。可以使用任意的 糖，例如单糖、二糖或多糖，或水溶性的聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、 麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、可溶淀粉、羟乙基淀粉和羧甲 基纤维素-Na。在一个实施方案中，糖添加剂是蔗糖。糖醇被定义为具有至少1个-OH基的 C4-C8烃，包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个 实施方案中，糖醇添加剂是甘露醇。可以单独地或组合地使用上述的糖或糖醇。对使用的 量没有固定的限制，只要糖或糖醇可溶于液体制备物中，且不会不利地影响使用本发明的 方法所得到的稳定效应。在一个实施方案中，糖或糖醇浓度是在约1 mg/ml至约150 mg/ ml之间。在一个实施方案中，等渗剂以1 mg/ml至50 mg/ml的浓度存在。在一个实施方 案中，等渗剂以1 mg/ml至7 mg/ml的浓度存在。在一个实施方案中，等渗剂以8 mg/ml至 24 mg/ml的浓度存在。在一个实施方案中，等渗剂以25 mg/ml至50 mg/ml的浓度存在。 这些具体等渗剂中的每一种构成本发明的可选实施方案。等渗剂在药物组合物中的应用是 技术人员众所周知的。为了方便起见，可参见Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版，2000。在本公开中使用的“生长激素”或“GH”是指来自任意物种的生长激素，包括禽、马、 猪、牛或羊的生长激素，优选哺乳动物来源的生长激素，更优选人的生长激素。表现出生长 激素样活性的任意其它多肽、它的片段和衍生物包括在本发明中提及的GH的含义内。已经报道了人生长激素(hGH)的野生型DNA和氨基酸序列。氨基酸序列可如SEQ ID No. 1所示。本发明描述了新颖的hGH变体，其具有通过定点诱变引入的N-糖基化位点。 本发明的hGH变体可以在能够糖基化的任意重组表达系统中表达。本发明的hGH变体序列中的氨基酸置换具有定义hGH变体的标识，例如，如下 指示氨基酸置换用单字母代码中的字母表示野生型残基，用数字指示在野生型序列中 的氨基酸位置，用第二个字母指示取代的氨基酸残基，例如L101S，其中在位置101处的 氨基酸L被氨基酸S置换。用被“ + ”隔开的一系列单个突变体指示多个突变体，例如 L93N+A98N+L101T+G104N表示携带所有这些突变的突变体。“质粒”和“载体”和“质粒载体”最常见地互换使用，在本说明书中也是如此。这 些术语意在包括任意核酸构建体，其在转染进宿主细胞后，能够独立于宿主基因组或整合 进宿主基因组中复制。 在本公开内容中提及的“表达载体”是载体的实施方案，且表示这样的核酸构建体，其含有可操作地连接到合适的控制序列上的核酸序列，所述控制序列能实现所述核酸 在合适的宿主中的表达。这样的控制序列包括实现转录的启动子、任选的控制这种转录的 操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。 在一个实施方案中，根据本发明的表达载体是适合在宿主细胞中重组表达的真核表达载 体，所述宿主细胞能将N-糖基化引入包含基序N-X-S/T的多肽的该基序处。在一个实施方 案中，根据本发明的表达载体是适合在CHO细胞中表达的表达载体。在本公开内容中提及 的“可操作地连接”表示在DNA或多肽的上下文中，它们在功能上彼此相关。例如，如果前 序列起信号序列的功能，参与蛋白的成熟形式的分泌，最可能参与信号序列的裂解，则前序 列可操作地连接到肽上。如果启动子控制编码序列的转录，则启动子可操作地连接到编码 序列上；如果核糖体结合位点的定位允许进行翻译，则核糖体结合位点可操作地连接到编 码序列上。本文使用的“寡糖链”是指共价连接到单个氨基酸残基上的整个寡糖结构。“N-聚 糖”是指共价连接到单个天冬酰胺残基上的整个寡糖结构。“触角”(“antenna”)是指寡 糖链的分支。N-聚糖可以是单触角的、二触角的、三触角的、四触角的、五触角的、六触角的 或七触角的。每个触角可以包含唾液酸部分。本发明涉及包含N-糖基化的人生长激素变体的制备物，所述N-糖基化的人生长 激素变体是本文所述的人生长激素变体，所述人生长激素变体已经被一个或多个N-聚糖 糖基化，其中所述N-聚糖已经连接到所述人生长激素变体中的一个或多个N-糖基化基序 (N-X-S/T)上，所述N-糖基化基序在野生型人生长激素中不存在，且其中至少50%的N-聚 糖包含至少一个唾液酸部分。在一个实施方案中，至少60%的N-聚糖包含至少一个唾液酸 部分，例如至少70%、75%、80%、85%、90%或95%的N-聚糖包含至少一个唾液酸部分。在分支 的寡糖链的情况下，每个N-聚糖可以包含大量唾液酸部分，例如多达5、8、10、12、14或16 个唾液酸部分。在下面描述了根据本发明的示例性实施方案，不应解释为对本发明范围的限制。实施方案
1.人生长激素变体，其中所述变体包含这样的氨基酸序列，该序列包含一个或多个在 野生型人生长激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)。2.根据实施方案1的人生长激素变体，其中所述在野生型人生长激素中不存在 的N-糖基化基序(N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的突变而产生S55N、 Q69N、E74S、E74T、R77N、I83N、L93N、A98N、L101S、L101T、G104N、S106N、Y111S、Y111T、I121N、 D130N、K140N、T142N、G161S、G161T和 E186N。 3.根据实施方案1的人生长激素变体，其中所述在野生型人生长激素中不存在 的N-糖基化基序(N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的一个或多个突变/ 突变对而产生K41N、Q49N、S55N、E65T、E65T、E65N、Q69N、E74S、E74T、R77N、I83N、L93N、 A98N、L101S、L101T、G104N、S106N、Y111S、Y111T、I121N、D130N、P133N、K140N、T142N、 G161S、G161T、E186N、R19N+H21S/T、A34N+I36S/T、L45N+N47S/T、I58N+P59F、S62N+R64S/T、 S71N+L73S/T、K115N+L117S/T、R127N+E129S/T、L128N+D130S/T 和 T175N+L177S/T。4.根据实施方案1-3中任一个的人生长激素变体，其中所述在野生型人生长激 素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的一个或多个突变 / 突变对而产生K41N、Q49N、E65T、E65N、Q69N、E74T、R77N、I83N、L93N、A98N、L101T、 G104N、S106N、Y111T、I121N、D130N、P133N、K140N、T142N、T148N、G161T、E186N、R19N+H21S、 A34N+I36S、L45N+N47S、I58N+P59F、S62N+R64T、S71N+L73T、K115N+L117T、R127N+E129T、 L128N+D130T 和 T175N+L177S。5.根据实施方案1、3和4中任一个的人生长激素变体，其中所有所述在野生型 人生长激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)已经通过引入选自下述的一个或多个 突变 / 突变对而产生K41N、Q49N、E65T、E65N、E74T、L93N、A98N、L101T、G104N、Y111T、 P133N、K140N、G161T、E186N、R19N+H21S、I58N+P59F、S62N+R64T、S71N+L73T、R127N+E129T 和 L128N+D130T。6.根据实施方案1或2的人生长激素变体，其中所有所述在野生型人生长激素 中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)已经通过引入独立地选自下述的突变而产生S55N、 Q69N、E74S、E74T、R77N、I83N、L93N、A98N、L101S、L101T、G104N、S106N、Y111S、Y111T、I121N、 D130N、K140N、T142N、G161S、G161T 和 E186N。7.根据实施方案1、2和3中任一个的人生长激素变体，其中所述N-糖基化基序 (N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的突变而产生Q69N、R77N、I83N、L93N、 A98N、L101T、G104N、S106N、Y111T、I121N、D130N、K140N、G161T 和 E186N。8.根据实施方案7的人生长激素变体，其中所有所述N-糖基化基序(N-X-S/T) 已经通过引入独立地选自下述的突变而产生Q69N、R77N、I83N、L93N、A98N、L101T、G104N、 S106N、Y111T、I121N、D130N、K140N、G161T和 E186N。9.根据实施方案5的人生长激素变体，其中所述N-糖基化基序(N-X-S/T)中 的至少一个已经通过引入选自下述的一个或多个突变/突变对而产生Q49N、E65N、L93N、 A98N、LlOlT G104N、S71N+L73T 和 R127N+E129T。10.根据实施方案1-9中任一个的人生长激素变体，其中所述N-糖基化基序 (N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的突变而产生L93N、A98N、LlO IT和 G104N。11.根据实施方案10的人生长激素变体，其中所有所述N-糖基化基序(N-X-S/T) 已经通过引入独立地选自下述的突变而产生L93N、A98N、LlOlT和G104N。12.根据实施方案1-10中任一个的人生长激素变体，其中所述N-糖基化基序 (N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的突变而产生L93N、A98N和G104N。13.根据实施方案12的人生长激素变体，其中所有所述N-糖基化基序(N-X-S/T) 已经通过引入独立地选自下述的突变而产生L93N、A98N和G104N。14.根据实施方案1-10中任一个的人生长激素变体，其中所述N-糖基化基序 (N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的突变而产生L93N、L101T和G104N。 15.根据实施方案14的人生长激素变体，其中所有所述N-糖基化基序(N-X-S/T) 已经通过引入选自下述的突变而产生L93N、L101T和G104N。16.根据实施方案1-15中任一个的人生长激素变体，其准确地包含一个在野生 型人生长激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)。17.根据实施方案1-15中任一个的人生长激素变体，其包含至少2个在野生型人 生长激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)。
18.根据实施方案17的人生长激素变体，其准确地包含2个在野生型人生长激素 中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)。19.根据实施方案17的人生长激素变体，其包含至少3个在野生型人生长激素中 不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)。20.根据实施方案19的人生长激素变体，其准确地包含3个在野生型人生长激素 中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)。21.根据实施方案20的人生长激素变体，其中所述3个在野生型人生长激素中不 存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)已经通过引入突变L93N、A98N和G104N而产生。22.根据实施方案20的人生长激素变体，其中所述3个在野生型人生长激素中不 存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)已经通过引入突变L93N、L101T和G104N而产生。23.根据实施方案19的人生长激素变体，其包含至少4个在野生型人生长激素中 不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)。24.根据实施方案23的人生长激素变体，其准确地包含4个在野生型人生长激素 中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)。25.根据实施方案24的人生长激素变体，其中所述4个在野生型人生长激素中不 存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)已经通过引入突变L93N、A98N、L101T和G104N而产生。26.根据实施方案23的人生长激素变体，其包含至少5个在野生型人生长激素中 不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)。27.根据实施方案26的人生长激素变体，其准确地包含5个在野生型人生长激素 中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)。28.根据实施方案26的人生长激素变体，其包含至少6个或7个在野生型人生长 激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)。29.根据实施方案28的人生长激素变体，其准确地包含6个或7个在野生型人生 长激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)。30.根据实施方案17的人生长激素变体，其中在野生型人生长激素中不存在的 N-糖基化基序(N-X-S/T)已经通过引入至少2个N-糖基化基序而产生，所述基序通过引入 选自下述的突变组而产生
a)Q49N 和 R127N+E129T，
b)Q49N、E65N和 G104N，
c)Q49N、L93N 和 R127N+E129T，
d)Q49N、E65N、L93N 和 G104N，
e)Q49N、E65N、G104N 和 R127N+E129T，
f)Q49N、E65N、S71N+L73T、G104N 和 R127N+E129T，
g)Q49N、E65N、S71N+L73T、L93N、G104N 和 R127N+E129T，
h)Q49N、E65N、S71N+L73T、L93N、A98N、G104N 和 R127N+E129T，
i)S71N+L73T、L93N、A98N和 G104N， j) L93N、G104N 和 R127N+E129T 和
k) S71N+L73T、L93N、G104N和 R127N+E129T。31.核酸，其编码根据实施方案1-30中任一个的人生长激素变体。
32.根据实施方案31的核酸，其是DNA构建体。33.载体，其包含根据实施方案31的核酸序列。 34.根据实施方案32的载体，所述载体是表达载体。35.根据实施方案33的载体，所述载体是适合在宿主细胞中重组表达的表达载 体，所述宿主细胞能将N-糖基化引入包含基序N-X-S/T的多肽的该基序处。36.根据实施方案35的载体，所述载体是真核表达载体。37.根据实施方案36的载体，所述载体是适合在哺乳动物细胞中重组表达的真 核表达载体。38.根据实施方案37的载体，所述载体是适合在CHO细胞中重组表达的表达载 体。39.根据实施方案32-38中任一个的载体，其中所述根据实施方案31的核酸是 DNA构建体。40.宿主细胞，其包含根据实施方案22-39中任一个的载体。41.根据实施方案40的宿主细胞，所述细胞能在包含基序N-X-S/T的多肽的该基 序处进行N-糖基化。42.根据实施方案41的宿主细胞，所述细胞是真核细胞。43.根据实施方案42的宿主细胞，所述细胞是哺乳动物细胞。44.根据实施方案43的宿主细胞，所述细胞是CHO细胞。45.制备N-糖基化的人生长激素变体的方法，所述方法包括，在真核细胞中重组 表达根据实施方案31或实施方案32的核酸。46.根据实施方案45的制备N-糖基化的人生长激素变体的方法，其中在哺乳动 物细胞中表达所述核酸。47.根据实施方案46的制备N-糖基化的人生长激素变体的方法，其中在CHO细 胞中表达所述核酸。48.根据实施方案45-47中任一个的方法，其中在重组表达所述核酸后，不进行 N-聚糖的其它糖基化或修饰。49.使用根据实施方案45-48中任一个的方法制备的人生长激素变体。50.使用根据实施方案45-48中任一个的方法制备的人生长激素变体，其中所述 变体的等电点的酸性比野生型人生长激素更高。51.使用根据实施方案45-48中任一个的方法制备的人生长激素变体，其中当用 糖苷酶处理时，所述变体会改变在SDS-PAGE中的迁移率。52.根据实施方案51的人生长激素变体，其中所述糖苷酶是肽-N-聚糖酶F或神
经氨酸酶。53.使用根据实施方案45-48中任一个的方法制备的人生长激素变体，其中与野 生型人生长激素相比，所述变体分子量增加。54.根据实施方案49-53中任一个的人生长激素变体，其中与野生型人生长激素 相比，所述变体的活性降低了不超过100倍、例如不超过50倍、例如不超过20倍、例如不超 过10倍、例如不超过5倍、例如不超过2倍、例如不超过1倍。55.根据实施方案54的人生长激素变体，其中所述变体的活性基本上与野生型人生长激素的活性相同。56.根据实施方案49-55中任一个的人生长激素变体，其中与野生型人生长激素 相比，所述人生长激素变体的体内循环半衰期延长。57.根据实施方案49-56中任一个的人生长激素变体，其中至少50%的聚糖被唾 液酸化。58. N-糖基化的人生长激素变体，所述变体在至少一个N-糖基化基序(N-X-S/T) 中被N-糖基化，所述基序在野生型人生长激素中不存在。59. N-糖基化的人生长激素变体，所述N-糖基化的人生长激素变体是根据实施 方案1-30和49-57中任一个的人生长激素变体，所述人生长激素变体已经被一个或多个 N-聚糖糖基化，其中所述N-聚糖已经连接到所述人生长激素变体中的一个或多个N-糖基 化基序(N-X-S/T)上，所述N-糖基化基序在野生型人生长激素中不存在。60.根据实施方案59的N-糖基化的人生长激素变体，其中所述人生长激素变体 已经被一个或多个N-聚糖糖基化，其中所述N-聚糖已经连接到所述人生长激素变体中的 所有N-糖基化基序(N-X-S/T)上，所述N-糖基化基序在野生型人生长激素中不存在。61.根据实施方案60的N-糖基化的人生长激素变体，其中所述在野生型人生长 激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的突变而 产生S55N、Q69N、E74S、E74T、R77N、I83N、L93N、A98N、L101S、L101T、G104N、S106N、Yl 1 IS、 Y111T、I121N、D130N、K140N、T142N、G161S、G161T 和 E186N。62.根据实施方案55的N-糖基化的人生长激素变体，其中所述在野生型人生 长激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的一 个或多个突变 / 突变对而产生K41N、Q49N、S55N、E65T、E65N、Q69N、E74S、E74T、R77N、 I83N、L93N、A98N、L101S、L101T、G104N、S106N、Y111S、Y111T、I121N、D130N、P133N、K140N、 T142N、G161S、G161T、E186N、R19N+H21S、A34N+I36S、L45N+N47S、I58N+P59F、S62N+R64T、 S71N+L73T、K115N+L117T、R127N+E129T、L128N+D130T 和 T175N+L177S。63.根据实施方案55的N-糖基化的人生长激素变体，其中所述在野生型人生长 激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的一个或 多个突变 / 突变对而产生K41N、Q49N、E65T、E65N、Q69N、E74T、R77N、I83N、L93N、A98N、 L101T、G104N、S106N、Y111T、I121N、D130N、P133N、K140N、T142N、T148N、G161T、E186N、 R19N+H21S、A34N+I36S、L45N+N47S、I58N+P59F、S62N+R64T、S71N+L73T、K115N+L117T、 R127N+E129T、L128N+D130T 和 T175N+L177S。 64.根据实施方案55的N-糖基化的人生长激素变体，其中所述在野生型人生长 激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的一个或 多个突变 / 突变对而产生K41N、Q49N、E65T、E65N、E74T、L93N、A98N、L101T、G104N、Y111T、 P133N、K140N、G161T、E186N、R19N+H21S、I58N+P59F、S62N+R64T、S71N+L73T、R127N+E129T 和 L128N+D130T。65.根据实施方案61的N-糖基化的人生长激素变体，其中所有所述在野生型人 生长激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)已经通过引入独立地选自下述的突变而产 生S55N、Q69N、E74S、E74T、R77N、I83N、L93N、A98N、L101S、L101T、G104N、S106N、Y111S、 Y111T、I121N、D130N、K140N、T142N、G161S、G161T 和 E186N。
66.根据实施方案64的N-糖基化的人生长激素变体，其中所述N-糖基化基序 (N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的突变而产生Q69N、R77N、I83N、L93N、 A98N、L101T、G104N、S106N、Y111T、I121N、D130N、K140N、G161T 和 E186N。67.根据实施方案64的N-糖基化的人生长激素变体，其中所有所述N-糖基化基 序(N-X-S/T)已经通过引入独立地选自下述的突变而产生06911 77118311^9314981 L101T、G104N、S106N、Y111T、I121N、D130N、K140N、G161T 和 E186N。68.根据实施方案60-67中任一个的N-糖基化的人生长激素变体，其中所述 N-糖基化基序(N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的突变而产生L93N、A98N、 LlOlT 和 G104N。 69.根据实施方案67的N-糖基化的人生长激素变体，其中所有所述N-糖基化基 序(N-X-S/T)已经通过引入独立地选自下述的突变而产生L93N、A98N、L101T和G104N。70.根据实施方案63-69中任一个的N-糖基化的人生长激素变体，其中所述 N-糖基化基序(N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的突变而产生L93N、A98N 禾Π G104N。71.根据实施方案70的N-糖基化的人生长激素变体，其中所有所述N-糖基化基 序(N-X-S/T)已经通过引入独立地选自下述的突变而产生L93N、A98N和G104N。72.根据实施方案63-69中任一个的N-糖基化的人生长激素变体，其中所述 N-糖基化基序(N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的突变而产生L93N、L101T 禾Π G104N。73.根据实施方案72的人生长激素变体，其中所有所述N-糖基化基序(N_X_S/T) 已经通过引入选自下述的突变而产生L93N、LlOlT和G104N。74.根据实施方案64的N-糖基化的人生长激素变体，其中所述N-糖基化基序 (N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的一个或多个突变/突变对而产生Q49N、 E65N、L93N、A98N、LlOlT G104N、S71N+L73T 和 R127N+E129T。75.根据实施方案74的N-糖基化的人生长激素变体，其中在野生型人生长激素 中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)已经通过引入至少2个N糖基化基序而产生，所述基 序通过引入选自下述的突变组而产生
a)Q49N和 R127N+E129T，
b)Q49N、E65N和 G104N，
c)Q49N、L93N 和 R127N+E129T，
d)Q49N、E65N、L93N 和 G104N，
e)Q49N、E65N、G104N 和 R127N+E129T，
f)Q49N、E65N、S71N+L73T、G104N 和 R127N+E129T，
g)Q49N、E65N、S71N+L73T、L93N、G104N 和 R127N+E129T，
h)Q49N、E65N、S71N+L73T、L93N、A98N、G104N 和 R127N+E129T，
i)S71N+L73T、L93N、A98N和 G104N， j) L93N、G104N 和 R127N+E129T 和
k) S71N+L73T、L93N、G104N 和 R127N+E129T。76.根据实施方案49-75中任一个的N-糖基化的人生长激素变体，其准确地包含一个N-聚糖。 77.根据实施方案49-75中任一个的N-糖基化的人生长激素变体，其包含至少2 个N-聚糖。78.根据实施方案77的N-糖基化的人生长激素变体，其准确地包含2个N-聚糖。79.根据实施方案77的N-糖基化的人生长激素变体，其包含至少3个N-聚糖。80.根据实施方案79的N-糖基化的人生长激素变体，其准确地包含3个N-聚糖。81.根据实施方案80的N-糖基化的人生长激素变体，其中所述3个在野生型人 生长激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)已经通过引入突变L93N、A98N和G104N而 产生。82.根据实施方案80的N-糖基化的人生长激素变体，其中所述3个在野生型人 生长激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)已经通过引入突变L93N、L101T和G104N而产生。83.根据实施方案79的N-糖基化的人生长激素变体，其包含至少4个N-聚糖。84.根据实施方案83的N-糖基化的人生长激素变体，其准确地包含4个N-聚糖。85.根据实施方案84的N-糖基化的人生长激素变体，其中所述4个在野生型人 生长激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)已经通过引入突变L93N、A98N、LlOlT和 G104N而产生。86.根据实施方案83的N-糖基化的人生长激素变体，其包含至少5个N-聚糖。87.根据实施方案86的N-糖基化的人生长激素变体，其准确地包含5个N-聚糖。88.根据实施方案86的N-糖基化的人生长激素变体，其包含至少6个N-聚糖。89.根据实施方案88的N-糖基化的人生长激素变体，其准确地包含6个N-聚糖。90.包含N-糖基化的人生长激素变体的制备物，所述变体在至少一个N-糖基化 基序(N-X-S/T)中被N-糖基化，所述基序在野生型人生长激素中不存在。91.根据实施方案90的制备物，其中所述制备物包含根据实施方案1-30中任一 个的人生长激素变体。92.根据实施方案90的制备物，其中所述制备物包含根据实施方案49-89中任一 个的N-糖基化的人生长激素变体，其中至少50%的N-聚糖包含至少一个唾液酸部分。93.根据实施方案90-92中任一个的制备物，其中至少50%的N-聚糖包含至少一 个唾液酸部分。94.根据实施方案93的制备物，其中至少75%的N-聚糖包含至少一个唾液酸部 分。95.根据实施方案94的制备物，其中至少90%的N-聚糖包含至少一个唾液酸部 分。96.根据实施方案95的制备物，其中至少95%的N-聚糖包含至少一个唾液酸部 分。97.根据实施方案90-92中任一个的制备物，其中至少20%的所述人生长激素变
体被N-糖基化。98.根据实施方案90-92中任一个的制备物，其中至少50%的所述人生长激素变 体被N-糖基化。
99.根据实施方案97的制备物，其中至少50%的所述人生长激素变体在野生型人 生长激素中不存在的所有糖基化基序上被N-糖基化。100.制备包含根据实施方案49-89中任一个的N-糖基化的人生长激素变体的药 物组合物的方法，所述方法包括下述步骤
i)在能进行N-糖基化的宿主细胞中重组表达根据实施方案31或实施方案23的核
酸，
ii)纯化N-糖基化的人生长激素变体，
iii)制备药学上可接受的制剂，其包含来自步骤ii)的纯化的N-糖基化的人生长激
素变体。101.制备包含根据实施方案100的N-糖基化的人生长激素变体的药物组合物的 方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。102.根据实施方案101的方法，所述细胞是哺乳动物细胞。103.根据实施方案102的方法，所述细胞是CHO细胞。104.药物组合物，其包含根据实施方案49-89中任一个的N-糖基化的人生长激 素变体和药学上可接受的载体。105.药物组合物，其包含根据实施方案90-99中任一个的制备物和药学上可接 受的载体。106.治疗需要人生长激素的哺乳动物的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施 用治疗有效量的根据实施方案49-89中任一个的N-糖基化的人生长激素变体。107.治疗需要人生长激素的哺乳动物的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施 用治疗有效量的根据实施方案90-99中任一个的制备物。将在下面的实施例中进一步说明本发明。但是，应当理解这些实施例仅用于说明 性目的，不应当用于以任何方式限制本发明的范围。
实施例实施例1
用于在哺乳动物细胞中表达野生型人生长激素的载体的构建
借助于侧接该序列的历‘/^ III和RI位点，将图IA所示的核苷酸序列插入质粒 ΡΕΕ14.4，产生质粒pGB039。在pGB039中，将编码生长激素的核苷酸序列置于巨细胞病毒 (CMV)启动子的转录控制下。通过插入在pTT5炮Hind III和Afoi I位点之间，亚克隆pGB039中的编码生长激 素的核苷酸序列，产生质粒PTVL01。实施例2
野生型人生长激素在哺乳动物HEK293细胞中的瞬时表达
按照生产商的说明书，用编码野生型人生长激素的PGB039表达质粒，转染悬浮适应的 人胚胎肾(HEK293F)细胞(Freestyle, Invitrogen)。简而言之，将30 Pg质粒与40 μ 293fectin (Invitrogen) 一起温育20 min，并添加至在125 ml锥形瓶中的3 X IO7细胞。 在振荡培养箱(37°C，8% CO2和125 rpm)中培养转染的细胞7天。每天收集培养基样品， 并用ELISA试剂盒(Roche)分析人生长激素。
ELISA的结果如图2所示，并证实瞬时转染的哺乳动物细胞是人生长激素的有效 生产者。将转染后7天收获的培养基和纯化的在细菌中生产的重组人生长激素的稀释液加 样到SDS-PAGE凝胶上，并电泳。用SimpleBlue SafeStain (Invitrogen)染色凝胶，并在 Odyssey读数器中扫描。来自转染的细胞的培养基含有分子量为约22 kDa的蛋白(其与在 细菌中生产的重组人生长激素共同移动)，但是来自未转染的细胞的培养基则不然。这表明 瞬时转染的哺乳动物细胞分泌成熟的重组人生长激素。实施例3
在人生长激素蛋白表面上、但是不参与和生长激素受体的结合界面的氨基酸残基，被 认为是最适合引入N-糖基化位点的位置。在这些残基中，选择在允许通过单个氨基酸置换 形成潜在N-糖基化位点(N-X-S/T)的序列背景(sequence context)中的氨基酸。但是， 不考虑通过包含半胱氨酸或脯氨酸残基的氨基酸置换形成的N-糖基化位点。通过用MolsoftBrowser 3. 4-9d (Molsoft)软件分析来自蛋白数据库(Protein Data Bank)的文件3hhr，发现了符合上述要求的氨基酸位置。文件3hhr描述了结合到2 种生长激素受体分子的胞外结构域上的人生长激素的结构，且是基于de Vos等人(1992) 的公开。该分析鉴定出了成熟的人生长激素的氨基酸序列中的下述氨基酸置换
S55N、Q69N、E74S、E74T、R77N、I83N、L93N、A98N、L101S、L101T、G104N、S106N、Y111S、 Y111T、I121N、D130N、K140N、T142N、G161S、G161T 和 E186N
这些序列改变中的每一个都会在被认为是在蛋白表面上、但是不参与和生长激素受体 的结合界面的位置处引入潜在的N-糖基化位点。实施例4
编石马H有一个潜在N-点的人牛长激素的表达构建体的产牛
通过PTVLOl的定点诱变，产生编码具有潜在N-糖基化位点的人生长激素变体的构 建体，所述PTVLOl由含有编码野生型人生长激素的插入物的pTT5组成。按照生产商的 推荐，使用表1所示的引物(SEQ ID NO 2-13)，使用QuikChange多点定向诱变试剂盒 (Stratagene)，产生编码含有突变 Q69N、R77N、Ι83Ν、L93N、Α98Ν、L101T、G104N、S106N、 Υ111Τ、Ι121Ν、Κ140Ν或G161T之一的变体的构建体。按照生产商的推荐，使用表2所示 的正向引物(SEQ ID NO 14-15)和互补的反向引物，使用QuikChange定点诱变试剂盒 (Stratagene)，产生编码含有突变D130N或Ε186Ν之一的变体的构建体。通过DNA测序，验 证产生的构建体中编码整个人生长激素变体的核苷酸序列的序列。编码14种变体的构建 体的名称如表1和2所示。表1
hGH突变体的构建体和引物_
I突变I诱变引物I构建体
Q69N 5' -GCAACAGAGAAGAGACCCAGAATAAGAGCAACCTGGAACTGCG-3’“pTVL02
R77N |5’ -GCAACCTGGAACTGCTGAATATCTCTCTGCTGCTGATCC-3’“ pTVL03
I83N +5，-GGATCTCTCTGCTGCTGAATCAGAGCTGGCTGGAAC-3，“ pTVL04
L93N |5’ -CTGGAACCCGTGCAGTTCAATAGAAGCGTGTTCGCCAACAG-3’“ pTVL05
A98N 5 -GTTCCTGAGAAGCGTGTTCAATAACAGCCTGGTGTACGGC-3 “ pTVL06
LlOlT 5' -GTGTTCGCCAACAGCACGGTGTACGGCGCC-3’“ pTVL07
I&104N \5' -CAACAGCCTGGTGTACAACGCCAGCGACAGCAAC-3’|pTVL08
权利要求
1.人生长激素变体，其中所述变体包含这样的氨基酸序列，该序列包含一个或多个在 野生型人生长激素中不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)。
2.根据权利要求1的人生长激素变体，其中与野生型人生长激素相比，所述变体分子 量增加。
3.根据权利要求1的人生长激素变体，其中所述变体的活性基本上与野生型人生长 激素的活性相同。
4.根据权利要求1的人生长激素变体，其中与野生型人生长激素相比，所述人生长激 素变体的体内循环半衰期延长。
5.根据权利要求1-4中任一项的人生长激素变体，其中所述在野生型人生长激素中 不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的一个或多个 突变 / 突变对而产生K41N、Q49N、S55N、E65T、E65N、E65S、Q69N、E74S、E74T、R77N、I83N、 L93N、A98N、L101S、L101T、G104N、S106N、Y111S、Y111T、I121N、D130N、P133N、K140N、T142N、 G161S、G161T、E186N、R19N+H21S/T、A34N+I36S/T、L45N+N47S/T、I58N+P59F、S62N+R64S/T、 S71N+L73S/T,K115N+L117S/T,R127N+E129S/T,L128N+D130S/T 和 T175N+L177S/T。
6.根据权利要求1-5中任一项的人生长激素变体，其中所述在野生型人生长激素中 不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的一个或多个突 变 / 突变对而产生K41N、Q49N、E65T、E65N、Q69N、E74T、R77N、I83N、L93N、A98N、L101T、 G104N、S106N、Y111T、I121N、D130N、P133N、K140N、T142N、T148N、G161T、E186N、R19N+H21S、 A34N+I36S、L45N+N47S、I58N+P59F、S62N+R64T、S71N+L73T、K115N+L117T、R127N+E129T、 L128N+D130T 和 T175N+L177S。
7.根据权利要求1-5中任一项的人生长激素变体，其中所述在野生型人生长激素中 不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的一个或多个 突变 / 突变对而产生K41N、Q49N、E65T、E65N、E74T、L93N、A98N、L101T、G104N、Y111T、 P133N、K140N、G161T、E186N、R19N+H21S、I58N+P59F、S62N+R64T、S71N+L73T、R127N+E129T 和 L128N+D130T。
8.根据权利要求1-5中任一项的人生长激素变体，其中所述在野生型人生长激素中 不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的突变而产生 S55N、Q69N、E74S、E74T、R77N、I83N、L93N、A98N、L101S、L101T、G104N、S106N、Y111S、Y111T、 I121N、D130N、K140N、T142N、G161S、G161T 和 E186N。
9.根据前述权利要求中任一项的人生长激素变体，其中所述在野生型人生长激素中 不存在的N-糖基化基序(N-X-S/T)中的至少一个已经通过引入选自下述的一个或多个突 变 / 突变对而产生Q49N、E65N、L93N、A98N、L101T、G104N、S71N+L73T 和 R127N+EU9T。
10.根据前述权利要求中任一项的人生长激素变体，其包括选自下述突变/突变对组 的一个或多个突变a.Q49N 和 R127N+E129T，b.Q49N、E65N 和 G104N，c.Q49N、L93N 和 R127N+E129T，d.Q49N、E65N、L93N 和 G104N，e.Q49N、E65N、G104N 和 R127N+E129T，f.Q49N、E65N、S71N+L73T、G104N 和 R127N+E129T，g.Q49N、E65N、S71N+L73T、L93N、G104N 和 R127N+E129T，h.Q49N、E65N、S71N+L73T、L93N、A98N、G104N 和 R127N+E129T，i.S71N+L73T、L93N、A98N 和 G104N，j. L93N、G104N 和 R127N+E129T 和k. S71N+L73T、L93N、G104N和 R127N+E129TI.L93N、A98N、L101T 和 G104N，m. L93N、A98N 禾口 G104N 禾口n. L93N、L101T 和 G104N。
11.根据前述权利要求中任一项的人生长激素变体，其包括一个或多个化学修饰或额外突变。
12.核酸、DNA构建体或载体，其编码根据权利要求1-11中任一项的人生长激素变体。
13.制备N-糖基化的人生长激素变体的方法，所述方法包括在真核细胞中重组表达 根据权利要求12的核酸、DNA构建体或载体。
14.N-糖基化的人生长激素变体，所述N-糖基化的人生长激素变体是根据权利要求 1-11中任一项的人生长激素变体，其已经被一个或多个N-聚糖糖基化，其中所述N-聚糖已 经连接到所述人生长激素变体中的一个或多个N-糖基化基序(N-X-S/T)上，所述N-糖基 化基序在野生型人生长激素中不存在。
15.包含根据权利要求14的N-糖基化的人生长激素变体的制备物，其中至少50%的 生长激素变体被N-糖基化。
16.包含根据权利要求14的N-糖基化的人生长激素变体的制备物，其中至少50%的 N-聚糖包含至少一个唾液酸部分。
17.制备包含根据权利要求14的N-糖基化的人生长激素变体的药物组合物的方法， 所述方法包括下述步骤a.在能执行N-糖基化的宿主细胞中重组表达根据权利要求8的核酸、DNA构建体或 载体，b.纯化N-糖基化的人生长激素变体，c.制备药学上可接受的制剂，其包含来自步骤ii)的纯化的N-糖基化的人生长激素 变体。
18.药物组合物，其包含根据权利要求14的N-糖基化的人生长激素变体或根据权利 要求15-16中任一项的制备物和药学上可接受的载体。
19.治疗需要人生长激素的哺乳动物的方法，所述方法包括给哺乳动物施用治疗有效 量的根据权利要求14的N-糖基化的人生长激素变体、根据权利要求15-16中任一项的制 备物、或根据权利要求15的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及新颖的具有一个或多个N-聚糖的人生长激素(hGH)变体。本发明的hGH变体包含这样的氨基酸序列，该序列包括至少一个N-糖基化基序(N-X-S/T)，所述基序源自在野生型hGH中不存在的一个或多个突变。本发明的hGH变体具有延长的循环半衰期，因而可以有效地用作将从增加的hGH水平受益的疾病状态的蛋白治疗剂。本发明也包括获得hGH变体的方法。
文档编号C12N15/79GK102131825SQ200980133295
公开日2011年7月20日 申请日期2009年6月26日 优先权日2008年6月27日
发明者克里斯滕森 C., 博尔 E., 博尔特 G., V. 伦德加尔德 T. 申请人:诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司