一种高效的虎奶菇多孢分离方法以及使用的多孢分离装置与流程

本发明涉及一种多孢分离方法，尤其涉及一种高效的虎奶菇多孢分离方法以及使用的多孢分离装置。

背景技术：

食用菌品种菌种质量的好坏是决定其产量高低和质量优劣的根基，也是食用菌种植效益的最直接影响因子。传统的菌种质量保持方法在实践中由于保藏基质、保藏环境以及继代操作等诸多因素，造成了部分菌种在栽培应用中，表现出生产性能的退化。因此，不少制种和生产单位开始大量应用新分离种作为原始种进行扩繁和生产。

多孢分离指采用分离多孢子获得纯培养物的方法，是食用菌育种的主要方法之一。多孢分离的效果例如孢子萌发率、次生菌丝菌落密度等直接影响优势菌株筛选效果。

关于菌种多孢分离的研究较多，目前公开及使用的主要以无菌纸收集法和钩子悬空方法为主，在公开的中国专利申请CN1786149A中，公开了一种伞菌孢子的野外分离方法，将子实体置于无菌纸上，然后将吸有清水的吸水纸贴于器皿内壁，器皿罩住无菌纸，孢子会弹射到无菌纸上，形成孢子印，该方法的主要缺点在于孢子的接触介质与孢子的接触面积大，受污染风险高；在公开的中国专利申请CN104396572A中，公开了一种冬虫夏草菌种孢子的分离提纯复壮方法，其中分离采用钩子悬空方法，包括在试管塞下端锤入一个小钩，在无菌条件下将菌种的子座下端倒挂于试管塞的小钩上，使子座尖端部向下，将挂好子座的试管塞塞入斜面试管；该方法的主要缺点在于一方面只能用于较小的子实体，另一方面，每一子实体只能收集于一个培养试管，效率不高。

基于以上情况，需要研究一种高效的、适合于大型子实体且污染风险小的多孢分离方法及装置。

技术实现要素：

一方面，本发明提供一种高效的虎奶菇多孢分离方法。

一种高效的虎奶菇多孢分离方法，包括：

将多孢分离装置封口并灭菌，采收菌盖直径6-8cm，箘褶外露而菌盖边缘未完全外翻的虎奶菇子实体，切除菌柄，消毒菌盖表面，打开隔离容器，箘褶朝下地把将菌盖放置于悬空放置装置，重新盖上隔离容器并封口，每隔8-10小时更换一次收集装置；

所述多孢分离装置包括：隔离容器，以及隔离容器中的悬空放置装置，所述悬空放置装置下方设置有收集装置。

优选的，所述消毒菌盖表面时不要接触箘褶部位。

优选的，每一次子实体可收集20-24小时。

优选的，当重新盖上隔离容器后，在隔离容器封口处喷施酒精后，再重新封口。

优选的，所述收集装置中还有培养基，所述培养基的组分按照重量百分比包括：蛋白胨0.4％-0.5％，酵母浸出粉0.1％-0.2％，葡萄糖1.5％-2％，磷酸氢二钾0.05％-0.1％，硫酸镁0.03％-0.05％，其余为水。

进一步优选的，上述培养基的pH为6.5。

优选的，所述收集装置中还有培养基，所述培养基的组分按照重量百分比包括：蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.2％，葡萄糖2％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，其余为水，所述培养基的pH 6.5。

优选的，将收集装置取出并封口后，在26℃培养箱中避光培养，所述多孢培养的孢子萌发率高，次生菌丝的菌落均匀。

优选的，所述隔离容器包括烧杯；所述悬空放置装置包括蒸架；所述收集装置包括培养皿。

优选的，更换子实体后，重新清洗、封口、灭菌多孢分离装置再使用。

另一方面，本发明还提供一种高效的虎奶菇多孢分离装置，用于上述高效的虎奶菇多孢分离方法。

一种高效的虎奶菇多孢分离方法使用的多孢分离装置，所述多孢分离装置包括：隔离容器，以及隔离容器中的悬空放置装置，所述悬空放置装置下方设置有收集装置。

优选的，所述悬空放置装置为直径10-11厘米、脚高7-8厘米的蒸架。

采用本发明的虎奶菇多孢分离方法分离得到的孢子经过培养后，可以得到大量半透明匍匐状初生菌丝体菌落，初生菌丝融合后，会出现白色毛毡状菌落，这些菌落可以用于后续的分离、鉴定或培养等。

采用本发明收集的虎奶菇孢子，收集的孢子的孢子萌发率高，次生菌丝的菌落均匀，从而有助于后续的优势菌株筛选。。

与现有技术的无菌纸收集法相比，本发明的虎奶菇多孢分离方法孢子的不与中间介质接触，直接收集到培养基中培养，减少污染风险；与现有技术的钩子悬空方法相比，本发明可以适用于较大型的子实体，而且可以多次更换收集装置，每一子实体可以实现多次收集，提高效率。

本发明的高效的虎奶菇多孢分离方法，经实验证明，污染风险小、效率高，融合后的次生菌丝体生长旺盛，方法和装置简化高效。

附图说明

图1是虎奶菇多孢分离后的次生菌丝体菌落。

图2是培养基环境下形成子实体原基的虎奶菇分离菌株。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

食用用菌从孢子萌发时产生初生菌丝，一般认为初生菌丝不具备形成子实体(菇体)的能力，初生菌丝体存在不同交配型，当相匹配的两个(或两个以上)交配型初生菌丝体接触并融合后，可产生具备形成子实体能力的次生菌丝体，在食用菌行业中则称为菌种。

多孢分离实际上是多孢子间布朗运动、随机重组的结果，是把许多孢子接种在同一培养基上，让其萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法，能获得与原始亲本具有不同遗传背景的菌株。

虎奶菇是一种能产生大体型、厚肉质子实体的侧耳属食用菌，作为食材时能适用多种烹饪方式，口感清爽有嚼劲。营养学研究指出，虎奶菇中含有丰富的蛋白质、矿质元素、多种维生素、真菌多糖、膳食纤维等食药用成分，蛋白质含量为15.6％、脂肪2.5％、粗纤维6.3％、粗多糖10.8％、总糖34.6％；矿质元素中钾、钙、铁、锌、硒含量较高，氨基酸总含量为14.9％，其中人体必需的8种氨基酸量占氨基酸总量的46.1％，异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸含量相对较高。并且，有关研究表明，虎奶菇中的虎奶多糖具有提高人体免疫功能、抗肿瘤等神奇效用。

进一步研究表明，虎奶菇属于偏高温型食用菌，菌丝体生长、子实体发育都需在25℃以上，适合在我国南方长夏季地区工厂化栽培生产，能极大降低栽培温控所产生的能耗。因此，虎奶菇是一种非常具有开发价值和潜力的食用菌。

鉴于此，一方面，本发明提供一种高效的虎奶菇多孢分离方法，包括：将多孢分离装置封口并灭菌，采收菌盖直径6-8cm，箘褶外露而菌盖边缘未完全外翻的虎奶菇子实体，切除菌柄，消毒擦拭菌盖表面，打开隔离容器，箘褶朝下地把将菌盖放置于悬空放置装置，重新盖上隔离容器并重新封口，每隔8-10小时更换一次收集装置中的培养平板；

所述多孢分离装置包括：隔离容器，以及隔离容器中的悬空放置装置，所述悬空放置装置下方设置有收集装置。

在本发明的上述多孢分离方法中，子实体的成熟度以及收集装置的收集时间对成功分离得到次生菌丝体纯培养菌落具有重要的影响，发明人经过反复研究发现，在子实体成熟度小于本发明分离方法所要求成熟度时，收集的多孢菌落稀少，萌发时间长，影响后续优势菌株挑选，而在子实体大于本发明分离方法所要求成熟度时，收集的多孢密度大，不易分离，并且污染几率显著上升；而切除菌柄可以进一步减少污染发生几率。

其中，上述方法中，所述消毒擦拭菌盖表面时优选不要接触箘褶部位，箘褶部位是孢子着生部位，脆弱而容易损伤，当损伤箘褶部位时会影响孢子的弹射；并且，当本发明所述的子实体成熟度时，子实体虽然暴露出箘褶时，但箘褶部位基本是无杂菌的状态，不接触箘褶可减少污染风险。

其中，上述方法中，优选每隔8-10小时，例如8小时更换一次收集装置。该优选的收集时间内，收集的多孢密度适中，有利于后续的菌落分离，并且不易污染。

其中，上述方法中，每一次子实体可收集优选20-24小时，例如24小时。

本发明每一次子实体可以收集2-3次，收集效果高，方便快捷。

其中，上述方法中，当重新盖上隔离容器后，优选在隔离容器封口处喷施酒精后，再重新封口，降低污染风险。

其中，上述方法中，优选所述收集装置中还有培养基，具有消毒后培养基的收集装置在收集多孢后，直接取出，就可以进行后续的培养，减少中间步骤带来的污染风险，操作方便。

其中，所述培养基的组分按照重量百分比包括：蛋白胨0.4％-0.5％、优选为0.5％，酵母浸出粉0.1％-0.2％、优选为0.2％，葡萄糖1.5％-2％、优选为2％，磷酸氢二钾0.05％-0.1％、优选为0.1％，硫酸镁0.03％-0.05％、优选为0.05％，其余为水。

进一步地，上述培养基的pH为6.5。

其中，所述培养基的组分按照重量百分比包括：蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.2％，葡萄糖2％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，其余为水，培养基的pH为6.5。经研究，这样的培养基适合于虎奶菇多孢培养。

其中，上述方法中，所述隔离容器在收集虎奶菇过程中提供/保持无菌环境，并且阻断外界气流对孢子的弹射影响，使得更多的孢子能够掉落与收集在收集装置中，所述隔离容器优选包括玻璃罩，例如烧杯等。

其中，上述方法中，所述悬空放置装置用于悬空放置子实体，可以根据虎奶菇子实体大小选择合适的悬空放置装置，例如蒸架。

对于本发明上述分离方法中的菌盖直径6-8cm，箘褶外露而菌盖边缘未完全外翻的虎奶菇子实体，优选采用直径10-11厘米、脚高7-8厘米的蒸架。

其中，上述方法中，所述收集装置用于收集弹射的孢子，根据隔离容器大小和收集需求选择合适大小的收集装置，例如基于商业方便购买角度，可以使用培养皿作为收集装置。

其中，上述方法中，更换子实体后，优选重新清洗、封口、灭菌多孢分离装置再使用。更换子实体会更容易带来污染风险，为控制/降低污染风险，在更换子实体后，对多孢分离装置清洗后，重新进行上述多孢分离方法的步骤。

其中，上述方法中，在收集装置收集完成后，将上述含有培养基的收集装置取出并封口后，在26℃培养箱中避光培养，例如培养5-7日后，会出现大量半透明匍匐状初生菌丝体菌落，待初生菌丝融合后，出现白色毛毡状菌落。

其中，本发明方法收集的多孢培养的孢子萌发率高，次生菌丝的菌落均匀，有助于后续优势菌落筛选。多孢分离的效果，应以是污染程度、生长旺盛的次生菌丝体菌落致密程度为要点。

应该理解，本发明中所述的多孢分离方法，不仅适用于虎奶菇，还可以用于与虎奶菇具有相似的子实体维持时间的菌种的多孢分离。

本发明的多孢分离方法，不仅可以实现一个子实体2-3次的收集，而且在该收集时间内收集的孢子密度合适，经培养后的次生菌丝菌落均匀，非常有益于后续优势菌落筛选；此外，本发明方法可以直接收集后培养萌发，不需要再转接而增加污染风险。

另一方面，本发明还提供一种高效的虎奶菇多孢分离装置，用于上述高效的虎奶菇多孢分离方法。

一种高效的虎奶菇多孢分离方法使用的多孢分离装置，所述多孢分离装置包括：隔离容器，以及隔离容器中的悬空放置装置，所述悬空放置装置下方设置有收集装置。

对于菌盖直径6～8cm，箘褶外露而菌盖边缘未完全外翻的虎奶菇子实体，本发明的多孢分离装置优选采用直径10-11厘米、脚高7-8厘米的蒸架。

进一步地，所述蒸架为金属蒸架。

在一个优选的实施例中，蒸架为直径10.5cm、脚高7.5cm的蒸架或金属蒸架，蒸架的脚朝向隔离容器开口方向放置。

其中，上述分离装置中，所述收集装置用于收集弹射的孢子，根据隔离容器大小和收集需求选择合适大小的收集装置，例如基于商业方便购买角度，可以使用培养皿作为收集装置。

其中，上述分离装置中，所述收集装置中还包含有适合于虎奶菇孢子萌发的培养基。上述培养基灭菌后倒入收集装置中，使用。

本发明中优选的培养基的组分按照重量百分比包括：蛋白胨0.4％-0.5％、优选为0.5％，酵母浸出粉0.1％-0.2％、优选为0.2％，葡萄糖1.5％-2％、优选为2％，磷酸氢二钾0.05％-0.1％、优选为0.1％，硫酸镁0.03％-0.05％、优选为0.05％，其余为水。

进一步地，上述培养基的pH为6.5。

本发明中更优选的培养基，包括以下重量百分比组分：蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.2％，葡萄糖2％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，其余为水，培养基的pH为6.5。

多孢分离装置使用时，需要对分离装置进行封口后灭菌，具体地，将分离装置组装完成后，将隔离容器进行封口，并灭菌，例如高压蒸汽灭菌，灭菌后，干燥容器内水滴，例如在超净工作台内采用风机干燥容器内水滴。

本发明中所述的“封口”，如无特别说明，是指对装置与外界环境进行隔离，特别是对装置的开口部分与外界环境进行隔离，例如采用报纸或封口膜等。

所述多孢分离装置按照上述分离方法在分离虎奶菇多孢中使用。

实验证明，本发明的虎奶菇多孢分离方法简化、快捷，并且高效，基本能使污染率达到0％，在食用菌育种等方面具有较大应用价值。

实施例1

一种多孢分离装置，包括2000mL烧杯作为隔离容器，烧杯的杯口直径约14.5cm，内放置一直径10.5cm，脚高7.5cm的金属蒸架作为悬空放置装置，架脚朝烧杯杯口方向放置，杯口以报纸和橡皮筋封口后，高压蒸汽灭菌30min(0.1MPa，121℃)，灭菌结束冷却后取出，放置入超净工作台，打开气流风机，干燥瓶内水滴；另一方面，配制培养基，高压蒸汽灭菌16min后，稍冷却，取出于超净台中倒入直径6cm的无菌培养皿，将培养皿置于烧杯内，金属属蒸架下面，即得。

培养基的组分为：蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.2％，葡萄糖2％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，其余为水，培养基的pH为6.5。

实施例2

一种高效的虎奶菇的多孢分离方法

本实施例方法采用实施例1的多孢分离装置，采收表面无杂物污物，菌盖直径6～8cm，箘褶外露而菌盖边缘未完全外翻的虎奶菇子实体，用已表面消毒的刀沿箘褶与菌柄连接处齐根切除菌柄，用蘸有75％酒精棉球稍拭擦菌盖表面，但不接触箘褶部位；将菌盖部分送入超净工作台，摘下分离装置的报纸(即打开封口)，举起烧杯，箘褶朝下地把菌盖放置在蒸架上，重新盖上烧杯，在烧杯口和底部报纸接触位置喷施75％酒精，翻折报纸以橡皮筋重新封杯口，开始收集。

每隔8h更换一次培养皿，一个子实体可使用24h，更换3次培养皿进行3次收集，更换子实体后需要重新清洗、封口和灭菌分离装置。

实施例3

一种高效的虎奶菇的多孢分离方法

本实施例基本采用实施例1的多孢分离装置，不同的是，将已经准备好的含有培养基的培养皿暂时不放置到烧杯内，而放置在超净台中待用，在使用时再组装。

采收表面无杂物污物，菌盖直径6～8cm，箘褶外露而菌盖边缘未完全外翻的新鲜虎奶菇子实体，用已表面消毒的刀沿箘褶与菌柄连接处齐根切除菌柄，用蘸有75％酒精棉球稍拭擦菌盖表面，但不接触箘褶部位，将菌盖部分送入超净工作台，解开烧杯的封口，举起烧杯，箘褶朝下地把菌盖放置在蒸架上，在蒸架之下放入含培养基的培养皿，重新盖上烧杯，在烧杯口和底部报纸接触位置喷施75％酒精，翻折报纸以橡皮筋重新封杯口。

每隔8小时更换一次培养皿，一个子实体收集3次。更换子实体后需要重新清洗、封口和灭菌分离装置。

取出的收集了孢子的培养皿用封口膜封口后置26℃培养箱中避光培养，5-7日后可见大量半透明匍匐状初生菌丝体菌落，待初生菌丝融合，出现白色毛毡状菌落，产生气生菌丝体，如图1所示，可挑选出并移接到新的培养基上根据需要进行后续分离、鉴定或培养操作。

实施例4

将实施例3收集孢子后培养得到的白色毛毡状菌落，挑取生长旺盛的单菌落至新的培养基中，发现菌落在培养基的环境下即可形成子实体原基，如图2所示，而此现象在多孢分离前的虎奶菇菌种中并未发现，表明虎奶菇经多孢分离后获得了子实体形成能力强的菌株，孢子萌发率高、多孢融合菌丝的菌落均匀。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。