具有延长的体内半寿期的因子ix类似物的制作方法

专利名称：：具有延长的体内半寿期的因子ix类似物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及凝血因子IX(FIX)类似物及衍生物，与天然的因子IX相比，它们在血流中的循环时间延长。
背景技术：
：因子IXa(FIXa)是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，在止血过程中发挥重要作用，它是凝血因子X酶复合物的组成部分，产生大部分的因子Xa,因子Xa在凝血过程中参与凝血酶的形成(见综述(Hoffman和Monroe，III2001))。先天性因子IXa缺乏导致X-连锁出血性疾病-血友病B,男性发病率约为I:IOO，OOO。目前，血友病B的治疗主要是使用重组或血浆凝血因子IX的替代疗法。然而，目前的观点正由传统的按需治疗转变为预防性治疗。当前的预防性治疗需要每周多次给药，但要达到最佳的血浆浓度和药效，最好每天注射一次。但考虑到每天给药的实用性和经济限制，目前尚不能用于患者的治疗。因而，显然需要一种长效的重組因子IX药物。WO2006005058涉及因子IX的一部分与一种或多种分子量为5-150kDa的水溶性聚合物的结合体。WO2006018204涉及修饰的维生素K依赖性多肽，包括修饰的激活肽。WO2004101740涉及嵌合蛋白，至少包括一种凝血因子和部分免疫球蛋白恒定区。WO2005001025涉及嵌合单体-二聚体杂交蛋白，其中该蛋白的第一条多肽链包括部分免疫球蛋白恒定区和生物活性分子，第二条多肽链包括不含生物活性分子的部分免疫球蛋白恒定区。US2006040856涉及因子IX和聚乙二醇的结合，聚乙二醇通过完整的糖基连接起来并连接到多肽和修饰基上。SE9501285A公开了使用一种混合物在体外合成具有适当折叠和二硫化物交联的生物活性蛋白的方法，该混合物包括蛋白二硫化物氧化还原酶(如蛋白二硫化物异构酶(PDI))，谷氧还蛋白和氧化还原体系。参考文献主要是关于参与分子内二疏键形成的半胱氨酸残基。4WO2006/134173涉及至少包含一个非天然半胱氨酸残基的重组工程化蛋白的选择性还原和衍生方法，重组蛋白包括因子IX多肽在内。本发明的目的是提供修饰的FIX类似物或衍生物，与天然FIX相比，它们在血流中的循环时间延长，但仍能维持足够的生物活性参与凝血。发明概述一方面，本发明涉及循环半寿期延长的FIX类似物，其中在下列位点的天然氨基酸残基中至少有一个被结合(conjugate)化学基团的半胱氨酸残基残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加，所述位点为第44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415位。在优选实施方案中，FIX类似物在下列位点的天然氨基酸残基中至少有一个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加，所述位点为第44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80或84位。在另一优选实施方案中，FIX类似物在下列位点的天然氨基酸残基中至少有一个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加，所述位点为第87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141或142位。在另一优选实施方案中，FIX类似物在下列位点的天然氨基酸残基中至少有一个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加，所述位点为第185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、5257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415位。在另一优选实施方案中，FIX类似物在位点146-180的天然^tJ^酸残基中至少有一个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。可以理解，由于位点146-180相当于FIX的活性肽，该活性肽在FIX激活时被释放(remove),那么，对于这样一种FIX类似物，其中在选自位点146-180的天然氨基酸残基中至少有一个被半胱氨酸残基取代，所述半胱氨酸残基结合了使FIX多肽的分子量增加的化学基团，在类似物激活后，所述化学基团将不存在于类似物中。在另一优选实施方案中，FIX类似物在下列位点的天然氨基酸残基中至少有一个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加，所述位点选自第155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177位。在另一优选实施方案中，FIX类似物在下列位点的天然氨基酸残基中至少有一个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加，所述位点选自第160、161、162、163、164、165和166位。在另一优选实施方案中，FIX类似物的氨基酸残基E162被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。另一方面，本发明涉及循环半寿期延长的FIX类似物，其C-末端T415后至少附加一个半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基与化学基团结合，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。在本发明优选实施方案中，与非天然半胱氨酸残基结合的化学基团是聚乙二醇(PEG)。在进一步的优选实验方案中，聚乙二醇的平均分子量是500-100,000,例如1000-75,000或2,000-60,000。优选的FIX类似物，其循环半寿期至少是野生型FIX半寿期的1.5倍。在进行凝血实-险时，本发明优选的FIX类似物，其生物活性至少6是野生型FIX的20%。另一方面，本发明涉及FIX类似物的制备方法，包括以下步骤a)选择性还原工程化(engineered)FIX多肽，该多肽在下列位点至少包含一个非天然半胱氨酸，所迷位点选自第44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415位，所述非天然半胱氨酸残基通过二硫键与低分子量的硫醇(thiol)(RS-CYS)结合，方法是使结合低分子量硫醇的FIX和含有氧化还原緩冲体系的混合物反应；b)同时或其后，将至少一个选择性还原的半胱氨酸(HS-Cys)部分与化学基团结合。在优选实施方案中，制备方法包含氧化还原緩冲体系(redoxbuffer),氧化还原緩冲体系包括含有还原型和氧化型谷胱甘肽的混合物。在进一步的优选实施方案中，氧化还原緩冲体系还包括谷氧还蛋白。另一方面，本发明涉及FIX类似物的制备方法，包括以下步骤a)选择性还原工程化FIX多肽，该多肽在下列位点至少包含一个非天然半胱氨酸，所述位点选自第44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415位，所述非天然半胱氨酸残基通过二硫键与低分子量的硫醇(RS-CYS)结合，方法是使结合低分子量硫醇的FIX和含有三芳基膦-3,3，，3"-三磺酸化合物的混合物反应；b)同时或其后，将至少一个选择性还原的半胱氨酸(HS-Cys)部分与化学基团结合。7在本发明的方法的优选实施方案中，化学基团选自聚乙二醇(PEG),尤其是平均分子量为500-100,000的PEG,例如1000-75,000或2,000-60,000。本发明的另一个方面涉及治疗血友病患者的药物制剂，其中包含有效治疗剂量的本发明的FIX类似物的和药学上可接受的载体。本发明的另一个方面涉及血友病患者的治疗方法，其中包括给予患者有效治疗剂量的本发明的FIX类似物及药学上可接受的载体。在优选实施方案中，治疗方法包括每周至少一次治疗。在另一优选实施方案中，治疗方法包括每周只进行一次的治疗。发明详述FIX是维生素K依赖性凝血因子，结构类似于因子vn、凝血素、因子X和蛋白C。其循环酶原的血浆半寿期约为18-30小时，由415个氨基酸组成，分为四个明显的结构域，包括N-末端富含Y-羧基谷氨酸(Gla)结构域，两个EGF结构域和C-末端胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域。FIX的激活是通过Arg145-Ala146和Arg18Q-Val181位氨基酸的限制性酶切，释放含有35个氨基酸残基的片段，所谓的激活肽(Schmidt和Bajaj2003)。激活肽高度糖基化，包括两个N-连接多糖和高达四个的O-连接多糖。共价修饰，例如聚乙二醇化或脂连接(lipidattachment),已经成功地用于几个蛋白质为基础的制药学中，改进药物的药代动力学和药效学。通过天然或工程化半胱氨酸残基进行的结合，提供了位点特异性的修饰方法，主要是由于蛋白表面缺乏这种半胱氨酸残基和硫醇进行的化学反应具有高度选择性。然而，实际上，这种方法通常是复杂的，原因是加入的半胱氨酸残基与低分子量(LMW)硫醇组成的混合二硫化物如半胱氨酸和谷胱甘肽会抑制随后的修饰反应。因此，就需要一种方法，其中半胱氨酸残基和低分子量硫醇组成的混合二硫化物能够在保护天然二硫键的情况下被化学还原。已经从哺乳动物细胞中分离、表达出人因子IX基因(K.Kumchi和E.W.Davie.编码人因子IX的cDNA的分离与特征描述。PNAS.79(21I):6461-6464,1982;K.H.Choo,K.G.Gould,D.J.Rees,和G.G.8Brownlee;人抗血友病因子IX基因的分子克隆，Nature299(5879):178-180,1982;R.J.Kaufman,L.C.Wasley,B.C.Furie,B.Furie和C.B.Shoemaker;中国大鼠卵巢细胞中合成的重组"羧基因子IX的表达、纯化和特征描述.J.Biol.Chem.261(21):9622-9628,1986.),并从cDNA中推导出氨基酸序列。目前FIX用于血友病B的治疗通常包括每周两次注射，例如在拔牙或手术前^L辅助注射。FIX在血循环中以无活性酶原形式存在，只有出血时才转变成有活性的FIXa。因此，FIX预防性治疗的方法是例如每周注射一次，增加患者血液中FIX的循环时间。这样，患者体内就总会有一定水平的FIX酶原，在任何时候都可以一皮激活，保证正常的凝血过程。本发明的FIX类似物，其修饰方法是用半胱氨酸残基取代FIX中的一个或多个天然氨基酸残基。识别FIX中适于加入半胱氨酸残基的位点要修饰的氨基酸残基位点优选来自相对侧链表面可接触性大于50%的氨基酸残基库。重链和EGF2结构域的表面可接触性从发表的晶体学数据库中计算而来(1PFX,Hopfner等，1999),而EGF1结构域表面可接触性的计算是基于猪FIXa晶体结构的同源模型(1PFX,Bmndstetter等，1995)。另外，激活肽中的氨基酸残基(155-177位残基)，尚无其结构信息的，也被认为是重要的。最近的出版物指出，激活肽这部分片段可以被删除，而不影响FIX的生活活性(Begbie等，2005)。表1中列出了人类FIX中所有相关的氨基酸残基位点。表l.位点特异性修饰的FIX相关位点。'ASA1，(以A"表示)是所有氨基酸残基的可接触位点，'ASA2，(以人2表示)是侧链的可接触位点，'Rel.ASA，是侧链的部分可接触位点。序列按照糜蛋白酶进行编号，与猪FIXa晶体结构的编号(lPFX.pdb)相同。标记有星号(*)或负号(-)侧链，被认为在与FVIIa/TF复合物(Chen,C.W.等，ThrombHaemost.2002;88:74-82.)或FVIIIa(Autin,L.等,J.Thromb.Haem.2005,3:2044-56)的连接中有重要作用。9FIXEO1残基号残基ASAlASA2RelASA标记44GLN98.989.620.6545TYR127.61102.770.56承46VAL92.0379.540.7347ASP120.51105.860.9150GLN94.2981.750.5652GLU137.29121.940.85承53SER110.671.750.8954ASN78.8162.970.54承57LEU94.4685.040.5759GLY64.1647.950.89承61SER57.2947.740.58*66ILE128.4117.580.7767ASN116.6299.470.8668SER65.5263.950.8470GLU104.0898.670.7172TRP143.49135.570.6374PRO109.6291.250.73承80LYS191.42178.010.9984LEU103.2998.380.65FIXEGF2残基号残基ASAlASA2RelASA标记87THR83.5776.410.6689ASN122.2699.360.890ILE8479.820.5391LYS128.196.730.5894ARG151.51138.140.69100LYS118.47114.680.6710101ASN78.9263.60.56102SER8353.180.63103ALA88.6647.670.7104ASP88.4674.730.62105ASN108.1999.740.86106LYS131.06126.340.68108VAL75.4969.940.59113GLU101.3787.960.58116ARG136.07129.020.64119GLU137.93126.990.82120ASN113.5886.880.72121GLN84.29830.57123SER52.4152.410.57125GLU76.1976.190.55129PRO127.1591.630.8138SER99.8772.520.79140THR78.2262.840.6141SER124.1790.361.02142LYS243.38231.320.95FIX重链残基号残基ASAlASA2RelAS185GLU104.18102.680.73186ASP93.0281.460.74188LYS124.37123.070.67189PRO62.1858.270.51201LYS174.2136.050.73202VAL73.9768.060.63203ASP103.2396.570.79224GLU110.0699.470.71225THR136.54115.791.0211228LYS158.34146.180.82239GLU111.987.550.58240GLU105.3695.430.66241THR93.6282.060.72243HIS160.28127.850.82247LYS147.15133.670.73249ASN62.462.40.54252ARG120.71108.770.57257HIS134.8798.770.65260ASN71.463.120.56261ALA62.4544.520.68262ALA94.5349.720.76263ILE141.89110.30.74265LYS100.0299.840.54277GLU104.36104.360.73280VAL102.3798.010.82292ASP72.6259.010.52293LYS115.6115.560.67294GLU107.3101.010.68301LYS146.99124.630.65314PHE120.75120.080.72316LYS165.63138.790.76318ARG170.14155.690.8321LEU98.8295.810.61327ARG120.09116.480.55332ASP79.5160.870.55333ARG148.18139.330.67338ARG188.9160.870.76341LYS220.48183.470.99342PHE118.351060.59343THR92.3277.520.6812346ASN61.2559.080.51354HIS106.42105.150.63355GLU100.5789.470.69372GLU93.7975.650.53374GLU140.35102.570.72391MET108.83100.480.67392LYS160.88145.950.81楊ASN104.2798.780.79410GLU117.1997.590.68413LYS153.75134.030.75415THR201.09182.540.95承承nx激活肽残基号155156157158159160161162163164165166167168169170171残基TyrValAsnSerThrGluAlaGluThrlieLeuAspAsnlieThrGinSer13172Thr173Gin174Ser175Phe176Asn177Asp本发明的FIX类似物较野生型FIX的循环半寿期长。循环半寿期可用技术人员采用已知的方法测量，如McCarthy等，ThrombHaemost.2002May;87(5):824-30中讲述的方法。在优选实施方案中，用同样的实验或模型测量时，本发明FIX类似物的循环半寿期至少是野生型FIX的1.5倍，例如至少1.64咅、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.2倍、2.4倍。此外，本发明的FIX类似物保持了足够的体内凝血生物活性。生物活性可用技术人员已知的方法测量，如McCarthy等，ThrombHaemost.2002May;87(5):824-30中讲述的方法。在优选实施方案中，用同样的实验测量时，本发明FIX类似物的凝血活性至少是野生型FIX的15%,例如至少20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%。突变，表达和纯化FIX类似物可用重组核普酸技术制备。通常，克隆的人核苷酸序列经过修饰，编码所需的FIX类似物，然后与表达载体连接、转化或转染宿主细胞。优选高等真核细胞，尤其是培养的哺乳动物细胞，作为宿主细胞。氨基酸序列的改变方法有很多种。核苷酸序列修饰可采用位点特异性突变方法。位点特异性突变技术在本领域是众所周知的，例如，在Zoller和Smith(DNA3:479-488,1984)或"重叠延伸剪接技术"，Horton等，Gene77,1989,pp.61-68中都有描述。因此，利用FIX的核苷酸序列和氨基酸序列可以进行改变。同样，利用特异性引物，采用多聚酶链反应制备DNA的程序也是本领域技术人员所熟知的(参考PCRProtocols,1990,AcademicPress,SanDiego,California,USA)。编码本发明的FIX类似物的核酸构建体可源自基因组或cDNA，例如，按照标准技术，构建基因组或cDNA文库，用合成的寡核苷酸探针采用杂交方法筛选编码FIX全长或部分片段的DNA序列(参考Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd.Ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989)。编码FIX多肽类似物的核酸体也可用已建立的标准方法合成，例如，Beaucage和Caruthers,TetrahedronLetters22(1981),1859—1869中讲述的亚磷酰胺(phosphoamidite)法，或Matthes等，EMBOJournal3(1984),801-805中讲述的方法。按照亚磷酰胺法，寡核普酸可以在例如DNA自动合成仪中合成，纯化，退火，连接，并克隆到适当的载体上。编码人FIX多肽的DNA序列也可以用特异性引物采用多聚酶链反应合成，例如US4,683,202,Saiki等，Science239(1988),487—491或Sambrook等(同上)中讲述的方法。此外，核酸构建体也可以是混合的合成和基因组核苷酸片段、混合的合成和cDNA核苷酸片段或混合的基因组和cDNA核苷酸片段，方法是按照标准技术，连接合成的、基因组或cDNA来源的核苷酸片段，这些核苷酸片段可以是FIX核苷酸序列全长的各个不同部分。编码FIX多肽的DNA序列通常浮皮插入到重组载体中，重组载体可以是任何载体，也可以是方便用于DNA重组程序的载体，载体的选自通常取决于诱导的宿主细胞。因而，载体可以是具有自我复制功能的，即独立于染色体之外的DNA,其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒。另外一种载体是导入宿主细胞后，整合到宿主细胞染色体DNA中，随着染色体复制而复制。载体优选表达载体，其中编码FIX类似物的DNA序列与载体中用于DNA转录的附加区段可操作连接。通常，表达载体来自质粒或病毒DNA,或两者均有。术语"可操作连接"指的是，排列核苷酸区段，使其功能达到共同目的，例如启动子启动转录，转录合成编码多肽的DNA序列。用于表达FIX类似物的表达载体，包括启动克隆基因或cDNA转录的启动子。启动子可以是在宿主细胞中具有转录活性的任何DNA15序列，也可以是来自宿主细胞中编码同源或异源性蛋白的基因。在哺乳动物细胞中启动编码FIX类似物DNA转录的合适启动子是SV40启动子(Subramam等，Mol.CellBiol.1(1981),854-864)、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等，Science222(1983),809■814)、CMV启动子(Boshart等，Cell41:521-530,1985)或腺病毒2主要晚期启动子(Kaufman和Sharp,Mol.Cell.Biol,2:1304-1319,1982)。必要的话，编码FIX类似物的DNA序列可以可操作地连接到合适的终止子上，如人生长激素终止子(Palmiter等，Science222,1983,pp.809-814)或TPI1终止子(Alber和Kawasaki,J.Mol.Appl.Gen.1,1982,pp.419_434)或ADH3终止子(McKnight等，TheEMBOJ.4,1985,pp.2093-2099)。表达载体也可以含有RNA剪接位点，位于启动子下游，FIX序列插入位点的上游。优选的RNA剪接位点源自腺病毒和/或免疫球蛋白基因。表达载体也含有多聚腺苷酸信号，位于插入位点的下游。优选的多聚腺苷酸信号包括SV40(Kaufman和Sha卬，ibid.)的早期或晚期多聚腺苷酸信号，腺病毒5Elb区的多聚腺苷酸信号，人生长激素基因终止子(DeNoto等，Nucl.AcidsRes.9:3719-3730,1981)或人FIX基因的多聚腺苷酸信号。表达载体也可能含有病毒的非编码先导序列，位于启动子和RNA剪接位点之间，例如腺病毒2的三联先导序列；也可能含有增强子，例如SV40增强子。为了能使本发明的FIX类似物进入宿主细胞的分泌途径，分泌信号序列(也可称为先导序列，信号肽序列或前序列)也应存在于重组载体中。分泌信号序列按正确的读码框架连接到编码FIX类似物的DNA序列上。分泌信号序列通常位于编码多肽的DNA序列的5'端。分泌信号序列通常和编码的蛋白有关，或者来自编码另一种分泌蛋白的基因。连接编码FIX类似物的DNA序列、启动子和终止子、分泌信号序列，并将其插入含有必要复制信息的适当载体中的程序，是本领域的^支术人员所熟^口的(参见例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor，NewYork,1989)。如Kaufman和Sharp,J.Mol.Biol.159(1982),601—621;Southern和16Berg,J.Mol.Appl.Genet1(1982),327-341;Loyter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79(1982),422—426;Wigler等，Cell14(1978),725;Corsaro和Pearson,SomaticCellGenetics7(1981),603,Graham和vanderEb，Virology52(1973),456;Neumann等，EMBOJ.1(1982),841誦845.克隆的DNA序列导入培养的哺乳动物细胞的方法，包括磷酸钙介导的转染(Wigler等，Cell14:725-732,1978;Corsaro和Pearson,SomaticCellGenetics7:603-616,1981;Graham和VanderEb，Virology52d:456-467,1973)或电穿孔法(Neumann等，EMBOJ.1:841-845,1982)。为了识别并筛选表达外源性DNA的细胞，含有筛选表型(筛选标志物)的基因通常和目的基因或cDNA—起导入宿主细胞。优选的筛选标志物包括抗药性基因，如抗新霉素、匀霉素和甲氨蝶呤。筛选标志物可以扩增。优选的可扩增的筛选标志物是二氬叶酸还原酶(DHFR)序列。Thilly对筛选标志物进行了综述(MammalianCellTechnology,ButterworthPublishers,Stoneham,MA,引入本文作为参考)。本领域的技术人员能够很容易的挑选适当的筛选标志物。筛选标志物可以用独立的质粒与目的基因同时导入宿主细胞中，也可以和目的基因使用相同的质粒导入宿主细月包。本领域的技术人员熟知这种结构类型(例如Levinson和Simonsen,U.S.4,713,339)。在导入细胞的混合物中添加额外的DNA也是有利的，被称为"载体DNA"。表达外源性DNA的细胞在适当的培养基中生长1-2天，开始表达目的基因。本文中的术语"适当的培养基"是指含有营养成分和其它细胞生长、FIX类似物表达所需成分的培养基。培养基通常含有碳源、氮源、必须氨基酸、必须的糖、维生素、盐、磷脂、蛋白质和生长因子。然后用药物筛选稳定表达筛选标志物的生长细胞。对于转染了可扩增筛选标志物的细胞，可以加大药物浓度，以筛选拷贝数增加的克隆序列，从而增加表达量。筛选稳定转染的细胞克隆用于FIX类似物的表达。本发明中使用的哺乳动物细胞系，包括COS-1细胞系(ATCCCRL1650),幼仓鼠肾细胞系(BHK)和293细胞系(ATCCCRL1573;Graham等，J.Gen.Virol.36:59-72,1977)。优选的BHK细胞系是tk-17tsl3BHK细！包系(Waechter和Baserga,Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:1106-1110,1982，引入本文作为参考)和下文中提到的BHK570细胞系。BHK570细胞系已经被列入ATCC库中，12301ParklawnDr.,Rockville,Md.20852,在ATCC中的编号为CRL10314。tk-tsl3BHK细胞系在ATCC中的编号是CRL1632。此外，其它多种细胞系也可以用于本发明中，包括鼠HepI(大鼠肝细胞瘤；ATCCCRL1600),鼠HepII(大鼠肝细胞瘤；ATCCCRL1548),TCMK(ATCCCCL139),人肺癌细月包(ATCCHB8065),NCTC1469(ATCCCCL9.1),CHO(ATCCCCL61)和CHO-DUKX细胞系(Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220,1980)。本发明的FIX类似物存在于细胞培养基中，可用本领域中已知的多种方法纯化，但并不局限于这些方法，包括层析法(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水层析、层析聚焦和过滤层析法)，电泳法(例如等电聚焦(IEF)),溶解度分离法(例如，硫酸铵沉淀法)或萃取法(参见蛋白纯化丄-C.Janson和LarsRyden编，VCHPublishers,NewYork,1989)。优选的是，将FIX类似物过抗FIX抗体柱的亲和层析法。其它纯化方法包括常规化学纯化法，例如高效液相色谱法。其它纯化法为本领域所知，可用于本文中新型FIX多肽的纯化。要达到治疗目的，FIX类似物的纯化至少达到约90-95%的均一性(homogeneity),优选的是至少约98%均一性。纯化率可以用凝月交电泳和氨基末端氨基酸测序测定。选择性还原考虑到上述半胱氨酸巯基基团介导的化学结合的困难性(所述巯基基团不参与重组技术制备的蛋白质分子内二硫键形成)，本发明使用氧化还原混合緩冲体系(例如，硫醇-二硫化物聚合氧化还原催化剂)或三芳基膦选择性还原低分子量硫醇和工程化蛋白组成的混合二硫键，该工程化蛋白至少包括一个非天然半胱氨酸，例如，含有工程化或天然半胱氨酸的凝血因子或丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶家族蛋白。混合二硫化物经选择性还原后，产生的游离半胱氨酸可通过本领域的技术人员所知道的蛋白质巯基偶联化学进行结合修饰。工程化或天然半胱氨酸介导的化学结合可以耙向蛋白修饰，产生单一同源性产物。然而，如果半胱氨酸与低分子量硫醇结合后，导致蛋白质分子内二硫键不稳定，那么该措施就不可行。本发明可以选择性去除低分子量硫醇部分，产生游离的半胱氨酸，用于随后的化学修饰。因此，本发明涉及选择性还原工程化FIX的方法，工程化FIX即至少包含一个非天然半胱氨酸的FIX,该FIX包含一个或多个半胱氨酸部分(moiety)，通过二硫键与低分子量硫醇(RS-Cys)结合，该半胱氨酸部分不参与活性蛋白分子内二硫键(Cys-S-S-Cys)的形成，此方法可以使结合低分子量硫醇的蛋白与包含氧化还原緩冲体系的混合物反应。另外，本发明涉及选择性还原工程化FIX的方法，工程化FIX即至少包含一个非天然半胱氨酸的FIX,该FIX包含一个或多个半胱氨酸部分，通过二硫键与低分子量硫醇(RS-Cys)结合，该半胱氨酸部分不参与活性蛋白分子内二硫键(Cys-S-S-Cys)的形成，此方法可以使结合低分子量硫醇的蛋白与包含三芳基膦还原剂的混合物反应。术语"选择性还原"指的是，大部分通过二硫键与低分子量硫醇结合的半胱氨酸部分，如60%、80%、90%或更多，经还原后释放含有巯基的半胱氨酸部分，其易于和其它基团结合，而大部分其它二硫键(主要是分子内二硫键)，如60%、80%、90%或更多，受到保护，这样，工程化蛋白就基本上保持其生物活性。(A)氧化还原緩冲体系如上所述，本发明提供了至少包括一个非天然半胱氨酸残基的工程化蛋白(例如，凝血因子或丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶家族蛋白)的选择性还原方法。涉及的蛋白包括一个或多个半胱氨酸部分，其经二硫键与低分子量硫醇(RS-Cys)结合，该半胱氨酸部分不参与活性蛋白分子内二硫键(Cys-S-S-Cys)形成，此方法包括使结合低分子量硫醇的蛋白与包含氧化还原緩冲体系的混合物反应。本文中术语"氧化还原緩沖体系"一词的意思是，硫醇/二硫化物氧化还原对比例合适，足以还原以破坏蛋白-低分子量硫醇组成的混合19二硫化物(RS-Cys)，并足以氧化以保护蛋白中天然二硫键的完整性。优选地，氧化还原緩冲体系包括低分子量硫醇/二硫化物氧化还原对。术语"低分子量"指的是，氧化还原对中硫醇形式的分子量最多为500g/mol。这些氧化还原对选自(i)还原型和氧化型谷胱甘肽，(ii)还原型和氧化型"谷氨酰半胱氨酸，(iii)还原型和氧化型半胱氨酰甘氨酸，(iv)还原型和氧化型半胱氨酸，(v)还原型和氧化型N-乙酰半胱氨酸，(vi)半胱胺，(vii)二氢硫辛酰胺/硫辛酰胺，优选(i)还原型和氧化型谷胱甘肽。最佳的氧化还原条件可以用本领域技术人员所知的蛋白氧化还原滴定来确定，参见Gilbert(1995)。在实施方案中，氧化还原緩冲体系包含还原型和氧化型谷胱甘肽氧化还原对，还原型谷胱甘肽浓度为0-100mM,还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比率是2-200。在另一实施方案中，氧化还原緩冲体系包含还原型和氧化型谷胱甘肽氧化还原对，还原型谷胱甘肽浓度为0-100mM,如0.01-50mM,氧化型谷胱甘肽的浓度是0-5mM，如0.001-5mM。对于因子IX多肽，还原型谷胱甘肽的浓度优选为0-5mM,如0.01-2mM,氧化型谷胱甘肽的浓度为0.001-2mM,如0.001-0.200mM。由于根据反应动力学，谷胱甘肽和其它低分子量硫醇通常是弱还原剂/氧化剂，混合物中最好含有硫醇/二硫化物氧化还原催化剂，与氧化还原緩冲体系一起作用，提高反应速率。混合物里的硫醇/二硫化物氧化还原催化剂包括二巯基型和单巯基型谷氧还蛋白。谷氧还蛋白及其功能在Fernandes等(2004)中有讲述。有用的谷氧还蛋白选自埃希氏菌属的Grxl、Grx2或Grx3(Holmgren等，1995)，啤酒酵母的Grxlp、Grx2p、Grx3p、Grx4p和Grx5p(Luikenhuis等，1998;Rodriguez画Manzaneque等，1999;Grant,2001),人类的Grxl和Grx2(Padilla等，1995;Lundberg等，2001)及其各种变异体。变异体包括，但不局限于这些，二巯基型谷氧还蛋白，其c-末端cxxc结构域的半胱氨酸残基被另一种氨基酸残基通常是丝氨酸残基取代(参见Yang等,1998)。氧化还原催化剂(尤其是谷氧还蛋白)优选的使用浓度为0.001-2020jiM。混合物里最好不要包含蛋白质二硫化物异构酶(PDI)。氧化还原緩冲体系也可包括其它一些成分，例如盐，pH緩冲体系等，本发明的方法可以在任何温度下实施，这些温度适于所涉及的蛋白，例如，-5°C至50。C,例如0°C至37。C，.当然，选用何种温度取决于蛋白在该温度下的稳定性。(B)三芳基膦还原剂如上所述，本发明提供了至少包括一个非天然半胱氨酸残基的工程化蛋白(例如凝血因子或丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶家族蛋白)的选择性还原方法。涉及的蛋白包括一个或多个半胱氨酸部分，其经二硫键与低分子量硫醇(RS-Cys)结合，该半胱氨酸部分不参与活性蛋白分子内二硫键(Cys-S-S-Cys)的形成，此方法包括使结合低分子量硫醇的蛋白与三芳基膦还原剂反应。术语"三芳基膦还原剂"指的是任选被一个或多个取代基取代的三芳基膦。三芳基膦还原剂的芳基基团优选自苯基、萘基、1,2,3,4-四氢化萘基、蒽基、苯蒽基、芘基、苯芘基、芴基、占p屯基，尤其是苯基，在当前挑选出的实施方案中，三个芳基基团是相同的。在当前最有意义的实施方案中，三芳基膦的三个芳基基团都来自苯基。芳基基团尤其是苯基中的取代基，通常选自磺酸、羧酸、d—6-烷基、d-6-烷氧基、C^-烷氧基-d-6-烷基、C3-6-亚烷基(alkylene)(含有两个相邻芳基碳原子的环)或Cw-亚烷基氧基(含有两个相邻芳基碳原子的环)或d_4-亚烷基-氧基-d—4-亚烷基(含有两个相邻芳基碳原子的环)。在当前最有意义的实施方案中，至少有一个芳基(如苯基)存在至少一个取代基，这些取代基选自磺酸和羧酸，尤其是磺酸；取代基最好位于磷原子键的间位。优选地，三个芳基基团都含磺酸取代基，而且至少有一个取代基位于磷原子键的对位，尤其是氧取代基。目前认为芳基基团还原剂不存在位于磷原子键邻位的取代基。术语"d-6-烷基"指的是含有1-6个碳原子的直链或支链饱和烃残21基。尤其是曱基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基等。同样地，"d-4-烷基，，指的是含有1_4个碳原子的直链或支链饱和烃残基。"d—6-亚烷基"、"C2-6-亚烷基"等分别为"d-6-烷基"、"C2-6-烷基"的二元基团。适当的三芳基膦还原剂在还原性和空间位阻之间存在着较好的平衡。三芳基膦的化学性质是，切开蛋白质-低分子量硫醇组成的混合二硫化物(RS-Cys),而保护天然蛋白二硫键的完整性。有意义的化合物是三芳基膦三磺酸，例如三苯基膦-3,3，,3，，-三磺酸及其类似物。举例说明，三芳基膦还原剂选自三苯基膦-3,3，,3，，-三磺酸及其类似物，如下列9-11化合物中之一。三芳基膦还原剂优选使用浓度为0.001-100mM,如0.01-50mM或0.1-25mM。在一项有意义的实施方案中，三芳基膦还原剂固定在载体上。这有利于还原剂与蛋白质分离。通常，三芳基膦还原剂，如9-11化合物，用本领域技术人员已知的方法固定，如在其中一个芳基基团中引入一个连接基。三芳基膦还原剂12就是还原剂1的一个连接变异体。反应温度通常是0-40。C,如室温，反应时间为5秒钟-几天，随具体情况而定。反应之后进行高效液相色镨分析，确定是否发生转变。溶剂优选水溶液，含有DMSO或DMF等助溶剂。溶剂也可含有盐，如4丐盐。R=H,Me，Et,Pr'2-Pr,Bu,Me。，EtO,PrO,2扁PrO,BuO.结合(conjligation)上述选择性还原方法的一个重要目的就是释放半胱氨酸基团，用于化学基团(如非多肽部分)的连接(结合)。因此，在一项重要的实施方案中，在选择性还原的同时或随后，将至少一个选择性还原的半胱氨酸(HS-Cys)部分与化学基团结合。应当理解，至少一个选择性还原的半胱氨酸残基与化学基团的结合可以与选择性还原同时进行，也可以随后进行，同时进行就是在含有氧化还原緩冲体系的混合物中加入一种或多种参与结合反应的试剂，随后进行就是在选择性还原蛋白经纯化或分离后。在一个实施方案中，化学基团是延长作用基(protractorgroup),即该基团结合到蛋白质(如因子IX多肽)上后，能够相比较未修饰的蛋白或多肽而言延长蛋白或多肽的循环半寿期。延长作用的特定原理可能是，使多肽序列变大，隐蔽多肽酶或抗体识别的位点，或使多糖分子变大，将其隐蔽，不被肝细胞或巨嗜细胞表面的多糖特异性受体识别，防止或减少它们的清除。在本发明的实施方案中，延长作用基选自(a)有机带电小分子(15-l，000Da),可包括一个或多个羧酸，磺酸胺，磷酸或其结合。(b)中性亲水性小分子(15-1,000Da),如环状糊精，或任选含有支链的聚乙烯链。(c)疏水性小分子，如脂肪酸或胆汁酸及其衍生物。(d)平均分子量为2,000-60,000Da的聚乙二醇。(e)定义明确的精密(precision)聚合物，如分子量精确为700-20，000Da的树状分子，更优选的是分子量为700-10，000Da。(f)基本上无免疫原性多肽，如清蛋白或抗体或任选含有Fc片段的抗体的部分。(g)大分子有机聚合物，如右旋糖酐。在本发明的另一实施方案中，延长作用基选自树状分子或聚亚烷基氧化物(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG),含支链的PEGs,聚乙烯醇(PVA),聚羧酸脂，聚乙烯吡咯酮，聚乙烯-顺丁烯二酸酐，聚苯乙烯-顺丁烯二酸肝和右23旋糖酐，右旋糖酐包括羧甲基葡聚糖。在本发明的一项有意义的实施方案中，延长作用基是PEG基团。术语"支链聚合物"或"树状聚合物"、"树状分子"或"树状结构"指的是有些含有支链的单体聚合而成的有机聚合物。在本发明的实施方案中，延长作用基选自由血清蛋白配体组成的基团，这些配体包括结合到白蛋白上的化合物，如脂肪酸，C5-C24月旨肪酸，脂肪族二元酸(如C5-C24)。其它延长作用基包括有机小分子或中性取代基，有机小分子含有在生理条件下电荷能发生改变的部分，例如羧酸或胺，中性取代基能防止多糖的特异性识別，如较小的烃基取代基(例如Cl-C5烷基)。在一项实施方案中，延长作用基是白蛋白。在一项实施方案中，化学基团是非多肽。在一项有意义的实施方案中，化学基团是聚乙二醇(PEG),尤其是平均分子量为500-100,000的PEG，如1,000-75，000或2,000-60,000。结合反应可以按照WO02/077218Al或WO01/58935A2中公开的方法进行。PEG可以用作与蛋白结合的化学基团。术语"聚乙二醇"或"PEG"指的是，聚乙二醇化合物及其衍生物，含或不含偶合剂，偶合或激活一些基团(如硫醇、三氟甲磺酸、三氟乙磺酸、氮丙环、环氧乙烷、硫代吡啶、乙烯砜，优选马来酰亚胺)。化合物如马来酰亚胺基单甲氧PEG就是本发明中一种有活性的PEG化合物。PEG是合适的聚合物分子，因为与多糖如右旋糖肝相比，它所含的具有交叉反应的基团很少。尤其是，单功能的PEG,如单甲氧基聚乙二醇(mPEG)很有意义，因为它的结合化学反应相对简单(只有一个反应基参与多肽表面基团的结合反应)。因此，交叉反应减少，目的多肽结合产物的同源性更大，聚合物分子与多肽的反应也更容易控制。为了使聚合物分子结合到多肽上，活化型的聚合物分子含有羟基末端，即反应活性基。有商业化的活化聚合物分子，如Shearwater公司，Huntsville,Ala.,USA或PolyMASCPharmaceuticalsplc,UK公司提供的活化聚合物分子。或者，可以用本领域已知的传统方法激活聚24合物分子，如WO90/13540中公开的方法。本发明中使用的线型或支链活化聚合物分子在Shearwater公司1997和2000的目录(具有生物功能的聚合物用作研究和药物，聚乙二醇及其衍生物，仅作参考)中有讲述。活化PEG聚合物包括下列线型PEGs:NHS-PEG(如SPA-PEG、SSPA-PEG、SBA國PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC誦PEG、SG國PEG和SCM誦PEG)，和NOR-PEG)，BTC-PEG、EPOX-PEG、NCO誦PEG、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS曙PEG、IODO-PEG和MAL-PEG;和支链PEGs,如PEG2-NHS,以及U.S.Pat.No.5,932,462和U.S.Pat.No.5,643，575中公开的PEGs,这两种出版物仅供参考。此外，下列出版物，仅供参考，也公开了有用的聚合物分子和/或PEG化的化学物U.S.Pat.No.5,824,778、U.S.PatNo.5,476,653、WO97/32607、EP229,108、EP402,378、U.S.Pat.No.4,902,502、U.S.Pat.No.5,281，698、U.S.Pat.No.5,122,614、U.S.Pat.No.5,219,564、WO92/16555、WO94/04193、WO94/14758、WO94/17039、WO94/18247、WO94/28024、WO95/00162、WO95/11924、WO95/13090、WO95/33490、WO96/00080、WO97/18832、WO98/41562、WO98/48837、WO99/32134、WO99/32139、WO99/32140、WO96/40791、W〇98/32466、WO95/06058、EP439508、W〇97/03106、WO96/21469、WO95/13312、EP921131、U.S.Pat.No.5,736,625、WO98/05363、EP8099%、U.S.Pat.No.5,629,384、WO96/41813、WO96/07670、U.S.Pat.No.5,473,034、U.S.Pat.No.5,516，673、EP605963、U.S.Pat.No.5,382,657、EP510356、EP400472、EP183503和EP154316。多肽和活化聚合物分子可用传统方法结合，如下面参考文献中讲(1991),"蛋白固定化，基础和应用，，，MarcelDekker,N.Y.;S.S.Wong,(1992)，"蛋白质偶合(conjugation)和交联化学，，，CRCPress,BocaRaton;G.T.Hermanson等，(1993),"固定化亲和配体技术",AcademicPress,N.Y.。技术人员知道活化方法和/或结合化学反应取决于多肽的附加基团(如上所述)和聚合物的功能基团(如，胺、羟基、羧基、乙醛基、巯基、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、乙烯砜或卤代乙酸)。聚乙二醇化可用于多肽表面附加基团(即这些附加基团暴露于多肽表面)的共价25修饰，或一个或多个特异的附加基团，如N-末端氨基酸(U.S.Pat.No.5,985,265)的共价修饰。此外，结合可以一步完成，也可以分步完成(如WO99/55377中所述)。应当理解，聚乙二醇化的目的是产生最佳的分子，包括PEG分子的数量、大小、形式(无论是线型还是支链型)以及多肽中PEG分子的结合位置。考虑到所要到达的效果，要选择分子量合适的聚合物。例如，如果结合反应的主要目的是产生高分子和较大的结合物(如减少肾清除率)，那么就可以将一个或一些高分子聚合物结合起来，或者将大量的低分子聚合物结合到一起。在实施方案中，使用几个低分子聚合物。这种情况也适用于大量的抗原决定簇需要隐蔽时。在这种情况下，要用到分子量约5,000Da的聚合物2-8个，如3-6个。在下面的例子中，要达到延长多肽体内半寿期的效果，使用大量低分子聚合物(如4-6个MW为5,000的聚合物)比使用少数几个高分子聚合物((如1-3个MW为12,000-20,000的聚合物)更有利，即使这两种情况产生的多肽总的分子量相同或相近。据人们所知，与单个高分子聚合物相比，大量低分子聚合物可以使多肽的直径或表观大小变大，至少当聚合物相对均匀地分步于多肽表面时是这样的。进一步发现，当本发明的大部分结合物的表观大小(也叫"表观分子量，，或"表观质量，，)至少为约50kDa,如约55kDa、60kDa、66kDa时，产生的结果更好。原因是，当结合物的表观大小足够大时，就基本消除其肾清除率。在本文中，蛋白结合物或因子IX多肽的"表)(见大小"可用SDS-PAGE电泳测定。此外，据报道，聚合物结合过多会导致化学基团(如非多肽)结合蛋白(如因子IX多肽)的活性丢失(如下所述)。解决此问题的方法是，去除位于功能位点的附加基团或者在结合前可逆地封闭功能位点，使得结合时功能位点被封闭。特异地说，就是用辅助分子如丝氨酸蛋白酶抑制剂封闭蛋白的功能位点后，再将蛋白和化学基团(如非多肽)结合。优选地，辅助分子能特异性识别蛋白的功能位点，例如受体或抑制剂的活性部位，从而保护催化三元体周围的区域(位于催化三联体原子IOA位的氨基酸残基)。辅助分子也可以是抗体，尤其是识别蛋白(如因子IX多肽)的单26克隆抗体。尤其是，辅助分子为中和性单克隆抗体。优选的是，蛋白在与化学基团结合前先与辅助分子结合。(使用和混合二硫化物还原反应中相同的辅助分子(如抑制物)更有利)。这样就能确保蛋白的功能位点受到屏蔽或保护，不能用于化学基团(如非多肽)如聚合物的结合。与辅助分子结合后，化学基团就可以和至少有一部分功能位点受到保护的蛋白结合。制剂和给药方式本发明的其中一方面涉及药物制剂，包括FIX类似物的干燥剂型，为何医生或患者在使用之前要加溶剂和/或稀释剂。"干燥剂型，，指的是流体药物或制剂经冷冻干燥(即冻干法，参见Williams和Polli(1984)J.ParenteralSci.Technol.38:48-59),喷雾干燥(参见Masters(1991)inSpray-DryingHandbook(5thed;LongmanScientificandTechnical,Essez,U.K.),pp.491-676;Broadhead等(1992)DrugDevel.Ind.Pharm.18:1169-1206;andMumenthaler等(1994)Pharm.Res.11:12-20),或空气干燥(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology25:459-470;和Roser(1991)Biopharm.4:47-53)。本发明的另一方面涉及药物制剂，包括FIX类似物的水溶液和緩冲体系，其中，FIX类似物的浓度为0.01mg/ml或以上，其中该制剂的pH值为约2.0-10.0。在本发明的另一实施方案中，緩沖体系选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、双甘氨肽、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、二氢磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、三羟甲基氨基甲烷、N-二(羟乙基)甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、苹果酸、琥珀酸盐、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、天冬氨酸或它们的混合物。每种特异的緩冲体系都可以组成本发明的一项实施方案。在本发明的另一实施方案中，制剂包括配药学上可接受的防腐剂。防腐剂选自苯酚、邻甲酚、间甲酚、对曱酚、对羟基苯曱酸曱酯、对羟基苯曱酸丙酯、2-苯氧乙醇、对羟基苯曱酸丁酯、2-苯乙醇、苯曱醇、氯丁醇、硫柳汞、溴硝醇、苯曱酸、咪脲、氯己定、脱氢醋酸钠、氯化甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、氯化千乙铵、3口-氯化苯氧丙烷-1,2-二醇，及其混合物。在本发明的实施方案中，防腐剂的浓度分别为O.lmg/ml-20mg/ml、0.1mg/ml-5mg/ml、5mg/ml-10mg/ml、10mg/ml-20mg/ml。每种特异的防腐剂都能组成本发明的一项实施方案。药物组合物里使用防腐剂是技术人员熟知的。为方便，可以参考Remington:77zeiScz'e/7ceaw<i尸n2c/7ceq/尸/zarmacy,19thedition,1995。在本发明的另一实施方案中，制剂包括等张溶剂(isotonicagent)。等张溶剂选自盐、糖或糖醇、氨基酸(L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、醛醇(如丙三醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)、聚乙二醇(如PEG400)及其混合物。单糖、双糖、或多糖、或水溶性葡聚糖，例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、戊醛糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖肝、支链淀粉、糊精、环式糊精、可溶淀粉、羟乙基淀粉、羧甲基纤维素等也可以使用。在实施方案中，添加的糖是蔗糖。糖醇是至少含有一个羟基的C4-C8烃，例如甘露醇、山梨醇、纤维醇、半乳糖醇、己六醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在实施方案中，添加的糖醇是甘露醇。上面提到的糖或糖醇可以单独或联合使用。使用的量没有明确限制，只要糖或糖醇溶于流体中，并且不会对本发明的方法产生的稳定效果起反作用。在实施方案中，糖或糖醇的浓度约为1mg/ml-150mg/ml。在本发明的进一步实施方案中，等张溶剂的浓度分别为1mg/ml-50mg/ml、1mg/ml-7mg/ml、8mg/ml-24mg/ml、25mg/ml-50mg/ml。每种特异的等张溶剂都能组成本发明的一项实施方案。药物组合物里使用等张溶剂是技术人员熟知的。为方便，可以参考Remington:7TzeS".ewce朋c/尸rac"ceq/"尸/^画qy,19thedition,1995。在本发明的另一实施方案中，制剂包括螯合剂。螯合剂选自乙二胺四乙酸盐(EDTA)、柠檬酸、天冬氨酸及其混合物。在本发明的实施方案中，螯合剂的浓度分别为0.1mg/ml-5mg/ml、0.1mg/ml-2mg/ml、2mg/ml-5mg/ml。每种特异的螯合剂都能组成本发明的一项实施方案。药物组合物里使用螯合剂是技术人员熟知的。为方1"更,可以参考Remington:ZTzeiSc/e"ce尸n2c"ce0/尸/zarm"cy,'19thedition,1995。28在本发明的实施方案中，制剂包括稳定剂。药物组合物里使用稳定剂是技术人员熟知的。为方便，可以参考Remington:77^Sc/e"ce/V(2c"ce0/尸/zarmacy,19thedition,1995。本发明的药物组合物里还包括一定量的氨基酸基Ominoacidbase),能够减少药物储存时多肽聚集体的形成。"氨基酸基"指的是单个氨基酸或氨基酸的组合，这些氨基酸可以是游离基(base)形态，也可以是盐形态。如果是氨基酸的组合，所有的氨基酸都可以是游离基形态或者盐形态，或者一部分氨基酸是游离基形态，而其它氨基酸是盐形态。在一个实施方案中，本发明使用的氨基酸是侧链带电荷的氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。一些特殊氨基酸(如甘氨酸、蛋氨酸、组氨酸、咪唑氨基酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸和它们的混合物)的立体异构体(即左旋、物里，:口、要这些特殊氨i酸二游离基形态i盐形态存在。在S施方案中，使用的是左旋立体异构体。本发明也可以使用这些氨基酸的类似物。"氨基酸类似物"指的是天然氨基酸的衍生物，这些天然氨基酸能够减少本发明的流体药物组合物在储存过程中多肽聚集体的形成。合适的精氨酸类似物包括胍氨酸，鸟氨酸，N-乙基左旋精氨酸，合适的蛋氨酸类似物包括乙硫氨酸，丁硫氨酸，合适的半胱氨酸类似物包括S-甲基左旋半胱氨酸。和其它氨基酸一起，这些氨基酸类似物以游离基形态或盐形态被添加到药物组合物里。在本发明的实施方案中，所使用的氨基酸或氨基酸类似物的浓度，足以防止或延迟蛋白的聚集。在本发明的实施方案中，如果治疗作用的多肽至少包括一个易于被氧化的蛋氨酸残基，那么添加蛋氨酸(或其它含硫氨基酸或其类似物)就可以抑制蛋氨酸残基氧化成蛋氨酸亚砜。"抑制，，指的是，随着时间的延长，使蛋氨酸氧化产物的积聚最少。抑制蛋氨酸氧化能更持久地保持多肽的分子形态。也可以使用蛋氨酸的立体异构体(如左旋、右旋或外消旋异构体)或它们的组合。使用的量应当足以抑制蛋氨酸残基的氧化，使产生的蛋氨酸亚砜的量达到管理机构的要求。一般来说，这意味着药物组合物里蛋氨酸亚砜的含量不超过约10%-30%。通常，添加的蛋氨酸和蛋氨酸残基的比率约为1:1-1000:1，如10:1-29约100:1就能达到要求。在本发明的实施方案中，制剂包括稳定剂，稳定剂选自高分子聚合物或低分子化合物。在本发明的实施方案中，稳定剂选自聚乙二醇(如PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯酮、羧基-氧化纤维素或它们的衍生物(如羟丙基纤维素、HPC-SL、HPC-L和羟丙基曱基纤维素)、环式糊精，含硫物质如硫代甘油、巯基乙酸、甲基硫代乙醇和各种盐(如氯化钠)。每种特异的稳定剂都能组成本发明的一项实施方案。药物组合物也包括稳定剂，进一步提高具有治疗作用的活性多肽的稳定性。本发明使用的稳定剂包括蛋氨酸和EDTA，但不局限于这些，防止多肽的蛋氨酸残基被氧化，也包括非离子型表面活性剂，防止在冻融或机械剪切过程中多肽发生聚集。在本发明的实施方案中，制剂包括表面活性剂。表面活性剂可以是去垢剂、乙氧基蓖麻油、聚乙二醇甘油酯、乙酰基甘油一酯、山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯嵌段共聚物(如泊洛沙姆，包括PluromcF68、泊洛沙姆188和407,TritonX-100)、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯和聚乙烯的烷基和烷氧基衍生物(吐温如吐温-20,吐温-40，吐温-80和Brij-35)、甘油一酯或其乙氧基化书f生物、甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物、乙醇、甘油、植物凝血素和磷脂(如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和鞘磷脂)、磷脂衍生物(如二棕榈酰磷脂酸)和溶血磷脂(如棕榈酰溶血磷脂酰-L-丝氨酸和1-酰基-磷脂酰乙醇胺、胆碱、丝氨酸或苏氨酸)和溶血磷脂、卵磷脂的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物，如溶血卵磷脂，二棕榈酰磷脂酰胆碱的十二酰和十四酰衍生物，和极性基团的修饰，如胆碱，乙醇胺，磷脂酸，丝氨酸，苏氨酸，甘油，肌醇，和带正电荷的DODAC,DOTMA，DCP,BISHOP,溶血磷脂酰丝氨酸，溶血磷脂酰苏氨酸，甘油磷脂(如脑磷脂)，甘油糖脂(如半乳糖吡喃糖苷)，神经鞘糖脂(如神经酰胺，神经节苷脂)，十二烷基磷脂酰胆碱，鸡蛋溶血卵磷脂，梭链孢酸衍生物(如牛磺二氬褐霉酸钠等)，长链脂肪酸及其C6-C12盐(如油酸和辛酸)，酰基肉碱及其衍生物，赖氨酸、精氨酸或組氨酸的Na-酰基衍生物，或30赖氨酸、精氨酸的侧链酰基衍生物，二肽的isr-酰基衍生物，二肽包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸和中性或酸性氨基酸的任一组合，三肽的Na-酰基衍生物，三肽包括中性氨基酸和两个带电荷氨基酸的任一组合，DSS(琥珀辛酯钠，CAS登录号为[577-11-7];琥珀辛酯4丐，CAS登录号为[128-49-4];琥珀辛酯钾，CAS登录号为[7491-09-0]),SDS(十二烷基磺酸钠)，辛酸钠，胆汁酸及其衍生物，胆汁酸及其盐和甘氨酸或牛磺酸结合物，胆烷酸，胆酸钠，脱氧胆酸钠，牛黄胆酸钠，甘胆酸钠，N-十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-l-丙磺酸盐，单价阴离子表面活性剂(烷基-烷基-磺酸盐)，两性离子表面活性剂(如N-烷基-N,N-二曱胺-l-丙磺酸盐，3-胆氨-l-丙基二甲胺-l-丙磺酸盐)，阳离子表面活性剂(季铵)(如十六烷基-三甲基溴化铵，十六烷基吡啶氯化物)，非离子型表面活性剂(如十二烷基(3-D-喃葡萄糖)和聚氧乙烯聚氧丙烯乙二胺共聚物(如Tetronic，s),泊洛沙胺(poloxamines)是四功能化合物的嵌段共聚体，是由环氧丙烯和环氧乙烯连续连接到乙二胺上组成的，或者表面活性剂可选自咪唑啉的衍生物，或者它们的混合物。每种特异的表面活性剂都能组成本发明的一项实施方案。药物组合物里使用表面活性剂是技术人员熟知的。为方便，可以参考Remington:77zeS".ewceaw<i尸rac〃ceo/尸/z"，aqy,19edition,1995。其它成分也可以用于本发明的药物制剂里，包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、疏松剂、增强剂、螯合剂、金属离子、油质物、蛋白质(如人血清白蛋白、胶质蛋白等)和两性离子(如三甲铵乙内酯、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然，这些添加剂不能对本发明药物制剂总的稳定性起反作用。胃肠道外给药方式包括皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射或静脉注射，可以使用钢笔型注射器注射，也可以使用输液器注射。另外一种胃肠道外给药方式是，FIX化合物的溶液或悬液通过鼻腔或肺喷雾给药。含有FIX化合物的药物也适用于经皮肤给药，如无针注射或离子导入疗法，或经粘膜给药，如经口腔粘膜给药。定义"因子IX，，或"FIX"在本文中指的是人血浆因子IX糖蛋白，它是内原性凝血途径的一员，是凝血过程必需的。应当理解，该定义包括天然和重组形式的人血浆因子IX糖蛋白。除非另有规定或说明，这里所说的因子IX是指任何在凝血过程中发挥正常作用的有功能的人因子IX蛋白分子，包括任何片段，类似物及其衍生物等。"天然FIX"指的是SEQIDNO:l中给出的人FIX分子全长。根据SEQIDNO:l对氨基酸残基位置进行编号，氮末端的第一个氨基酸残基编号为1,依次类推。术语"类似物"指的是含有SEQIDNO:l中氨基酸序列的因子FIX,其中母蛋白的一个或多个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代，或一个或多个氨基酸残基被去除，或一个或多个氨基酸残基插入母蛋白中，或一个或多个氨基酸残基加入母蛋白中。这个增加可能发生在母蛋白的N-末端、C-末端或两者都有。这种定义下的"类似物"，其活化型仍具有FIX的活性。在实施方案中，变异体的氨基酸序列与SEQIDNO:1中氨基酸序列的同一性分别达到70%,80%,90%和95%。本文中提及的特异位置均指与SEQIDNO:l中相应的位置。除非另有说明，因子IX结构域包括以下氨基酸残基谷氨酸结构域，包括从残基Tyrl到残基Lys43的区域；EGF1结构域，包括从残基Gln44到残基Leu84的区域；EGF2结构域，包括从残基Asp85到残基Argl45的区域；激活肽结构域，包括从残基Ala146到残基Argl80的区域；蛋白酶结构域，包括从残基Val181到残基Thr414的区域。轻链是指包括谷氨酸结构域，EGF1和EGF2结构域在内的区域，而重链是指蛋白酶结构域。"FIX半寿期，，是指因子IX在血循环中的半寿期，是本领域的技术人员采用已知的标准程序，根据药代动力学，对人或动物如老鼠进行测量得到的。"FIX活性，，或"FIX的生物活性，，的定义为,在血液凝固中发挥作用的能力，包括在活化血小板表面与FVIIIa相互作用，激活FX成FXa，并促进血凝块形成。这种活性可以在体外通过凝血实验测定，如McCarthy等，ThrombHaemost.2002May;87(5):824画30中讲述的方法，也可以用其它本领域的4支术人员已知的方法测定。32"延长型FIX"是指FIX化合物，与天然的人FIX相比，其给药后在患者体内的循环时间延长。术语"插入型氨基酸残基"包括两种，一种是取代天然FIX分子中天然氨基酸残基的插入型氨基酸残基，该氨基酸残基通常不会出现在该位点；另一种是在天然人FIX分子中新插入的氨基酸残基。这个新插入的氨基酸残基可以在两个原氨基酸残基中间，也可以在天然FIX分子的N-末端或C-末端。术语"聚乙二醇化FIX"指的是结合PEG分子的FIX。"半胱氨酸聚乙二醇化FIX"指的是含有与FIX分子中外源性半胱氨酸残基巯基结合的PEG分子的FIX。本文用到的氨基酸取代的术语如下第一个字母代表出现在人FVIII中的天然氨基酸残基。后面的数字代表氨基酸残基在人FIX中的位置。第二个字母代表取代天然氨基酸残基的不同氨基酸残基。如E162C,指的是人FIX第162位的赖氨酸残基被半胱氨酸残基取代。在本文中，使用三个字母或一个字母的氨基酸残基传统筒称形式，如表2所示。除非有特别说明，本文所提到的氨基酸残基都指左旋氨基酸残基。此外，除非另有说明多肽氨基酸残基序列的左右两端分别是指N-末端和C-末端。表2:氨基酸残基的简称:<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>术语"低分子量硫醇-结合(RS-Cys)形式"和类似的术语指的是所涉及的蛋白质中半胱氨酸残基的巯基与含巯基的化合物结合，其中该化合物的分子量小于500Da。这类化合物包括谷胱苷肽，"谷氨酰半胱氨酸，半胱氨酰甘氨酸，半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸，半胱胺等。术语"活化型"指的是能够发挥所需作用的蛋白质形态，例如催化剂(酶)，酶原，或辅助因子等。"活化型，，有时也被称为"正确折叠形态"。蛋白质通常是"工程化，，多肽，与天然蛋白相比至少包含一个非天然半胱氨酸残基。这种"工程化"多肽优先采用重组技术制备，这种技术是本领域的4支术人员所熟知的，参见WO02/077218Al和WO01/58935A2。本文引用的所有参考资料包括出版物，专利申请和专利的全部内容均通过引用结合到本文中，正如每一份参考资料均单独并特别的通过引用结合并在本文中列出其全部内容。本文使用的所有标题和副标题都只为方便，无i仑如何都不应纟皮理解为限制发明。本文提供的任何以及所有实例或者示例性语言(例如，"如")只是为了更好地阐述本发明，除非另有声明，并不限制发明的范围。本说明书中的语言不应理解为指明任何对本发明的实施非常必要的未声明要素。本文引用并整合专利文献只是为了方便，并不反映任何针对专利文献合法性、专利性或执行性的观点。本发明包括附属权利要求中所列主题的所有修改版和等价物，是法律所允许的。本发明的实施方案1.循环半寿期延长的FIX类似物，其中在位点44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415的天然氨基酸残基中至少有一个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。2.实施方案1的FIX类似物，其中在位点44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80或84的天然氨基酸残基中至少有一个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。3.实施方案1的FIX类似物，其中在位点87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141或142的天然氨基酸残基中至少有一个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。4.实施方案1的FIX类似物，其中在位点185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415的天然氨基酸残基中至少有一个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。5.实施方案1的FIX类似物，其中在位点146-180的天然氨基酸残基中至少有一个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。6.实施方案1的FIX类似物，其中在选自位点155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176或177的天然氨基酸残基中至少有一个一皮结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。7.实施方案1的FIX类似物，其中在选自位点160、161、162、163、164、165和166的天然氨基酸残基中至少有一个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。8.实施方案7的FIX类似物，其中E162位的氨基酸残基被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增力口。9.循环半寿期延长的FIX类似物，其中至少一个半胱氨酸残基附加在C-末端T415上，该半胱氨酸残基与化学基团结合，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。10.上述任一实施方案的FIX类似物，其中化学基团选自聚乙二醇(PEG)。11.实施方案10的FIX类似物，其中聚乙二醇的平均分子量为500-100,000,例如1000-75,000或2,000-60,000。12.上述任一实施方案的FIX类似物，其中类似物的循环半寿期至少为野生型FIX的1.5〃浩。13.上述任一实施方案的FIX类似物，用凝血实4全测定时，其中类似物的生物活性至少为野生型的20%。14.一种制备上述任一实施方案的FIX类似物的方法，包括a)选4奪性还原工程化FIX多肽，该多肽在选自44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、36341、372、374、391、392、406、410、413或415之一的位点至少包括一个非天然半胱氨酸残基，其通过二硫键与低分子量硫醇(RS-CYS)结合，方法是使低分子量硫醇结合的FIX与包含氧化还原緩冲体系的混合物反应；b)与之同时或随后，将至少一个选择性还原的半胱氨酸.(HS-Cys)部分与化学基团结合。15.实施方案14的方法，其中氧化还原緩冲体系包括含有还原型和氧化型谷胱甘肽和谷氧还蛋白的混合物。16.—种制备实施方案1-13中任一方案的FIX类似物的方法，包括a)选才奪性还原工程化FIX多肽，该多肽在选自44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415之一的位点至少包括一个非天然半胱氨酸残基，其通过二硫键与低分子量硫醇(RS-CYS)结合，方法是使低分子量硫醇结合的FIX与包含三芳基膦3，3，,3"-三磺酸化合物的混合物反应；b)与之同时或随后，将至少一个选择性还原的半胱氨酸(HS-Cys)部分与化学基团结合。17.实施方案14-16的方法，其中化学基团选自聚乙二醇(PEG).18.实施方案17的方法，其中化学基团是聚乙二醇，尤其是平均分子量为500-100,000,例如1000-75,000或2,000-60,000的PEG。19.用于血友病患者治疗的药物制剂，包含有效治疗剂量的实施方案1-13的FIX类似物和药学上可接受的载体。20.—种治疗血友病患者的方法，包括给予患者有效治疗剂量的实施方案1-13中任一方案的FIX类似物和药学上可接受的载体。21.实施方案20的方法，其中治疗包括每周至少一次的治疗。22.实施方案21的方法，其中治疗包括每周只进行一次的治疗。实施例下面实例中使用的氨基酸残基取代的术语如下第一个字母代表37天然出现在SEQIDNO:l所列位置里氨基酸残基。随后的数字代表此氨基酸残基在SEQIDNO:l中的位置。第二个字母代表取代天然氨基酸残基的不同氨基酸残基。例如因子IXE162C,指的是SEQIDNo:l中162位的谷氨酸残基被半胱氨酸残基取代原料-还原型和氧化型谷胱甘肽(分别是GSH和GSSG)购自Sigma公司。PEG5k-马来酰亚胺(2E2M0H01)，PEG20k-马来酰亚胺(2E2M0P01),PEG40k-马来酰亚胺(2D3Y0T01)购自NektarTherapeutics(Huntsville,AL)公司。其它所有化学物都是分析等级或更好的。浓度测定-储存液中GSSG的浓度根据248nm处的吸光度测定，消光系数为381M"cm"(Chau和Nelson,1991)。GSH的浓度用Ellman，s试剂(5,5，-二硫双(2-硝基苯甲酸))测定，消光系数为14150M^cm-1,14150M^cm-1是2-硝基-5-硝基苯甲酸在412nm处的摩尔消光系数(Riddles等，1979)。谷氧还蛋白的克隆和表达_编码埃希氏菌属大肠杆菌谷氧还蛋白2序列(Grx2)的DNA用耐热高保真PCR系统(罗氏诊断公司，Indianapolis,IN)，按照厂商的说明进行PCR扩增，其引物对oHOJ98-f/oHOJ98含有侧面WtM和A7zo1两个限制性酶切位点(引物序列在表l中列出)。PCR反应的基因组模板DNA按照标准程序从E.coli中提取而来(Grimberg等，1989)。纯化的PCR产物用NdeI和XhoI酶切，然后与pET-24a(+)(Novagen)连接构建pHOJ294。由于载体含有终止密码子，基因扩增的延长反应从3，载体端开始，编码的C-末端含有LEHHHHHH亲和标签。DNA测序识别正确的克隆。基因表达时，294质粒被导入化学感受态细胞BL21(DE3)(Stmtagene,LaJolla,CA)。培养过夜的新鲜转化菌抹接种到500ml、含30(ig/ml卡那霉素的TB培养基(Sambrook等，1989)中,初始OD600为0.02。在三角瓶中，37。C,230rpm培养至对数生长中期(OD6003-4),温度降低至25。C，0.1mM的异丙基-P-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。过夜培养，离心收集细胞，50ml细菌裂解液(50mM磷酸钾，300mM氯化钠，pH8.0)重悬细胞，反复三次冻融裂解细胞。细菌裂解液平衡20mlNi-NTA琼脂糖凝月交柱(QiagenGmbH,Hilden,Germany),然后将细菌裂解产物过琼脂糖凝胶柱，5ml/min。细菌裂解液流洗，含0-200m线性梯度咪唑的细菌裂解液洗脱结合蛋白。收集处于峰值的部分，20mM二石危苏糖醇处理20分钟，50mMTris-HCl,2mMEDTA,pH8.0溶液中透析。-80°C储存，SDS-PAGE电泳判断其纯度大于90%。280nm处吸光度计算浓度，消光系数为21740M"cm-1。构建编码因子IX和因子IXE162C和因子IX416C突变体的DNA分别编码因子IXE162C和因子IX416C的质粒pHOJ338和pHOJ358的构建方法是，使用(^11化1^0^1^6@定点突变试剂盒，引物对oHOJ137-f/oHOJ137-r和oHOJ155-f/oHOJ155-r(见表l)作为模板，按照厂商的说明书(Stratagene,LaJolla,CA)进行构建。DNA测序识别所有正确的克隆序列。因子IX及其突变体的纯化-因子IX及其突变体按照Arruda等(2001)说ood，97,130-138中讲述的方法纯化，此外，收集含有因子IX的片段(Cys突变体)，50mMHEPES,100mMNaCl,10mMCaCl2,pH7.0溶液中透析，-80。C储存。PEG-马来酰亚胺修饰FIXCys突变体-选择性还原步骤包括4.8mgFIXCys突变体，在含0.5mMGSH,20GSSG,和10|iMGrx2，总体积为4.4ml的50mMHEPES，100mMNaCl,10mMCaCl2,pH7.0緩冲液中，30。C孵育5小时。随后，加入终浓度为0.8mM的PEG5k-马来酰亚胺，PEG20k-马来酰亚胺或PEG40k-马来酰亚胺(溶于水中)选才奪性^^饰生成的游离石克醇。室温，15分钟，烷化石克醇和0.5mM半胱氨酸发生退火反应。加入含过量钙离子(终浓度20mM)的EDTA，将所有物质加入经緩冲液A(50mMHEPES,100mMNaCl,lmMEDTA,pH7.0)平tf的1mlHiTrapQFF(AmershamBiosciences,GEHealthcare)柱中，捕获FIXCys突变体。緩沖液A流洗，緩冲液B加入安装在HiTrap柱前面的HiLoadSuperdex20016/60pg柱(AmershamBiosciences)中，洗脱结合蛋白(IOmMGlyGly,150mMNaCl,10mMCaCl2,0.01%Tween80,pH7.0)。流速1ml/min,分离聚乙二醇化和非聚乙二醇化的蛋白，并测定280nm处的吸光度。峰值处含聚乙二醇化的FIXCys突变体，收集，-80。C储存。39用于质粒构建的DNA寡核苷酸引物质粒oH。J98-fpHOJ294oHOJ98-rpHOJ294oHOJ137-pHOJ338OHOJ137-pHOJ338oHOJ155國fOHOJ155-pHOJ358pHOJ358序列(5，—3，)GCCGCCGGCATATGAAGCTATACATTTACGATCACTGCCCCCGCCGCCCTCGAGAATCGCCATTGATGATAACAAATTGATTTGTGCTATGTAAATTCTACTGAAGCTTGCACCATTTTGGATAACATCACGTGATGTTATCCAAAATGGTGCAAGCTTCAGTAGAATTTACATAGGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTGCTAAGCGGCCGCTTCCCGGGAAGCGGCCGCTTAGCAAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTTAATCC参考文献BegbieM.E.,MamdaniA.，GataianceS.,Eltringham-SmithL.J.,BhaktaV.,HortelanoG.，和SheffieldW.P.(2005)活化肽结构域在控制血友病B小鼠血液中因子IX水平中的重要作用，r/2row6Z/aewoW94，1138-1147。BrandstetterH,BauerM,HuberR,LollarP,BodeW(1995)凝血因子IXa的X射线结构与Xase活性和血友病B有关的活性位点和才莫块结构，/WA92，9796-9800。Chau,M.H.和Nelson,J.W.(1991).通过高效液相色谱直接测量谷胱甘肽和二硫代苏糖醇之间的平tf,FEBSLett297,296-298。Fernandes,A.P.和Holmgren,A.(2004)谷氧还蛋白谷胱甘肽依赖型氧化还原酶，其功能远超简单的硫氧还蛋白备份系统，JWox^i^t/ax.iSVgwa/.,6，63-74。Gilbert,H.F.(1995)，石克醇/二石克化物交换平tlf和二石克《建稳定性，40MethodsEnzymol.257,8-28。Grant,C.(2001),小型综述谷胱甘肽/谷氧还蛋白和石危氧还蛋白系统在酵母生长和应激反应中的作用,Mol.Microbiol.39,533-541。Grimberg,J.,Maguire,S.,和Belluscio,L.(1989)，制备质粒和染色体大肠杆菌DNA的简单方法，NucleicAcidsRes〃,8893。Holmgren,A.,Aslund,F.(1995),谷氧还蛋白，MethodEnzymol.Z52,283-292。Hoffman,C.S.和Winston,F.(1987),10分钟DNA制备，有效释放用于转化大肠杆菌的自体质粒，Gene57,267-272。HoffmanM.和MonroeD.M.,III(2001)基于细月包的止血才莫型，T7z圆6肠,W85，958-965。HopfnerK.P.,LangA.,KarcherA.,SichlerK.,KopetzkiE.,BrandstetterH.,HuberR.，BodeW.,EnghR.A.(1999)凝血因子IXa:Tyr99的松弛构象阻断底物结合，5Yrw"w"Fo/t/wg&JeWg".7,989-96。Loferer,H.,Wunderlich,M.,Hennecke,H.,和Glockshuber,R.(1995)，与胞质硫氧还蛋白细胞，暴露于周质的细菌硫氧还蛋白样蛋白具有氧化还原特性，J.Biol.Chem.，,26178-26183。Luikenhuis,S.,Perrone,G.,Dawes,I.W.,和Grant,C.M.(1998).酉良酒酵母含有两个谷氧还蛋白基因，其为抗活性氧所需，Mol.Biol.Cell9,1081-1091。Lundberg，M.,Johansson,C.，Chandra,J.,Enoksson,M.,Jacobsson,G.,Ljung,J.,Johansson,M.,和Holmgren,A.(2001).具有线粒体和核同种型的新的人谷氧还蛋白(Grx2)的克隆和表达，JBiolChem276,26269-26275。McCarthy等(2002),在动脉内和皮下施用给狗和猕猴之后重组因子IX的药代动力学，ThrombHaemost,87(5):824-30。Rodriguez-Manzaneque,M.T.,Ros,J.,Cabiscol,E.,Sorribas,A.,和Herrero,E.(1999),Grx5谷氧还蛋白在酿酒酵母抗蛋白氧化损伤中起关键作用，MolCellBioWP,8180-8190。Oe,T.,Ohyagi,T.,Naganuma,A.(1998)通过高爻支液相色i普用荧光才全测测定y-谷氨酰谷胱甘肽和其它低分子量好u醇化合物，J.Chrom.B,7眠285-289。Ostergaard,H.,Tachibana,C.,和Winther,J.R.(2004).在真核细胞胞液中监测二疏键形成,JCellBiol风337-345。Padilla,C.A.,Martinez-Galisteo,E.,Barcena,J.A.,Spyrou,G.,和Holmgren,A.(1995)，从胎盘纯化人谷氧还蛋白，其氨基酸序列、结构比较和cDNA克隆，EurJBiochem"7,27-34。Riddles,P.W.,Blakeley,R.L.,和Zerner,B.(1979),Ellman试剂5,5'-二硫代二(2-硝基安息香酸)，重新检查，Anal.Biochem.9《75-81。Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,和Maniatis,T.(1989),分子克隆实马全指南.(冷泉港，NY:冷泉港实验室)。SchmidtA.E.和BajajS.P.(2003)因子IX和因子IXa的结构功能关系,7>￡"<^C"ni^wwcMed13，39-45。Takahashi,N.和Creighton,T.E.(1996),大肠杆菌硫氧还蛋白活性位点半胱氨酸残基的反应性和离子化，Biochemistry35,8342-8353。Wang,E.C.W.，Hung，S,H.,Cahoon,M.,Hedstrom,L.(1997)Cysl91-Cys220二硫键在胰蛋白酶中的作用工程化底物特异性的新目标,尸roto力i"gz>zee〃>7g,10,405-411。Vlamis-Gardikas,A.,Aslund,F.,Spyrou,G.,Bergman,T.，和Holmgren,A.(1997).来自大肠杆菌的非典型谷氧还蛋白-谷氧还蛋白2的克隆、过表达和表征，J.Biol.Chem.272,11236-11243。Yang,Y.,Jao,S.,Nanduri,S.,Starke,D.W.,Mieyal,J.J.,和Qin,J.(1998).人硫醇转移酶(谷氧还蛋白)C7S,C25S,C78S,C82S突变体的反应性，其谷胱甘酰混合二硫化物中间体反映催化特异性，Biochemistry37,17145-17156。权利要求1.循环半寿期延长的FIX类似物，其中在位点44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415的天然氨基酸残基中至少有一个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。2.权利要求1的FIX类似物，其中在位点146-180的天然氨基酸残基中至少有一个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。3.权利要求2的FIX类似物，其中E162位的氨基酸残基被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增力口。4.上述任一权利要求的FIX类似物，其中化学基团选自聚乙二醇(PEG)。5.权利要求4的FIX类似物，其中聚乙二醇的平均分子量为500-100,000,例如1000-75,000或2,000-60,000。6.上述任一权利要求的FIX类似物，其中类似物的循环半寿期至少为野生型FIX的1.5倍。7.上述任一权利要求的FIX类似物，当用凝血实-验测定时，其中类似物的生物活性至少为野生型FIX的20%。8.—种制备上述任一权利要求的FIX类似物的方法，包括a)选择性还原工程化FIX多肽，该多肽在选自44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415之一的位点至少包括一个非天然半胱氨酸，其通过二硫键与低分子量硫醇(RS-CYS)结合，方法是使低分子量硫醇结合的FIX与包含氧化还原緩冲体系的混合物反应；b)与之同时或随后，将至少一个选择性还原的半胱氨酸(HS-Cys)部分与化学基团结合。9.一种制备权利要求1-7中任一权项的FIX类似物的方法，其包括a)选择性还原工程化FIX多肽，该多肽在选自44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413或415之一的位点至少包括一个非天然半胱氨酸，其通过二硫键与低分子量硫醇(RS-CYS)结合，方法是使低分子量硫醇结合的FIX与包含三芳基膦-3,3',3"-三磺酸化合物的混合物反应；b)与之同时或随后，将至少一个选择性还原的半胱氨酸(HS-Cys)部分与化学基团结合。10.权利要求8-9的方法，其中化学基团选自聚乙二醇(PEG)。11.权利要求10的方法，其中化学基团是聚乙二醇，尤其是平均分子量为500-100,000,例如1000-75,000或2，000-60,000的PEG。12.—种治疗血友病患者的药物制剂，其包含有效治疗剂量的权利要求1-7的FIX类似物和药学上可接受的载体。13.—种治疗血友病患者的方法，其包括给予患者有效治疗剂量的权利要求1-7中任一项FIX类似物的和药学上可接受的载体。14.权利要求13的方法，其中治疗包括每周至少一次的治疗。15.权利要求14的方法，其中治疗包括每周只进行一次的治疗。全文摘要本发明涉及FIX类似物，与天然FIX相比，其激活前在血流中的循环时间延长(患者注射一周后，FIX的活性仍至少为注射后初始活性峰值的5％)。本发明所要求保护的FIX类似物包含一个插入型氨基酸残基，此氨基酸残基与化学基团结合而进一步被修饰，所述化学基团增加FIX类似物的分子量。文档编号C12N9/64GK101484576SQ200780019090公开日2009年7月15日申请日期2007年5月24日优先权日2006年5月24日发明者H·R·斯特尼克,H·奥斯特加德,O·H·奥尔森,T·D·斯蒂恩斯特鲁普申请人:诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司