专利名称：速度因子的制作方法
速度因子速度因子是在37°C和13°C下测定的抗原-抗体复合物缔合速率常数的比率，凭借速度因子有可能将抗体归类为例如熵或焓的结合物，而无需详细的热力学测定和计算。
背景技术：
生产具有卓越的抗原特异性和非凡的抗原复合物稳定性的高亲和力抗体是诊断和治疗抗体开发中的主要目标。就蛋白质-蛋白质相互作用的热力学分析而言，占主导地位的技术是量热测定(Chaires, J. B. , Ann. Rev. Biophys. 37(2008) 135-51 ；Perozzo, R.,等人’ J. Recept. Signal Transduct. Res. 24(1-2) (2004) 1-52 ；Li, L.，等人，Chem. Biol. Drug Des. 71(6) (2008)529-32 ；Liang, Y.，Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai)40(7)(2008)565-76 ； Thielges，M. C.，等人，Biochemistry 47(27) (2008)7237-47)。用于反应量热计测定所需的样品量很高，例如至少125μ g/ml的抗体浓度和至少150 μ 1的样品体积。而且，反应量热法需要高样品纯度，且不容许任何样品杂质或样品异质性。另外，样品缓冲液直接影响测定的热力学参数的结果。此外，反应量热法仅能解决平衡热力学。表面等离子共振(SPR)仪器(Roos，H.，等人，J.Mol. Recognit. 11(1-6) (1998)204-210 ；Van Regenmortel, Μ. H.，等人，J. Mol. Recognit. 11(1-6) (1998) 163-167 ； Gunnarsson, K. , Curr. Prot. Immunol. Chapter 18 (2001)Unit 18. 6 ；Drake, Α. W., 等人，Anal. Biochem. 328 (1) (2004) 35-43 ；Kikuchi, Y.,等人，J. Biosci. Bioeng. 100 (3) (2005)311-7)允许以高通量的方式快速测定温度依赖的动力学谱(见例如 Canziani, G. Α.,等人，Anal. Biochem. 325(2004)301-307 ；Saefsten, P.,等)κ, Anal. Biochem. 353 (2006) 181-190 ；Leonard, P.，等人，J. Immunol. Methods 323 (2007) 172-9)。Wassaf，D.，等人(Anal. Biochem. 351 (2006)241-253)报导了使用表面等离子共振微阵列的抗体的高通量亲和力排序。在Roos，H.，等人，J.Mol.Recognit. 11(1998)204-210 中报导了使用生物传感器技术的蛋白质相互作用的热力学分析。Wark, K. L.，等人(Adv. Drug. Deliv. Rev. 58 (2006) 657-670)报导了用于增强抗体亲和力的技术。Papalia, G. A.，等人在 Anal. Biochem. ；359 (2006) 112-119 中报导了使用BIAcore T100的抗体片段/抗原相互作用的高分辨率表征。Sagawa，Τ.，等人(Mol. Immunol. 39(2003)801-808)报导了在针对半抗原的免疫应答期间抗体进化的热力学和动力学方面。Jason-Moller, L.，等人在 Curr. Prot. Prot. ki. (2006) page unitl9. 13 中报导了 BIAcore系统和应用的综述。Gelb，W.报导了用于肽研究的微量热法(Proc. 4th Int. Peptide Sympos. (2007)第 1 页)。发明概述已发现，为了抗体的表征，不需要完整的动力学表征，而需要测定在37°C下的缔合速率常数和在13°C下的缔合速率常数。可使用其比率将抗体根据其结合性能分类。如本文报导的第一方面是用于选择抗体的方法，其包括选择速度因子为10或更小的抗体的步骤。在一个实施方案中，用于选择抗体的方法包括以下步骤
a)提供一组或一群或一批抗体，b)测定温度依赖的动力学数据，c)计算所有提供的抗体的速度因子，d)选择速度因子为10或更小的抗体。在一个实施方案中，速度因子是从0至10。在另一个实施方案中，速度因子是在 37°C下的缔合速率常数和在13°C下的缔合速率常数的比率。在另一个实施方案中，在13°C 和37°C下测定温度依赖的动力学数据。在另一个实施方案中，用表面等离子共振测定温度依赖的动力学数据。在另外的实施方案中，所述方法是高通量的方法。在另一个实施方案中，通过速度因子和八S° $ass值选择。在一个实施方案中，在表面等离子共振中，在表面等离子共振芯片上固定抗原。在另外的实施方案中，温度依赖的动力学数据是热力学平衡数据和过渡态热力学数据。在另一个实施方案中，用van，t Hoff和Eyring和Arrhenius 方程的线性形式计算温度依赖的动力学数据。在一个实施方案中，选择小于200J/mol*K 的AS° $ass(AS° % ass < 200J/mol*K)的抗体。在一个实施方案中，用范围从-200J/ 11101^(至2001/11101^(的Δ S。$ ass选择抗体。还在一个实施方案中用范围从_150J/mol*K 至+100J/mol*K的Δ S。
ass选择抗体。在另一个实施方案中，表面等离子共振使用补充 lmg/ml羧甲基葡聚糖的HBS-EP缓冲液。在另一个实施方案中，通过单个杂交瘤或B细胞产生每种抗体。如本文报导的第二方面是得到具有对至少2种抗原的交叉反应性的抗体的方法， 所述方法包括用50或更大的速度因子选择抗体。在一个实施方案中，速度因子是从50至 300。如本文报导的另外的方面是生产抗体的方法，其包括以下步骤a)提供一组/群/批生产抗体的细胞，b)选择生产具有10或更小的速度因子的抗体的细胞，c)培养选定的细胞，d)从培养的选定细胞或其培养基中回收抗体并由此生产抗体。在一个实施方案中，以单个细胞储存生产抗体的细胞。在另外的实施方案中，在选择前培养储存的单个细胞。在另一个实施方案中，在选择前纯化抗体。在另外的实施方案中，在回收后纯化抗体。在特定的实施方案中，通过蛋白质A层析纯化。如本文报导的另一个方面是用于选择亲本抗体的人源化形式的方法，其包括a)提供亲本抗体，b)提供一组/群/批亲本抗体的人源化形式，c)测定所有提供的抗体的温度依赖的动力学数据，d)计算所有提供的抗体的速度因子，e)比较人源化形式的速度因子和亲本抗体的速度因子，f)通过用小于亲本抗体的速度因子的2倍的速度因子选择抗体，选择亲本抗体的人源化形式。在一个实施方案中，用小于亲本抗体的速度因子的125%的速度因子选择人源化形式，在另一个实施方案中，用小于亲本抗体的速度因子的110%的速度因子选择人源化形式。
如本文报导的另一个方面是用如本文报导的方法选择的抗体作为治疗或诊断剂的用途。本发明的一个方面是包含用如本文报导的方法得到的抗体的药物组合物。发明详述本文报导的方法是基于速度因子的测定。基于速度因子可将抗体分类，即可根据其结合性能将抗体表征为例如熵或焓的抗原结合物。已经发现，基于速度因子的分类不需要测定和/或计算详细的热力学，因此减少了待测定的参数量和待进行的计算量。速度因子是在37°C和在13°C下独立测定的抗原-抗体复合物的缔合速率常数(ka)的比率。因为仅需要2次实验测定计算速度因子，这是一个快速和适合高通量的方法。可使用速度因子例如比较人源化抗体和其来源的亲本抗体。其也可用于评估直接来自杂交瘤和/或B细胞上清的抗体。其不需要初步纯化，因为可使用粗上清直接进行测定。基于表面等离子共振的动力学方法比传统的量热测定具有若干优势——高通量处理是可能的，——低样品消耗，——测量亲和力(affinity)而不是亲合力(avidity)，和——使用粗细胞上清或复杂的培养混合物。表面等离子生物传感器表面是亲和基质，其用于例如从粗细胞培养上清中捕获抗体。因此，可使用粗制和复杂混合物作为样品。由于相互作用配偶之一被固定在传感器的表面上，而第二种化合物被注入流动系统，可以测量平衡和过渡态热力学，因为FIA(流动注射分析)系统允许并可单独监控复合物的缔合和解离相。使用此技术，计算热力学参数——标准自由结合焓Δ G °，——标准结合焓Δ H。，——标准结合熵Δ S。，和过渡态参数——标准自由缔合焓Δ G° $ ass,——标准缔合焓ΔΗ° $ass，——标准缔合熵$ass，-活化能 Eaass，——标准自由解离能Δ G° $ diss，——标准解离焓Δ H。$ diss,——标准解离熵Δ S。$ diss，和——解离能fediss是可能的。在使用非线性van，t Hoff方程的情况下，也可测定Δ Cp值。一般在基于SPR的动力学抗体筛选(见例如Steukers，Μ.，等人，J. Immunol. Methods 310 (2006) 126-135 ；Rich, R. L.，等人，Anal. Biochem. 361 (2007) 1-6)后进行第二个步骤，即更高分辨率的热力学sra分析。培养生产抗体的细胞，并使产生的细胞培养上清在一个实施方案中经历高通量分析，其中产生温度依赖的动力学数据，以计算速度因子和过渡态(化)热力学性能。基于其热力学行为进行根据如本文报导的方法的抗体的选择。通过抗原复合物缔合速率常数ka[l/Ms]的温度依赖的增加和抗原复合物解离速率常数kd[l/s]的保持或减少表征高亲和力抗体。令人惊讶地，通过抗原相互作用机制表征这样的抗体，其显示了在结合平衡中的大的熵变。因此，必须通过量热学以外的方式进行风险评估，以测定熵供量(contribution)来源于哪种效应。在复合物缔合相是有风险的， 因为混乱的抗原结合，或在复合物解离相，其恰好指示了包含潜在诱发的抗原构象变化的复杂的抗原相互作用。在一个实施方案中，熵供量来源于抗体-抗原复合物解离步骤，其中发生解离熵Δ S。
diss的大的正变化或大的负变化。高亲和力抗体也可具有来源于抗原解离相的热力学异常，其中解离速率常数 kd[l/s]令人惊讶地和出乎意料地随着温度增加而减少。通过如下热力学参数表征这样的抗体i)显示负或接近0的解离活化能fedissDa/mol]的解离相，ii)负解离焓ΔΗ° | diSS[kJ/mol]，和iii)大的负解离熵AS° idissDa/mol]。必须指出，这是此效应的完全的理论处理，且不应被视为限制。因此，在一个实施方案中，测定解离活化能fediss，解离焓 Δ H。$ diss和解离熵八S° $ diss，并选择具有i)负或接近0的解离活化能fedissDa/ mol], ii)负解离焓 ΔΗ° $dissDa/m0l]，和 iii)大的负解离熵 AS° $ diss[kj/mol]的抗体。因此，如本文报导的方法允许基于速度因子和Δ S。
ass值从一批高亲和力抗体中选择抗体。可在筛选前如在一个实施方案中在100ml旋转培养瓶中使用RPMI1640培养基培养储存的单细胞克隆。在另一个实施方案中，在测定温度依赖的动力学数据，即热力学筛选前，通过蛋白质A Sepharose(TM)柱层析从上清中纯化抗体。在一个实施方案中，用于热力学筛选的系统缓冲液是HBS-EP。在另一个实施方案中，对样品缓冲液补充lmg/ml羧甲基葡聚糖凝胶以降低非特异性传感器基质效应。大多数使用基于sra测量的出版物不使用抗体捕获系统作为传感器表面呈递技术。通常抗体或其片段被共价固定在传感器上。此技术不可用于高通量形式，因为表面不适于多目的抗体呈递，此外其受到固定了配体的传感器数量的技术限制。为了进行热力学筛选，可建立具有合适的温度依赖的第二抗体复合物稳定性的种类特异性捕获系统。生物传感器需通过优化程序校准从而以高通量形式测定具有不同表位特异性的抗体的结合特征。热力学筛选提供温度依赖的数据集(见图3)。在较低的温度下观察到较低的响应，因为捕获系统的缔合速率降低了(见实施例幻。在较高的温度下缔合速率加快。此外发现在低于13°C的温度下，捕获系统的缔合动力学太慢而得不到足够的抗体响应。在低于13°C和高于37°C下，抗体的抗原结合动力学测定提供了根据van’ t Hoff, Eyring和Arrhenius方程的不可线性化的数据。在一个实施方案中，在13°C或17°C和37°C的温度下进行热力学筛选。已经发现， 在此温度范围内有可能根据van’ t Hoff方程的线性形式简单计算热力学平衡数据并根据线性Eyring和线性Arrhenius方程简单计算过渡态热力学(Wear，Μ. Α.，等人，Anal.Biochem. 359 (2006) 285-287 ；又见图幻。在一个实施方案中，在相同的条件下进行所有测量以使高通量筛选(HTQ容易控制。用于计算，可使用如下公式a) Arrhenius 方程(I)k = A*e(-WK*T)b) van，t Hoff 计算(II) AG° = ΔΗ° _T*AS°(III)AG。= _R*T* InK11(IV)InK11 二 _1/Τ*( Δ H° /R)/斜率-(Δ S。/R)/截距(V)R*T*lnKD = ΔΗ° T0_T*AS° T0+AC° p (T-T0)—Τ* Δ Cp° 1η(Τ/Τ0)c) Eyring 缔合相
权利要求
1.得到抗体的方法，其包括以下步骤a)提供一批抗体，b)测定在37°C下每种抗体与其抗原的缔合速率常数和在13°C下每种抗体与其抗原的缔合速率常数，c)计算在37°C下的缔合速率常数与在13°C下的缔合速率常数的比率，d)通过选择具有10或更小的比率的抗体并由此得到抗体。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于用表面等离子共振进行测定。
3.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于通过计算比率和通过测定% ass进行选择。
4.根据权利要求2-3中任一项的方法，其特征在于在表面等离子共振中在表面等离子共振芯片上固定抗原。
5.根据权利要求3或4中任一项的方法，其特征在于以小于200J/mol^(的八S°$ass 选择抗体。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于通过单个杂交瘤细胞或B细胞产生每种抗体。
7.用于得到具有对至少2种抗原的交叉反应性的抗体的方法，其包括以下步骤a)提供一批抗体，b)测定在37°C下每种抗体与其抗原的缔合速率常数和在13°C下每种抗体与同一抗原的缔合速率常数，c)计算在37°C下的缔合速率常数与在13°C下的缔合速率常数的比率，d)通过以50或更大的比率选择抗体并由此得到具有对至少2种抗原的交叉反应性的抗体。
8.生产抗体的方法，其包括以下步骤a)提供一组生产抗体的细胞，b)测定在37°C和13°C下每种生产抗体的细胞产生的每种抗体与抗原的缔合速率常数，c)计算在37°C下的缔合速率常数与在13°C下的缔合速率常数的比率，d)选择生产具有10或更小的比率的抗体的生产抗体的细胞，e)培养选定的细胞，f)从培养的选定细胞或其培养基中回收抗体并由此生产抗体。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于以单个细胞保存在步骤a)中的生产抗体的细胞。
10.根据权利要求8或9任一项的方法，其特征在于包括在选择前培养储存的单个细胞的额外步骤。
11.得到人源化抗体的方法，其包括a)提供亲本抗体，b)提供一组亲本抗体的人源化形式，c)测定在37°C和13°C下每种人源化抗体形式与其抗原的缔合速率常数d)计算在37°C下的缔合速率常数与在13°C下的缔合速率常数的比率，e)比较人源化形式的比率和亲本抗体的比率，f)以小于亲本抗体比率2倍的比率选择人源化形式作为人源化抗体，并由此得到人源化抗体。
12.根据权利要求1-7的方法得到的抗体作为治疗或诊断剂的用途。
13.包含根据权利要求1-12任一项的方法得到的抗体的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及速度因子。基于速度因子可将抗体分类，即可按照其结合性能将抗体表征为例如熵或焓的抗原结合物。基于速度因子的分类不需要详细的热力学测定和/或计算。速度因子是在37℃和13℃下测定的抗原-抗体复合物缔合速率常数ka的比率。因为仅需要2种实验测定计算速度因子，这是快速和适于高通量的方法。
文档编号A61K39/395GK102482344SQ201080037440
公开日2012年5月30日 申请日期2010年8月19日 优先权日2009年8月25日
发明者普罗夫 L·范, M·施拉伊姆尔 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司