粪便试样的调制方法、粪便试样调制用溶液、及粪便采集用试剂盒的制作方法

专利名称：粪便试样的调制方法、粪便试样调制用溶液、及粪便采集用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于调制粪便试样中所含的核酸的保存性优异的粪便试样的粪便试 样的调制方法、粪便试样调制用溶液及粪便采集用试剂盒、通过该调制方法调制得到的粪 便试样、由该粪便试样回收核酸的方法、及使用了通过该核酸回收方法回收的核酸的核酸 分析方法。本申请要求2008年8月沈日在日本申请的日本特愿2008-217019号的优先权， 并将其内容援引于此。
背景技术：
与欧美同样，日本结肠癌的患者数也在逐年急剧增加，结肠癌已占居癌症死亡率 的前几位。其原因认为是日本人的饮食生活转变成欧美型的以肉食为中心。具体而言，每 年约6万人左右罹患结肠癌，在按照脏器分类的死亡数方面，结肠癌排在第三位，仅次于胃 癌、肺癌，预测今后也会进一步增加。另一方面，结肠癌与其他癌不同，通过在发病初期进行 治疗，近100%能够治愈。因此，将结肠癌作为早期癌诊察的对象是非常有意义的，用于早期 发现结肠癌的检查方法的研究和开发正在盛行。作为用于早期发现结肠癌的检查方法，进行的有例如灌肠检查、结肠镜 (colonoscopic)检查等。灌肠检查是如下检查向大肠中注入钡使其附着于大肠的粘膜 面，照射X射线拍摄该表面的凹凸，观察大肠的表面。另一方面，结肠镜检查是通过内窥镜 直接观察大肠内部的检查。特别是结肠镜检查的灵敏度和特异性高，还具有能够同时切除 息肉和早期癌的优点。然而，这些检查方法存在成本高、给受试者带来的负担大、伴随并发症的风险的问 题。例如，灌肠检查中存在X射线暴露和肠梗阻的危险性。另外，结肠镜检查由于将内窥镜 直接插入大肠内因此具有侵入性。进而，需要内窥镜操作熟练，能够检查的设施有限。因此， 这些检查方法不适于定期体检等以无症状的普通人为对象的结肠癌检查。近年来，作为结肠癌的一次筛查方法，正广泛实施一种非侵入性且低成本的粪便 潜血检查。粪便潜血检查是调查粪便中所含的红细胞来源的血红蛋白的有无的检查，是间 接预测结肠癌的存在的方法。作为粪便潜血检查被广泛利用的主要原因，可列举出可在常 温下进行粪便的采集和保存，不需要冷藏和冷冻等特殊的保存条件；以及，可以在普通家庭 简单地进行；操作非常简便。但是，在粪便潜血检查中，存在灵敏度低至25%左右、漏检结 肠癌的概率高的问题。进而，阳性命中率也低，粪便潜血检查为阳性的受试者中实际为结肠 癌患者的比例为10%以下，包括很多假阳性。因此，强烈期望开发可靠性更高的新型检查方 法。作为适于定期体检等的、非侵入性、简便、且可靠性高的新型检查方法，调查粪便 中有无癌细胞或有无癌细胞来源的基因的检查受到瞩目。这些检查方法由于直接调查有无 癌细胞或癌细胞来源的基因，因此可以期待，与调查有无产生伴随结肠癌的患病间接产生的消化道出血的粪便潜血检查法相比，该检查方法可靠性更高。为了以高精度检测粪便中的癌细胞等，有效地回收粪便中的癌细胞来源的核酸很 重要。特别是，由于粪便中的癌细胞来源的核酸为微量，且粪便中含有大量消化残留物和细 菌，因此核酸非常容易被分解。因此，为了有效地从粪便试样回收核酸、特别是人等哺乳细 胞来源的核酸，重要的是调制粪便试样以防止粪便中核酸的分解并且能够稳定地保存至检 查操作时为止。作为这种粪便试样的调制方法，例如有从采集的粪便中分离从大肠等消化 道脱落的癌细胞的方法。通过从粪便中分离癌细胞，可以抑制细菌等来源的蛋白酶、DNase、 RNase等分解酶造成的影响。作为从粪便中分离癌细胞的方法，例如公开了(1) 一种从粪 便中分离细胞的方法，其特征在于，其包括以下工序a)将粪便冷却至低于其凝胶凝固点 (gel freezing point)的温度；b)维持粪便温度低于其凝胶凝固点以使得粪便实质上保持 完好的状态的同时从粪便中采集细胞(例如参照专利文献1。)。另外，公开了 O)以下方 法在通常周围温度下将粪便分散到含有蛋白酶抑制物质、粘液溶解剂和杀菌剂的运输培 养基中，然后分离从大肠脱落的细胞(例如参照专利文献2。)。另一方面，在组织学及细胞学上观察细胞的形态的情况下，为了使采集的细胞形 态维持到观察时为止，以往一直实行福尔马林固定、醇固定等多种固定方法。所述方法为应 用这些固定方法的方法，作为能够进行哺乳细胞试样的长期保存及保存后的细胞观察的保 存溶液，公开了例如(3)细胞溶液保存剂，其含有足以固定哺乳细胞的量的能与水混合的 醇；足以防止溶液中哺乳细胞凝集的量的抗凝剂；保存细胞的期间将溶液的PH保持在4 7的范围的缓冲剂(例如参照专利文献3。)。另外，作为不仅能够进行细胞的组织学及细胞学观察、还能够对保存后的细胞中 的蛋白质和核酸等进行分子学分析的保存溶液，例如公开了 (4)含有缓冲成分、至少1种 醇成分、固定剂成分、以及抑制由RNA、DNA及蛋白质组成的组中的至少1种物质分解的药 剂的普通采集培养基(例如参照专利文献4。)；以及( 含有5 20%聚乙二醇及80 95%甲醇的非水溶液(例如参照专利文献5。)等。此外，公开了 (6) —种使细胞的结构 及核酸稳定的组合物，所述组合物含有(a)含有至少1种醇或酮的、能够使蛋白质沉淀或变 性的第1物质；和(b)促进第1物质注入到至少1个细胞中的第2促进物质(例如参照专 利文献6。)；以及(7) —种固定液组合物，其特征在于，其是用于保存组织及生物学样品的 固定液组合物，其含有一种以上的醇、具有200 600的分子量的聚乙二醇、每1升固定液 组合物以0. 01 0. 10摩尔浓度混合的一种以上的弱有机酸、以及水，该固定液组合物本质 上不含甲醛等交联结合剂(例如参照专利文献7。)。现有技术文献专利文献专利文献1专利文献2专利文献3专利文献4专利文献5专利文献6专利文献7日本特表平11-511982号公报 日本特表2004-519202号公报 日本特开2003-153688号公报 日本特表2004-500897号公报 日本特表2005-5328 号公报 日本特开2001-128662号公报 日本特表2008-502913号公报

发明内容
发明要解决的问题在上述(1)的方法中，一边将粪便试样冷却一边分离细胞。如果在不冷却的情况 下进行该分离操作，则由于粪便试样的变质等而无法得到准确的检测结果。因此，为了有效 地防止粪便试样的变质，在采集粪便后迅速进行冷却很重要。然而，在如诊察等那样在家庭 中进行粪便采集的情况下，采集后迅速将粪便试样冷却非常困难，无法实现。另外，为了防止粪便试样的变质而考虑到将粪便试样冷冻，但在检查前必须使冷 冻的粪便试样融解，因此操作变得繁杂。在上述O)的方法中，通过添加杀菌剂等，从而不需要进行冷却操作就能够在室 温下调制和保存粪便试样，但存在从粪便中分离大肠脱落细胞的操作繁杂的问题。另外， 被杀菌剂等破坏的细菌来源的核酸分解酶、蛋白分解酶会导致从大肠脱落的细胞及从大肠 脱落的细胞来源的核酸等分解，因此，结肠癌检测的精度可能降低。此外，由于在细胞存活 的状态下对其进行保存，因此还存在如下问题从大肠脱落的细胞中的基因表达等分子谱 (molecular profiling)受到培养基中的抗生素等成分或经时的影响而发生变化。另一方面，通过使用上述(3) (5)的保存溶液，能够在室温下稳定地保存细胞。 然而，这些保存溶液基本上是对于分离后的细胞而使用的，难以直接用于粪便那样的含有 多种物质的生物试样。此外，上述(6)的组合物主要用于稳定地保存阴道拭子试样中的、主 要来源于细菌的核酸。关于上述(6)的组合物是否是也能够稳定地保存具有与细菌大不相 同的结构且远比细菌微量的哺乳细胞来源的核酸的组合物未作任何记载。此外，关于将上 述(6)的组合物用于与阴道拭子试样不同的含有大量消化残留物等的粪便的情况下是否 也能够稳定地保存核酸也未作任何记载。同样地，上述(7)的组合物是对于标本等杂质非 常少的试样用作固定液的组合物，关于用于含有很多消化残留物等的粪便的情况下是否也 能够稳定地保存核酸未作任何记载。本发明的目的在于，提供一种无需繁杂的操作调制能够稳定地保存粪便中的核酸 的粪便试样的方法、用于该调制方法的粪便试样调制用溶液及粪便采集用试剂盒、以及使 用通过该调制方法调制得到的粪便试样来回收并分析粪便中的核酸的方法。用于解决问题的方案为了解决上述问题，通过实现以下内容，从而完成了本发明。I.通过在以含有有机酸的水溶性有机溶剂作为有效成分的粪便试样调制用溶液 中混合所采集的粪便，从而能调制能够稳定地保存粪便中所含的核酸的粪便试样；以及，II.通过从利用该调制方法调制得到的粪便试样中同时回收作为检测对象的哺乳 细胞等常居肠细菌以外的生物来源的核酸和粪便中大量含有的常居肠细菌来源的核酸，从 而也能够非常有效地回收微量的常居肠细菌以外的生物来源的核酸。即，本发明为(1) 一种粪便试样的调制方法，其将所采集的粪便与粪便试样调制用溶液混合。(2)此外，本发明为一种粪便试样调制用溶液，其用于混合所采集的粪便，且以含 有有机酸的水溶性有机溶剂作为有效成分。(3)上述( 所述的粪便试样调制用溶液还可以具有缓冲作用。
(4)上述( 或( 所述的粪便试样调制用溶液中所含的上述水溶性有机溶剂可 以为选自由水溶性醇、酮类及醛类组成的组中的1种以上。(5)上述⑵ (4)中任一项所述的粪便试样调制用溶液的pH可以为2 6. 5。(6)上述(5)所述的粪便试样调制用溶液的pH可以为3 6。(7)上述( (6)中任一项所述的粪便试样调制用溶液中所含的上述有机酸可 以为选自由直链脂肪酸、二羧酸、氨基酸、羟基酸、及芳香族或杂环的多元羧酸组成的组中 的1种以上。(8)上述(7)所述的粪便试样调制用溶液中所含的上述有机酸可以为选自由乙 酸、乳酸、柠檬酸、及己二酸组成的组中的1种以上。(9)上述(6) ⑶中任一项所述的粪便试样调制用溶液的pH可以为4. 5 5. 5。(10)上述O) (9)中任一项所述的粪便试样调制用溶液的有机酸浓度可以为 0. 01 0. IM0(11)上述(4) (10)中任一项所述的粪便试样调制用溶液中所含的上述水溶性 有机溶剂为水溶性醇和/或酮类，其水溶性有机溶剂的浓度可以为30%以上。(12)上述(11)所述的粪便试样调制用溶液中所含的上述水溶性有机溶剂可以含 有选自由乙醇、丙醇、及甲醇组成的组中的1种以上作为水溶性醇。(13)上述(11)所述的粪便试样调制用溶液中所含的上述水溶性有机溶剂可以为 乙醇。(14)上述(11)或(1 所述的粪便试样调制用溶液中所含的上述水溶性有机溶剂 可以含有丙酮和/或甲乙酮作为酮类。(15)上述(4) (10)中任一项所述的粪便试样调制用溶液中所含的上述水溶性 有机溶剂为醛类，该水溶性有机溶剂的浓度为0. 01 30%。(16)上述( (15)中任一项所述的粪便试样调制用溶液中，关于上述粪便与上 述粪便试样调制用溶液的混合比率，相对于粪便体积1，粪便试样调制用溶液体积可以为1 以上。(17)上述( (16)中任一项所述的粪便试样调制用溶液还可以含有表面活性 剂。(18)上述(2) (17)中任一项所述的粪便试样调制用溶液还可以含有着色剂。(19)上述( (18)中任一项所述的粪便试样调制用溶液中的上述水溶性有机 溶剂的浓度可以为30%以上。(20)此外，本发明为一种粪便采集用试剂盒，其包含以含有有机酸的水溶性有机 溶剂作为有效成分的粪便试样调制用溶液、和含有该粪便试样调制用溶液的粪便采集容
ο(21)上述00)所述的粪便采集用试剂盒中所含的上述粪便试样调制用溶液中的 含有有机酸的水溶性有机溶剂的浓度可以为30%以上。(22)此外，本发明为一种粪便试样，其使用上述(2) (19)中任一项所述的粪便 试样调制用溶液调制而成。(23)此外，本发明为一种从粪便试样中回收核酸的方法，其从上述0 所述的粪 便试样中同时回收常居肠细菌来源的核酸和常居肠细菌以外的生物来源的核酸。
(24)上述所述的核酸回收方法中，上述常居肠细菌以外的生物来源的核酸 可以为哺乳细胞来源的核酸。(25)上述03)或04)所述的核酸回收方法中的回收核酸的工序可以包括以下工 序(a)使上述粪便试样中的蛋白质变性，并使核酸从上述粪便试样中的常居肠细菌及常 居肠细菌以外的生物中溶出；(b)回收上述工序(a)中溶出的核酸的工序。(26)上述0 所述的核酸回收方法中，在上述工序(a)之后、上述工序(b)之前， 可以包括(c)除去通过上述工序(a)而变性的蛋白质的工序。(27)上述05)或06)所述的核酸回收方法中的上述工序(a)中的蛋白质的变性 可以使用选自由离液序列高的盐、有机溶剂、及表面活性剂组成的组中的1种以上来进行。(28)上述(XT)所述的核酸回收方法中使用的上述有机溶剂可以为酚类。(29)上述06) 08)中任一项所述的核酸回收方法中的上述工序(c)中的变性 的蛋白质的除去可以使用氯仿来进行。(30)上述05) 09)中任一项所述的核酸回收方法中的上述工序(b)中的核酸 的回收可以包括以下工序(bl)使上述工序(a)中溶出的核酸吸附到无机支撑体上；以及 (b2)使上述工序(bl)中吸附的核酸从无机支撑体中溶出。(31)上述05) (30)中任一项所述的核酸回收方法中，上述工序(a)之前，可以 包括(d)从上述粪便试样中回收固体成分的工序。(32)此外，本发明使用由上述03) (31)中任一项所述的核酸回收方法回收的 核酸，分析哺乳细胞来源的核酸。(33)上述(32)所述的核酸分析方法中所用的上述哺乳细胞可以为消化道细胞。(34)上述(3 所述的核酸分析方法中所用的上述哺乳细胞可以为从大肠脱落的 细胞。(35)上述(3 (34)所述的核酸分析方法中所用的上述哺乳细胞来源的核酸可 以为指示致瘤性转化的标记物。(36)上述(3 (34)中任一项所述的核酸分析方法中所用的上述哺乳细胞来源 的核酸可以为指示炎症性消化器官疾病的标记物。(37)上述(32) (36)中任一项所述的核酸分析方法可以为RNA分析和/或DNA 分析。(38)上述(37)所述的核酸分析方法中，上述RNA分析可以是RNA上的碱基的插 入、缺失、置换、重复、倒置、或剪接变体的分析、mRNA表达分析、及功能性RNA分析中的任意 1种以上。(39)上述(37)所述的核酸分析方法中，上述DNA分析可以是突变分析及表观遗传 学(印igenetics)变化分析中的任意1种以上。(40)上述(39)所述的核酸分析方法中，上述突变分析可以是碱基的插入、缺失、 置换、重复、或倒置中的任意1种以上突变的分析。(41)上述(39)所述的核酸分析方法中，上述表观遗传学变化分析可以是DNA的甲 基化分析及DNA的脱甲基化分析中的任意1种以上。(42)上述(39)所述的核酸分析方法中，上述突变分析可以是K-ras基因的突变分 析。
发明的效果本发明的粪便试样调制用溶液，粪便试样中所含的核酸的保存性优异，以含有有 机酸的水溶性有机溶剂作为有效成分。通过将粪便与含有有机酸的水溶性有机溶剂混合， 从而将粪便中所含的核酸的分解等所致的损失抑制到最小限度，能够在该水溶性有机溶剂 中非常稳定地保存核酸。这样高的核酸保存效果通过水溶性有机溶剂成分所具有的脱水作 用，通过使常居肠细菌、哺乳细胞、病毒等具有核酸的生物的细胞活性显著降低，从而抑制 核酸的经时变化。此外可以推测，本发明的粪便试样调制用溶液的高核酸保存效果通过水 溶性有机溶剂成分所具有的蛋白质变性作用，从而使得粪便中的蛋白酶、DNaSe、RNaSe等各 种分解酶的活性显著降低，抑制核酸的分解。进而，本发明的粪便试样调制用溶液由于以含 有有机酸的水溶性有机溶剂作为有效成分，因此能够将粪便试样调制用溶液保持为酸性。 因此，能够进一步提高水溶性有机溶剂成分的蛋白质变性作用。进而，由于还能够有效抑制 核酸的水解等，因此推测可获得非常优异的核酸高保存效果。此外，通过本发明的粪便试样的调制方法，可以调制能够稳定地保存粪便中的核 酸的粪便试样。即，通过本发明的粪便试样的调制方法，也能够以能在室温下长期保存的程 度稳定地维持粪便试样中所含的比较少量的哺乳细胞等常居肠细菌以外的生物来源的核 酸。这样，通过采用本发明的粪便试样的调制方法，能够在稳定地保存粪便试样中的核酸的 同时在室温下简便地进行从粪便的采集到粪便试样的调制、保存、输送，因此非常适合于用 于健康检查等筛查的粪便试样的调制。进而，即使在调制粪便试样以用于分析哺乳细胞等 常居肠细菌以外的生物来源的核酸时，也无需从粪便试样中分离哺乳细胞等作为检测对象 的生物或其细胞等的繁杂的操作，因此，即使在处理很多检查体时，也能够有效降低劳力和 成本。特别是通过使用本发明的粪便采集用试剂盒，能够更简便地调制粪便试样。


图1是表示可以用于本发明的粪便采集用试剂盒的粪便采集容器A的一个实施方 式的图。图2是表示可以用于本发明的粪便采集用试剂盒的粪便采集容器B的一个实施方 式和其使用方法的一个例子的图。图3是表示实施例1中各粪便试样来源的RNA中的GAPDH基因的表达量的相对比 较结果的图。图4是表示实施例2中粪便试样2-1 2-3及5_1来源的RNA中的GAPDH基因的 表达量的相对比较结果的图。图5是表示实施例2中粪便试样3-1 3-3及5_1来源的RNA中的GAPDH基因的 表达量的相对比较结果的图。图6是表示实施例2中粪便试样4-1 4-3及5_1来源的RNA中的GAPDH基因的 表达量的相对比较结果的图。图7是表示参考例1中从各粪便试样回收的RNA量的图。图8是表示参考例3中从使用各浓度的乙醇溶液所调制的粪便试样回收的RNA量 的图。附图标记说明
1...容器本体、
la...隆起部、
2...ΓΤΠ、
3...粪便采集棒、
3a...杯、
S...粪便试样调制用溶液、
11...容器本体、
12.. ΓΤΠ、
13...粪便采集棒、
13a.··孔、
13b. ·可动盖、
15.. 袋、
Ε...粪便
具体实施例方式本发明的粪便试样的调制方法中使用的粪便试样调制用溶液(以下简称为调制 用溶液幻、即本发明的调制用溶液S以含有有机酸的水溶性有机溶剂作为有效成分。粪便 等生物试样通常含有大量的水分，以对水的溶解度高的溶剂或能与水以任意的比例混合的 水溶性有机溶剂作为有效成分。由此，本发明的调制用溶液S可与粪便试样迅速混合，可获 得更高的核酸高保存效果。本发明中水溶性有机溶剂包括醇类、酮类、或醛类。另外，上述水溶性有机溶剂具 有直链结构，在室温附近例如15 40°C下为液态。通过以具有直链结构的水溶性有机溶剂 作为有效成分，与以具有苯环等环状结构的有机溶剂作为有效成分相比，能够迅速地进行 与粪便的混合。具有环状结构的有机溶剂通常容易与水分离，因此不易与粪便混合，难以获 得高的核酸保存效果。即使是在水中溶解一定程度的溶剂，为了使粪便均勻分散，也需要剧 烈混合、或者加温。另外还考虑到，为了易于将粪便与具有环状结构的有机溶剂混合，预先 制作有机溶剂与水的混合溶液后，再将粪便与上述混合溶液混合。然而，为了制作上述混合 溶液，需要将具有环状结构的有机溶剂与水剧烈混合、或者加温，因此不优选。本发明的调制用溶液S优选为对水的溶解度为12重量％以上的水溶性有机溶剂， 更优选上述溶解度为20重量％以上的水溶性有机溶剂，进一步优选上述溶解度为90重 量％以上的水溶性有机溶剂，特别优选能够与水以任意的比例混合的水溶性有机溶剂。作 为能够与水以任意的比例混合的水溶性有机溶剂，例如有甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、丙 酮、甲醛等。本发明的调制用溶液S中所含的水溶性有机溶剂只要是满足上述定义、且发挥较 高核酸保存效果的溶剂，则没有特别限制。作为上述水溶性有机溶剂，例如作为醇类，有水 溶性醇即甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、巯基乙醇等。作为酮类，有丙酮、甲乙酮(对水的溶解度 为90重量％)等，作为醛类，有乙醛(acetylaldehyde)、甲醛(福尔马林)、戊二醛、低聚甲 醛、乙二醛(glyoxal)等。丙醇可以是正丙醇，也可以是2-丙醇。此外，丁醇可以是1_ 丁 醇(对水的溶解度为20重量％)，也可以是2-丁醇(对水的溶解度为12. 5重量％)。作为本发明中所用的水溶性有机溶剂，水溶性醇、丙酮、甲乙酮、甲醛由于对水的溶解度充分 高而优选。从获得容易性、处理性、安全性等方面出发，更优选水溶性醇，进一步优选乙醇、 丙醇、甲醇。特别是乙醇由于安全性最高，在家庭内也容易处理，因此在定期体检等筛查中 特别有用。本发明的调制用溶液S中的水溶性有机溶剂的浓度只要是可发挥高核酸保存效 果的浓度，则没有特别限制，可以考虑水溶性有机溶剂的种类等而适当决定。例如，使用 水溶性醇或酮类作为有效成分时，本发明的调制用溶液S的水溶性有机溶剂的浓度优选为 30%以上。通过使水溶性有机溶剂的浓度为充分高浓度，从而在将粪便与调制用溶液S混 合时，能够使水溶性有机溶剂成分迅速渗透到粪便中的哺乳细胞等或常居肠细菌中，迅速 发挥高核酸保存效果。另外，本发明及本申请说明书中，只要没有特别记载，“ %，，表示“体积％ ”。特别是使用水溶性醇作为有效成分时，本发明的调制用溶液S的水溶性有机溶剂 的浓度优选为30%以上，更优选为50%以上，进一步优选为50 80%的范围，特别优选为 60 70%的范围。水溶性有机溶剂的浓度越高，对于水分含量多的粪便，也能够通过使用 少量的调制用溶液S，充分获得高核酸保存效果。此外，使用丙酮、甲乙酮作为有效成分时，本发明的调制用溶液S的水溶性有机溶 剂的浓度优选为30%以上，更优选为60%以上，进一步优选为80%以上。此外，使用乙醛、 甲醛、戊二醛、低聚甲醛、乙二醛作为有效成分时，本发明的调制用溶液S的水溶性有机溶 剂的浓度优选为0. 01 30%的范围，更优选为0. 03 10%的范围，进一步优选为3 5% 的范围。醛类与醇类或酮类相比即使为低浓度，也能发挥高核酸保存效果。此外，本发明中使用的水溶性有机溶剂可以仅含有1种水溶性有机溶剂，也可以 是2种以上的水溶性有机溶剂的混合溶液。例如，可以是2种以上醇的混合溶液，也可以是 醇与其他种类的水溶性有机溶剂的混合溶液。为了进一步改善核酸保存效率，优选醇与丙 酮的混合溶液。作为本发明中使用的有机酸，例如有直链脂肪酸、二羧酸、氨基酸、羟基酸、芳香族 或杂环的多元羧酸等。更具体而言，可列举出甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等直链脂肪酸；草 酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、富马酸、马来酸、邻苯二甲酸、问苯二甲酸、对苯二甲酸 等二羧酸；甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、 胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸等氨基酸；乙醇酸、乳酸、羟基丙烯酸、α-羟基丁 酸、甘油酸、丙醇二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、水杨酸、没食子酸、扁桃酸、托品酸、抗坏血 酸、葡萄糖酸等羟基酸；肉桂酸、苯甲酸、苯基乙酸、烟酸、红藻氨酸、山梨酸、吡咯烷酮羧酸、 偏苯三酸等芳香族或杂环的多元羧酸等。作为本发明的调制用溶液S中添加的有机酸，特别优选直链脂肪酸、二羧酸、羟基 酸等，更优选乙酸、己二酸、柠檬酸、乳酸。通过使用己二酸或柠檬酸，能够获得特别优异的 核酸保存效果。此外，乙酸除了能够获得充分的核酸保存效果以外，还通用且经济，因此特 别优选。另外，本发明的调制用溶液S可以仅含有1种有机酸，也可以含有2种以上的有机 酸。此外，本发明的调制用溶液S中添加的有机酸的量只要是能够将上述调制用溶液S维 持在酸性的量，则没有特别限制，可以考虑所添加的有机酸的种类、上述调制用溶液S中的水溶性有机溶剂的种类和浓度等适当决定。本发明的调制用溶液S的PH优选为酸性。这是由于能够更有效地抑制核酸的水 解。作为本发明的调制用溶液S，PH优选为2 6. 5的范围，更优选为3 6的范围，进一 步优选为4. 5 5. 5的范围。本发明的调制用溶液S即使在添加了一些酸或碱的情况下，特别是在添加了粪便 的情况下，PH的变动也少，优选为具有维持在前述PH范围内那样的缓冲作用的调制用溶液 S。作为具有缓冲作用的调制用溶液S，可以是在适当的缓冲液中添加有机酸和水溶性有机 溶剂而得到的溶液，但本发明中，特别优选为含有有机酸和该有机酸的共轭碱的调制用溶 液S，其通过上述有机酸和其共轭碱而发挥缓冲作用。例如，可以通过在调制用溶液S中添 加有机酸和该有机酸的碱金属盐、或碱土金属盐，调节至所期望的PH。此外，也可以在添加 有机酸后，用碱金属或碱土金属的氢氧化物来调节PH。此外，作为本发明的调制用溶液S，也可以是含有有机酸和无机酸这两者的溶液， 其具有适当的缓冲作用。例如可以是在甘氨酸/HCl缓冲体系、二甲次胂酸Na/HCl缓冲体 系、或邻苯二甲酸HK/HC1缓冲体系等在酸性侧具有缓冲作用的缓冲体系中混合水溶性有 机溶剂而得到的溶液。因此，本发明中，调制用溶液S中的有机酸浓度优选为能充分发挥缓冲作用的浓 度。例如，通过添加有机酸使得调制用溶液S中有机酸的最终浓度为0. OlM 0. 1M，能够具 备充分的缓冲作用。另外，本发明中，调制用溶液S的pH是将以玻璃电极法为测定原理的pH计(例如 东亚〒人一 V — ’一公司制造)通过邻苯二甲酸盐标准液和中性磷酸盐标准液校正后测 定得到的值。与采集的粪便混合的调制用溶液S的体积没有特别限定，关于粪便与调制用溶液 S的混合比率，设粪便体积为1时，相对于粪便体积1，调制用溶液S体积优选为1以上。在 装有调制用溶液S的粪便采集容器中加入粪便的情况下，只要是与粪便同等量以上的调制 用溶液S，就可将粪便完全浸渍到调制用溶液S中，因此可获得本发明的效果。例如在粪便 与调制用溶液S为同等量的情况下，能够实现装有调制用溶液S的粪便采集容器的轻量化 和小型化。另一方面，通过相对于粪便混合5倍以上体积的调制用溶液S，能够迅速且有效 地进行粪便在调制用溶液S中的分散，进而，还能够抑制粪便中含有的水分导致的水溶性 醇浓度的降低对粪便的影响。由于能够在装有调制用溶液S的粪便采集容器的轻量化和粪 便的分散性的提高这两个效果方面取得良好的平衡，因此粪便与调制用溶液S的混合比率 更优选为1 1 1 20的范围，进一步优选为1 3 1 10的范围，更优选为1 5 左右ο另外，用于本发明的粪便试样的调制方法的粪便只要是来源于动物，则没有特别 限定，优选来源于哺乳动物，更优选来源于人。例如，优选为了定期体检、诊断等而采集的人 的粪便，但也可以是家畜、野生动物等的粪便。另外，可以是采集后保存了一定时间的粪便， 但优选刚采集后的粪便。进而，采集的粪便优选刚排泄后的粪便，但也可以是排泄后经过一 段时间的粪便。供于本发明的粪便试样的调制方法的粪便的量没有特别限定，优选为IOmg Ig 的范围。如果粪便量过多的话，则采集操作费事，粪便采集容器也变大，因此处理性等可能降低。相反，粪便量过度减少时，粪便中所含的从大肠脱落的细胞等哺乳细胞数量过少，因 此无法回收所需的核酸量，目标核酸分析的精度可能降低。另外，由于粪便是不均质的，即 各种各样的成分不均勻地存在，因此为了避免哺乳细胞存在于局部的影响，优选在采集粪 便时从粪便的不同部位采集。调制用溶液S可以通过将水溶性有机溶剂适当稀释并调节至所期望的浓度后添 加适当量的有机酸而获得。用于稀释的溶剂没有特别限定，但优选为水或磷酸缓冲液等缓 冲液。例如，通过利用水将水溶性有机溶剂适当稀释后，添加充分量的有机酸，再用氢氧化 钠等碱金属或碱土金属的氢氧化物溶液调节至所期望的PH，可以获得具有优选的缓冲作用 的调制用溶液S。此外，本发明的调制用溶液S中，只要不损害水溶性有机溶剂成分所带来的高核 酸保存效果，则除了有机酸和水溶性有机溶剂以外，可以含有任意的成分。例如可以含有离 液序列高的盐，也可以含有表面活性剂。通过含有离液序列高的盐或表面活性剂，能够更有 效地抑制粪便中的细胞活性和各种分解酶的酶活性。作为调制用溶液S中能够添加的离液 序列高的盐，例如有盐酸胍、胍异硫氰酸酯、碘化钠、高氯酸钠及三氯乙酸钠等。作为调制用 溶液S中能够添加的表面活性剂，优选非离子性表面活性剂。作为上述非离子性表面活性剂，例如有吐温80、CHAPS(3-[3_胆酰胺丙基二甲氨 基]-1-丙磺酸内盐)、Triton X-100、吐温20等。离液序列高的盐、表面活性剂的种类、浓 度只要是可获得较高核酸保存效果的浓度，则没有特别限定，可以考虑粪便量、之后的核酸 回收和分析方法等适当决定。 此外，调制用溶液S中也可以适当添加着色剂。通过将调制用溶液S着色，能够获 得防止误吞、减轻粪便颜色等效果。作为上述着色剂，优选用作食品添加剂的着色料，优选 为蓝色、绿色等。例如，可列举出坚牢绿FCF (Green No. 3)、亮蓝FCF (Blue No. 1)、靛蓝胭脂 红(Blue No. 2)等。另外，可以混合添加多种着色剂，也可以单独添加。优选快速地进行粪便与调制用溶液S的混合。通过将粪便快速地分散到调制用溶 液S中，从而能够迅速地进行水溶性有机溶剂成分对粪便中的细胞的渗透，能够快速地获 得较高的核酸保存效果。另外，将粪便与调制用溶液S混合的方法只要是采用物理手法进行混合的方法， 则没有特别限定。例如，可以通过向预先装有调制用溶液S的能够密闭的容器中投入采集 的粪便，密闭后，将该容器上下颠倒而进行混合，也可以通过将上述容器置于旋涡混合器等 震荡机上进行混合。此外，也可以将粪便与调制用溶液S在混合用颗粒的存在下进行混合。该混合方法由于能够快速进行混合，因此优选使用震荡机的方法、使用混合用颗 粒的方法。特别是通过使用预先含有混合用颗粒的粪便采集容器，从而在家庭等没有特殊 装置的环境中也能够迅速混合。作为混合用颗粒，只要是不损害水溶性有机溶剂成分所带来的较高的核酸保存效 果的组合物，并且具有通过与粪便碰撞能够将粪便迅速分散到调制用溶液S中的硬度和比 重的颗粒，则没有特别限定。进而，混合用颗粒可以是由1种材质形成的颗粒，也可以是由2 种以上的材质形成的颗粒。作为这样的混合用颗粒，例如有由玻璃、陶瓷、塑料、胶乳、金属 等形成的颗粒。此外，混合用颗粒可以为磁性颗粒，也可以为非磁性颗粒。以常居肠细菌以外的生物来源的核酸、即与粪便试样中大量含有的常居肠细菌来源的核酸相比仅少量含有的核酸为靶核酸进行分析时，优选使用本发明的调制用溶液S来 调制粪便。排泄后，随着时间的经过粪便中的核酸由于分解等而慢慢损失。因此，靶核酸为 粪便中仅少量存在的核酸时，如果使用核酸不断分解的粪便试样进行分析，则无法回收对 于分析而言充分的量的靶核酸。其结果是，即使在刚排泄后的粪便中存在靶核酸时，也可能 被判断为阴性(粪便中不存在该靶核酸)。通过使用本发明的调制用溶液S来调制粪便，从 而能够稳定地保存粪便中的核酸，因此即使粪便中仅存在少量的核酸，也能够有效地回收。 由此能够提高核酸分析的可靠性。作为这样的常居肠细菌以外的生物来源的核酸，例如有癌细胞来源的核酸等哺乳 细胞来源的核酸、肝炎病毒等感染症的初期或后期的这些感染症的致病菌来源的核酸等。 此外，也可以是寄生虫来源的核酸。另外，本发明中，常居肠细菌是粪便中比较大量存在的细菌细胞，意味着通常栖 息在人等动物的肠内的常居菌。作为该常居肠细菌，例如有拟杆菌属(Bacteroides)、真 杆菌属(Eubacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium) 等专性厌氧菌，埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属 (Klebsiella)、柠檬酸杆菌属(CitrcAacter)、肠球菌属(Enterococcus)等兼性厌氧菌等。此外，只要存在充分量的水溶性有机溶剂，则这样的水溶性有机溶剂成分带来的 较高的核酸保存效果不会特别地受到温度条件的影响。因此，本发明的粪便试样的调制方 法中，即使在通常进行粪便采集的温度下进行调制、即在室温下进行时，也能够抑制粪便中 的核酸的损失而保存核酸。此外，所调制的粪便试样，即使在室温下进行保存或输送时，也 能够稳定地保存该粪便试样中的核酸。但是，该粪便试样的保存温度优选为50°C以下。通 过在高温条件下长期保存，可能会导致粪便试样中的水溶性有机溶剂的浓度由于挥发等而 降低至低于对于发挥较高的核酸保存效果而言充分的浓度。通过本发明的粪便试样的调制方法调制的粪便试样、即本发明的粪便试样，通过 含有有机酸的水溶性有机溶剂的脱水作用、蛋白质变性作用、核酸分解抑制作用，能够更稳 定地保存粪便中的核酸、特别是哺乳细胞等来源的在粪便中仅以较少量存在的核酸。因此， 通过本发明的调制方法调制粪便试样时，不仅刚调制后的粪便试样能够期待获得可靠性高 的分析结果，即使使用长期保存后或输送后的粪便试样进行核酸分析时，也能够期待获得 可靠性高的分析结果。特别是能够将粪便中所含的从大肠脱落的细胞等哺乳细胞的分子谱 的经时性的变化抑制到最小限度，而且能够长期在室温下稳定地保存粪便中的核酸、特别 是哺乳细胞来源的核酸。因此，通过使用本发明的调制方法来调制采集的粪便，从而即使在 像诊察等筛查那样的、从粪便采集后到核酸分析时存在间隔的情况以及粪便采集场所远离 核酸分析场所的情况下，也能够在抑制核酸、特别是容易损坏的RNA分解的同时，保存或输 送粪便试样。另外，无需用于冷藏、冷冻的特别的设备、也无需设定保存温度条件，能够简便 且以低成本保存或输送粪便试样。本发明的粪便试样与含有核酸的其他生物试样同样能够应用于各种核酸分析。特 别优选用于核酸分析以调查是否患有早期发现很重要的癌症或有无罹患感染症。另外，还 优选用于核酸分析以调查有无结肠炎、肠炎、胃炎、胰腺炎等炎症性疾病的发病。此外，还可 以用于息肉等隆起性病变的检查、胃溃疡等大肠、小肠、胃、肝脏、胆囊、胆管的疾病的检查。例如，通过从粪便试样检测并分析癌细胞来源的核酸、即发生突变等的核酸，从而能够检查有无结肠癌、胰腺癌等癌症的发病。另外，通过从粪便试样中检测感染症等的原因 即病原菌来源的核酸、例如病毒来源的核酸或寄生虫来源的核酸等，能够调查有无感染症 的罹患、有无寄生虫的存在。特别是通过利用粪便试样来检测甲型、戊型肝炎病毒等排出到 粪便中的病原菌，能够非侵入性且简便地进行感染症检查。此外，通过检测常居肠细菌以外 的病原细菌、例如肠道出血性大肠杆菌0-157等引起食物中毒的菌类、病原菌来源的核酸， 能够调查有无罹患细菌感染症。特别优选通过核酸分析来检测指示致瘤性转化的标记物、指示炎症性消化器官疾 病的标记物。作为指示致瘤性转化的标记物，例如有癌胚抗原(CEA)、唾液酸Tn抗原(STN) 等公知的癌标记物，APC基因、p53基因、K-ras基因等中有无突变等。另外，pl6、hMLHI、 MGMT、pl4、APC、E-cadherin, ESRl、SFRP2等基因的甲基化的检测作为结肠疾病的诊断标记 物也是有用的(例如，参照 Lind et al.、“A CpG island hypermethylationprofile of primary colorectal carcinomas andcolon cancer celllines'^Molecular Cancer>2004 年、第3卷第观章。)。此外，已经报道了粪便试样中的幽门螺杆菌来源的DNA被用作胃 癌标记物(例如参照 Nilsson et al. ,Journal of ClinicalMicrobiology、2004 年、第 42 卷第8号、第3781 8页。)。另一方面，作为指示炎症性消化器官疾病的标记物，例如有 Cox-2基因来源核酸等。从通过本发明的调制方法调制的粪便试样能够非常有效地回收核酸，因此，该试 样不仅非常适合用于粪便中大量存在的常居肠细菌来源的核酸的分析，还非常适合用于微 量存在的哺乳细胞来源的核酸的分析。特别优选由粪便分析大肠、小肠、胃等消化道细胞来 源的核酸，特别优选分析从大肠脱落的细胞来源的核酸。粪便试样中存在多种多样的物质，也存在很多核酸分析中成为干扰因素的物质。 因此，不将粪便试样直接用于分析，而是通过从粪便试样回收核酸，并利用所回收的核酸进 行核酸分析，能够进一步提高分析的精度。从粪便试样回收核酸的方法没有特别限定，只要 是从试样回收核酸时通常采用的方法，则可以通过任意方法进行。本发明的粪便试样中， 主要含有哺乳细胞等常居肠细菌以外的生物(以下，称为哺乳细胞。)来源的核酸、和常居 肠细菌来源的核酸。从粪便试样回收核酸时，可以分别回收哺乳细胞等来源的核酸和常居 肠细菌细胞来源的核酸，但特别优选同时回收。通过同时回收哺乳细胞等来源的核酸和常 居肠细菌来源的核酸，粪便中大量存在的常居肠细菌来源的核酸作为载体发挥功能。其结 果是，与预先从粪便中分离哺乳细胞等后再回收核酸时相比，对于量较少的哺乳细胞等来 源的核酸能够非常有效地回收。并且，通过利用这样回收的核酸进行核酸分析，能够以非常 高灵敏度且高精度检测结肠癌等特定的疾病标记物。另外，从粪便试样回收的核酸可以是 DNA，可以是RNA，也可以是DNA和RNA这两者。例如，作为工序(a)，使本发明的粪便试样中的蛋白质变性，使核酸从上述粪便试 样中的哺乳细胞等及常居肠细菌溶出后，作为工序(b)，通过回收所溶出的核酸，从而同时 从粪便试样回收哺乳细胞来源的核酸和常居肠细菌来源的核酸。工序(a)中的粪便试样中的蛋白质的变性可以通过公知的方法来进行。例如，通 过在粪便试样中添加离液序列高的盐、有机溶剂、表面活性剂等通常用作蛋白质的变性剂 的化合物，能够使粪便试样中的蛋白质变性。在工序(a)中添加到粪便试样中的离液序列 高的盐、表面活性剂可以使用与作为本发明的调制用溶液S中添加的离液序列高的盐及表面活性剂列举的同样的物质。作为有机溶剂，优选为酚类。酚类可以为中性，也可以为酸性。 使用酸性的酚类时，能够将RNA选择性地优先于DNA提取到水层中。另外，工序(a)中在粪 便试样中添加离液序列高的盐、有机溶剂、表面活性剂等时，可以添加1种化合物，也可以 添加2种以上的化合物。在工序(a)与工序(b)之间，可以设置工序(C)以除去通过工序(a)而变性的蛋 白质。通过在回收核酸之前预先除去变性了的蛋白质，能够提高所回收的核酸的品质。工 序(c)中的蛋白质的除去可以通过公知的方法进行。例如，通过离心分离，使变性蛋白质沉 淀并仅回收上清液，能够除去变性蛋白质。此外，添加氯仿，通过旋涡混合器等充分搅拌混 合后进行离心分离，使变性蛋白质沉淀并仅回收上清液。由此，与仅进行离心分离时相比， 能够更完全地除去变性蛋白质。工序(b)中的溶出的核酸的回收可以通过乙醇沉淀法、氯化铯超离心法等公知的 方法进行。作为回收方法的例子，可列举出以下的工序(bl)和工序(b2)。作为工序(bl)， 使工序(a)中溶出的核酸吸附到无机支撑体上。然后，作为工序0^2)，将工序(bl)中吸附 的核酸从无机支撑体上溶出。由此，能够回收核酸。工序(bl)中所用的无机支撑体可以使 用能够吸附核酸的公知的无机支撑体。此外，该无机支撑体的形状也没有特别限定，可以是 颗粒状，也可以是膜状。作为该无机支撑体，例如有硅胶、硅基氧化物(siliceous oxide), 玻璃、硅藻土等含二氧化硅的颗粒(珠子)，尼龙、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、硝基纤维素等的 多孔质膜等。工序( )中所用的溶剂，可以考虑所要回收的核酸的种类、之后的核酸分析方法 等，适当使用通常用于使核酸从这些公知的无机支撑体溶出的溶剂。例如，作为该溶出用溶 剂，特别优选纯化水。另外，优选在工序(bl)之后、工序( )之前，用适当的洗涤缓冲液对 吸附有核酸的无机支撑体进行洗涤。另外，使用含有用于使核酸从哺乳细胞等中溶出的充分浓度的离液序列高的盐、 表面活性剂的调制用溶液S来调制粪便试样时，从粪便试样回收核酸的工序中，也可以省 略工序(a)。使用不含用于使核酸从哺乳细胞等中溶出的充分浓度的离液序列高的盐、表面活 性剂的调制用溶液S来调制粪便试样时，优选在工序(a)之前设置工序(d)，从粪便试样回 收固体成分。对于粪便试样而言，由于将粪便与调制用溶液S迅速混合，粪便中的液体成分 相对于固体成分的比率大。因此，通过从粪便试样中除去调制用溶液S，仅回收含有哺乳细 胞等和常居肠细菌的固体成分，从而能够减小核酸的回收工序及分析的规模(scale)。此 外，通过从固体成分中除去水溶性有机溶剂，还能够抑制从该固体成分中回收核酸的工序 中的水溶性有机溶剂的影响。例如，通过将本发明的粪便试样离心分离，使固体成分沉淀并 除去上清，从而能够仅回收固体成分。此外，通过用过滤器过滤等，也能够仅回收固体成分。 此外，还优选使用PBS(磷酸缓冲生理盐水、pH7. 4)等适当的缓冲液对所回收的固体成分进 行洗涤。另外，可以在所回收的固体成分中直接添加离液序列高的盐等蛋白质变性剂，但 优选暂时悬浮到适当的溶出用药剂中后再添加蛋白质变性剂。回收DNA时，作为溶出用 药剂，例如可以使用磷酸缓冲液、tris缓冲液等。溶出用药剂优选通过高压蒸汽灭菌等使 DNase失活的药剂，进而更优选含有蛋白酶K等蛋白质分解酶的药剂。另一方面，回收RNA时，作为溶出用药剂，例如可以使用柠檬酸缓冲液等，但由于RNA是非常容易分解的物质， 因此优选使用含有硫氰酸胍、盐酸胍等RNase抑制剂的缓冲液。之后的分析方法，也可以不从粪便试样中回收核酸，而使核酸从粪便试样中的哺 乳细胞等、常居肠细菌溶出后，将溶解有核酸的缓冲液直接用于核酸分析。例如，粪便试样 中存在大量病原菌等时，对该病原菌来源的核酸进行分析时，从粪便试样仅回收固体成分 后，添加含有蛋白酶K等蛋白质分解酶的PBS等溶出用药剂而获得粪便试样溶液。通过将 该粪便试样溶液直接用于核酸分析，能够检测病原菌来源的基因等。此外，从粪便试样中回 收核酸也可以使用核酸提取试剂盒、病毒检测试剂盒等市售的试剂盒来进行。从本发明的粪便试样回收的核酸可以采用公知的核酸分析方法进行分析。作为这 些核酸分析方法，例如有对核酸进行定量的方法、使用PCR等检测特定的碱基序列区域的 方法等。例如，通过检测编码癌基因等的碱基序列区域、含有小随体(microsatellite)的 碱基序列区域等有无基因突变，能够调查有无癌症的发病。使用从粪便试样回收的DNA时， 例如可以进行DNA上的突变分析、表观遗传学变化分析。作为突变分析，例如可列举出碱基 的插入、缺失、置换、重复、或倒置的分析等。此外，作为表观遗传学变化分析，例如可列举 出甲基化、脱甲基化的分析等。此外，回收RNA时，通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR: Reverse transcriptase- polymerase chainreaction) ^] cDNA PllUWiM cDNA % DNA 同样地用于分析。使用回收的RNA时，例如可以检测RNA上的碱基的插入、缺失、置换、重 复、倒置、或剪接变体(isoforms)等突变。此外，可以进行功能性RNA(非编码RNA)分析、 例如转运 RNA (transfer RNA, tRNA)、核糖体 RNA (ribosomal RNA, rRNA)、microRNA(miRNA、 小RNA)等的分析。此外，也可以检测并分析RNA表达量。特别优选进行mRNA的表达分析、 K-ras基因的突变分析、及DNA的甲基化的分析等。另外，这些分析可以通过该领域中公知 的方法进行。此外，也可以使用K-ras基因突变分析试剂盒、甲基化检测试剂盒等市售的分 析试剂盒。这样，通过采用本发明的粪便试样的调制方法、从通过该调制方法调制的粪便试 样中回收核酸的方法、及使用通过该核酸回收方法回收的核酸的核酸分析方法，能够以高 灵敏度且高精度分析粪便中的核酸。因此，可以期待贡献及应用于以结肠癌为首的、各种症 状和疾病的早期发现、诊断、治疗经过的观察、及其他异常状态的病理学研究等。本发明通过将粪便采集到预先含有调制用溶液S的粪便采集容器中，能够更简便 且迅速地调制采集的粪便。此外，通过使用具有本发明的调制用溶液S、和含有该调制用溶 液S的粪便采集容器的粪便采集用试剂盒，能够更简便地发挥本发明的效果。另外，该粪便 采集用试剂盒中可以适当具有粪便采集棒等除该调制用溶液S及含有其的粪便采集容器 以外的构成物。本发明中所用的粪便采集容器的形态和大小等没有特别限定，可以使用可含有溶 剂的公知的粪便采集容器。粪便采集容器的盖与粪便采集棒一体化的粪便采集容器由于处 理简便而优选。此外，由于可控制粪便采集量，更优选能够采集一定量的粪便的粪便采集 棒。作为这种公知的粪便采集容器，例如有日本特公平6-72837号公报中公开的粪便采集 容器等。图1及图2是分别表示可以用于本发明的粪便采集用试剂盒的粪便采集容器A和 B的实施方式的图。另外，可以用于本发明的粪便采集用试剂盒的粪便采集容器并不限定于这些粪便采集容器。首先，对图1的粪便采集容器进行说明。本实施方式的粪便采集容器A具有与粪 便采集棒3 —体化的盖2、和容器本体1，容器本体1的内部含有本发明的调制用溶液S。粪 便采集棒3的前端具有能够采集一定量粪便的杯3a，在该杯3a的底部布有网作为筛子。另 一方面，在容器本体1的底部具有与杯3a的形状大致相同、并与杯3a的形状重合的隆起部 la。通过将杯3a嵌合到隆起部Ia中，从而使得杯3a中采集的粪便从杯3a的底部布的网 挤出，所以能够将粪便快速分散到调制用溶液S中。图2中记载的粪便采集容器具有与前端尖锐的粪便采集棒13—体化的盖12、和容 器本体11，是容器本体11内部具有含有调制用溶液S的密封袋15的粪便采集容器B。粪 便采集棒13的前端侧挖有能够采集一定量粪便E的孔13a。此外，粪便采集棒13的两侧部 安装有可动盖13b，该可动盖1 作为孔13a的盖而在粪便采集棒13上滑动。以下说明本 粪便采集容器B的使用方法的一个实施方式。首先，如图加所示，使粪便采集棒13上的可动盖1 远离孔13a而靠近盖12侧， 使孔13a处于完全开口的状态，将粪便采集棒13压入粪便E中。于是如图2b所示，在孔13a 中填充了粪便Ε。在该状态下，通过使可动盖1 滑动到粪便采集棒13的前端侧而盖住孔 13a，从而将多余的粪便E分离，所以能够准确地仅采集孔13a的容量的量的粪便(图2c)。 然后，使可动盖1 恢复到原来的位置使孔13a处于完全开口的状态(图2d)，然后将盖12 收纳到容器本体11中(图加)。在粪便采集棒13被收纳到容器本体11中时，粪便采集棒 13的尖锐的前端刺破含有调制用溶液S的袋15，从而容器本体11中充满调制用溶液S至 含有粪便E的孔13a以上的水位，粪便E与调制用溶液S直接接触(图3f)。此时，容器本 体11被盖12密封，所以调制用溶液S不会漏出。然后，通过搬运等而移动容器本体11，从 而将容器11内部的调制用溶液S与粪便E混合。这样的粪便采集容器B由于从粪便采集棒 13插入到容器中开始溶液就充满容器中，所以即使使用像甲醇那样对人体有害的调制用溶 液S的情况下，也能够避免溶液漏出导致的事故，在家庭中也能够安全处理。实施例接着示出实施例对本发明进一步详细说明，但本发明并不限定于以下的实施例。 另外，在没有特别记载的情况下，“ %，，表示“体积％ ”。此外，培养细胞Caco-2细胞、SW620 细胞、及MKN45细胞、以及细菌细胞EntercAacter aerogenes通过常规方法进行培养。[实施例1]将由1名健康人采集的粪便分别各取0. 5g到8根15mL的聚丙烯管中。对于各粪 便，添加表1中记载的调制用溶液SlOmL使粪便充分分散，分别调制了粪便试样1-1 1-8。 另外，将添加了 0. IM的柠檬酸的调制用溶液S用NaOH调节至表1中记载的pH。此外，未添 加有机酸的60%乙醇溶液的pH是添加到粪便中之前的pH。[表1]
权利要求
1.一种粪便试样的调制方法，其将所采集的粪便与粪便试样调制用溶液混合。
2.一种粪便试样调制用溶液，其用于混合所采集的粪便， 以含有有机酸的水溶性有机溶剂作为有效成分。
3.根据权利要求2所述的粪便试样调制用溶液，上述粪便试样调制用溶液具有缓冲作用。
4.根据权利要求2或3所述的粪便试样调制用溶液，上述水溶性有机溶剂为选自由水 溶性醇、酮类及醛类组成的组中的1种以上。
5.根据权利要求2 4中任一项所述的粪便试样调制用溶液，上述粪便试样调制用溶 液的PH为2 6. 5。
6.根据权利要求5所述的粪便试样调制用溶液，上述粪便试样调制用溶液的pH为3 6。
7.根据权利要求2 6中任一项所述的粪便试样调制用溶液，上述有机酸为选自由直 链脂肪酸、二羧酸、氨基酸、羟基酸、及芳香族或杂环的多元羧酸组成的组中的1种以上。
8.根据权利要求7所述的粪便试样调制用溶液，上述有机酸为选自由乙酸、乳酸、柠檬 酸及己二酸组成的组中的1种以上。
9.根据权利要求6 8中任一项所述的粪便试样调制用溶液，上述粪便试样调制用溶 液的PH为4. 5 5. 5。
10.根据权利要求2 9中任一项所述的粪便试样调制用溶液，上述粪便试样调制用溶 液的有机酸浓度为0. 01 0. 1M。
11.根据权利要求4 10中任一项所述的粪便试样调制用溶液，上述水溶性有机溶剂 为水溶性醇和/或酮类，该水溶性有机溶剂的浓度为30%以上。
12.根据权利要求11所述的粪便试样调制用溶液，上述水溶性有机溶剂含有选自由乙 醇、丙醇及甲醇组成的组中的1种以上作为水溶性醇。
13.根据权利要求11所述的粪便试样调制用溶液，上述水溶性有机溶剂为乙醇。
14.根据权利要求11或12所述的粪便试样调制用溶液，上述水溶性有机溶剂含有丙酮 和/或甲乙酮作为酮类。
15.根据权利要求4 10中任一项所述的粪便试样调制用溶液，上述水溶性有机溶剂 为醛类，该水溶性有机溶剂的浓度为0. 01 30%。
16.根据权利要求2 15中任一项所述的粪便试样调制用溶液，关于上述粪便与上述 粪便试样调制用溶液的混合比率，相对于粪便体积1，粪便试样调制用溶液体积为1以上。
17.根据权利要求2 16中任一项所述的粪便试样调制用溶液，上述粪便试样调制用 溶液含有表面活性剂。
18.根据权利要求2 17中任一项所述的粪便试样调制用溶液，上述粪便试样调制用 溶液含有着色剂。
19.根据权利要求2 18中任一项所述的粪便试样调制用溶液，上述粪便试样调制用 溶液中的上述水溶性有机溶剂的浓度为30%以上。
20.一种粪便采集用试剂盒，其具有以含有有机酸的水溶性有机溶剂为有效成分的 粪便试样调制用溶液、和含有上述粪便试样调制用溶液的粪便采集容器。
21.根据权利要求20所述的粪便采集用试剂盒，上述粪便试样调制用溶液中的水溶性 有机溶剂的浓度为30%以上。
22.一种粪便试样，其使用权利要求2 19中任一项所述的粪便试样调制用溶液调制 而成。
23.一种从粪便试样中回收核酸的核酸回收方法，从权利要求22所述的粪便试样中， 同时回收常居肠细菌来源的核酸和常居肠细菌以外的生物来源的核酸。
24.根据权利要求23所述的核酸回收方法，上述常居肠细菌以外的生物来源的核酸为 哺乳细胞来源的核酸。
25.根据权利要求23或M所述的核酸回收方法，回收核酸的工序具有以下工序(a)使上述粪便试样中的蛋白质变性，从而使核酸从上述粪便试样中的常居肠细菌及 常居肠细菌以外的生物中溶出的工序；和(b)回收上述工序(a)中溶出的核酸的工序。
26.根据权利要求25所述的核酸回收方法，在上述工序(a)之后、上述工序(b)之前， 还具有(c)除去通过上述工序(a)而变性的蛋白质的工序。
27.根据权利要求25或沈所述的核酸回收方法，上述工序(a)中的蛋白质的变性是使 用选自由离液序列高的盐、有机溶剂、及表面活性剂组成的组中的1种以上来进行的。
28.根据权利要求27所述的核酸回收方法，上述有机溶剂为酚类。
29.根据权利要求沈 观中任一项所述的核酸回收方法，上述工序(c)中的除去变性 的蛋白质是使用氯仿来进行的。
30.根据权利要求25 四中任一项所述的核酸回收方法，上述工序(b)中的核酸的回 收具有(bl)使上述工序(a)中溶出的核酸吸附到无机支撑体上的工序；和(b2)使上述工序(bl)中吸附的核酸从无机支撑体溶出的工序。
31.根据权利要求25 30中任一项所述的核酸回收方法，在上述工序(a)之前，具有(d)从上述粪便试样回收固体成分的工序。
32.一种核酸分析方法，使用由权利要求23 31中任一项所述的核酸回收方法回收的 核酸，分析哺乳细胞来源的核酸。
33.根据权利要求32所述的核酸分析方法，上述哺乳细胞为消化道细胞。
34.根据权利要求32所述的核酸分析方法，上述哺乳细胞为从大肠脱落的细胞。
35.根据权利要求32 34中任一项所述的核酸分析方法，上述哺乳细胞来源的核酸为 指示致瘤性转化的标记物。
36.根据权利要求32 34中任一项所述的核酸分析方法，上述哺乳细胞来源的核酸为 指示炎症性消化器官疾病的标记物。
37.根据权利要求32 36中任一项所述的核酸分析方法，上述分析为RNA分析和/或 DNA分析。
38.根据权利要求37所述的核酸分析方法，上述RNA分析为RNA上的碱基的插入、缺 失、置换、重复、倒置、或剪接变体的分析、mRNA表达分析、及功能性RNA分析中的任意1种 以上。
39.根据权利要求37所述的核酸分析方法，上述DNA分析为突变分析及表观遗传学变 化分析中的任意1种以上。
40.根据权利要求39所述的核酸分析方法，上述突变分析为碱基的插入、缺失、置换、 重复或倒置中的任意1种以上突变的分析。
41.根据权利要求39所述的核酸分析方法，上述表观遗传学变化分析为DNA的甲基化 分析及DNA的脱甲基化分析中的任意1种以上。
42.根据权利要求39所述的核酸分析方法，上述突变分析为K-ras基因的突变分析。
全文摘要
本发明提供无需繁杂的操作就可调制能够稳定地保存粪便中的核酸的粪便试样的方法、用于该方法的粪便试样调制用溶液及粪便采集用试剂盒、以及使用通过本发明的调制方法调制的粪便试样来回收分析粪便中的核酸的方法，通过将采集的粪便与以含有有机酸的水溶性有机溶剂为有效成分的粪便试样调制用溶液混合，能够调制粪便试样中所含的核酸的保存性优异的粪便试样。
文档编号C12N15/09GK102131928SQ20098013325
公开日2011年7月20日 申请日期2009年8月25日 优先权日2008年8月26日
发明者谷上恭央, 长冈智纪 申请人:奥林巴斯株式会社