具有延长的体内半衰期的因子viii，冯·维勒布兰德因子或它们的复合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及：编码凝血因子VIII（FVIII）及冯·维勒布兰德因子（VWF）以及它们的复合物及它们的衍生物的修饰的核酸序列，含该核酸序列的重组表达载体，用该重组表达载体转化的宿主细胞，所述核酸序列编码的重组多肽及衍生物，所述重组多肽及衍生物具有生物活性，及相比未修饰的野生型蛋白具有延长的体内半衰期和/或提高的体内恢复。本发明还涉及导致提高的表达产率的相应FVIII序列。本发明还涉及制备该重组蛋白及它们的衍生物的方法。本发明还涉及用于人基因治疗的转移载体，其包括该修饰的核酸序列。
【专利说明】具有延长的体内半衰期的因子Vl I 1、冯.维勒布兰德因子或它们的复合物
[0001]本申请是申请日为2009年6月24日、申请号为200980123818.X、发明名称为“具有延长的体内半衰期的因子VII1、冯.维勒布兰德因子或它们的复合物”的中国发明专利申请的分案申请。
【【技术领域】】
[0002]本发明涉及编码凝血因子VIII (FVIII)及冯?维勒布兰德因子(VWF)以及它们的复合物及它们的衍生物的修饰的核酸序列，含该核酸序列的重组表达载体，用该重组表达载体转化的宿主细胞，所述核酸序列编码的重组多肽及衍生物，所述重组多肽及衍生物具有生物活性，及相比未修饰的野生型蛋白具有延长的体内半衰期和/或提高的体内恢复。本发明还涉及导致提高的表达产率的相应FVIII序列。本发明还涉及制备该重组蛋白及它们的衍生物的方法。本发明还涉及用于人基因治疗的转移载体，其包括该修饰的核酸序列。
【【背景技术】】
[0003]有各种出血障碍凝血因子缺陷引发。最常见的障碍是血友病A及B，分别由凝血因子VIII及IX缺陷所致。另一已知的出血障碍是冯.维勒布兰德病。
[0004]在血浆中，FVIII大多以与VWF的非共价复合物形式存在，及其促凝剂功能加速因子X到Xa的因子IXa依赖的转变。由于FVIII与VWF的复合物形成，长时间认为，FVIII与VWF功能是同一分子的2个功能。到了七十年代才得知FVIII与VWF是在生理条件下形成复合物的独立的分子。到了八十年代测定出约0.2nmol/L的解离常数(Leyte et al.，BiochemJ1989, 257:679-683)，及研究了 2种分子的DNA序列。
[0005]经典的血友病或血友病A是遗传的出血障碍。其由凝血因子FVIII的染色体X-联锁的缺陷所致，及以每10，000个人介于I个和2个个体之间的发病率几乎仅影响男性。X-染色体缺陷可被本身不是血友病患者的女性携带者传递。血友病A的临床表现是增加的出血趋势。用FVIII浓缩物治疗之前，患严重的血友病的人的平均寿命少于20年。自血浆的FVIII浓缩物的使用显著改善了血友病A患者的状况，大大增加了平均寿命，假设他们中的大部分活大致正常寿命的可能性。但是，已有某些有关源于血浆的浓缩物及它们的使用的问题，其中最严重的问题是病毒传播。迄今，导致乙型肝炎，非甲非乙型肝炎及AIDS的病毒已经严重危害人群。从此以后，已新开发了不同的病毒灭活方法及新的高度纯化的FVIII浓缩物，它们也对于血浆来源的FVIII建立了非常高的安全标准。
[0006]FVIII 的cDNA的克隆(Wood et al.1984.Nature312:330-336; Vehar et al.1984.Nature312:337-342 )使重组表达FVIII成为可能，导致开发了几种重组FVI11产物，它们已在1992和2003之间被有关机关批准。位于氨基酸Arg-740和Glu_1649之间的FVIII多肽链的中央B结构域对于全生物活性似乎不是必需的事实也导致开发了删除了B结构域的
FVII1
[0007]成熟的FVIII分子由2332个氨基酸构成，其可分为3个同源A结构域，2个同源C结构域及I个B结构域，它们以下列顺序排列:A1-A2-B-A3-C1-C2。成熟的人FVIII的完整氨基酸序列示于SEQ ID N0:15。在其分泌到血浆的过程中，FVIII被细胞内加工为一系列金属-离子连接的异源二聚体作为单链FVIII，其在B-A3边界及在B-结构域内的不同位点被切割。此加工产生由Al，A2及B-结构域的不同部分构成的异源重链分子，其具有90kD~200kDa的分子大小。此重链经金属离子结合到轻链，所述轻链由A3，Cl及C2结构域构成(Saenko et al.2002.Vox Sang.83:89-96)。在血浆中，此异源二聚体FVIII以高亲和性结合冯?维勒布兰德因子(VWF)，其保护其免于成熟前分解代谢。在血浆中非活化的FVIII结合VWF的半衰期为约12小时。
[0008]通过由FXa及凝血酶在重链内的氨基酸Arg372及Arg740，及在轻链中的Argl689蛋白水解切割活化凝血因子FVIII，导致冯.维勒布兰德因子释放及产生活化的FVIII异源二聚体，其会在磷脂表面上与FIXa及FX形成tenase复合物，前提是Ca2+存在。异源二聚体由Al结构域(50kDa片段)，A2结构域(43kDa片段)及轻链(A3-C1-C2) (73kDa片段)构成。因此，活化形式的FVIII (FVIIIa)由通过二价金属离子连接物与经凝血酶切割的A3-C1-C2轻链连接的Al-亚基及与Al及A3结构域相对松散连接的游离A2亚基构成。
[0009]为避免过量凝集，FVIIIa必需在活化之后很快灭活。经活化的蛋白C (APC)通过在Arg336及Arg562切割的FVIIIa灭活不被认为是主要的限速步骤。反倒是非共价附着的A2亚基从异源二聚体解离是凝血酶活化之后FVIIIa灭活中的限速步骤(Fay etal.1991.J.Biol.Chem.2668957，Fay&Smudzinl992.J.Biol.Chem.267:13246-50)。这是很快的过程，其解释血浆中FVIIIa的短半衰期，其仅2.1分钟(Saenko et al.2002.VoxSang.83:89-96)。
[0010]由于FVIII的约12~14小时的短血浆半衰期，严重的血友病A患者经历预防性治疗FVIII必需每周静脉内(1.V.)施用约3次。每次静脉内施用都麻烦，伴随疼痛及承担感染的风险，尤其是被诊断为血友病A的患者自己或儿童的父母在家进行时。
[0011]因此非常需要制造出允许制备含FVIII的药物组合物的具有增加的功能半衰期的FVIII，其必需低频度施用。
[0012]已做了几种尝试，即通过如下手段延长非活化的FVIII的半衰期:减少其与细胞受体的相互作用(W003/093313A2，W002/060951A2),将聚合物共价附着到FVIII(W094/15625,W097/11957 及 US4970300)，包裹 FVIII (W099/55306)，导入新的金属结合位点(W097/03193)，通过肽键(W097/40145 及 W003/087355)或二硫键(W002/103024A2)将 A2结构域共价附着到A3结构域，或将Al结构域共价附着到A2结构域(W02006/108590)。
[0013]增加FVIII或VWF的功能半衰期的其他方法是FVIII的PEG化(W02007/126808，W02006/053299, W02004/075923)或 VWF 的 PEG 化(W02006/071801)，具有增加的半衰期的PEG化的VWF还会间接增加血浆中存在的FVIII的半衰期。
[0014]由于以上所列方法中尚未有一种方法得到获得批准的FVIII药物，且由于向FVIII野生型序列导入突变或导入化学修饰至少要承担产生免疫原性FVIII变体的理论风险，因此仍需要开发呈现延长的半衰期的修饰的凝血因子VIII分子。
[0015]鉴于潜在的血栓形成风险，相比延长FVIIIa的半衰期，更期望延长非活化形式的FVIII的半衰期。
[0016]有缺失，功能上有缺陷或仅以减少的量在不同形式的冯.维勒布兰德病(VWD)中可用的VWF是哺乳动物血浆中存在的多聚体粘着糖蛋白，其有多种生理功能。初次止血期间，VffF发挥血小板表面上的特异受体与细胞外基质成分(例如胶原)之间的介质的作用。而且，VWF发挥促凝剂FVIII的载质及稳定蛋白的作用。VWF在内皮细胞及巨核细胞中合成为2813个氨基酸的前体分子。野生型VWF的氨基酸序列及cDNA序列公开于Collins etal.1987，Proc Natl.Acad.Sc1.USA84:4393 - 4397。前体多肽，前原 VffF,由见于成熟的血浆VWF的22个残基的信号肽，741个残基的原肽及2050个残基的多肽构成(Fischer etal., FEBS Lett.351:345-348, 1994)。在内质网切割信号肽之后，在2个VWF单体之间形成C-端二硫桥。在转运通过分泌通路期间添加12个N联的及10个O联的碳水化合物侧链。更重要的是，VWF 二聚体经N-端二硫桥多聚化，及在晚期高尔基体中用酶PACE/弗林蛋白酶切割下741个氨基酸长度的原肽。VWF (VWF-HMWM)的原肽以及高分子量多聚体储存在内皮细胞的魏伯尔-帕拉德小体内或血小板的α-颗粒内。
[0017]一旦分泌到血浆中，蛋白酶ADAMTS13在VWF的Al结构域内切割VWF。血浆VWF因此由整个范围的多聚体构成，所述范围从500kDa的单个二聚体到由分子量超过10，OOOkDa的达多于20个二聚体构成的多聚体。VWF-HMWM因此具有最强的止血剂活性，其可以利托菌素辅因子活性(VWF = RCo)测量。VWF: RCo/VWF抗原比越高，高分子量多聚体的相对量越高。
[0018]VWF中的缺陷引发冯.维勒布兰德病(VWD)，其特征在于多少显著的出血表型。3型VWD是最严重形式，其中VWF完全缺失，I型VWD涉及定量丧失WF,且其表型可非常微小。2型VWD涉及VWF的定性缺陷，且可严重如3型VWD。2型VWD有许多亚型，其中一些关联于高分子量多聚体的缺失或减少。2a型Von VWD的特征在于缺失中等的及大的多聚体。2B型VWD的特征在于缺失最高分子量的多聚体。VWD是人最常见的遗传出血障碍，且可通过用含质粒或重组来源的VWF的浓缩物的取代疗法治疗。VWF可从人血浆中制备，例如描述于EP05503991。EP0784632描述了分离重组VWF的方法。
[0019] 血浆中FVIII以高亲和性结合von VWF，其保护其免于成熟前分解代谢，及因此除了其初次止血中的作用之外，还在调节血浆FVIII水平中起关键作用，结果还是控制二次止血的中心因子。血浆中非活化的FVIII束缚于VWF的半衰期为约12~14小时。3型冯?维勒布兰德病中，无或几乎不存在VWF，FVIII的半衰期仅为约6小时，由于FVIII的降低的浓度，该患者中导致微小到温和的血友病A的症状。VWF对FVIII的稳定作用还用于辅助 CHO 细胞中 FVIII 的重组表达(Kaufman et al.1989, Mol Cell Biol)。
[0020]而今，血友病A及VWD的标准治疗涉及频频静脉输注FVIII制剂及VWF浓缩物或包括源于人供者血浆的FVIII及VWF的复合物的浓缩物，或在FVIII的情况中，基于重组FVIII的药物制剂。同时这些取代疗法一般有效，例如在经历预防性治疗的严重的血友病A患者中，由于约12小时的FVIII的短血浆半衰期，FVIII必需每周静脉内(1.V.)施用约3次。非血友病患者中上述1%的FVIII活性水平，例如通过升高0.01U/ml的FVIII水平，将严重的血友病A转变为温和的血友病A。在预防性治疗中，剂量方案设计为FVIII活性的低谷水平不降到非血友病患者中FVIII活性的2~3%水平以下。每次静脉内施用都麻烦，伴随疼痛及承担感染的风险，尤其是常在由被诊断为患血友病A的患者自身或儿童的父母进行的家中治疗中。此外，频频静脉内注射不可避免地导致瘢痕形成，干扰将来的输注。由于严重的血友病的预防性治疗开始于生命的早期，儿童常常小于2岁，这更难以每周注射FVIII3次到那么小的患者的静脉内。对于受限的时期，端口系统的植入常为替代性方法。尽管重复的感染可发生，且端口可导致身体运动期间的不便，然而他们通常认为相比静脉内注射有利。
[0021]人循环中人VWF的体内半衰期为约12~20小时。在VWD (例如3型)的预防性治疗中还高度希望发现延长VWF的功能半衰期的方法。另一加长VWF的功能半衰期的方法是PEG化(W02006/071801 )，PEG化的VWF有增加的半衰期，其还间接加长血浆中存在的FVIII的半衰期。
[0022]但是，PEG或其他分子与治疗性蛋白的化学缀合总是要承担如下风险，由于与其他蛋白的重要相互作用位点被罩住，特异活性降低，化学缀合在制备该蛋白中增加了额外的步骤，降低了最终产率及加大的制备的成本。对人健康的长效影响也不清楚，因为目前已知的PEG化的治疗性蛋白不是如在冯?维勒布兰德病的预防中施用的VWF或在血友病A中施用的FVIII的情况中一样需要终生施用。
[0023]高度需要得到未被化学修饰的长寿的VWF。
[0024]现有技术中已描述了凝血因子与作为加长半衰期的多肽的白蛋白(W001/79271)，α -甲胎蛋白(W02005/024044)及免疫球蛋白(W02004/101740)的融合。这些被连接到相应治疗性蛋白部分的羧基-或氨基-端或者两端，有时通过肽接头连接，优选通过由甘氨酸及丝氨酸构成的接头连接。
[0025]Ballance等人(W001/79271)描述了多个不同治疗性多肽融合到人血清白蛋白的N-或C-端融合多肽。其描述了潜在的融合偶体的长列表，但就是否相应白蛋白融合蛋白实际上保持生物活性及具有提 高的特性，未公开几乎任何这些多肽的实验数据。所述治疗性多肽列表中也提到了 FVIII及VWF。
[0026]本领域技术人员不会认真考虑C-端融合，因为在FVIII的氨基酸2303与2332之间的FVIII的甚C-端部分的FVIII的C2结构域包括血小板膜结合位点，其必要于FVIII功能。这也是为什么这区域已知有许多导致血友病A的氨基酸突变。因此惊讶地发现，相对大的异源多肽(如白蛋白)可融合到FVIII的C-端部分，而不通过阻止血小板结合阻止FVIII功能。此外，C2结构域还含VWF的结合位点。这位点及氨基酸序列1649~1689负责FVIII与VWF的高亲和性结合。因此，本领域技术人员还不预期有C-端白蛋白融合的FVIII会保持其与VWF结合。
[0027]惊讶地发现，相对于Ballance等人的预测，白蛋白融合到FVIII的N-端不分泌到培养基。因此及因为如上详述的理由，更惊讶地发现，于其C-端部分融合到白蛋白的FVIII分泌到培养基，及保持其包括结合活化的血小板膜及结合VWF在内的生物功能。
[0028]还惊讶地发现，本发明的修饰的FVI11显示相比野生型FVI11约20%增加的体内恢复。
[0029]本领域技术人员还未想到将人白蛋白融合到VWF的N-或C-端。在N-端融合中，白蛋白部分会在原肽加工期间被切割下。或如果略去原肽，多聚化不会发生。如上所述，VffF的C-端必要于初始二聚化及必要于分泌，如Schneppenheim等人(Schneppenheim R.etal.1996.Defective dimerization of VWF subunits due to a Cys to Arg mutation inVWD type IID.Proc Natl Acad Sci USA93:3581-3586;Schneppenheim R.et al.2001.Expression and characterization of VWF dimerization defects in different typesof VWD.Blood97:2059-2066.)，Baronciani 等人(Baronciani Let al.2000.Molecularcharacterization of a multiethnic group of21patients with VffD type3.Thromb.Haemost84:536-540), Enayat 等人(Enayat MS et al.2001.Aberrant dimerization ofVffF as the result of mutations in the carboxy-terminal region:1dentificationof3mutations in members of3different families with type2A(phenotype IID)VWD.Blood98:674-680)及 Tjernberg 等人(Tjernberg et al.2006.Homozygous C2362F VffFinduces intracellular retention of mutant VffF resulting in autosomal recessivesevere VWD.Br J Haematol.133:409-418)所不。因此，本领域技术人员不会想到大蛋白(如人白蛋白)与VWF的C-或N-端的融合，如其预期VWF的正常二聚化或多聚化一样，会被损坏。随着VWF的更高多聚体在初次止血中最活跃，本领域技术人员会考虑其他方法延长VWF的功能半衰期。
[0030]现令人惊讶的发现，异源多肽(例如白蛋白)与VWF的C-端部分融合，不仅使得VWF嵌合蛋白从哺乳动物细胞表达及分泌，还得到保持显著的VWF活性及形成高分子量多聚体的修饰的VWF分子。此外，该修饰的VWF分子呈现延长的体内半衰期和/或提高的体内恢复。
[0031]【发明概述】
[0032]本发明旨在提供具有加长的体内半衰期的修饰的FVIII，或者修饰的VWF，以及修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，以及修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物。
[0033]本发明中术语“修饰的FVIII”或“修饰的VWF”是指融合到加长半衰期的多肽的FVIII或VWF多肽，还含盖FVIII或VWF的天然等位体，变体，删除及插入。
[0034]本发明还旨在提供具有提高的体内恢复的修饰的FVIII，或者修饰的VWF，以及修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，以及修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物。
[0035]本发明另一目的在于，这修饰的FVIII，或者修饰的VWF，以及修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，以及修饰的FVIII与修饰的VffF的复合物可由哺乳动物细胞表达，及保持它们相应的生物活性。
[0036]总之，本发明的所述修饰的FVIII，或者修饰的VWF，以及修饰的FVI11与非修饰的VffF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，以及修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物意料之外地保持生物活性，具有增加的体内半衰期及体内恢复。
[0037]本发明的FVIII被修饰且活化之后A2结构域仅保持非共价连接到A3结构域的那些实施方式的潜在益处是仅非活化形式的FVIII的半衰期增加，而活化形式的FVIII的半衰期基本上保持相同，其相比导致活化形式的FVIII稳定的FVIII变体，可导致降低的血栓形成风险。
[0038]本发明的修饰的FVIII，或者修饰的VWF，以及修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，以及修饰的FVIII与修饰的VWF分子的复合物可通过加长半衰期的蛋白(HLEP)部分与FVIII的C-端部分或与VWF的C-端部分融合产生。
[0039]本发明中的HLEP选自:白蛋白家族成员，其包括:白蛋白，afamin, α -甲胎蛋白及维生素D结合蛋白，以及免疫球蛋白恒定区部分及能在生理条件下结合白蛋白家族成员以及结合免疫球蛋白恒定区部分的多肽。最优选的HLEP是人白蛋白。
[0040]本发明因此涉及于所述修饰的FVIII和/或VWFC-端部分融合到HLEP的修饰的FVIII，或者修饰的VWF，以及修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，以及修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，特征在于:所述修饰的FVIII，或者修饰的VWF，以及修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或者所述修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物具有相比野生型FVII1、或野生型VWF、或者野生型VWF与野生型FVIII的复合物的功能半衰期延长的功能半衰期。
[0041]本发明还涉及C-端融合到多于一个HLEP，其中所述HLEP (其融合几次)可为相同的HLEP或可为不同HLEP的组合。
[0042]本发明还涉及于C-端部分融合到HLEP的修饰的FVIII，特征在于，所述修饰的FVIII，或者修饰的VWF，或者修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或者所述修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物具有相比野生型FVII1、或野生型VWF、或者野生型VWF与野生型FVIII的复合物的体内恢复提高的体内恢复。
[0043]本发明的另一实施方式是于C-端部分融合到HLEP的修饰的FVIII多肽，特征在于，所述修饰的FVIII以比野生型FVIII更高的产率分泌到发酵培养基。
[0044]本发明另一方面是编码所述修饰的FVIII和/或所述修饰的VWF的多核苷酸或多核苷酸的组合。
[0045]本发明还涉及包括本文所述的多核苷酸的质粒或载体,涉及包括本文所述的多核苷酸或质粒或载体的宿主细胞。
[0046]本发明另一方面是产生修饰的FVIII，或者修饰的VWF，或者修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或者修饰的FVIII与修饰的VffF的复合物的方法，包括:
[0047](a)在所述修饰的凝血因子表达的条件下培养本发明的宿主细胞 '及
[0048](b)任选从宿主细胞或从培养基回收所述修饰的凝血因子。
[0049]本发明还涉及包括修饰的FVIII，或者修饰的VWF，或者修饰的FVIII与非修饰的VffF的复合物，或者非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或者修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，多核苷酸，或本文所述的质粒或载体的药物组合物。
[0050]本发明另一方面是本发明的修饰的FVIII，或者修饰的VWF，或者修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，或者非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或者修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，一种或多种多核苷酸，或一种或多种质粒或载体，或宿主细胞用于制备治疗或预防血凝集障碍的药物的用途。
[0051]【发明详述】
[0052]本发明涉及复合物，其包括:FVIII及von VWF，或其独立多肽成分之一，其中所述复合物的至少一种多肽成分于其主要翻译产物的C-端部分融合到加长半衰期的多肽(HLEP)的N-端部分。
[0053]本发明还涉及修饰的FVIII，或者修饰的VWF，或者包括修饰的FVIII及非修饰的VffF的复合物，或者包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，其中所述修饰的FVIII于FVIII的主要翻译多肽的C-端部分融合到HLEP的N-端部分，或所述修饰的VWF于VWF的主要翻译多肽的C-端部分融合到HLEP的N-端部分。
[0054]本发明的优选实施方式涉及修饰的FVIII,或者修饰的VWF,或者包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，其中，
[0055](a)所述修饰的FVIII具有相比野生型FVIII的功能半衰期延长的功能半衰期，或
[0056](b)所述修饰的VWF具有相比野生型VWF的功能半衰期延长的功能半衰期，或
[0057](c)所述包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物具有相比包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的功能半衰期延长的功能半衰期，或
[0058](d)所述包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物具有相比包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的功能半衰期延长的功能半衰期，或
[0059](e)所述修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物具有相比包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的 功能半衰期延长的功能半衰期。
[0060]本发明的优选实施方式是如上所述的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述修饰的多肽具有相比相应野生型多肽的功能半衰期增加至少25%的功能半衰期，或所述包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的功能半衰期增加至少25%的功能半衰期。
[0061]本发明的另一实施方式是:修饰的FVIII，或者修饰的VWF，或者包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，其中，
[0062](a)所述修饰的FVIII具有相比野生型FVIII的抗原半衰期延长的抗原半衰期，或
[0063](b)所述修饰的VWF具有相比野生型VWF的抗原半衰期延长的抗原半衰期，或
[0064](c)所述包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的抗原半衰期延长的抗原半衰期，或
[0065]Cd)所述包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的抗原半衰期延长的抗原半衰期，或
[0066](e)所述包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的抗原半衰期延长的抗原半衰期。
[0067]本发明的优选实施方式是如上所述的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述修饰的多肽具有相比相应野生型多肽的抗原半衰期增加至少25%的抗原半衰期，或所述包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的抗原半衰期增加至少25%的抗原半衰期。
[0068]本发明的再一实施方式是修饰的FVIII，或者修饰的VWF，或者包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，其中，
[0069](a)所述修饰的FVIII具有相比野生型FVIII的体内恢复增加的体内恢复，或
[0070](b)所述修饰的VWF具有相比野生型VWF的体内恢复增加的体内恢复，或
[0071](c)所述包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的体内恢复增加的体内恢复，或
[0072]Cd)所述包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的体内恢复增加的体内恢复，或
[0073](e)所述包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的体内恢复增加的体内恢复。
[0074]本发明的另一优选的实施方式是如上所述的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述修饰的多肽具有相比相应野生型多肽的体内恢复增加至少10%的体内恢复，或所述包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物增加至少10%的体内恢复。
[0075]本发明的另一优选的实施方式是:
[0076](a)如上所述的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述复合物的至少一种多肽成分于其主要翻译产物的C-端氨基酸融合到HLEP的N-端部分，或
[0077](b)如上所述的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述复合物的至少一种多肽成分于其主要翻译产物的C-端部分融合到HLEP的N-端氨基酸，或
[0078](C)如上所述的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述复合物的至少一种多肽成分于其主要翻译产物的C-端氨基酸融合到HLEP的N-端氨基酸。
[0079]本发明的另一优选的实施方式是如上所述的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述修饰的多肽具有野生型多肽的生物活性的至少10%，或所述包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物具有野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的生物活性的至少10%。
[0080]本发明还包括制备具有增加的功能半衰期的修饰的FVIII或修饰的VWF的方法，包括将加长半衰期的多肽的N-端部分融合到FVIII的主要翻译多肽的C-端部分或融合到VffF的主要翻译多肽的C-端部分；以及制备包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物的方法，通过混合上述方法制备的修饰的FVIII与野生型VWF，或通过混合野生型FVIII与上述方法制备的修饰的VWF，或通过混合上述方法制备的修饰的FVIII与修饰的VWF。
[0081]本发明还包括下列物质用于制备同时、分开或依次用于治疗出血障碍，优选用于治疗血友病A和/或冯.维勒布兰德病的联合药物制剂的用途:
[0082]Ca)上述方法制备的修饰的FVIII及野生型VWF，或
[0083](b)野生型FVIII及上述方法制备的修饰的VWF，或
[0084](c)上述方法制备的修饰的FVIII及上述方法制备的修饰的WF0
[0085]本发明中的“功能半衰期”是所述修饰的FVI11或所述修饰的VWF，或者修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物或非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或者修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物一旦施用给哺乳动物的生物活性半衰期，及可在所述修饰的FVIII或所述修饰的VWF，或者修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，或者非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或者所述修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物已施用之后，从所述哺乳动物以不同的时间间隔取得的血样品中体外测量。
[0086]词〃融合〃或〃融合的〃是指将氨基酸添加到FVIII的C-端部分和/或VWF的C-端部分。当本文说道“融合到FVIII的C-端氨基酸”或“融合到VWF的C-端氨基酸”，时，是指于成熟的野生型FVIII的氨基酸2332的cDNA序列精确融合到FVIII的C-端氨基酸，或于野生型成熟的VWF的氨基酸2050精确融合到VWF的C-端氨基酸。成熟的FVIII或成熟的VWF是指原肽切割之后的相应多肽。但是，本发明还含盖本发明中的“融合到FVIII的C-端部分”或“融合到VWF的C-端部分”，其还可包括分别融合到FVIII和/或VWF分子，其中一个或多个氨基酸位置，直到η个氨基酸从FVIII和/或VWF的C-端氨基酸被删除。η是不应大于FVIII和/或VWF的氨基酸总数的5%，优选不大于1%的整数。通常，η是20，优选15，更优选10，再更优选5或更小(例如1，2，3，4或5)。 [0087]在一实施方式中，所述修饰的FVIII具有以下结构:
[0088]N-FVII1-C-L1-H，[式 I]
[0089]其中，
[0090]N是FVIII的N-端部分，
[0091]LI是化学键或接头序列，
[0092]H 是 HLEP，及
[0093]C是FVIII的C-端部分。
[0094]另一实施方式中所述修饰的VWF具有以下结构:
[0095]N-VWF-C-L1-H，[式 2]
[0096]其中，
[0097]N是VWF的N-端部分，
[0098]LI是化学键或接头序列，
[0099]H 是 HLEP，及
[0100]C是VWF的C-端部分。
[0101]LI可为由一个或多个氨基酸构成的化学键或接头序列，例如I~20，I~15，I~10，1~5或I~3 (例如1，2或3)个氨基酸，及其可彼此相同或不同。通常，接头序列不存在于野生型凝血因子的相应位置。存在于LI中的适宜氨基酸的例包括Gly及Ser。
[0102]优选的HLEP序列如下所述。本发明还包括到相应HLEP的精确“N-端氨基酸”的融合体，或到相应HLEP的“N-端部分”的融合体，其包括:N-端删除HLEP的一个或多个氨基酸。
[0103]本发明的所述修饰的FVIII或所述修饰的VWF或所述修饰的FVIII与非修饰的VffF的复合物，非修饰的FVIII与所述修饰的VWF的复合物或所述修饰的FVIII与修饰的VffF的复合物可包括多于一个HLEP序列，例如2或3个HLEP序列。这些多个HLEP序列可串联融合到FVIII的C-端部分和/或VWF的C-端部分，例如作为连续重复子。
[0104]FVIII可在各阶段经蛋白水解加工。例如，如上所述，在其分泌到血浆期间，单链FVIII在细胞内在B-A3边界及在B-结构域内的不同位点被切割。重链经金属离子束缚到具有结构域结构A3-C1-C2的轻链。FVIII经在重链内的氨基酸Arg372及Arg740及在轻链内的Argl689蛋白水解切割而活化产生活化的由Al结构域，A2结构域，及轻链(A3-C1-C2)构成的FVIII异源二聚体，73kDa片段。因此，活跃形式的FVIII (FVIIIa)构成由通过二价金属离子连接物与凝血酶切割的A3-C1-C2轻链连接的Al-亚基及与Al及A3结构域相对松散连接的游离A2亚基。
[0105]因此，本发明还含盖不存在为单链多肽，但由经非共价键彼此连接的几个多肽(例如I个或2个或3个)构成的修饰的FVIII。
[0106]优选N - FVII1- C包括FVIII的全长序列。只要保持FVIII的生物活性，还包括FVIII的N-端，C-端或内部缺失。如果具有缺失的FVIII保持至少10%，优选至少25%，更优选至少50%，最有选至少75%的野生型FVIII的生物活性，则在本发明中认为保持生物活性。FVIII的生物活性可如下所述由本领域技术人员测定。
[0107]测定FVIII的生物活性的适宜测试例如一步或两步凝集试验(Rizza etal.1982.Coagulation assay of FVII1:C and FIXa in Bloom ed.The Hemophilias.NY Churchchill Livingstonl992)或显色底物 FVII1:C 试验(S.Rosen，1984.Scand JHaematol33:139-145, suppl.)。将这些参考文献的内容通过引用并入本文。成熟的野生型的人凝血因子FVIII的cDNA序列及氨基酸序列分别显示于SEQ ID N0:14及SEQ ID NO:
15。说道特定序列的氨基酸位置，是指所述氨基酸在FVIII野生型蛋白中的位置，及不排除突变的存在，所述突变例如在所述序列中的其他位置的缺失，插入和/或置换。例如，SEQID NO:15的〃Glu2004〃中的突变不排除在修饰的同源体中，在SEQ ID NO:15的位置I~2332的一个或多个氨基酸缺失。
[0108]术语〃凝血因子V III"，〃因子VIII〃及“FVIII"在本文互换使用。〃凝血因子VIII"包括:野生型凝血因子FVIII，以及具有野生型凝血因子FVIII的促凝剂活性的野生型凝血因子FVIII的衍生物。衍生物可相比野生型FVIII的氨基酸序列有缺失，插入和/或添加。术语FVIII包括:蛋白水解加工形式的FVIII，例如活化之前的形式，包括重链及轻链。
[0109]术语"FVIII"包括具有野生型因子VIII的生物活性的至少25%，更优选至少50%，最有选至少75%的任何FVIII变体或突变体。
[0110]作为非限制性实施例，FVIII分子包括:阻止或减少APC切割的FVIII突变体(Amanol998.Thromb.Haemost.79:557-563),进一步稳定 A2 结构域的 FVIII突变体(W097/40145)，导致增加的表达的FVIII突变体(Swaroop et al.1997.JBC272:24121-24124),降低其免疫原性的 FVIII 突变体(LolIar1999.Thromb.Haemost.82:505-508)，由差异表的重链及轻链重构的 FVIII (Oh et al.1999.Exp.Mol.Med.31:95-100),降低与受体结合导致FVIII如HSPG (硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)和/或LRP (低密度脂蛋白受体关联蛋白)分解代谢的FVIII突变体(Ananyeva etal.2001.TCM, 11:251-257)，二硫键-稳定的 FVIII 变体(Gale et al.，2006.J.Thromb.Hemost.4:1315-1322)，具有提高的分泌特性的 FVIII 突变体(Miao et al.，2004.Bloodl03:3412-3419),具有增加的辅因子特异活性的FVIII突变体(Wakabayashi etal.，2005.Biochemistry44:10298-304),具有提高的生物合成及分泌，将少的ER伴侣蛋白相互作用，提高的ER-Golgi转运，增加的活化或针对灭活的抗性及提高的半衰期的FVIII突变体(总结于Pipe2004.Sem.Thromb.Hemost.30:227-237)。所有这些FVIII突变体及变体通过引用整体并入本文。[0111]VffF可在各阶段经蛋白水解加工。例如，如上所述，蛋白酶ADAMTS13在VWF的A2结构域内切割VWF。因此，本发明还含盖已被蛋白水解切割(例如被ADAMTS13)的修饰的VWF。所述切割会产生在它们的末端包括至少I个或最多2个已被ADAMTS13切割的VWF单体的VffF多聚体链。
[0112]优选N-VWF-C包括VWF的全长序列。只要保持VWF的生物活性，还包括VWF的N-端，C-端或内部缺失。如果具有缺失的VWF保持至少10%，优选至少25%，更优选至少50%，最有选至少75%的野生型VWF的生物活性，则在本发明中认为保持生物活性。野生型VWF的生物活性可由本领域技术人员使用利托菌素辅因子活性(Federici AB etal.2004.Haematologica89:77-85), VWF 与血小板糖蛋白复合物 Ib-V-1X 的 GP Iba 的结合(Sucker et al.2006.Clin Appl Thromb Hemost.12:305-310),或胶原结合试验(Kallas&Talpsep.2001.Annals of Hematology80:466-471)的方法来测定。
[0113]在上述定义内〃FVIII〃和/或〃VWF〃还包括可在个体之间存在及出现的天然等位变异。在上述定义内“FVIII"和/或〃VWF〃还包括FVIII及或VWF的变体。该变体与野生型序列相差一个或多个氨基酸残基。该差异的例可包括保守氨基酸置换，即具有类似特性的氨基酸组内置换，例如(I)小氨基酸，(2)酸性氨基酸，(3)极性氨基酸，(4)碱性氨基酸，(5)疏水性氨基酸，及(6)芳族氨基酸。所述保守置换的例显示于下表。
[0114]表1
[0115]
【权利要求】
1.复合物，其包括:因子VIII(FVIII)及冯?维勒布兰德因子(VWF)，或其独立多肽成分之一，其中所述复合物的至少一种多肽成分或其独立成分中的至少一种于其主要翻译产物的C-端部分融合到加长半衰期的多肽(HLEP)的N-端部分。
2.修饰的FVIII，或者 修饰的von VWF，或者 包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者 包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者 包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，其中， 所述修饰的FVIII于FVIII的主要翻译多肽的C-端部分融合到HLEP的N-端部分，或 所述修饰的VWF于VWF的主要翻译多肽的C-端部分融合到HLEP的N-端部分。
3.权利要求1或2的 修饰的FVIII，或者 修饰的VWF，或者 包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者 包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者 包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，其中， Ca)所述修饰的FVIII具有相比野生型FVIII的功能半衰期延长的功能半衰期，或 (b)所述修饰的VWF具有相比野生型VWF的功能半衰期延长的功能半衰期，或 (c)所述包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物具有相比包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的功能半衰期延长的功能半衰期，或 Cd)所述包括非修饰的FVIII及修饰`的VWF的复合物具有相比包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的功能半衰期延长的功能半衰期，或 (e)所述修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物具有相比包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的功能半衰期延长的功能半衰期。
4.权利要求3的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中， 所述修饰的多肽具有相比相应野生型多肽的功能半衰期增加至少25%的功能半衰期，或 所述包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的功能半衰期增加至少25%的功能半衰期。
5.权利要求1或2的 修饰的FVIII，或者 修饰的VWF，或者 包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者 包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者 包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，其中 Ca)所述修饰的FVIII具有相比野生型FVIII的抗原半衰期延长的抗原半衰期，或 (b)所述修饰的VWF具有相比野生型VWF的抗原半衰期延长的抗原半衰期，或 (c)所述包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的抗原半衰期延长的抗原半衰期，或 Cd)所述包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VffF的相应复合物的抗原半衰期延长的抗原半衰期，或 (e)所述包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的抗原半衰期延长的抗原半衰期。
6.权利要求5的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中， 所述修饰的多肽具有相比相应野生型多肽的抗原半衰期增加至少25%的抗原半衰期，或 所述包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的抗原半衰期增加至少25%的抗原半衰期。
7.权利要求1或2的 修饰的FVIII，或者 修饰的VWF，或者 包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者 包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者 包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，其中 Ca)所述修饰的FVIII具有相比野生型FVIII的体内恢复增加的体内恢复，或 (b)所述修饰的VWF具有 相比野生型VWF的体内恢复增加的体内恢复，或 (c)所述包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的体内恢复增加的体内恢复，或 Cd)所述包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的体内恢复增加的体内恢复，或 Ce)所述包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的体内恢复增加的体内恢复。
8.权利要求7的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中， 所述修饰的多肽具有相比相应野生型多肽的体内恢复增加至少10%的体内恢复，或所述包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物增加至少10%的体内恢复。
9.以上权利要求中任一项的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述复合物的至少一种多肽成分于其主要翻译产物的C-端氨基酸融合到HLEP的N-端部分。
10.以上权利要求中任一项的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述复合物的至少一种多肽成分于其主要翻译产物的C-端部分融合到HLEP的N-端氨基酸。
11.以上权利要求中任一项的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述复合物的至少一种多肽成分于其主要翻译产物的C-端氨基酸融合到HLEP的N-端氨基酸。
12.以上权利要求中任一项的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中， 所述修饰的多肽具有野生型多肽的生物活性的至少10%，或 所述包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物具有野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的生物活性的至少10%。
13.以上权利要求中任一项的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述HLEP选自:白蛋白家族蛋白及免疫球蛋白恒定区。
14.权利要求13的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述HLEP是白蛋白或其片段。
15.以上权利要求中任一项的重组的修饰的FVIII，其中所述重组的修饰的FVIII以比野生型FVIII更高产率由哺乳动物细胞分泌。
16.多核苷酸或多核苷酸组,其编码权利要求1~15中任一项的多肽,或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物。
17.质粒或载体,所述质粒或载体包括权利要求16的多核苷酸,或质粒或载体组,所述组包括权利要求16的多核苷酸组。
18.权利要求17的质粒或载体，或者质粒或载体组，所述质粒或载体是表达载体。
19.权利要求17的载体或载体组，其为用于人基因治疗的转移载体。
20.宿主细胞，其包括: 权利要求16的多核苷酸或多核苷酸组，或者 权利要求17~19中任一项的质粒或载体,或者质粒或载体组。
21.产生修饰的VWF的方法，包括: Ca)在所述修饰的VWF表达的条件下培养权利要求20的宿主细胞；及 (b)任选从宿主细胞或从培养基回收所述修饰的VWF。
22.药物组合物，其包括: 权利要求1~15中任一项的多肽或包括所述修饰的多肽的复合物， 权利要求16的多核苷酸或多核苷酸组，或 权利要求17~19中任一项的质粒或载体,或者质粒或载体组。
23.下列用于制备治疗或预防血凝集障碍的药物的用途: 权利要求1~15中任一项的多肽或包括所述修饰的多肽的复合物， 权利要求16的多核苷酸或多核苷酸组，或 权利要求17~19中任一项的质粒或载体,或者质粒或载体组,或 权利要求20的宿主细胞。
24.权利要求23的用途，其中所述血凝集障碍是血友病A。
25.权利要求23的用途，其中所述血凝集障碍是冯.维勒布兰德病。
26.权利要求23~25中任一项的用途，其中所述治疗包括人基因治疗。
27.制备具有增加的功能半衰期的修饰的FVI11或修饰的VWF的方法，包括将加长半衰期的多肽的N-端部分融合到FVIII的主要翻译多肽的C-端部分或融合到VWF的主要翻译多肽的C-端部分。
28.制备下列复合物的方法: 包括修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，或者 包括非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或者 包括修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物， 如下制备: 混合通过权利要求27的方法制备的修饰的FVIII与野生型VWF，或 混合野生型FVIII与通过权利要求27的方法制备的修饰的VWF，或 混合通过权利要求27的方法制备的修饰的FVIII与修饰的VWF。
29.下列物质用于制备同时、分开或依次用于治疗出血障碍，优选用于治疗血友病A和/或冯.维勒布兰德病的联合药物制剂的用途: Ca)通过权利要求27的方法制备的修饰的FVIII及野生型VWF，或 (b)野生型FVIII及通过权利要求27的方法制备的修饰的VWF，或 (c)通过权利要求27的方法制备的修饰的FVIII及通过权利要求27的方法制备的修饰的VWF。
【文档编号】C12N15/62GK103739712SQ201310596839
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2009年6月24日 优先权日:2008年6月24日
【发明者】T·魏默, S·舒尔特, H·米兹尼尔, U·克龙塞勒, H·林德, W·朗 申请人:德国杰特贝林生物制品有限公司