可调型基因自杀机制组合物和方法

专利名称：可调型基因自杀机制组合物和方法
技术领域：
本发明的实施方案涉及用于产生、纯化、配制和使用作为靶向递送媒介的真细菌 小细胞的组合物和方法，所述媒介用于体内和体外核酸、蛋白和小分子药物的递送以及靶 向体内成像和诊断技术。相关技术的描述提供下列说明以辅助理解本发明公开内容，但是并非承认描述或构成针对本公开 的现有技术。本申请中所提及或引用的文章、专利和专利申请和所有其他文献以及电子化 可利用信息的内容，都通过引用的方式全文并入本文，其并入的程度，如同每篇单独的出版 物被特别且单独指出通过引用的方式并入一样。本申请人保留将任何和所有来源于任何此 类文章、专利、专利申请或其他的文献的材料和信息在物理上并入本申请的权利。小细胞是非染色体的、被膜包裹的生物纳米粒子(< 400nm)，该纳米粒子在细菌 细胞的正常分裂器破坏后，由细菌形成。本质上，小细胞是正常细菌细胞的小的、新陈代谢 活跃的复制品，但是它们不含有染色体DNA并因此为非分裂的和无存活力的。尽管小细胞 不含有染色体DNA、质粒DNA分子、RNA分子，但已证明天然和/或重组表达蛋白和其他的代 谢物都可分离出小细胞。在整个上世纪中，研究科学家已利用小细胞作为研究细胞分裂、质粒复制、质粒分 离、RNA产生、蛋白产生、质粒隔离、质粒表征和原核生物中质粒源性毒力因子产生的工具。作为微生物学、微生物遗传学和分子生物学领域中进展的结果，任何给定的小细 胞，不管其来自哪种亲代细胞种类，现在都可以被“改造”并随后用作体内或体外靶向递送 或成像的媒介。小细胞特别适合于作为体内递送和成像的媒介，因为它们将许多其他的递送技术 的单独的优势组合成单一的通用递送媒介。小细胞可以被“改造”为优先封装、偶联或吸收 包括各种核酸、蛋白和小分子药物的生物活性分子，以用于随后的治疗和预防医药应用。如 下文更为详细描述的，因为通过使用几种不同的抗体或基于亲和力的方法，它们可以靶向 于特定的细胞、组织和器官类型，所以小细胞具有更多优势。发明概述一些实施方案提供了产生小细胞的细菌，所述细菌包含编码产生小细胞的基因 产物的可表达基因，该基因产物调节隔膜形成、二分裂和染色体分离中的一个或多个；和编 码核酸内切酶的可表达基因，其中所述产生小细胞的细菌的染色体包含一个或多个核酸内 切酶的识别位点。在一些实施方案中，产生小细胞的基因是细胞分裂基因。细胞分裂基因 包括但不限于ftsZ、sulA、CCdB以及sfiC。在一些实施方案中，在诱导型启动子的控制下，表达所述产生小细胞的基因。在一些实施方案中，核酸内切酶基因位于产生小细胞的细菌 的染色体上。在一些实施方案中，核酸内切酶是归巢核酸内切酶(homing endonuclease) 0 所述归巢核酸内切酶包括但不限于I-CeuI、PI-SceI, I-Chul、I-CpaI、I-SceIII, I-CreI、 I-Msoia-Scelia-ScelVa-Csmia-DmoI.I-Porl,PI-TliI,PI-TliII 和 PI-ScpI。在一些 实施方案中，在诱导型启动子的控制下，表达所述核酸内切酶。在一些实施方案中，产生小 细胞的细菌是革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌包括但不限于空肠弯曲菌(CampylcAacter jejuni)、乳杆菌属禾中(Lactobacillus spp·)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、 嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、沙门氏菌属种(Salmonella spp.)、志贺氏 菌属种(Shigella spp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)。在一些实施方案中，产生小细胞的细菌包含编码参与脂多糖合成 的基因产物的基因，与相应的野生型基因相比，所述基因是遗传修饰的。在一些实施方案 中，所述基因是msbB基因，该基因编码基因产物，与相应的野生型细菌中的脂质A分子相 比，所述基因产物引起细菌产生改变的脂质A分子。在一些实施方案中，与相应的野生型 细菌中的脂质A分子相比，对于将肉豆蔻酸(myristolic acid)添加至脂多糖分子的脂 质A部分而言，所述改变的脂质A分子是有缺陷的。产生小细胞的细菌可以是革兰氏阳性 细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于葡萄球菌属种Staphylococcus spp.)、链球菌属种 (Streptococcus spp·)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或赌样芽胞杆菌(Bacillus cereus)。在一些实施方案中，产生小细胞的细菌包含参与同源重组的基因，其中与相应的 野生型基因相比，这一基因是遗传修饰的，其中所述产生小细胞的细菌在DNA损伤修复方 面是有缺陷的。一些其他的实施方案提供了制备小细胞的方法，包括培养本文所公开的产生小细 胞的细菌和将小细胞与产生小细胞的亲代细胞基本分离，因此产生包含小细胞的组合物。 在一些实施方案中，所述方法还包括由产生小细胞的亲代细胞诱导小细胞的形成。在一些 实施方案中，所述方法还包括诱导编码核酸内切酶的基因的表达。在一些实施方案中，通过 一种或多种选自异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、 蜜二糖(melbiose)和四环素的化学化合物的存在诱导小细胞形成。在一些实施方案中，通 过温度变化诱导编码核酸内切酶的基因的表达。在一些实施方案中，所述方法还包括由所 述组合物纯化小细胞。在一些实施方案中，通过选自离心、超速离心、密度梯度、免疫亲和性 和免疫沉淀的方法将所述小细胞与亲代细胞基本分离。一些其他的实施方案提供了包含外膜的真细菌小细胞，其中所述外膜包含没有肉 豆蔻酸部分的脂质A分子。在一些实施方案中，本文所公开的真细菌小细胞的外膜具有这 样的成分与来自相应的野生型细菌的真细菌小细胞的外膜相比，所述成分导致哺乳动物 宿主中促炎症免疫反应的减少。在一些实施方案中，所述真细菌小细胞还包含一种或多种 生物活性化合物。在一些实施方案中，至少一种生物活性化合物选自放射性同位素、多肽、 核酸和小分子。生物活性化合物可以是小药物分子、小分子成像剂、化学治疗剂或前体药物 转化酶。生物活性化合物也可以是核酸和小分子的组合，小分子成像剂和小分子药物的组 合，小分子药物、小分子成像剂和核酸的组合，或核酸和多肽的组合。在一些实施方案中， 本文所公开的真细菌小细胞还包含细胞表面定位的靶向部分(cell-surface localized targeting moiety)。在一些实施方案中，细胞表面定位的靶向部分是融合蛋白，其中所述融合蛋白是所述真细菌的外膜锚定结构域和抗体片段的融合物。在一些实施方案中，细胞 表面定位的靶向部分是融合蛋白，其中所述融合蛋白是淋病奈瑟氏菌IgAP和识别哺乳动 物细胞表面抗原的抗体片段的融合物。在一些实施方案中，哺乳动物细胞表面抗原选自脂 肪分化相关蛋白(adipophilin)、AIM-2、BCLX(L)、BING-4、CPSF、细胞周期蛋白 DU DKK1、 ENAH、Ep-CAM (上皮细胞粘附分子)、EphA3、FGF5 (纤维母细胞生长因子5)、G250/MN/CAIX、 HER-2/neu、IL-13Rα 2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白(alpha-foetoprotein)、M-CSF(巨噬细胞集 落刺激因子)、MCSP、mdm-2、MMP-2(基质金属蛋白酶-2)、MUC-I、p53、PBF、PRAME、PSMA(前 列腺特异性膜抗原)、RAGE-1、RGS5(G蛋白信号调节蛋白5)、RNF43 (环指蛋白43)、RU2AS、分 离蛋白 Ksecernin 1)、S0X10、STEAPl、生存素(survivin)、端粒酶(Telomerase)、WTl (肾 母细胞瘤1)、Cdc27、⑶K4(细胞周期蛋白依赖性激酶4)、⑶KNh(细胞周期蛋白依赖性激 酶 2a)、BCR-ABL、BAGE-1、GAGE1-8、GnTV、HERV-K-MEL,KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-Al、 MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A9、粘蛋白(muc iη)、ΝΑ-88、NY-ESO-1、 LAGE-2、SAGE、Spl7、SSX-2、SSX-4、TRAG-3、CD-166 和 TRP2-INT2。附图简要说明

图1是显示I-CeuI对Ε. coli培养物生长影响的图。图2是显示I-CeuI对E. coli生存力影响的图。图3A和;3B是显示与单独的min⑶E突变体或ftsZ超表达相比，同时ftsZ超表达 和I-CeuI诱导导致更高的小细胞产量的柱状图。图4A-D是显示基于ftsZ超表达和I-CeuI诱导的自杀系统使亲代细胞丝状形成 增加的图。图5是显示基于I-CeuI的自杀系统引入不可修复的双链染色体断裂的柱状图。图6是显示基于I-CeuI的自杀系统减少纯化的小细胞中的亲代细胞污染的柱状 图。图7是显示鼠伤寒沙门氏菌(S. Typhimurium)中mslA基因的缺失改变脂多糖 (LPS)谱的银染色的SDS-PAGE (十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶。图8是显示mslDb的缺失引起J774. Al小鼠巨噬细胞样细胞产生较低水平的抗鼠 伤寒沙门氏菌LPS的肿瘤坏死因子α (TNFa)的柱状图。图9显示单链I-CeuI DNA识别序列和双链I-Ceul DNA切割位点。发明的详细描述^X本文所使用的术语“细胞分裂基因”指的是编码参与细胞分裂过程的基因产物的 基因。在本领域中已发现并表征了许多细胞分裂基因。所述细胞分裂基因的实例包括但不 限于 zipA、sulA、secA、dicA、dicB、dicC、dicF、ftsA、ftsl、ftsN、ftsK、ftsL、ftsQ、ftsW、 ftsZ、minC、minD、minE、seqA、ccdB、sf iC 禾口 ddlB。本文所使用的术语“转基因”指的是天然地或通过许多基因工程技术的任何一种 从一个生物体转移到另一个生物体的基因或遗传物质。在一些实施方案中，所述转基因是 含有基因序列的DNA区段，所述基因序列已被从一个生物体分离出来并被引入到不同的生 物体中。这种非天然的DNA区段可以保留在转基因生物体中产生RNA或蛋白的能力，或它 可以改变转基因生物体遗传密码的正常功能。在一些实施方案中，所述转基因是人工构建的DNA序列，不管它是否包含基因编码序列，将所述DNA序列引入到其中之前不存在该转基 因的生物体。如本文所使用的，如果相对于进行纯化前的组合物，在组合物中该试剂的浓度增 加和/或一种或多种不期望的污染物的浓度减少，则说已纯化这一试剂。因此纯化包括富 集组 合物中的试剂和/或从所述组合物中分离试剂。本文所使用的术语“结构域”或“蛋白结构域”指的是具有共同的物理和/或化学 特征的分子或结构的区域。蛋白结构域的非限制性实例包括疏水的跨膜或外周膜结合区、 球状的酶促区或受体区、蛋白_蛋白相互作用结构域和/或核酸结合结构域。本文所使用的术语“真细菌”和“原核生物”如本领域技术人员所使用的那些 术语一样。本文所使用的术语“真细菌”和“原核生物”包括真细菌，其包括革兰氏阴性 细菌和革兰氏阳性细菌、原核病毒(例如噬菌体)和专性细胞内寄生虫(例如立克次体 (Richettsia)、衣原体(Chlamydia)等)。本文所使用的术语“核酸”指的是不同核酸分子的任何集合。核酸可以是 ssDNA (单链 DNA)、dsDNA (双链 DNA)、ssRNA (单链 RNA)、dsRNA (双链 RNA)、tRNA (转运 RNA)(包括稀有密码子使用的tRNA)、mRNA (信使RNA)、核糖体RNA(rRNA)、肽核酸(PNA)、 DNA-RNA杂合体、反义寡核苷酸、核酶或适体。本文所使用的术语“超表达”指的是宿主细胞中DNA所编码的多肽或蛋白的表达， 其中所述多肽或蛋白不是宿主细胞中正常存在的，或其中所述多肽或蛋白在宿主细胞中的 存在水平高于编码所述多肽或蛋白的内源性基因所正常表达的多肽或蛋白的水平。本文所使用的术语“调节”指直接或间接与靶标相互作用以至于改变所述靶标活 性来调节生物学过程。“调节”的模式包括但不限于增强靶标的活性、抑制靶标的活性、限制 靶标的活性或扩展靶标的活性。碰真细菌小细胞非常适于用作靶向递送载体和成像载体。因为它们来自通常是固有 致病的或至少条件致病的细菌，所以在体内系统给药特别是静脉内给药之前，从给定的群 体中功能性地消除污染性亲代细胞是有利的。因此，理想的小细胞制剂将是这样的制剂，在 所述制剂中，随着小细胞被处理和纯化，残余的活亲代细胞计数应尽可能低。实现这一目的 的一种方法是，在物理分离步骤已完成后，引入自杀机制以杀死残余的亲代细胞。这种增强 的安全特性减少了感染和败血症的风险，降低了通过与其他细菌的重组事件而导致的遗传 回复突变的可能性，并且使宿主中插入事件的风险最小化。优选的是从产生小细胞的亲代 细胞菌株的细菌染色体中除去抗生素抗性标记物。从产生小细胞的细菌株中除去抗生素抗 性基因标记物是理想的，因为这样可以满足美国食品和药品管理局(FDA)对人类应用的监 管要求。对于最终产品意图应用于人类的菌株而言，FDA只允许出于选择细菌或细菌生产株 的目的而使用的卡那霉素(Kanamycin)抗性基因标记物。而且，FDA要求用于分析药物产 品和最终的小细胞制剂的某些证明标准必须满足USP (美国药典)和ICH(国际协调会议) 对纯度、聚集物缺乏和特定物质缺乏的指标。因此，药物产品的上游和下游加工都归入公司 的化学、生产和控制(CMC)药物产品产生活动。对更好的纯化方法的需求是研发来自致病菌的小细胞的难题。本发明的实施方案 涉及可调型基因自杀机制的引入和用途，一旦暴露于适当的信号，该机制就将不可修复的双链断裂引入至产生小细胞的亲代细胞的染色体中，从而导致亲代细胞死亡。与其他的产 生小细胞的菌株相比，自杀机制的激活也增加了小细胞的产量，而且同时使所有产生小细 胞的亲代细胞转化为不可逆的丝状表型。因此，本文所公开的自杀机制不限于促进携带染 色体的亲代细菌细胞的死亡，而是能具有其他多功能作用，即共同作用以改进小细胞产生。 在一些实施方案中，本文所公开的多功能自杀机制即“MSM”系统所发挥的作用是，杀死携带 染色体的亲代细胞。在一些实施方案中，本文所公开的“MSM”系统所发挥的作用是，增加小 细胞的产量。在一些实施方案中，本文所公开的“MSM”系统所发挥的作用是，专门地诱导亲 代细胞的不可逆的丝状表型以辅助亲代细胞与小细胞分离。在一些实施方案中，本文所公 开的“MSM”系统同时发挥以下作用(i)杀死携带染色体的亲代细胞，(ii)增加小细胞的产 量，和(iii)专门地诱导亲代细胞的不可逆的丝状表型以辅助亲代细胞与小细胞分离。所 述MSM系统的多功能作用能利用本文所述的技术改善小细胞的产生和纯度。一些实施方案涉及组合物和方法，所述组合物和方法用于通过将多功能基因自杀 机制即“MSM”系统引入至产生小细胞的亲代细胞系，从而减少或消除可存活的污染性产生 小细胞的活真细菌亲代细胞的数量，同时优化所产生的小细胞的产量和纯度。一些实 施方 案还涉及MSM系统用于在合成生物学应用中的用途。污染性的活亲代细胞在最终的小细胞制剂中的存在，尤其对于来自活致病细菌和 条件致病细菌的小细胞来说，是有问题的。当由细菌产生意图在人类或其他的哺乳动物中 使用的生物制剂或药物时，因为细菌可能引起疾病、严重炎症和在某些情况下导致死亡，因 此与污染性亲代细菌相关的安全性和CMC问题是至关重要的。本文所述的产生细菌小细胞 的组合物和方法不但改进了小细胞的产生和纯度，而且同时改善了用于体内和其他用途的 小细胞制剂的安全特性。不限于下文的实施例，高纯度和安全的小细胞制剂的体内应用可 以用于靶向生物成像和癌症、遗传病症和感染性疾病的治疗性预防和治疗。本发明公开内 容的一些实施方案涉及可调型基因MSM机制的引入和用途，即一旦暴露于适当的信号，所 述可调型基因MSM机制就会将不可修复的损伤引入至产生小细胞的亲代细胞的染色体。所 述自杀机制同时有利于纯化技术，所述纯化技术旨在从意图用于多数靶向递送应用中的小 细胞制剂中更好地消除可存活的亲代细胞。本文所用的术语“可调型基因自杀机制”指的是这样一种机制，其中一个细胞或一 组细胞受已知的和外部的来源刺激产生一种或多种基因产物，所述基因产物可以不可逆地 损伤细胞的生物学必需组件或细胞过程，从而使得所述细胞不再有存活力，也不能从所述 事件中恢复。术语“多功能自杀机制”即MSM，指的是使用可调型基因自杀机制同时诱导高 水平的小细胞产生、诱导亲代细胞死亡和在诱导自杀元件期间专门在亲代细胞中诱导产生 丝状表型。本文所用的术语“靶向小细胞”或“靶向递送”指的是这样的小细胞组合物，其中 所述小细胞封装一个或多个所选择的生物活性分子而且展现小细胞的外部表面上的靶向 部分，不管小细胞是(i)完全完整的，(ii)原生质体(外膜和细胞壁被移除)或(iii)原 生质体(外膜被移除或可通透的)，从而使得所述部分特异性结合、被结合或通过一些其他 的方法特异性识别并因此在特定的细胞、器官或组织类型中递送、定位或聚集以递送所述 小细胞的分子内容物至体外或体内的所述靶细胞、组织和器官类型。意图通过这种特异的 靶向来使用小细胞来递送有效载荷至靶细胞或组织。
这种利用小细胞的体内递送应用包括但不限于生物活性的(与生物学上有活性 的同义)小分子药物、生物活性核酸、生物活性蛋白和生物活性脂多糖的靶向递送，用以在 动物中产生“生物学效应”(与生物学反应同义)。所述生物学效应包括但不限于杀死靶 细胞(例如癌细胞)的效应、取代在特定靶向细胞类型中可能缺陷的或功能异常的基因的 效应、减少在特定靶细胞中失调的蛋白或信号传导分子的表达和/或活性的效应、减少或 增加来自特定细胞的激素的分泌的效应、刺激针对一种或多种抗原的适应性细胞免疫反应 的效应、刺激针对一种或多种抗原的适应性体液反应的效应、同时刺激针对一种或多种抗 原的适应性体液反应和细胞免疫反应的效应、刺激或抑制一种或多种固有性免疫反应的效 应；积极地或消极地影响动物体内的生物学过程的效应，以及影响致病寄生虫、细菌、病毒 或其他的致病微生物中的生物学过程以治疗或预防所述动物体内的疾病的效应。生物活性 元件本身并不一定就具有免疫原性而诱导宿主动物中的免疫反应，但可以是因为其生物活 性的结果而间接地引起免疫反应。真细菌小细胞对于递送而言的独特优势是它们可以被改造从而靶向并将生物活 性分子递送至体内的特定细胞类型。通过与特异性针对靶细胞表面分子的小细胞抗体或抗 体衍生物的表面偶联实现所述靶向。可选地，靶向可以通过产生小细胞的亲代菌株的基因 工程来完成，从而使得它们产生的小细胞在小细胞外膜上表达并展现与靶细胞特异性表面 分子有亲和力的抗体片段或其他多肽。在这后一种情况下，可以通过制备细胞表面定位的 靶向部分和例如来自淋病奈瑟氏菌的IgAP的跨膜蛋白序列间的嵌合融合蛋白，从而将所 述小细胞表面上经修饰的靶向部分固定在膜上(见下文)。在它们的表面上展现所述抗体 和靶向部分的小细胞被用于靶向体内的特定细胞类型以优先地将它们的生物活性有效载 荷递送至靶组织、器官和细胞类型。意图用于辅助将小细胞靶向至特定的组织、器官和细胞类型的抗体或其任何部分 可以来自免疫球蛋白或免疫球蛋白亚类，或是其一部分，包括但不限于IgA、IgM、IgD、IgG 或IgE。意图用于促进小细胞的靶向功能的任何亚类的抗体可以是“人源化的”，但是也可 以在已知能够通过适应性免疫产生抗体反应的任何动物以内产生抗细胞特异性抗原的任 何亚类的任何抗体，也能够达到相同的目标的。本质上，所产生的抗体应使得它们包含两个 单独的具有针对它们各自抗原的独特特异性的臂。没有受下文所限，修饰小细胞表面的靶 向部分可以来自噬菌体显示文库，或可以是来自识别靶细胞上的配体的细胞外受体片段的 嵌合融合蛋白。

抗体可以被改造为独立地特异性针对不同抗原，从而使得单个的抗体同时靶向两 种单独的抗原。这被称为‘双特异性’抗体或‘双特异性’靶向部分。作为非限制性实例， 所述抗体可以被改造为其中一个Fab’识别给定的真细菌小细胞的推定的表面组分(例如 LPS 0-抗原)，并且所述双特异性抗体的另一个Fab’可以被改造为识别诸如下文所列举的 那些细胞特异性表面抗原。另外，本领域技术人员容易认识到，可以通过将具有各自特异性 的两个单独的抗体与蛋白A/G(Pr0tein A/G)相偶联而将它们非共价性连接，从而形成能够 粘附于小细胞表面的双特异性抗体衍生物，其中所述复合物中的一个抗体特异性粘附于所 述小细胞的表面，而另一个抗体被展现，从而特异性识别并因此在体内“靶向”特定的细胞、 组织或器官类型。类似地，本领域技术人员将认识到，可以利用各种交联技术将具有单独特 异性的两个单独的抗体共价连接，以达到相同的效果。
在一些实施方案中，小细胞被遗传“改造”为在其表面表达并展现重组靶向蛋白。 这已经通过利用包含抗原43-α外膜蛋白锚定结构域与具有Chlam 12或CTP3特异性的单 链FcV(ScFv)抗体片段融合的融合蛋白，成功地在肠沙门氏菌(Salmonella enterica)中 实现。相似的研究已经表明，表达并展现针对冠状病毒(Coronavirus)表位的单链FcV抗 体片段与淋病奈瑟氏菌的外膜定位的IgA蛋白酶相融合的融合蛋白的E. coli细胞能够在 体外中和冠状病毒和预防感染。可以利用相同类型的策略以产生并 在小细胞表面展现靶向 融合蛋白。其他的包括LamB、OmpF, OmpC, OmpA, OmpD, PhoE, PAL和各种鞭毛蛋白的天然的 外膜蛋白已被用作革兰氏阴性肠杆菌科(Enterobacteriacea)成员中的膜锚定和展现结 构域。通常，相同的方法可以用于在来自任何肠杆菌科(Enterobacteriaceae)或芽孢杆 菌科(Bacillaceae)成员的小细胞表面上表达和显示抗体片段，从而使得所述小细胞成为 针对存在于涉及各种临床指征的细胞、组织或器官类型表面的抗原的“特异性”靶向递送媒 介。实现上述目标的主要问题是产生一个编码融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白含有推 定的或预测的外膜蛋白或外膜定位序列和对存在于给定的细胞、组织或器官类型中的表面 分子有亲和力的抗体、抗体衍生物或其他多肽序列。小细胞作为递送媒介(靶向或非靶向的)的另一个优势是可以组合递送生物活性 分子。例如，已证明了当小细胞被用作质粒DNA疫苗的递送媒介时，所述小细胞可以成功地 产生抗异源性抗原的体液免疫反应。当小细胞被用于同时递送DNA疫苗和相应的蛋白时， 体液反应被极大地改进，说明了小细胞对于递送选择的灵活性的益处。在相似的方法中，所 述小细胞被用于封装并递送特异性针对不同mRNA转录物的不同核酸类型的组合，所述核 酸类型诸如质粒DNA或各种反义干扰RNA (例如shRNA、siRNA)分子，从而使得在单次递送 事件中沉默多个基因。小细胞也用于同时递送两种或多种小分子药物，从而使得在单次事 件中定位多个细胞内的靶标。本文所公开的一些实施方案描述了能够共同或单独地递送几类生物活性有效载 荷的靶向真细菌小细胞，其中借助应用于常规分离技术的诱导型基因自杀机制的组合效 应，所述小细胞最终制剂基本上不含任何剩余的可存活的污染性亲代细胞。1.小细胞的产生小细胞是非染色体的、被膜包裹的生物纳米粒子(< 400nm)，该纳米粒子在细菌 细胞的正常分裂器破坏后，由细菌形成。本质上，小细胞是正常细菌细胞的小的、新陈代谢 活跃的复制品，但是它们不含有染色体DNA并因此为非分裂的和无存活力的。尽管小细胞 不包含染色体DNA，质粒、RNA分子、天然和/或重组表达蛋白和其他的代谢物都已显示可分 离出小细胞。在2002年5月24日提交的美国专利申请第10/154，951号中详细讨论了一 些产生小细胞的细菌菌株的构建方法，在此通过引用将其全文并入。染色体复制和细胞分裂之间的协调的破坏导致从大多数杆状原核生物的极性区 形成小细胞。通过一些涉及隔膜形成和二分裂的基因的超表达可以促进染色体复制和细胞 分裂之间的协调的破坏。或者，小细胞可以产生于在调节隔膜形成和二分裂的基因中含有 突变的菌株中。已在许多不同的原核生物中证明，受损的染色体分离机制也可以导致小细 胞的形成。类似地，通过参与初期染色体分离至子细胞的过程的基因的超表达或突变可以实 现小细胞的产生。例如已证明E. coli的parC或mukB基因座的突变可产生小细胞。这两者分别影响肠杆菌科的染色体分离过程中的独立的且不可缺少的步骤。与本文所述的细胞 分裂基因相似，任何对参与染色体分离过程的给定基因的野生型水平进行改造并导致小细 胞产生的操作也会在其他的家族成员中具有相似的效应。因为细胞分裂和染色体复制过程对于细胞存活十分关键，所以在原核家族成员中 负责这些过程的基因在遗传上和功能上的保守性均很高。一个家族成员中可以驱动小细胞 产生的细胞分裂基因的超表达或突变可以被用于在另一个家族成员中产生小细胞。例如， 已证明E. coli FtsZ基因在其他肠杆菌科成员诸如沙门氏菌属种(Salmonella spp.)和志 贺氏菌属种(Shigella spp.)以及其他类别的成员诸如假单胞菌属种(Pseudomonas spp.) 中的超表达将导致相似水平的小细胞的产生。以上事实同样可以在肠杆菌科的基于突变的产生小细胞的菌株中得到证明。例如 任何肠杆菌科成员的min基因座的缺失都导致小细胞的产生。肠杆菌科的其中突变可以导 致小细胞形成的细胞分裂基因包括但不限于min基因(MinCDE)。尽管可以由min突变菌株 产生小细胞，但这些菌株作为产生菌株而言的商业价值有限。这是因为具有min基因中的 缺失或突变的菌株使得小细胞处于组成性低水平。这就会出现商业化和规模经济方面的两 个问题。第一个问题是是来自这些菌株的小细胞产率低，这就增加了产生成本。第二个问 题是突变菌株的小细胞产率是高度易变的，而且批次之间的差异性对与生产质量控制和监 管保证相关关的可变生产成本具有极大的影响。首先通过亲代细胞使用突变菌株制备以产 生已封装生物活性分子诸如蛋白、RNA、DNA和其他的代谢物用于递送的小细胞，所以所产生 的封装所述生物活性分子的小细胞是有问题的。突变菌株中小细胞的产生的启动不能控制 而且发生率处于低水平，所以最终的结果是一些小细胞将不包含生物活性分子同时其他的 小细胞则包含高度可变数量的生物活性分子。这些缺点一起或单独地大大地限制了使用这 些突变菌株产生商业上可用的产率和/或质量的小细胞的可能性。超表达细胞分裂基因的产生小细胞的菌株(“超表达体”)相对于基于突变的菌株 而言是优 选的，因为当待被超表达的细胞分裂基因被置于诱导型或其他条件活性真细菌的 启动子系统的控制下时，这种产生小细胞的表型是可控的。利用基于质粒的互补研究在鉴 定E. coli中的基本细胞分裂基因时，研究者发现超表达细胞分裂基因ftsZ的菌株能够产 生小细胞。在这些研究中，ftsZ基因的存在量超过10拷贝/细胞。证明ftsZ的多基因拷 贝的存在可产生小细胞和非常长的丝状细胞。最终，这种向不可逆的丝状表型的转变消极 地影响了超表达来自多拷贝质粒的ftsZ的菌株的小细胞的产量，但是所产生的小细胞的 数量仍然比任何突变菌株所产生的小细胞的数量高。目前已经证实，通过将ftsZ基因拷贝 的数量减少至单个(染色体双倍)产生的小细胞的数量增加的量比ftsZ位于多拷贝质粒 上的那些菌株要高，而且丝状表型的数量更少。因此，一些优选的组合物是可被诱导而产生 小细胞的菌株，该菌株超表达来自ftsZ的双倍染色体整合拷贝的ftsZ基因。所使用的双倍 ftsZ基因可以直接来自其中产生小细胞表型经过改造的细菌种类，也可以来自其他细菌种 类的ftsZ基因序列。作为非限制性实例，大肠埃希菌的ftsZ基因的超表达可以用于产生 来自大肠埃希菌和鼠伤寒沙门氏菌的小细胞。所得到的菌株含有野生型的ftsZ基因和位 于染色体上的分离的双倍诱导型ftsZ基因拷贝，以及下文中更详细描述的诱导型基因自 杀机制。这种使用诱导型表型产生小细胞的方法比起突变系统来具有几个独特的优势。首先，因 为在这些菌株中没有基因突变，所以正常生长期间不存在选择性压力，而且培养细胞 在小细胞表型被诱导之前都保持非常稳定和正常的生理机能。最终的结果是产生型小细胞 的诱导型菌株更健康且更稳定，这最终导致了如图3所示的较高的小细胞产量。另一个使 用诱导型表型产生小细胞的方法的独特的优势是如果小细胞被用于递送产生小细胞的亲 代细胞自身所能够制备的诸如蛋白、RNA、DNA和其他的代谢物的生物活性分子，所产生的小 细胞能够封装那些生物活性分子。在上述情况下，一种优选的方法是在诱导小细胞表型之 前先诱导亲代细胞内形成生物活性分子，这样所有产生的小细胞都将包含足够数量的所需 分子以便于封装递送。当这些优势被组合使用时，可获得更高质量和数量的小细胞。作为 非限制性实例，可以在肠杆菌科中被超表达而产生小细胞的分裂基因包括但不限于FtsZ、 MinE、SUIA、CcdB和SfiC。优选的组合物含有双倍拷贝的细胞分裂基因，所述双倍拷贝的细 胞分裂基因处于诱导型启动子的控制之下，并稳定整合至给定的真细菌菌株的染色体中。 如果这种诱导型细胞分裂基因盒存在于质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、重组噬菌体或 存在于细胞中的其他的游离体DNA分子上，那么也可以进行这一相同的策略。也可以使用 来自其他生物体的这些基因的或基因产物的类似物。本文所述的新颖的诱导型MSM系统更进一步地增加了诱导型小细胞菌株的小细 胞产量。MSM系统的激活与其他仅靠过多产生ftsZ而促进小细胞形成的菌株相比，小细胞 产量增加了 10倍以上(实施例3)。将MSM系统与在MinCDE中含有突变或缺失的产生小细 胞的菌株组合起来是可能的。一种优选的实施方案是使用MSM系统控制产生小细胞的诱导 型表型，增加小细胞的产率，导致不可修复的细胞损伤和促进亲代细胞群中的丝状表型。一 种优选的MSM基因组合含有超表达ftsZ或任何其功能性类似物的产生小细胞的诱导型菌 株和归巢核酸内切酶的诱导型表达，如下文更详细描述的，所述归巢核酸内切酶优选地为 来源于藻类 Chlamydomonas moewusii 的 I-CeuI 基因。能够产生小细胞并可由诱导型MSM系统的激活导致亲代细胞自杀/丝状表型不限 于肠杆菌科，而是可以在包括革兰氏阴性或革兰氏阳性来源的任何杆状细菌中产生。例如， 已详细地研究了枯草芽孢杆菌和芽孢杆菌科的其他成员的产生小细胞的菌株。与肠杆菌科 的产生小细胞的菌株类似，所有芽孢杆菌科的产生小细胞的菌株都是参与细胞分裂或染色 体分离过程的基因的突变或超表达的结果。因此，存在足够的证据支持这一构想对参与 任何杆状细菌科或属的细胞分裂或染色体分离过程的保守基因的操作，也可以用于在同一 科或属的生物体的其他成员中制备能够产生小细胞的菌株。同样地，如下表1所证明的那 样，用于产生MSM系统的基因类别可以识别并破坏许多不同杆状革兰氏阴性和革兰氏阳性 细菌种类的染色体。诱导型启动子诱导型启动子可以用于通过在生物体发育的某些阶段启动或关闭基因转录而调 节基因表达。这些启动子的活性可以被生物或非生物因素的存在或不存在所诱导。诱导型启动子包括但不限于化学调节的启动子和物理调节的启动子。化学调 节的启动子的转录活性包括启动子可以受一种或多种化合物的存在或不存在调节。所 述化合物包括但不限于小分子、核酸、多肽和蛋白。所述化合物的非限制性实例有异丙 基-β -D-I-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蜜二糖、四环素、 乙醇、类固醇、金属和其他化合物。物理调节的启动子包括其转录活性受一种或多种物理因素的存在或不存在调节的启动子，所述物理因素诸如水压力或盐压力、照明、光亮或黑暗、 辐射、低温或高温、氧气和氮气。 2.小细胞与亲代细胞的分离和小细胞的纯化因为小细胞来自通常是固有致病的或条件致病的细菌，在给药前从给定群体中功 能性地除去任何污染性亲代细胞是有利的。常规地通过物理方法或者生物学方法除去活的 亲代细胞。物理方法包括使用基于离心作用的分离方法、过滤方法、色谱方法、密度梯度、免 疫亲和性、免疫沉淀反应或其任何组合。上述方法尽管有效，但每一种都也有缺点，并没有 一种物理分离方法可以完全适于从小细胞中除去可存活的亲代细胞。最终，对于商业生产 而言，由于过滤方法或其组合的简易性、实用性、低成本和规模可控性，使过滤方法或其组 合成为最优选的技术。然而，当前的过滤方案是受到限制的，因为许多污染性亲代细胞会穿 过过滤器，而当尽力避免这一问题时，就会导致最终的小细胞产量的减少。最终，通过设计 和使用影响亲代细胞大小和存活力的生物因素，并与常规过滤方法相结合，将能够实现除 去活细胞的最佳效果。如下文所示，本文公开的MSM系统使得可以诱导性地发育出细长丝 状的亲代细胞，这种细长丝状的亲代细胞在生产期间更容易与小细胞相分离。生物性除去可以通过包括但不限于下列的手段而实现亲代细胞的优先裂解、营 养缺陷型亲代菌株的使用、抗生素处理、紫外辐射(UV辐射)处理、二氨基庚二酸(DAP)的 耗尽、亲代细胞的选择性吸附和使用其他DNA损伤剂的处理。通常通过诱导溶原性原噬菌体(lysogenic prophage)的裂解周期来介导亲代细 胞的优先裂解。就产生小细胞的菌株而言，最有用的是使用有裂解能力但在再感染能力上 有缺陷的原噬菌体，从而使得溶解表型激活期间小细胞不会随后被感染和裂解。或者作为 非限制性实例，可以表达诸如那些被分类为holin基因家族成员的单独的基因，以实现相 似水平的裂解而不需担心使用溶原性原噬菌体所固有的再感染。这两种方法都受限于下述 事实裂解事件，不管使用哪种方法实现，都会将不可接受数量的游离内毒素驱除进入到介 质中。清除如此大量的游离内毒素既耗费时间，又会受批次之间的变异性的影响并且最终 成本高昂。营养缺陷型菌株的使用会导致有关回复的问题，而且因此它只能用于由共生的或 非致病性细菌菌株产生小细胞的情况。因此，对于被用作除去小细胞产生中的活亲代细胞 的方法而言，它们的应用是受限的。用抗生素处理小细胞制剂会导致发展出对抗生素的抗性的问题，尤其当从致病的 或条件致病的亲代菌株中制备小细胞时这一问题更为重要。当使用抗生素在给定的小细胞 产生过程中除去亲代细胞时，有关监管和费用的问题也是值得重视的。UV辐射的处理可以用于在产生小细胞的过程中除去活的亲代细胞，但是UV辐射 是随机的，而且结果在批次之间是高度可变的。另外，当使用小细胞递送治疗的或预防的核 酸时，这种方法不是优选的，因为UV辐射是不加区分地随机损伤核酸。例如，质粒DNA也非 常容易受UV辐射的影响而造成DNA损伤，这样一来即使它被有效地递送，也仍然没有治疗 或预防效果。DAP耗尽可以用于除去活的亲代细胞，但是这种方法受限于它能够应用物种的数 量。换句话说，并不是所有能够产生小细胞的亲代细胞种类都需要依赖DAP而存活，而对于不依赖DAP存活的物种使用这种方法就没有意义。DAP依赖性菌株的回复突变也是这种方 法的一个问题。对于从活的亲代细胞中纯化小细胞而言，还必须利用选择性吸附的方法。选择性吸附被定义为凭借亲代细胞对基质的亲和力而使亲代细胞被优先地吸附到基质的任何过 程。作为非限制性实例，高亲和力的蛋白-蛋白相互作用可被用于这一用途。作为非限制 性实例，来自革兰氏阴性种类假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)的外膜 蛋白侵袭素对嵌入到整合素的蛋白序列中的RGD基元具有高亲和力。可以容易地在产 生小细胞的菌株中引入受诱导型启动子控制的编码侵袭素的基因。可以在侵袭素基因表达 激活前从这一菌株中产生小细胞，从而使得所产生的小细胞不在它们的细胞表面表达或展 现侵袭素。当从所述菌株中产生所需数量的小细胞后，就可以给予培养中的活细胞信号以 产生侵袭素蛋白，从而使得所述侵袭素只被表达或展现在活细胞上。当所述侵袭素在可存 活的亲代细胞的表面被表达后，亲代细胞就可以容易地被吸附至包被有β “整合素或RGD 基元的基质上，所述RGD基元嵌入到合成多肽或其他的重组蛋白中。在被吸附后，就可以根 据所使用的基质类型，通过许多不同的方法选择性地从可存活的亲代细胞中纯化走所述小 细胞。所述基质包括但不限于用于重力过滤应用的固相色谱柱、磁珠、离子交换柱或高压液 相色谱(HPLC)柱。这种方法受限于这一缺点没有一种蛋白_蛋白相互作用能够有效地用 于所有产生小细胞的亲代细胞的种类。例如，上文所述的侵袭素-整合素方法可以用于大 多数的革兰氏阴性肠杆菌科成员，但不能用于产生小细胞的革兰氏阳性芽孢杆菌科成员。以上所提及的产生小细胞的亲代菌株的丝状表型的使用，在辅助常规的、基于大 小的物理分离技术诸如过滤方面表现出一个非常独特的优势，因为它优先地将污染性活细 胞的大小从约1 μ M的长度增加至约10-15 μ M的长度。然而小细胞仍保持它们约400ηΜ的 典型大小。小细胞和丝状亲代细胞间增加的大小差异极大地简化了过滤方案，并使其可以 作为除去可存活的亲代细胞的优选方法。通过几种方法可以在杆状真细菌中诱导丝状形 成，所述几种方法中，最常见的方法包括通过以下手段给予细胞生理应激加入高浓度的盐 或通过增加或减少培养物的ΡΗ，细胞分裂基因(诸如上文所述的fts基因)的超表达和SOS 反应的诱导。细菌中SOS应激反应的诱导通常通过引入重要染色体损伤来诱导，但是已证 明其他的机制也可以起作用。但对细胞培养物施加生理应激以诱导丝状形成的问题是，并 不是细胞群中所有的细胞都平等地响应这种应激，从而导致细胞大小差异很大，有的亲代 细胞完全不受影响，有的细胞部分地丝状形成，还有的细胞彻底地丝状形成。这种群体中不 平等的反应限制了这种方法在纯化过程中的可重复性。这种现象在通过外源性DNA损伤剂 的添加诱导SOS反应中同样存在，因为并不是细胞群中所有的细胞都平等地响应所述损伤 剂并产生细丝。考虑到上文所列举的所有生物学方法的局限性，为改进用于体内应用的小细胞的 安全特性，还是亟需研发普遍可靠且有效的方法来除去可存活的产生小细胞的亲代细胞。 为此，本发明的实施方案满足了这一需求并提供方法，所述方法通过利用现有技术中未记 载的可调型基因自杀机制，能够不可修复地损伤可存活的产生小细胞的亲代细胞的染色 体。所述基因自杀机制的激活同时且不可逆地杀死细胞同时诱导丝状表型，该丝状表型用 于辅助常规的，基于过滤技术，将可存活的污染性亲代细胞与小细胞分离。一种优选且新颖的方法能够确保群体中所有的可存活的产生小细胞的亲代细胞都一致地变为丝状，所述方法通过基因工程的手段将处于诱导型启动子控制之下的一个基 因或一组基因引入到产生小细胞的菌株的染色体上，一旦使用诱导物进行激活，所述一个 或一组基因就会引起如本文所述的MSM系统所实现的丝状形成(实施例4)。可以确定的是， 本文所述的基因自杀(MSM)机制的激活引起广泛而深度的丝状形成(实施例4)。因此，通过 确保任何可存活的细胞(具有染色体的细胞)都将在人为控制下变成丝状，本发明的实施 方案克服了其他方法所表现出的丝状形成一致性的问题。理想的是，为了确保在给予适当 信号时给定群体中的所有细胞都进入自杀程序，应避免与诱导物摄取和其他影响启动子活 性的生理学因素有关的自杀机制表达的问题。为避免启动子活性不足并确保群体中的每个 细胞都能变成丝状，一种优选地用于激活基因自杀机制的启动子系统是温度调节的，例如 CI857ts启动子系统。一些实施方案包含革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌菌株，所述细菌菌株 含有以下核酸一种核酸包含与诱导型原核表达信号可操作地连接的针对产生小细胞的基 因编码的基因(优选ftsZ)，另一种核酸包含与诱导型原核表达信号(优选CI857ts)可操 作地连接的针对不裂解亲代细胞的自杀基因编码的基因(优选归巢核酸内切酶I-CeuI)。 与产生小细胞的基因和自杀基因相连接的原核表达信号可以处于相同的原核表达信号或 不同的原核表达信号的控制下。而且，产生小细胞的基因和自杀基因可以位于细胞中相同 的或不同的核酸上，该核酸的其中一个可以是游离的核酸(例如质粒)。在一些其他的实施 方案中，产生小细胞的基因和自杀基因被可操作地连接在转录融合物中(即在相同的mRNA 转录物上)，而且处于共同的诱导型原核表达信号的控制之下。产生小细胞的基因和自杀基 因都可位于每细胞多于一个的基因拷贝中。在一些实施方案中，在包含小细胞的组合物中，基本将小细胞和产生小细胞的亲 代细胞分离。分离后，少于约 99. 9%、99. 5%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、 92%,91 %,90%,89%,88%,87%,86%,85%,84%,83%,82%,81 %,80%,79%,78%, 77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35% 或 30%的包含小细胞的组合物不含有产生小细胞的亲代细胞。3.诱导不可修复的染饩体损伤的方法已通过UV辐射的使用最佳地阐明了如下概念给定细胞的不可修复的大量染色 体损伤将导致不可逆的细胞死亡。UV辐射引起给定的DNA分子中邻近的胸腺嘧啶核苷酸间 的胸腺嘧啶二聚体的形成。如果胸腺嘧啶二聚体的数量达到某一阈值，而其中又没有足够 数量的蛋白参与这些加合物的DNA修复，细胞就会有效地死亡。然而，如上文所提及的，因 为这种方法对于染色体中加合物形成的位点之间缺乏特异性，对所有核酸类型都不加区分 地影响，以及不依赖暴露时间的差异性，所以这种方法是严重受限的。不可修复的染色体损伤也可以通过核酸内切酶的超表达而实现。核酸内切酶可以 在序列特异的切割位点处切割双链DNA。根据所使用的限制酶，切割可以产生平端或粘端的 切割产物。4. Chlamydomonas moewusii 的 I-CeuI 基因 Chlamydomonas moewusii 的叶绿体 DNA(SEQ ID NO :1)所编码的 I-CeuI 限制酶 特别可用于在许多种产生小细胞的真细菌的亲代菌株的染色体中引入不可修复的损伤。所 述的I-CeuI属于内含子编码的I型限制酶的独特家族，这一家族通常被称为归巢核酸内切 酶。I-CeuI归巢限制酶23S核糖体RNA (rRNA)的rrn操纵子位点(SEQ ID NO 2)的15-19碱基对保守序列内特异地切割。因为23S rRNA序列在真细菌中十分保守，所以I-CeuI可 以用于在许多种产生小细胞的亲代细胞种类中引入不可修复的染色体损伤。在大多数真细 菌中，23S rRNA位点位于4-10个不同位置中的任何位置(见表1)，这一系列位点均可支持 不可修复的损伤。通常，常见的质粒DNA分子序列内没有23S rRNA位点，因此I-CeuI可以 用于在消除亲代细胞的同时仍使得质粒能够增殖和分离到小细胞中，使其能够作为治疗的 或预防的有效载荷而被递送。而且，I-CeuI归巢核酸内切酶在42-47°C时操作最有效，因 此使得它专一地适合于使用温度调节启动子系统，诸如来自噬菌体λ的CI857ts启动子系 统。在温度39°C以下时，所述CI857ts启动子系统是失活的，当温度变化为42_45°C时，该 系统会具有极高的活性，这使得培养物中的每个产生小细胞的亲代细胞都快速、持久且一 致地暴露于I-Ceul。这一启动子系统的激活很大程度上与许多抑制的生理学因素诸如诱导 物摄取无关。表1.不同的真细菌基因组内I-CeuI识别位点的列表
权利要求
1.产生小细胞的细菌，所述细菌包含编码产生小细胞的基因产物的可表达的基因，所述基因产物调节隔膜形成、二分裂和 染色体分离中的一种或多种；和编码核酸内切酶的可表达的基因，其中所述产生小细胞的细菌的染色体包含一个或多个所述核酸内切酶的识别位点。
2.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的基因为转基因。
3.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，其中所述核酸内切酶基因为转基因。
4.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的基因为细胞分裂基因。
5.如权利要求4所述的产生小细胞的细菌，其中所述细胞分裂基因选自ftsZ、sulA、 ccdB 和 SfiC0
6.如权利要求5所述的产生小细胞的细菌，其中所述细胞分裂基因为ftsZ。
7.如权利要求6所述的产生小细胞的细菌，其中所述ftsZ包含SEQID NO :3的核酸 序列。
8.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的基因在诱导型启动 子的控制下被表达。
9.如权利要求8所述的产生小细胞的细菌，其中所述启动子为温度敏感启动子。
10.如权利要求8所述的产生小细胞的细菌，其中所述启动子可被一种或多种化学化 合物的存在诱导。
11.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，其中所述核酸内切酶基因位于所述产生 小细胞的细菌的染色体上。
12.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，其中所述核酸内切酶为归巢核酸内切酶。
13.如权利要求12所述的产生小细胞的细菌，其中所述核酸内切酶选自I-Ceul、 PI-SceI, I-ChuI, I-CpaI, I-SceIII, I-CreI, I-MsoI, I-SceII, I-SceIV, I-CsmI, I-DmoI, I-PorI, PI-TliI, PI-TliII 和 PUcpI。
14.如权利要求13所述的产生小细胞的细菌，其中所述核酸内切酶为I-Ceul。
15.如权利要求14所述的产生小细胞的细菌，其中所述I-CeuI包含SEQID NO 4的 氨基酸序列。
16.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，其中所述核酸内切酶在诱导型启动子的 控制下被表达。
17.如权利要求16所述的产生小细胞的细菌，其中所述启动子为温度敏感启动子。
18.如权利要求16所述的产生小细胞的细菌，其中所述启动子可被一种或多种化学化 合物的存在诱导。
19.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的细菌为革兰氏阴 性细菌。
20.如权利要求19所述的产生小细胞的细菌，其中所述革兰氏阴性细菌选自空 JS^ffi ^ (Campylobacter jejuni) > ILff ^Mft (Lactobacillus spp. ) >K 菌(Neisseria gonorrhoeae)、嗜月市军团菌(Legionella pneumophila)、沙门氏菌属 种(Salmonella spp·)、志贺氏菌属种(Shigella spp·)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)禾口大 1 ;^ (Escherichia coli)。
21.如权利要求19所述的产生小细胞的细菌，所述细菌包含编码参与脂多糖合成的基 因产物的基因，其中所述基因与相应的野生型基因相比经过遗传修饰。
22.如权利要求21所述的产生小细胞的细菌，其中所述基因为编码基因产物的msbB基 因，与相应的野生型细菌中的脂质A分子相比，所述基因产物导致细菌产生改变的脂质A分 子。
23.如权利要求22所述的产生小细胞的细菌，其中与相应的野生型细菌中的脂质A分 子相比，所述改变的脂质A分子对于肉豆蔻酸添加至所述脂多糖分子的脂质A部分而言是 有缺陷的。
24.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的细菌为革兰氏阳 性细菌。
25.如权利要求M所述的产生小细胞的细菌，其中所述革兰氏阳性细菌选自葡萄 球菌属禾中(Staphylococcus spp·)、链球菌属禾中(Streptococcus spp·)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)禾口赌样芽胞杆菌(Bacillus cereus)。
26.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，所述细菌包含参与同源重组的基因，其中 所述基因与相应的野生型基因相比经过遗传修饰，其中所述产生小细胞的细菌在DNA损伤 修复中是有缺陷的。
27.制备小细胞的方法，所述方法包括 培养权利要求1所述的产生小细胞的细菌；和基本上将小细胞与所述产生小细胞的亲代细胞分离，由此产生包含小细胞的组合物。
28.如权利要求27所述的方法，所述方法还包括由所述产生小细胞的亲代细胞诱导小 细胞形成。
29.如权利要求27所述的方法，所述方法还包括诱导编码所述核酸内切酶的基因的表达。
30.如权利要求观所述的方法，其中通过选自异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蜜二糖和四环素的一种或多种化学化合物的存在， 诱导小细胞形成。
31.如权利要求四所述的方法，其中通过温度的变化诱导所述编码核酸内切酶的基因 的表达。
32.如权利要求四所述的方法，所述方法还包括从所述组合物中纯化所述小细胞。
33.如权利要求27所述的方法，其中通过选自离心、超速离心、密度梯度、免疫亲和性 和免疫沉淀的方法将所述小细胞与所述亲代细胞基本分离。
34.制备小细胞的方法，所述方法包括 培养权利要求21所述的产生小细胞的细菌；和基本上将所述小细胞与所述产生小细胞的亲代细胞分离，由此产生包含小细胞的组合物。
35.如权利要求34所述的方法，所述方法还包括由所述产生小细胞的亲代细胞诱导小 细胞形成。
36.如权利要求34所述的方法，所述方法还包括诱导编码所述核酸内切酶的基因的表达。
37.如权利要求35所述的方法，其中通过选自异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蜜二糖和四环素的一种或多种化学化合物的存在， 诱导小细胞形成。
38.如权利要求36所述的方法，其中通过温度的变化诱导所述编码核酸内切酶的基因 的表达。
39.如权利要求35所述的方法，所述方法还包括从所述组合物中纯化所述小细胞。
40.如权利要求34所述的方法，其中通过选自离心、超速离心、密度梯度、免疫亲和性 和免疫沉淀的方法将所述小细胞与所述亲代细胞基本分离。
41.包含外膜的真细菌小细胞，其中所述外膜包含没有肉豆蔻酸部分的脂质A分子。
42.如权利要求41所述的真细菌小细胞，其中所述外膜的组成与来自相应的野生型细 菌的真细菌小细胞的外膜相比，导致哺乳动物宿主中促炎症免疫反应的减少。
43.如权利要求41所述的真细菌小细胞，所述真细菌小细胞还包含一种或多种生物活 性化合物。
44.如权利要求43所述的真细菌小细胞，其中至少一种所述生物活性化合物选自放射 性同位素、多肽、核酸和小分子。
45.如权利要求43所述的真细菌小细胞，其中至少一种所述生物活性化合物为小分子 药物。
46.如权利要求43所述的真细菌小细胞，其中至少一种所述生物活性化合物为小分子 成像剂。
47.如权利要求43所述的真细菌小细胞，其中至少一种所述生物活性化合物为化学治 疗剂。
48.如权利要求43所述的真细菌小细胞，其中至少一种所述生物活性化合物为核酸。
49.如权利要求43所述的真细菌小细胞，其中至少一种所述生物活性化合物为多肽。
50.如权利要求43所述的真细菌小细胞，其中至少一种所述生物活性化合物为前体药 物转化酶。
51.如权利要求43所述的真细菌小细胞，其中至少一种所述生物活性化合物为核酸和 小分子的组合。
52.如权利要求43所述的真细菌小细胞，其中至少一种所述生物活性化合物为小分子 成像剂和小分子药物的组合。
53.如权利要求43所述的真细菌小细胞，其中至少一种所述生物活性化合物为小分子 药物、小分子成像剂和核酸的组合。
54.如权利要求43所述的真细菌小细胞，其中至少一种所述生物活性化合物为核酸和 多肽的组合。
55.如权利要求43所述的真细菌小细胞，所述真细菌小细胞还包含细胞表面定位的靶 向部分。
56.如权利要求55所述的真细菌小细胞，其中所述细胞表面定位的靶向部分为融合蛋 白，其中所述融合蛋白为真细菌的外膜锚定结构域和抗体片段的融合物。
57.如权利要求56所述的真细菌小细胞，其中所述细胞表面定位的靶向部分为融合蛋白，其中所述融合蛋白为淋病奈瑟氏菌IgAP和识别哺乳动物的细胞表面抗原的抗体片段 的融合物。
58.如权利要求57所述的真细菌小细胞，其中所述哺乳动物的细胞表面抗原选 自脂肪分化相关蛋白、AIM-2、BCLX(L)、BING-4、CPSF、细胞周期蛋白DU DKKU ENAH、 Ep-CAM (上皮细胞粘附分子)、EphA3、FGF5 (纤维母细胞生长因子5)、G250/MN/CAIX、HER_2/ neu、IL-13Ra 2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、M_CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、MCSP、mdm_2、 MMP-2(基质金属蛋白酶-2)、MUC-l、p53、PBF、PRAME、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、RAGE-l、 RGS5(G蛋白信号调节蛋白5)、RNF43(环指蛋白43)、RU2AS、分离蛋白1、S0X10、STEAPl、生存 素、端粒酶、WTl (肾母细胞瘤l)、Cdc27、⑶K4(细胞周期蛋白依赖性激酶4)、⑶细胞 周期蛋白依赖性激酶 2a)、BCR-ABL、BAGE-1、GAGE 1-8、GnTV、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、 LAGE-I、MAGE-Al、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A9、粘蛋白、NA-88、 NY-ES0-1、LAGE-2、SAGE、Spl7、SSX-2、SSX-4、TRAG-3、CD-166 和 TRP2-INT2。
59.由权利要求34所述的方法产生的真细菌小细胞。
全文摘要
本发明的实施方案涉及可调型基因自杀机制在用于在改进的生物学纯化中引入和用途，包括在各种真细菌小细胞的产生和纯化方法中的辅助用途。本文描述了具有遗传修饰的包含可调型基因自杀机制的高产量的产生小细胞的真细菌菌株，所述基因自杀机制不可修复地破坏亲代细胞的染色体，从而使得可以在小细胞产生和纯化过程的运行期间，在任何时间，功能性地消除培养中的活亲代细胞。本发明的实施方案还描述了用于在其他基于细胞的生物学产生期间消除活亲代细胞的方法。
文档编号C12N1/21GK102131927SQ200980133155
公开日2011年7月20日 申请日期2009年6月23日 优先权日2008年6月25日
发明者斯坦利·马洛伊, 辻晋吾, 马修·J·贾卡洛内 申请人:瓦克星治疗有限公司