胃肠增殖因子及其用途的制作方法

专利名称：胃肠增殖因子及其用途的制作方法
1.背景 1.1发明领域 本发明一般性地涉及含有胃肠增殖因子多肽和多核苷酸的组合物及其使用方法。
1.2序列表 本文提供了序列表。
1.3背景 电离辐射疗法和细胞毒素化学疗法会对口腔和胃肠粘膜造成损伤，对经受抗肿瘤治疗的患者而言，这一直是严重的问题。粘膜炎是粘膜炎症，在以治疗或缓解为目的而使用化学疗法和放射疗法的患者群体中，这是一个特别普遍的问题。(胃肠道区域的)放射和化学疗法导致的胃肠道粘膜损伤包括隐窝细胞被破坏，绒毛变短以及胃肠上皮的溃疡和坏死(Berthrong M，World J Surg 10155-170(1986))，这构成包括胃肠道粘膜炎和小肠结肠炎的疾病的基础。对患者而言，这可能意味着腹痛、血性腹泻、吸收不良，有时意味着细菌易位(Guzman et al.，J Surg Res 46104-107(1989))。此外，化学疗法和电离辐射也会影响其它粘膜，包括口咽和嘴唇粘膜以及食道粘膜。众所周知，同时使用放射和化学疗法的组合式疗法可在头颈癌患者中产生高征候的口炎，在小细胞肺癌患者中产生食管炎。化疗和放疗通过直接和间接毒性对口腔和胃肠粘膜造成损伤。直接粘膜炎的机理是对处于快速分裂中的基底上皮细胞进行非特异性细胞杀伤，导致上皮变薄、炎症、细胞更新减少并最终形成溃疡。这些令人痛苦的损伤也会使局部和全身性感染的风险有所增加。间接粘膜毒性是化学疗法-诱导的骨髓抑制的副产品，它使直接粘膜损伤部位发生细菌和病毒感染。这些影响的严重性会妨碍剂量的逐步增加，延误治疗，并且保证会使剂量减少，因此限制了癌症疗法的效力。
化疗和放疗-诱导的(粘膜)胃肠损伤(粘膜炎)的预防和治疗通常必需接受亚适量的化疗或放疗处方，在随后的毒性产生之后的疗程中向下改变剂量，或在中等-剂量或高剂量的氨甲喋呤之后使用特异性的解毒药，如甲酰四氢叶酸(leucovorin)(Allegra CJ.Antifolates.InChabner and Collins，eds.Cancer ChemotherapyPrinciples and Practice.Philadelphia，Pa.JP LippincottCo；1990110-153.)。
对胃肠粘膜的损伤也与总称为炎症性肠疾病的胃肠道慢性炎症疾病有关。基于细胞因子的疗法可用于治疗炎症性肠疾病(Bouma and StroberNature Rev 3521-533(2003))。然而，患有炎症性肠疾病，如局限性回肠炎克罗恩氏病(Crohn’s disease)的患者经常需要切除小肠。在外伤、血管意外和癌症之后也必需通过外科手术切除小肠。仅留下短于200cm的存活小肠的外科切除术将患者置于发展成为短肠综合征(short-bowel syndrome)(SBS)的风险中。SBS这种病在临床上的定义是吸收不良、腹泻、体液和电解质紊乱以及营养不良。SBS患者的治疗经常需要长期或终身使用非肠道的营养物质(DiBaise etal.，Am JGastroenterol 991823-1832(2004))。
因此，有必要寻找一种药剂，用以预防性或治疗性地增强对抗肿瘤治疗的耐受性，推进治疗炎症性肠疾病的最新疗法，并恢复在小肠经外科手术切除后受损的消化和吸收过程。
2.

发明内容
本发明部分基于下述发现，即胃肠增殖因子(GIPF)能诱导胃肠道上皮细胞增殖。因此，含有GIPF，其片段或其类似物的组合物可用于治疗需要形成上皮的疾病，如用于治疗胃肠道病症，包括化疗和放疗导致的粘膜炎，口咽、嘴唇和食道的粘膜炎，炎症性肠疾病，其它包括创伤、烧伤、眼病的疾病以及任何需要刺激上皮细胞增殖或再生的疾病。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及含有治疗有效量的GIPF多肽和药物可接受载体的组合物。
本发明的组合物包括分离的编码GIPF多肽的多核苷酸，其包括重组DNA分子和克隆的基因或其简并变体，特别是天然变体，如等位基因变体。具体地，本发明的多核苷酸基于分离自cDNA文库的GIPF多核苷酸(SEQIDNO2)，所述文库由人胎皮肤mRNA制备得到。
本发明的组合物还包括载体，如含有本发明的多核苷酸的表达载体，经基因工程改造后含有所述多核苷酸的细胞和经基因工程改造后可表达所述多核苷酸的细胞。
本发明的组合物含有分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括但不限于GIPF多核苷酸，其片段或其突变体；含有SEQID NO2或3的全长蛋白质编码序列的多核苷酸(例如SEQID NO4；GIPFwt)；含有SEQID NO5的经V5-His-标记的蛋白质编码序列的多核苷酸(例如SEQID NO6；GIPFt)；含有SEQID NO9的显性成熟蛋白质编码序列的核苷酸序列的多核苷酸(例如SEQID NO10)；含有SEQID NO11的成熟蛋白质编码序列的核苷酸序列的多核苷酸(例如SEQID NO12)；含有SEQID NO13的血小板反应蛋白(thrombospondin)结构域的核苷酸序列的多核苷酸(例如SEQID NO14)；含有编码缺乏弗林蛋白酶(furin)切割位点的显性成熟蛋白质序列的核苷酸序列的SEQID NO15的多核苷酸(例如SEQID NO16)；含有突变弗林蛋白酶裂解位点的编码GIPF多肽的核苷酸序列的SEQ ID NO17的多核苷酸(SEQID NO18)；以及编码含有不同长度GIPF多肽的多核苷酸(SEQ ID NOs84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104和177)。本发明的多核苷酸组合物还包括，但不限于，在严格杂交条件下与下述核苷酸杂交的多核苷酸(a)SEQID NO2，3，5，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177所述的任一核苷酸序列的互补序列；(b)编码SEQ IDNO4，6，8，10，12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105和178的核苷酸序列；上述任一多核苷酸变体(例如，等位基因变体)的多核苷酸，与上述任一多核苷酸至少有70％序列同一性(例如75％，80％，85％，90％，92％，94％，96％，98％和99％)；编码上述任一多肽的种属同系物(例如直向同源物(ortholog)的多核苷酸；或编码包含SEQ ID NO4或6多肽特定结构域或截短体的多肽的多核苷酸。
本发明进一步提供了包含上述多核苷酸至少一部分的克隆载体或表达载体，以及用这些表达载体转化的宿主细胞或生物体。有用的载体包括本领域熟知的质粒、粘粒、λ-噬菌体衍生物、噬菌粒等。相应的，本发明还提供了包含本发明多核苷酸的载体和包含所述多核苷酸的宿主细胞。总的来说，载体包含在至少一种生物体中起作用的复制起始点，合适的限制内切酶位点，和宿主细胞的可选择标记。本发明载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，可以是单细胞生物体或多细胞生物体的一部分。
本发明的药物组合物包括，但不限于，含有SEQ ID NO4，6，10，12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105或178的氨基酸序列的分离多肽的多肽。本发明多肽还包括由下述多核苷酸编码的生物活性多肽(a)包含SEQ ID NO2，3，5，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177所述核苷酸序列的任一多核苷酸；或(b)在严格杂交条件下与(a)中多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸。还包括SEQ ID NO4，6，10，12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105或178所述任一蛋白序列的生物活性或免疫活性类似物，及其保留生物活性的基本等价物。本发明多肽可以完全或部分化学合成得到，但优选利用本发明的基因改造细胞(如宿主细胞)通过重组方式来生成。本发明包括与SEQ ID NO4，6，10，12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105和178中任一序列有至少85％，90％，92％，94％，96％，98％或99％相同的多肽。本发明还包括序列形式上有20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1个氨基酸残基与SEQ ID NO4，6，10，12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105或178任一序列不同的多肽。氨基酸变化可以是保守的或非保守的。
本发明还涉及产生GIPF多肽的方法，包括在适于目的蛋白表达的条件下，在合适的培养基中培养含有表达载体的宿主细胞，该表达载体包含至少一个编码本发明GIPF多肽的GIPF多核苷酸片段，并从培养基中或宿主细胞中纯化蛋白质或多肽。优选的实施方案包括产生成熟蛋白或显性成熟蛋白形式蛋白质的方法。
本发明的多肽可用于多种目前应用于其它蛋白的常规过程和方法中。例如，本发明多肽可用于产生特异性结合该多肽的抗体。这种抗体，特别是单克隆抗体，在检测或定量组织中该多肽时很有用。
在另一实施方案中，本发明涉及刺激上皮细胞增殖的方法。该方法包括将上皮细胞与组合物接触，该组合物含有治疗有效量的GIPF多肽、其片段或其类似物，以及药学上可接受的载体。特别是，对需要刺激上皮细胞(包括细胞保护、增殖和/或分化)的个体，给予治疗有效量的或预防有效量的GIPF蛋白、其片段或其类似物。
在所有提到的方法中，上皮细胞可以和GIPF多肽在体外或体内相互接触。
还提供了预防、治疗或改善病症的方法，包括给予哺乳动物个体治疗有效量的组合物，该组合物包含本发明的肽和药学可接受载体。
特别是，本发明的GIPF多肽可用于诱导胃肠隐窝细胞(crypt cell)增殖和/或分化，从而使消化道的上皮层再生。因此，本发明的GIPF多肽和多核苷酸可用于治疗化学或放疗引起的粘膜炎、小肠结肠炎和炎症性肠疾病(inflammatory bowel disease)。还可用于治疗包括创伤、烧伤、眼病以及需要刺激上皮细胞增殖或再生的任何其它疾病。
本发明的多核苷酸和多肽还可用作胃肠上皮组织分化和发育的标记物。
本发明的方法还为治疗本文中所提到的疾病提供了方法，包括对表现出本文所述疾病相关的症状或倾向的哺乳动物个体，给予治疗有效量的组合物，该组合物包含本发明的多核苷酸和多肽，以及药学可接受载体。另外，本发明包括治疗本文中所提到的疾病的方法，包括给予含有能调节目标基因产物整体活性的化合物和其它物质，以及药学可接受载体的组合物。化合物和其它物质能影响对目标基因/蛋白表达水平，或目标蛋白活性的调节。特别的，还提供了预防、治疗或改善包括粘膜炎、炎症性肠疾病、创伤等病症的方法，包括给予哺乳动物个体，包括但不限于人，治疗有效量的包含本发明多肽的组合物或包含本发明GIPF多肽的结合配偶体的组合物。特定病症或病理学机制将指示本发明多肽或其结合配偶体对需要治疗的个体是否有益。
本发明进一步提供了制备用于上述方法的药物的方法。
本发明还涉及检测样本(如组织或样品)中本发明多核苷酸或多肽的存在的方法。这种方法例如可用于预后和诊断本文所述疾病，以及鉴别易患人群。
本发明提供了检测样品中本发明多肽的方法，包括在一定条件下，将样品和与所述多肽结合并形成复合物的化合物接触足够长的一段时间，从而形成复合物，检测该复合物的形成，如果复合物形成，就可检测该多肽。
本发明同时提供了包含多核苷酸探针和/或单克隆抗体，以及任选地定量标准品的试剂盒，以实现本发明方法。而且，本发明提供了在治疗上述疾病的临床实验中，评价药物疗效、监控病人进程的方法。
本发明还提供了调节(例如增加或降低)本发明多核苷酸和/或多肽表达或活性的化合物的鉴别方法。这种方法可用于，例如鉴别增强GIPF多肽治疗活性、改善本文所述疾病症状的化合物。这种方法包括，但不限于，鉴定分析与本发明多肽相互作用(例如结合)的化合物和其它物质。
本发明提供了与本发明多肽结合的化合物的鉴别方法，包括在一定条件下，使化合物和所述多肽接触足够长的时间，从而形成多肽/化合物复合物，检测该复合物，如果检测到了该多肽/化合物复合物，就鉴别出与多肽结合的化合物。
本发明还提供了与多肽结合的化合物的鉴别方法，包括将化合物和细胞中的多肽接触足够长的时间以形成多肽/化合物复合物，其中该复合物推动细胞中报道基因序列的表达，通过检测报道基因序列表达从而检测复合物，如果检测到了所述多肽/化合物复合物，就鉴别出了与多肽结合的化合物。
本发明的另一个实施方案是通过传递GIPF多肽，为治疗本文所述疾病提供了基因治疗方法。
相关实施方案中，本发明涉及载体在制备治疗本文所述疾病的药物中的应用，该载体包含编码GIPF多肽的基因，该基因与表达调控序列可操作连接从而表达GIPF多肽。更具体地，本发明提供了本发明腺病毒载体(例如，在下文中详述)在制备治疗粘膜炎或炎症性肠疾病的药物中的应用。
除了前面所述的方法和用途，本发明提供了一种新的病毒载体，包含与表达调控序列可操作连接的编码GIPF多肽的基因。一个优选实施方案中，病毒载体是腺病毒载体。本发明的病毒载体能提供编码任意GIPF多肽的基因，如上文所述。
本发明还提供了药物组合物，包含本发明的任一病毒载体和药学可接受载体。
在另一方面，本发明关注转基因构建物，包含编码天然人GIPF蛋白、其类似物或其片段的核酸，在转录调节序列的控制下，该核酸在B细胞中表达。转基因构建物优选包括B细胞特异性启动子，如免疫球蛋白κ链启动子。
另一方面，本发明关注转基因非人哺乳动物，在其B细胞中产生可检测水平的天然人GIPF蛋白，其类似物或其片段，其中所述转基因哺乳动物已经将编码天然人GIPF蛋白，具有天然人GIPF蛋白生物活性的其类似物或片段的核酸序列稳定地整合到染色体中，并与指导该核酸序列在B细胞中表达的转录调控序列可操作连接。转录调控序列优选包括B细胞特异性启动子，如免疫球蛋白κ链启动子。非人转基因哺乳动物可以是，但不限于例如小鼠、大鼠、兔子、猪、绵羊、山羊或牛。
另一方面，本发明关注治疗本文所述疾病的药物候选物的筛选方法，包括(a)将药物候选物给予转基因小鼠，该小鼠B细胞中表达GIPF多肽，并具有与上皮细胞过度增殖有关的肠膨胀(intestinal distension)；(b)评价候选药物对上皮细胞过度增殖的影响。所述药物候选物可以调节(如增加或降低)本发明多核苷酸和/或多肽的表达或活性。
本发明还包括一种治疗或改善病症的方法，所述病症包括粘膜炎、炎症性肠疾病和创伤，该方法包括给予哺乳动物个体，包括但不限于人，治疗有效量的GIPF多肽和细胞因子。
另一方面，本发明包括药物组合物，该组合物包含本发明多肽，第二种治疗剂，例如细胞因子，和药学可接受载体。
根据下列实施本发明的详细描述，本发明的其他方面和优点对本领域技术人员是显然的。
3.附图简述

图1描述全长GIPF的DNA序列(SEQ ID NO2)(A)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO4)(B)。SEQ ID NO2包括5’端和3’端非翻译区和开放阅读框。
图2描述GIPF mRNA在人组织(A)和鼠组织(B)中的表达 图3是本发明组合物的GIPF多肽的示意图。下划线的数字对应多肽的SEQ ID NOs，其他数字是编码多核苷酸序列的SEQID NOs。
图4A是SEQ ID NO2或3编码的GIPF蛋白(即SEQ ID NO4)与人干细胞生长因子A1 SEQID NO23(PCT WO 01/77169 A2的SEQ ID NO10)的BLASTP氨基酸序列比对，说明这两个序列中，SEQ ID NO4的10-251位氨基酸残基和SEQ ID NO23的11-257位氨基酸残基有63％的相似性，SEQ ID NO4的10-251位氨基酸残基和SEQ ID NO23的11-257位氨基酸残基有46％同一性。
图4B是SEQ ID NO2或3编码的GIPF蛋白(即SEQ ID NO4)与人血小板反应蛋白1的特定区域(SwissProt登记号P07996的501-657位氨基酸残基；SEQID NO28)的BLASTP氨基酸序列比对。该图表明这两个序列中，SEQ ID NO4的14-166位氨基酸残基和SEQ ID NO28的501-657位氨基酸残基有36％的相似性和26％同一性，其中A＝丙氨酸，C＝半胱氨酸，D＝天冬氨酸，E＝谷氨酸，F＝苯丙氨酸，G＝甘氨酸，H＝组氨酸，I＝异亮氨酸，K＝赖氨酸，L＝亮氨酸，M＝蛋氨酸，N＝天冬酰胺，P＝脯氨酸，Q＝谷氨酰胺，R＝精氨酸，S＝丝氨酸，T＝苏氨酸，V＝缬氨酸，W＝色氨酸，Y＝酪氨酸。缺口用虚线表示。
图5A-5R描述了产生本发明GIPF敲入(knock-in，GIPF-KI)载体的方法步骤。还描述了产生其B细胞中表达GIPF的转基因小鼠的优选方法。
图6描述了Southern印迹分析中用来筛选同源重组产生的ES克隆的探针的位置，以及经历同源重组或非同源重组的小鼠基因组DNA的EcoRI消化片段的大小。
图7是GIPF-KI小鼠肠道的大体病理学对照组(A)GIPF-KI(B)。
图8分别是GIPF-KI小鼠(A)和对照嵌合小鼠(B)的小肠横向切片(transverse section)的H&E染色。
图9是在更高放大倍数下看到的图8的小肠切片H&E染色。A和C对应图8中的A的GIPF-KI切片，B和D对应图8中的B的对照嵌合小鼠的肠切片。
图10是对照嵌合小鼠(A和C)和GIPF-KI小鼠(B和D)的小肠横向切片(cross-section)的Ki67染色。
图11是对照小鼠(A和C)和用1×1010病毒颗粒处理的小鼠(B和D)的小肠横向切片。切片是在分别注射空白和注射GIPF腺病毒3天后得到的。
图12是对照小鼠(A和C)和用1×1010病毒颗粒处理的小鼠(图12的B和D)的小肠横向切片。切片是在分别注射空白和注射GIPF腺病毒5天后得到的。
图13是BrdU掺入对照小鼠(A和C)和用1×1010病毒颗粒(VP)处理的小鼠(B和D)小肠的增殖的隐窝细胞。
图14是对照小鼠(A和C)和GIPF-腺病毒处理小鼠(B和D)小肠的增殖的隐窝细胞的Ki67染色。
图15是对照小鼠(A和C)和用1×109病毒颗粒处理的小鼠(B和D)的小肠横向切片的H&E染色。
图16是对照小鼠(A和C)和GIPF-腺病毒处理小鼠(B和D)结肠横向切片的H&E染色。
图17(A和B)从CHO细胞中纯化得到的天然V5-组氨酸-标记的GIPF蛋白的溶解度要求。
图18(A和B)小鼠血清中的V5-组氨酸-标记的GIPF蛋白的药代动力学。
图19是对照小鼠(A和C)和用纯化的GIPF蛋白处理的小鼠(B和D)小肠横向切片的H&E染色。
图20是BrdU掺入对照小鼠(A和C)和用纯化的GIPF蛋白处理的小鼠(B和D)小肠的增殖的隐窝细胞。
图21是对照小鼠(A)和纯化的GIPF蛋白处理小鼠(B)结肠横向切片的H&E染色。
图22是BrdU掺入对照小鼠(A和C)和用纯化的GIPF蛋白处理的小鼠(B和D)结肠的增殖的隐窝细胞。
图23是未受辐射照射小鼠(A)和盐水(B)、KGF(C)或GIPFwt(D)处理的辐射小鼠小肠横向切片的H&E染色。
图24是5-FU对对照小鼠和接受GIPFwt小鼠的肿瘤尺寸的影响。
图25是GIPF对正常小鼠(E和F)和荷瘤小鼠(A-D)的小肠和结肠的大体病理学的影响。
图26是正常小鼠(A)和接受5-FU和/或GIPF的荷瘤小鼠的小肠和结肠横向切片的H&E染色。
图27对肠绒毛长度和隐窝深度的微形态测量，显示GIPF对接受5-FU小鼠的小肠上皮的影响。
图28是对照小鼠(A和B)和用KGF或GIPF处理并且全身受辐射照射的小鼠(C-E)的腹侧舌(ventral tongue)增殖的上皮细胞的Ki67染色。
图29是对照小鼠(A和B)和用KGF或GIPF处理并且全身受辐射照射的小鼠(C和D)的背侧舌(dorsal tongue)增殖的上皮细胞的Ki67染色。
图30是用KGF或GIPF处理并且全身受辐射照射的小鼠腹侧舌上皮细胞的增殖指数。
图31是用GIPF处理并且全身受辐射照射的小鼠舌切片的H&E染色。
图32是GIPF对DSS诱导结肠炎小鼠炎症性肠疾病的活动指数(IBDAI)的影响。
图33是GIPF对DSS诱导结肠炎小鼠动物体重得数的影响。
图34是GIPF对DSS诱导结肠炎小鼠粪便粘稠度得分的影响。
图35是GIPF对DSS诱导结肠炎小鼠直肠出血得数的影响。
图36是GIPF对对照小鼠和DSS诱导小鼠的小肠和结肠大体病理学的影响。
图37是DSS和/或GIPF处理小鼠的小肠和结肠横向切片的H&E染色。
图38对肠绒毛长度和隐窝深度的微形态测量，显示GIPF对DSS诱导结肠炎小鼠的小肠上皮的作用。
图39是BrdU掺入接受DSS和/或GIPF的小鼠的小肠和结肠增殖的隐窝细胞。
图40是GIPF对DSS诱导结肠炎小鼠的小肠上皮增殖的影响。
图41是GIPF对人内分泌和肾上皮细胞中β-连环蛋白(catenin)稳定性的影响。GIPF诱导HEK293细胞中β-连环蛋白的稳定作用呈剂量依赖性(A)和时间依赖性(B)。煮沸(C)并不影响GIPF的稳定作用。
图42是GIPF对GSK3β磷酸化的作用。
图43设计用于测定GIPF不同区域稳定β-连环蛋白能力的GIPF多肽类似物的示例。片段编号1-11分别对应SEQ ID Nos85，87，89，91，93，95，97，99，101，103和105的多肽。
图44是图43所示GIPF类似物对β-连环蛋白的稳定作用。
图45是人和鼠GIPF对小鼠肠道大体病理学活性的比较。
图46是GIPF对肠隐窝深度的影响。
图47是GIPF对分离的隐窝细胞中β-连环蛋白的稳定作用的影响。
图48是GIPF对具有TNBS诱导结肠炎的动物的体重的影响。
图49是GIPF对具有TNBS诱导结肠炎的动物的结肠炎得分的影响。
图50是GIPF对由DSS诱导的慢性结肠炎的影响。
图51是GIPF对具有DSS诱导慢性结肠炎动物的绒毛长度和隐窝深度的影响。
图52是GIPF对具有DSS诱导慢性结肠炎动物的隐窝增殖指数的影响。
图53是GIPF对辐射后隐窝存活的影响。
图54A-N在转基因小鼠上皮中以绒毛蛋白驱动GIPF表达的转基因构建示意图。
图55GIPF在转基因小鼠肠上皮和肝中的胚胎表达。
图56表达GIPF的转基因小鼠中β-连环蛋白的稳定。
图57表达GIPF的转基因小鼠的小肠切片的H&E染色。
图58A-C在转基因小鼠中以绒毛蛋白驱动(villin-driven)表达GIPF和Wnt3a的转基因构建示意图。
图59GIPF和Wnt3a在转基因小鼠小肠和大肠的胚胎表达。
图60表达GIPF和Wnt3a的转基因小鼠中β-连环蛋白的稳定。
图61表达GIPF和Wnt3a的转基因小鼠胚胎中小肠切片的H&E染色。
图62A-K是RS-KO载体构建示意图。
图63是天然和重组RS-KO克隆的基因组图谱。
图64A-K是在转基因小鼠中表达GIPF缺失突变体(SEQ ID NO91)的敲入载体pCk m4 KI的构建示意图。
图65A-C是在转基因小鼠中表达GIPF缺失突变体(SEQ ID NO91)的敲入载体pPS m4 KI的构建示意图。
图66是天然和重组Ck m4 KI克隆的基因组图谱。
图67是天然和重组PS m4 KI克隆的基因组图谱。
图68A-C是在转基因小鼠中表达GIPF突变体(SEQ ID NO177；GenBank登记号AK098225)的敲入载体pCk VR KI的构建示意图。
图69A-C是在转基因小鼠中表达GIPF突变体(SEQ ID NO177；GenBank登记号AK098225)的敲入载体pPS VR KI的构建示意图。
图70是天然和重组Ck VR KI克隆的基因组图谱。
图71是天然和重组PS VR KI克隆的基因图谱。
图72是对照小鼠和表达GIPF缺失突变体SEQ ID NO91的转基因小鼠的小肠和大肠的比较。
图73是表达GIPF缺失突变体SEQ ID NO91转基因小鼠的小肠横向切片的H&E染色(低放大倍数)。
图74是表达GIPF缺失突变体SEQ ID NO91转基因小鼠的小肠横向切片的H&E染色(高放大倍数)。
图75是表达GIPF缺失突变体SEQ ID NO91转基因小鼠中洋虫胶-2(Axin-2)的稳定。
图76是表达GIPF突变体(SEQ ID NO177；GenBank登记号AK098225)的转基因小鼠(PSVR KI)的小肠和大肠与对照动物的比较。
图77是对照小鼠和表达GIPF突变体(SEQ ID NO177；GenBank登记号AK098225)转基因小鼠(PSVR KI)小肠横向切片的H&E染色(低放大倍数)。
图78是对照小鼠和表达GIPF突变体(SEQ ID NO177；GenBank登记号AK098225)转基因小鼠(PSVR KI)小肠横向切片的H&E染色(高放大倍数)。
图79是对照小鼠和表达GIPF突变体(SEQ ID NO177；GenBank登记号AK098225)转基因小鼠中洋虫胶-2的稳定。
图80是对照动物和T细胞转移诱导的慢性IBD动物(实施例37)的大肠切片的H&E染色。
4.发明详述 本发明多肽如图3所示，在下面将详细描述。
SEQ ID NO4的GIPF多肽是263个氨基酸的蛋白质，预计分子量约29kDa，未糖基化。SEQ ID NO2是编码GIPF多肽的cDNA。起始蛋氨酸从SEQ ID NO2的603位开始，推测的终止密码从SEQ ID NO2的1392位开始。用BLAST算法(Altschul S.F.et al.，J.Mol.Evol.36290-300(1993)和Altschul S.F.et al.，J.Mol.Biol.21403-10(1990)，引入此处作为参考)检索蛋白库，表明SEQ ID NO4与SEQ ID NO23干细胞生长因子A-1(PCTWO01/77169 A2的SEQ ID NO10)(图4A)和人血小板反应蛋白1(SEQ IDNO28)(图4B)同源。
SEQ ID NO4的1-20位氨基酸残基是预期的约20个残基的信号肽(SEQ ID NO8)。细胞外部分自身有用。信号肽区域是用神经网络信号P VI.I程序(Nielsen etal.，Int.J.Neural Syst.8581-599(1997)引入此处作为参考)和/或神经网络信号P V1.I程序(Nielsen et al，(1997)Int.J.Neural Syst.8，581-599)预测的。本领域技术人员应该知道，准确的切割位点可能与电脑程序预测的位点不同。SEQ ID NO10是缺少推定信号肽(SEQ ID NO8)的SEQ ID NO4的GIPF多肽。
在哺乳动物细胞培养物中克隆和纯化了源自SEQ ID NO4的两个物种的多肽。SEQ ID NO10是从用包含SEQ ID NO3核苷酸序列的载体构建物转染的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的细胞培养基中纯化得到的多肽。SEQ IDNO10的多肽是GIPF的显性成熟形式。SEQ ID NO9是编码SEQ ID NO10多肽的核苷酸序列。该多肽的N端序列通过Edman降解测序(Speicher，D.W..Methods 6248-261(1994)；Tempst et al.，Methods6248-261(1994))确定。SEQ ID NO12是从用包含SEQ ID NO3的载体构建体转染的人胚胎肾293细胞的细胞培养物中分离得到的成熟多肽形式。SEQ ID NO11是相应的编码SEQ ID NO12多肽的核苷酸序列。通过Edman降解测序，已经确定SEQID NO12多肽缺少SEQ ID NO4的前31个氨基酸残基。这31个氨基酸的肽包含弗林蛋白酶切割位点的共有位点(SEQ ID NO20)(Zhou et al.，J BiolChem 27420745-20748(1999)，引入此处作为参考)。
利用Pfam软件程序(Sonnhammer etal.，Nucleic Acids Res.，Vol.26(1)pp.320-322(1998)引入此处作为参考)，检验GIPF多肽(SEQ ID NO4)中与已知肽结构域同源的结构域。预期SEQ ID NO4的GIPF多肽具有1型血小板反应蛋白结构域(SEQ ID NO14，由SEQ ID NO 13的核苷酸序列编码)。包含在SEQ ID NO4中的1型血小板反应蛋白结构域的Pfam评分是0.0034，并且预期来自SEQ ID NO4的151-206位氨基酸残基。所述血小板反应蛋白结构域自身有用。
利用eMATRIX软件包(Stanford University，Stanford，CA)(Wu et al.，J.Comp.Biol.，vol.6，pp.219-235(1999)，引入此处作为参考)，预期SEQ ID NO4的GIPF多肽含有下表列出的结构域，其中A＝丙氨酸，C＝半胱氨酸，D＝天冬氨酸，E＝谷氨酸，F＝苯丙氨酸，G＝甘氨酸，H＝组氨酸，I＝异亮氨酸，K＝赖氨酸，L＝亮氨酸，M＝蛋氨酸，N＝天冬酰胺，P＝脯氨酸，Q＝谷氨酰胺，R＝精氨酸，S＝丝氨酸，T＝苏氨酸，V＝缬氨酸，W＝色氨酸，Y＝酪氨酸 为了调控主要由CHO细胞和/或293细胞产生的显性成熟(dominantmature)多肽或成熟多肽形式(分别是SEQID NO10和SEQ ID NO12)的产生，制备了合成构建体。SEQ ID NO16是表达多肽(SEQ ID NO16)的载体系统所包含的核苷酸序列，其中预期的信号肽(SEQ ID NO8)邻近293细胞产生的显性成熟形式(SEQ ID NO10)。SEQ ID NO17是通过定点诱变(Weiner et al.，Gene 12635-41(1993))在共有弗林蛋白酶切割位点(SEQ IDNO22)产生突变从而产生的核苷酸构建体。该突变将SEQ ID NO20的第一个精氨酸残基(R)变成谷氨酰胺(Q)。从精氨酸到谷氨酰胺的突变使得293细胞产生GIPF显性成熟形式(SEQ ID NO10)。
血小板反应蛋白是一族细胞外基质蛋白，参与细胞-细胞、细胞-基质的联系(Lawler et al.，Curr.Opin.Cell Bio.12634-640(2000))。已知有超过五种不同的血小板反应蛋白，并有不同模式的组织分布。一些组织，如心、软骨和脑表达大多数血小板反应蛋白基因产物。1型血小板反应蛋白是血小板的主要成分。1型血小板反应蛋白在细胞表面发挥作用，将膜蛋白与细胞因子和其它可溶性因子带到一起。与1型血小板反应蛋白相结合的膜蛋白包括整连环蛋白、整连环蛋白相关蛋白(CD47)、CD36和蛋白聚糖。转化生长因子β(TGFβ)和血小板衍生的生长因子也与1型血小板反应蛋白相结合。
1型血小板反应蛋白是具有许多不同结构域的大蛋白。其N端和C端含有球形结构域，与前胶原(procollagen)同源的区域，以及三种重复序列基序，分别叫做血小板反应蛋白(TSP)1型、2型和3型重复。TSP1重复在多种不同蛋白中存在，包括补体成分(C6，C7，C8A等)，胞外基质蛋白如ADAMTS、mindin、轴突指导分子(axonal guidance molecule)如F-底板反应蛋白信号素(F-spondin semaphorins)、SCO-spondin和原质团(plasmodium)的TRAP蛋白。
血小板反应蛋白1型重复(TSP1)能激活TGFp上皮组织，参与调节细胞生长、分化、粘附、迁移和死亡。血小板反应蛋白1型重复还参与蛋白结合、肝素结合、细胞粘附、神经突向外生长、抑制增殖、抑制血管形成和激活凋亡。原质体环子孢子(plasmodium circumsporozoite)(CS)蛋白和TRAP蛋白的TSP1结构域与子孢子(sporozoite)侵入唾液腺有关。
TSP1序列的特征是保守的半胱氨酸、紧密间隔的色氨酸以及一簇碱性残基。TSP1序列的空间构型显示有两个与肝素结合的β-片层结构域(Kilpelainen et al(200)J.Biol Chem.275，13564-13570，引入此处作为参考)。已经描述了肝素结合生长相关分子(HB-GAM)的相似空间折叠。HB-GAM与下列分子相同促有丝分裂和神经突向外生长促进蛋白质pleitrophin；成骨细胞特异因子-1；肝素结合神经营养因子；肝素亲和调节肽。HB-GAM的表达与轴突束和突触的胞外基质有关，还与脑外和软骨基质内的基底膜有关。最近，N-多配体聚糖(N-syndecan)被认为是脑内HB-GAM的受体，并且在调节海马长时程增强效应(参与记忆和学习的脑可塑性(plasticity)形式)中起作用。因此，含有TSP1的蛋白可作为生长启动子并显示GIPF活性。
另外，骨髓中合成的并沉积在细胞外基质内的血小板反应蛋白可作为原代多能祖细胞和分化成红细胞系、粒细胞系和巨核细胞系的造血祖细胞的粘附分子。因此，血小板反应蛋白对于血细胞发育是重要的(Long and Dixit(1990)Blood 75，2311-2318，引入此处作为参考)。
本发明的GIPF多肽和多核苷酸可用于诱导胃肠隐窝细胞的增殖或分化。它们可用于治疗需要上皮形成的病症，如治疗胃肠道疾病，包括化疗和放疗引起的粘膜炎，口咽、唇和食道的粘膜炎，炎症性肠疾病或包括创伤、烧伤、眼病的其它疾病，以及需要刺激上皮细胞增殖或再生的任何疾病。本发明的多核苷酸和多肽也可用于产生新组织和新器官从而辅助治疗需要移植组织的病人。
4.1定义 在描述本发明时，采用下列名词，其定义如下。
应当注意在本文和附加的权利要求中，除非另有明确说明，单数形式的″一″、″一个″和″某一个″包括复数含义。
名词“GIPF”指对上皮细胞具有特别活性的“胃肠增殖因子”。
本发明中，名词“GIPF蛋白”或“GIPF多肽”指由1位蛋氨酸至263位丙氨酸所确定的全长蛋白(SEQ ID NO4)、其片段或其类似物。
名词“全长GIPF”、“长型GIPF”、“野生型GIPF”、或“天然GIPF”指包含263个氨基酸残基的多肽(SEQID NO4)，如图1B所示。
名词“GIPFwt”或“hGIPF”指人野生型、全长GIPF多肽(SEQ ID NO4)；名词“GIPFt”指V5His6-标记的人GIPF多肽(SEQ ID NO6)；“mGIPFt”指来源于鼠的V5His6-标记的GIPF(SEQ ID NO69)。GIPF多肽突变体在SEQ ID NO4的第50位是异亮氨酸而不是缬氨酸。
名词“片段”指衍生于天然GIPF，但不包括GIPF全部序列的多肽。这类片段可以是全长分子的截短变体，如SEQ ID NO9和12，以及内部缺失的多肽，如SEQ ID NO16。通过检测GIPF在体内或体外对上皮细胞增殖的影响，发现GIPF片段具有GIPF生物活性，如本文所述。
名词“类似物”指相关分子的衍生物。类似物如上所述保留生物活性。一般来讲，名词“类似物”指具有天然多肽序列和结构的化合物，与天然分子相比，发生了一个或多个氨基酸插入、取代(通常其性质是保守的)和/或缺失，只要该修饰不破坏活性。SEQ ID NO18是GIPF类似物的例子。优选类似物至少具有与亲本分子相同的生物活性，甚至可以比亲本分子的活性更高。制备多肽类似物的方法是本领域已知的。特别优选的类似物包括天然保守取代，即发生在一族侧链相关氨基酸间的取代。具体地，氨基酸一般分为四族(1)酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性氨基酸赖氨酸、天冬酰胺和组氨酸；(3)非极性氨基酸丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸；和(4)不带电荷极性氨基酸甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被划分为芳香族氨基酸。例如，可以合理预测用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，用丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构相关氨基酸进行类似保守取代，可以保留GIPF的生物活性。
通过对比特定多肽和同源多肽的序列，使高度同源区域(保守区域)的氨基酸序列变化数目最少，或用共有序列取代氨基酸，可以确定哪个氨基酸残基可以取代、添加或缺失，而不破坏目标活性。
另外，编码这些相同或相似多肽的重组类似物可以是合成的或利用遗传密码子的“多余性”选择得到。可以在质粒或病毒载体中引入各种密码子取代，如产生各种限制性位点的沉默改变，以优化特定原核或真核体系中的克隆或表达。多核苷酸序列的突变可在多肽或加入多肽的其它肽结构域中反映出来，修饰了多肽任一部分的性质，改变了如配体结合亲和性、链间亲和力或降解/循环率等性质。
优选，氨基酸“取代”是用另一个具有相似结构和/或化学性质的氨基酸取代一个氨基酸的结果，即“保守”氨基酸取代。“保守”氨基酸取代是以参与残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性为基础的。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸；极性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷胺酰胺；正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。“插入”或“缺失”优选在约1-20个氨基酸范围内，更优选1-10个氨基酸。用重组DNA技术，系统地在多肽分子中插入、缺失或取代氨基酸，并检测所获得的重组变异体的活性，可以确定允许的变异。
另外，当需要改变功能时，可以进行插入、缺失或非保守改变以产生改变的多肽。这种改变可以，例如，改变本发明多肽的一种或多种生物功能或生化性质。例如，这种改变可以改变多肽的性质，如配体结合亲和力、链间亲和性或降解/循环率。此外，可以选择这种改变以产生更适合于在用于表达的宿主细胞中表达和扩充(scale up)等等的多肽。例如，可以缺失半胱氨酸残基或用另一个氨基酸残基取代以消除二硫键。
名词“衍生”指用以下技术化学修饰的多肽遍在蛋白化作用、标记(如用放射性核素或各种酶)、共价聚合物结合，如PEG化(用聚乙二醇衍生)，用非天然存在于人类蛋白中的化学合成氨基酸，如鸟氨酸，进行插入或取代。
名词“多肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物，并且不限制产物的最小长度。除非另有说明，该名词还包括不改变氨基酸序列的多肽修饰，例如糖基化、乙酰化和磷酸化形式。基于本发明的目的，多肽或蛋白质可以是合成的或重组产生的，或是从天然来源分离得到的。
对于多肽或多核苷酸来说，“纯化的”和“分离的”指目的分子存在而其它同类生物大分子基本不存在。此处名词“纯化的”指样品中存在的同类生物大分子优选至少占75％(重量)，更优选至少85％(重量)，更优选至少95％(重量)，更优选至少98％(重量)。在一个实施方案中，多核苷酸或多肽纯化至，除了水、缓冲液和其它小分子，尤其是分子量低于1000Da的分子外，至少含有95％的目的生物大分子。
“编码特定多肽的分离的多核苷酸”指基本不含不编码目的多肽的其它核酸分子的核酸分子；然而，该分子可以包括一些不损害该组合物基本性质的其它碱基或部分。
名词“天然多肽”指未经基因工程改造的细胞产生的多肽，特别是多肽翻译后修饰产生的各种多肽，修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、酯化和酰化。
名词“翻译蛋白编码部分”指编码包括任何先导序列的全长蛋白的序列或加工序列。
名词“显性成熟蛋白编码序列”指编码不含任何先导/信号序列的肽或蛋白质的序列。“显性成熟蛋白部分”指不含先导/信号序列的蛋白质部分。“成熟”形式指缺少先导/信号序列和弗林蛋白酶切割位点的GIPF多肽。可以在细胞的加工过程中除去肽的先导/信号序列和/或弗林蛋白酶切割位点，或通过合成方法或用仅编码成熟蛋白编码序列的多核苷酸制备蛋白。成熟蛋白或显性成熟蛋白部分可以包含或不包含起始甲硫氨酸残基。起始甲硫氨酸通常在肽加工过程中被除去。
此处的名词“分离的”指核酸或多肽与其天然来源中的至少另一种成分(例如，核酸或多肽)相分离。在一个实施方案中，核酸或多肽存在于仅有溶剂、缓冲体系、离子或该溶液中天然存在的其它成分的溶液中。名词“分离的”和“纯化的”不包括其天然来源中存在的核酸或多肽。
对于多肽或蛋白质，此处的名词“重组”指从重组表达系统(如微生物、昆虫或哺乳动物)来源的多肽或蛋白质。“微生物的”指在细菌或真菌(如酵母)表达体系中产生的重组多肽或蛋白质。作为产物，“重组微生物的”指基本不含天然内源物质、并不伴有天然糖基化的多肽或蛋白质。在大多数细菌培养中，如大肠杆菌，表达的多肽或蛋白质缺少糖基化修饰；在酵母中表达的多肽或蛋白质通常具有与在哺乳动物细胞中表达所不同的糖基化形式。
“重组多肽”指用本文所述重组DNA技术制备的多肽。概括来说，克隆编码目的多肽的基因，并在转化的生物体中表达，见下述。宿主生物体在表达条件下表达外源基因产生多肽。另外，可以改变调控内源多肽表达的启动子以产生重组多肽。
名词“活性”指保留任何天然多肽的生物活性和/或免疫活性的多肽形式。按照本发明，名词“生物学活性”或“生物活性”指具有天然分子的结构、调节或生化功能的蛋白质或肽。同样“生物学活性”或“生物活性”指天然的、重组的或合成的GIPF肽、或其任意的肽片段，在适宜的动物或细胞中，诱发特定生物学反应和结合特定抗体的能力。
名词“分泌的”包括穿膜或跨膜蛋白质，包括在适当宿主细胞中表达时，在信号序列作用下的氨基酸序列转运。“分泌的”蛋白包括但不限于从表达细胞中完全分泌(如可溶性蛋白质)或部分分泌(如受体)的蛋白质。“分泌的”蛋白也包括但不限于跨内质网膜转运的蛋白。“分泌的”蛋白还包括带有非典型信号序列的蛋白(如白介素-1β，见Krasney，P.A.和Young，P.R.(1992)Cytokine 4(2)134-143)以及从损伤细胞释放的因子的蛋白(如白介素-1受体拮抗剂，见Arend，W.P.et.al.(1998)Annu.Rev.Immunol.1627-55)。
此处的名词“多核苷酸”或“核酸分子”指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的任意长度的核苷酸多聚物。该名词仅指分子的一级结构，因此包括双链和单链DNA和RNA。也包括已知的修饰类型，如已知的标记、甲基化、加帽、用类似物取代一个或多个天然核苷酸、核苷酸间修饰，如不带电连接(如甲基磷酸盐化合物、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酯类等等)和带电连接(如磷硫酯、二硫代磷酸酯等)、含有悬挂部分，例如蛋白质(包括例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚L-赖氨酸等)，带有插入剂(如丫叮(acridine)、补骨脂素等)，含有螯合物(例如金属、放射性金属、硼、金属氧化物等)，含有烷化剂，带有修饰连接(如α异头物(anomeric)核酸等)和多核苷酸的非修饰形式。一般来讲，本发明提供的核酸片段由基因组片段和短寡核苷酸接头组装而成、或由一系列寡核苷酸或单个的核苷酸组装而成，产生合成的核酸，能够在含有源自微生物或病毒操纵子或真核基因的调节元件的重组转录单元中表达。
名词“寡核苷酸片段”或“多核苷酸片段”、“部分”或“片段”或“探针”或“引物”可互换使用，指至少约5个核苷酸、更优选至少约7个核苷酸、更优选至少约9个核苷酸、更优选至少约11个核苷酸、最优选至少约17个核苷酸的核苷酸残基序列。所述片段优选少于约500个核苷酸，优选少于约200个核苷酸，更优选少于约100个核苷酸，更优选少于约50个核苷酸，最优选少于约30个核苷酸。探针优选约6-200个核苷酸，优选约15-50个核苷酸，更优选约17-30个核苷酸，最优选约20-25个核苷酸。优选所述片段可用于聚合酶链式反应(PCR)、各种杂交程序或微阵列检测以鉴定或扩增mRNA或DNA分子的相同或相关部分。片段可特异地鉴别本发明每个多核苷酸序列。优选所述片段包括与下列序列的一部分基本相似的序列SEQ IDNO1，2，5，7，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177。
探针可用于例如确定细胞或组织中是否存在特异性mRNA分子或用于分离染色体DNA的相似核酸序列，如Walsh et al.所述(Walsh，P.S.et al.，1992，PCR Methods Appl 1241-250)。可用缺口平移、Klenow填充反应、PCR或其它公知方法进行标记。本发明的探针、其制备和/或标记参见Sambrook，J.et al.，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，NY；or Ausubel，F.M.et al.，1989，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York NY，引入此处作为参考。
本发明的核酸序列还包括来自SEQ ID NO1，2，5，7，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177的任一序列的序列信息。序列信息可以是特异识别或代表SEQ ID NO1，2，5，7，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177序列信息的SEQ ID NO1，2，5，7，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177序列的片段。这种片段之一可以是20mer的核酸序列，因为与人基因组完全匹配的20mer的可能性是1/300。在人基因组中，每组染色体上有3,000,000,000个碱基对。因为可能存在420个20mer核酸序列，一组人染色体上有20mer核酸序列的300倍数量的碱基对。利用同样的分析，与人基因组完全匹配的17mer的可能性是约1/5。当这些片段用于表达分析时，可使用15mer片段。表达序列中完全匹配的15mer片段的可能性同样是约1/5，因为被表达的序列包含少于约5％的整个基因组序列。
同样的，当利用序列信息检测单个错配时，片段可是25mer。将完全匹配的几率(1/425)乘以每个核苷酸位点升高的错配几率(3×25)，可以计算出人基因组中出现的带有单个错配的25mer的几率。表达研究试验中检测到的含有单个错配的18mer序列的几率是约1/5。人基因组中带有单个错配的20mer片段的几率是约1/5。
名词“开放阅读框(ORF)”是指一系列不含终止密码子的编码氨基酸的核苷酸三联体，并可翻译成蛋白质。
名词“可操作连接”或“可操作联合”指功能相关的核酸序列。例如，如果启动子调控编码序列转录，则启动子与编码序列是可操作连接的或可操作联合的。当可操作连接的核酸序列是连续的且在同一阅读框内，某些遗传元件如抑制基因与编码序列不是连续连接，但仍能够控制编码序列的转录/翻译。
此处的名词“重组DNA分子”或“重组多核苷酸”是指基因组多核苷酸、cDNA、半合成或合成的，根据其来源或处理方法可分为(1)与其天然伴随的多核苷酸的全部或部分不相连，(2)与其天然连接的多核苷酸不相连，(3)非天然的。因此，该名词包括“合成衍生的”核酸分子。
名词“互补的”或“互补性的”指碱基配对产生的多核苷酸天然结合。例如，序列5′-AGT-3′与互补序列3′-TCA-5′相结合。两个单链分子的互补性可以是部分性的，即仅一些核酸相结合，或是完全性的，即整个单链分子之间完全互补。核酸链间的互补程度对于核酸链间杂交的有效性和强度有重要影响。
名词“严谨”指本领域通常理解的严谨条件。严谨条件包括高度严谨条件(65℃与膜结合DNA杂交，反应体系为0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，1mM EDTA，68℃用0.1×SSC/0.1％SDS洗涤)，和中度严谨条件(即42℃用0.2×SSC/0.1％SDS洗涤)。其它杂交条件的示例在实施例中说明。
当脱氧寡核苷酸杂交时，其它示例性严谨杂交条件包括在6×SSC/0.05％焦磷酸钠中在37℃(14个碱基的寡核苷酸)，48℃(17个碱基的寡核苷酸)，55℃(20个碱基的寡核苷酸)，60℃(23个碱基的寡核苷酸)条件下洗涤。
本文中“基本相同”指核苷酸序列和氨基酸序列，例如由于一个或多个取代、缺失或添加而不同于参照序列的突变序列，这些改变的净效应不导致参照序列和目标序列的相反功能的异化(adverse functional dissimilarity)。典型的，这种基本相同序列与本文所述的序列的不同等于或小于约35％(即与相应参照序列相比，基本相同序列中发生取代、添加和/或缺失的残基数量除以基本相同序列中的总残基数等于约0.35或更小)。这个序列与所列序列有65％序列同一性。在一个实施方案中，本发明的基本相同序列，如突变体，与所述序列的不同等于或低于30％(70％序列同一性)；该实施方案的一个修改方案中，不同不超过25％(75％序列同一性)；另一个修改方案中，不同不超过20％(80％序列同一性)；另一个修改方案中，不同不超过10％(90％序列同一性)；另一个修改方案中，不同不超过5％(95％序列同一性)。本发明的基本相同氨基酸序列，如突变体，优选与所列氨基酸序列至少有80％序列同一性，更优选90％序列同一性。考虑到例如遗传密码的重复性或简并性，本发明基本相同核酸序列可具有较低的序列同一性。优选核酸序列至少约65％相同，更优选至少约75％相同，更优选至少约95％相同。对于本发明的目的，具有基本相同生物活性和基本相同表达性质的序列被认为是基本相同的。为了确定相似度，忽略成熟序列的截短体(如通过产生假终止密码子的突变)。用Jotun Hein方法(Hein，J.(1990)MethodsEnzymol.183626-645)可以确定序列同一性。也可用其它已知方法，如通过改变杂交条件，确定序列之间的同一性。
名词“载体”指能够转运所连另一核酸的核酸分子。名词“表达载体”包括能够合成由载体携带的各个重组基因编码的GIPF蛋白的质粒、粘粒或噬菌体。优选质粒能够自主复制和表达所连的核酸。
名词“转化”指将DNA引入到合适的宿主细胞中，使DNA作为染色体外元件或者通过染色体整合而复制。
名词“转染”指适当的宿主细胞吸收表达载体，无论任意编码序列是否实际表达。名词“感染”指用病毒或病毒载体将核酸引入合适的宿主细胞中。
名词“转录调节元件”和“转录调节序列”可以互换使用，指在特定生物体中与编码序列可操作连接的表达所必需的DNA序列。适合原核生物的调控序列包括，例如启动子、任意的操纵子序列，和核糖体结合位点。真核细胞利用启动子、增强子、剪切信号和polyA信号。这些名词包括增强或调节转录的所有元件，包括启动子、RNA聚合酶和转录因子的基本相互作用所必需的核心元件、上游元件、增强子和反应元件(Lewin，″Genes V″(OxfordUniversity Press，Oxford)pages 847-873)。
当RNA聚合酶将编码序列转录为mRNA时，编码序列“处于细胞内转录和翻译调控序列的调节”下，生成的mRNA任选地进行反式RNA剪切并翻译为编码序列编码的蛋白。
名词“组织特异性启动子”指作为启动子的核酸序列，即调节与启动子可操作连接的所选DNA序列的表达，影响所选DNA序列在特定细胞，如B细胞中的表达。在一个说明性实施方案中，利用B细胞特异性启动子的基因构建体优选用于指导B细胞中GIPF蛋白或蛋白片段的表达。
名词“表达调节片段(EMF)”指一系列调节可操作连接的ORF或另一EMF表达的核苷酸。
本文中，当EMF存在改变序列表达时，称序列“调节可操作连接序列的表达”。EMFs包括但不限于，启动子和启动子调节序列(诱导元件)。一类EMFs是诱导操作连接的ORF响应特定调节因子或生理事件进行表达的核酸片段。
名词“重组表达载体”指表达DNA(RNA)序列的多肽的质粒、噬菌体或病毒或载体。表达载体包括转录单元，包含(1)遗传元件或基因表达中起调节作用的元件，例如启动子或增强子，(2)可转录为mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列，如(3)适当的转录起始和终止序列。酵母或真核表达系统所用的结构单元优选包括使宿主细胞胞外分泌翻译蛋白的前导序列。另外，不含前导或转运序列的重组蛋白表达时，氨基末端可能含有甲硫氨酸残基。该残基随后可能从表达的重组蛋白中切除或不被切除，产生终产物。
名词“重组表达系统”指重组转录单元稳定整合至染色体DNA的宿主细胞，或携带染色体外重组转录单元的宿主细胞。一旦引入调节元件并与所要表达的DNA片段或合成基因连接，本文定义的重组表达系统就表达异源多肽或蛋白质。该名词也指稳定整合了重组遗传元件或调节基因表达的元件(如启动子或增强子)的宿主细胞。一旦引入调节元件并与内源性DNA片段或要表达的基因连接，本文定义的重组表达系统就表达细胞内源性多肽或蛋白质。细胞可以是原核细胞或真核细胞。
名词“转基因”指对于引入该核酸的转基因动物或细胞来说是部分异源或全部异源，即外来的核酸序列，或者对于引入该核酸的转基因动物或细胞的内源基因来说是同源的，但需要插入动物基因组中以改变被插入细胞的基因组，例如插入与天然基因不同的位置。转基因可操作地连接于一个或多个转录调节序列和任何其它核酸，如优化所选核酸表达所必需的内含子。
相应的，“转基因构建体”指包括转基因、并任选包括如转录调节序列，polyA位点、复制起始点、标记基因等其它核酸的核酸，通常用于将转基因插入宿主生物体的基因组。
名词“转基因”用来形容例如包含转基因的动物或构建体的性质。例如，本文中“转基因生物体”可以是任何动物，优选非人类哺乳动物，其中一个或多个动物细胞含有通过人工干预，如用已知转基因技术，引入的异源核酸。通过仔细的遗传操作，如微注射或用重组病毒感染，可以将核酸直接或间接引入细胞前体从而引入细胞。核酸可整合入染色体内，或者作为染色体外复制的DNA。在本文描述的转基因动物中，转基因使细胞表达或过量表达GIPF蛋白。
名词“多能性”指细胞分化为成年生物体中存在的多种不同分化的细胞类型的能力。多能性细胞与全能细胞相比，分化能力有限。
名词“胚胎干细胞(ES)”包括生殖细胞，指在胚胎或成体中产生许多分化的细胞类型的细胞。名词“种系干细胞(GSCs)”指源于原始干细胞(primordial germ cell)，能够稳定和连续提供干细胞以产生配子的干细胞。名词“原始干细胞(PGCs)”指胚胎形成过程中，源于其它细胞系，特别是源于卵黄囊、隔膜(mesentery)或性腺脊的一小群细胞，具有分化为生殖细胞(germcell)或其它细胞的潜能。PGCs是GSCs和ES细胞的来源。PGCs、GSCs和ES细胞均能自我更新。因此，这些细胞不仅可以组成种系并产生组成成体专门器官的多种终末分化细胞，还可以再生自己。名词“全能性”指细胞分化为成熟生物体所有细胞种类的能力。名词“多能性”指细胞分化为成年生物体中存在的多种分化细胞类型的能力。多能性细胞与全能性细胞相比，分化能力有限。
名词“创始细胞系(founder line)”和“创始动物(founder animal)”指被植入转基因的胚胎发育成熟的动物，即由插入了DNA并植入一个或更多代理宿主中的胚胎发育而得的动物。
名词“后代”和“转基因动物后代”指继最初转化的哺乳动物之后的每一代的任意和所有后代。
名词“非人类哺乳动物”指除人类以外的哺乳动物的所有成员。“哺乳动物”指任何被列为哺乳动物的动物，包括人类、家禽和养于农场、动物园、运动场的动物或宠物，如小鼠、大鼠、兔子、猪、绵羊、山羊、牛和更高等的灵长类动物。
名词“治疗”或“处置”指治疗性和预防性或防止性措施，以预防或减轻不希望的生理变化或状况，如化疗或放疗导致的粘膜炎。对于本发明的目的，有益的或期望的临床效果包括但不限于，缓解症状、减轻疾病严重程度、稳定疾病状态、无论是否可觉察。
“疾病”指可用本发明转基因动物模型鉴定的分子治疗的任意状态。包括造成哺乳动物病理学状态紊乱的慢性和急性紊乱或疾病。本文所治疗的紊乱的非限制性例子包括粘膜炎、炎症性肠疾病和皮肤损伤。本文所治疗的病症优选是粘膜炎。
本文中“炎症性肠疾病(IBD)”指小肠和/或大肠的自发性或慢性炎症，包括克罗恩病(Croh’s disease)、溃疡性结肠炎、感染源导致的IBD和抗生素相关的IBD。
此处的“粘膜炎”指包括口咽、唇、食道、大肠和小肠等的消化道粘膜的炎症。
“短肠综合症”或“SBS(Short Bowel Syndrome)”指相当长一段小肠的解剖性或功能性丧失引起的营养吸收不良。
名词“有效量”或“药学有效量”指达到预期生物效果的有效但无毒的剂量。所述效果可以是减轻和/或改善体征、症状、疾病病因或其它任何预期的生物体系的改变。例如，用于本发明方法的GIPF片段的有效量是足以刺激上皮细胞兴奋或增殖的量，优选是使个体胃肠上皮再生增加的量，所述个体经受化疗或放疗引起的粘膜炎、炎症性肠疾病或需要上皮细胞增殖的其它疾病。所述给药量在下文描述。本领域技术人员根据常规试验可以确定每一个案的适宜“有效量”。
“药物可接受”或“药学可接受”指非生物上不期望的材料的或其它不希望的材料，即可给予个体而不引起任何非期望的生物作用或不以有害方式与包含其的组合物中的任一组分相互作用的材料。
“生理pH”或“生理范围内的pH”指pH值约7.0～8.0。优选生理pH值约7.2～7.6之间。
本文中名词“个体”包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于哺乳动物种属的任何成员人，非人灵长类动物如猩猩、猿、猴子等；农业动物如牛、马、绵羊、山羊和猪；家畜如兔子、狗和猫；实验动物包括啮齿类动物，如大鼠、小鼠、豚鼠等等。非哺乳动物的例子包括但不限于鸟、鱼等等。不指定特定的年龄或性别。
4.2本发明的药物组合物 4.2.1核酸组合物 本发明基于以下发现含有上皮细胞生长因子多肽、GIPF和编码GIPF多肽的多核苷酸的药物组合物，刺激小肠上皮细胞，包括隐窝细胞生长和增殖。因此，这些药物组合物可用于诊断和治疗需刺激上皮细胞增殖或再生的疾病。
本发明的分离的多核苷酸包括但不限于，包含SEQ ID NO2，3，5，7，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177任一核苷酸序列的多核苷酸；包含SEQ ID NO3，5，7，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177的全长蛋白编码序列的多核苷酸(例如编码SEQID NO4，6，8，10，12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105或178的序列)；包含SEQ ID NO4多肽的成熟蛋白和显性成熟蛋白的编码核苷酸序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸还包括但不限于，在严谨条件下与下列序列杂交的多核苷酸(a)SEQID NO2，3，5，7，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177任意核苷酸序列的互补序列；(b)编码SEQID NO4，6，8，10，12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105或178任一多肽的多核苷酸；(c)上述任意多核苷酸的等位变体的多核苷酸；(d)编码上述任意蛋白种属同系物的多核苷酸；或(e)编码包含SEQID NO4，6，8，10，12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105或178多肽的特定结构域或截短体的多核苷酸。目的结构域包括胞外区、跨膜区、或胞浆区、或其组合；以及催化和底物结合结构域。
本发明多核苷酸包括天然或全部或部分合成的DNA，例如cDNA、基因组DNA和RNA，例如mRNA。多核苷酸可包括cDNA的所有编码区域或cDNA编码区域的一部分。
本发明还提供了包含本文所述cDNA序列的相应基因的组合物。相应基因可利用本文所述的序列信息用已知方法纯化。这类方法包括用已知序列信息制备探针或引物来鉴定和/或扩增适当基因组文库或其它基因组材料来源的基因。5′和3′端序列可通过本领域已知方法获得。例如，对应于SEQID NO2任意多核苷酸的全长cDNA或基因组DNA可通过在合适杂交条件下，用SEQ ID NO2，3，5，7，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177任意多核苷酸或其一部分作为探针，筛选适当的cDNA或基因组DNA文库而获得。另外，SEQ ID NO2，3，5，7，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177的多核苷酸可作为在基因组DNA或cDNA文库中鉴定和/或扩增基因的适当引物的基础。
本发明核酸序列可由ESTs和从一个或更多公共数据库，如dbEST、gbpri和UniGene获得的序列(包括cDNA和基因组序列)组装而成。EST序列可提供鉴定序列信息、典型片段信息、或全长基因的新片段信息。
本发明多核苷酸还提供了包括与上述多核苷酸基本相同的核苷酸序列的多核苷酸。例如，本发明的多核苷酸与上述多核苷酸序列至少有约65％、至少约70％、至少约75％，至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，或89％，更加典型的至少约90％，91％，92％，93％或94％甚至更加典型的至少约95％，96％，97％，98％或99％序列同一性。
本发明核酸序列包括在严谨条件下与SEQ ID NO1，6，8，10，12，14，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177中的任意核酸序列或其互补序列杂交的核酸序列片段，该片段大于约5个核苷酸，优选7个核苷酸，更优选大于9个核苷酸，最优选大于17个核苷酸。可选择例如15、17或20个或更多个核苷酸的片段(即与本发明任一多核苷酸特异性杂交)。与多核苷酸特异性杂交的探针可以将本发明多核苷酸序列与相同基因家族的其它多核苷酸序列区别开，或将人基因与其它物种基因区别开，并且优选基于独特的核苷酸序列。
本发明范围内的序列不仅限于这些特定序列，还包括其等位基因变体和种属变体。将SEQ ID NO2，3，5，7，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177的序列、其代表性片段、或与SEQ ID NO2，3，5，7，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177至少90％相同，优选95％相同的核苷酸序列，与相同物种另一分离物中的序列进行比较，可以常规地确定等位基因变体和种属变体。而且，为了适应密码子可变性，本发明包括编码与本文所述特定ORFs具有相同氨基酸序列的核酸分子。也就是说，ORF编码区域中，包括用一个密码子取代另一个编码相同氨基酸的密码子。
本发明核酸的最近的邻域可利用算法或程序搜索数据库得到。优选用BLAST，即基本局部序列比对检索工具，检索局部序列比对(Altshul，S.F.JMol.Evol.36 290-300(1993)和Altschul S.F.et al.J.Mol.Biol.21403-410(1990))。
本发明同样提供了所述多核苷酸和蛋白质的种属同系物(或直向同源物)。通过此处提供的序列制备合适的探针或引物，筛选源自所需物种的适当核酸，可以分离和鉴别种属同系物。
本发明也包括所述多核苷酸或蛋白质的等位突变体；即分离的多核苷酸的天然的不同形式，编码与所述多核苷酸编码的蛋白相同、同源或相关的蛋白质。
本发明的核酸序列还包含编码所述核酸类似物的序列。用本领域已知方法，将适当的核苷酸变化引入天然或变异多核苷酸中，可以制备这些氨基酸序列类似物。在构建氨基酸序列突变体中有两种可变因素突变位点和突变性质。编码氨基酸序列类似物的核酸优选通过突变多核苷酸以编码非天然氨基酸序列来构建。这些核酸改变可发生在使核酸不同于其它种属核酸的位点(突变位点)或在高度保守区域(恒定区)。典型的，这类位点可通过一系列方法进行修饰，例如先进行保守取代(如用一个不同的疏水氨基酸取代另一个疏水氨基酸)，再进行其它取代(如用带电荷氨基酸取代疏水氨基酸)，然后在目的位点上进行删除或插入。氨基酸序列删除通常约1～30个残基，优选约1～10个残基，并且通常是连续的。氨基酸插入包括氨基端和/或羧基端融合长度1～100或更多个残基，以及序列内插入单个或多个氨基酸残基，序列内插入通常约1～10个氨基酸残基，优选1～5个残基。末端插入的示例包括用于分泌或在不同宿主细胞中进行胞内定位所必需的异源信号序列，和例如poly-His等利于纯化表达蛋白的序列。
在一种优选方法中，编码新氨基酸序列的多核苷酸通过定点突变发生改变。这种方法利用寡核苷酸序列来改变编码预期氨基酸突变体的多核苷酸，并使得氨基酸突变位点两端有足够的临近核苷酸以在经历改变的位点的任何一端均产生稳定二倍体。一般的，定点突变技术对本领域技术人员是已知的，在Edelman et al.，DNA 2183(1983)中有说明。Zoller和Smith，Nucleic Acids Res.106487-6500(1982)公开了一种在多核苷酸序列中产生定点突变的通用和有效的方法。PCR也可用于产生新核酸的氨基酸序列突变体。当用少量模板DNA作为起始材料时，与模板DNA相应区域的序列轻微不同的引物可以产生预期的氨基酸突变体。PCR扩增得到一组产物DNA片段，与编码多肽的多核苷酸模板在引物特异性位点不同。产物DNA片段替代了质粒中的相应区域，并产生编码预期氨基酸突变体的多核苷酸。
制备氨基酸突变体的另一技术是盒式突变技术，如Wells et al.，Gene 34315(1985)所述；以及其它本领域已知的突变技术，如Sambrook et al.，出处同上，和Current Protocolsira Molecular Biology，Ausubel et al。由于遗传密码自身的简并性，编码基本相同或功能等同氨基酸序列的DNA序列也可用于本发明克隆和表达这些新核酸。这类DNA序列包括在严谨条件下与适宜的新核酸序列杂交的序列。
编码本发明优选多肽截短体的多核苷酸可用于制备多核苷酸，编码含有本发明一个或更多结构域和异源蛋白序列的嵌合或融合蛋白。
本发明多核苷酸还包括上述任意多核苷酸的互补物。所述多核苷酸可以是DNA(基因组、cDNA、扩增的或合成的DNA)或RNA。获得这类多核苷酸的方法和算法对本领域技术人员是熟知的，可包括，例如确定杂交条件以便常规分离具有所需序列同一性的多核苷酸的方法。
本发明的多核苷酸序列包括显性成熟蛋白或成熟蛋白编码序列，SEQID NO6或8的任意编码序列或其功能等同体，可用于制备在适宜宿主细胞中引导核酸或其功能等同体表达的重组DNA分子。也包括本文鉴定的任意克隆的cDNA插入物。
本发明的多核苷酸可利用已有的重组DNA技术(见SambrookJ et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，NY)与任何其它核酸序列相连。用于连接多核苷酸的核苷酸序列包括本领域公知的一类载体，如质粒、粘性质粒、λ噬菌体衍生物、噬菌粒等。相应的，本发明提供了包括本发明多核苷酸的载体和含有多核苷酸的宿主细胞。一般的，载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起始点、限制性内切酶位点和宿主细胞选择性标记。本发明载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。本发明宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，可以是单细胞生物体或多细胞生物体的一部分。
本发明还提供了含有SEQ ID NO2，3，5，7，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177任意核苷酸序列或其片段或任何其它GIPF多核苷酸的核酸的重组构建体。在一个实施方案中，本发明重组构建体包括载体，如质粒或病毒载体，其中插入了具有SEQ ID NO2，3，5，7，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177任一核苷酸序列或其片段的核酸。在包含本发明ORF之一的载体的情况下，所述载体还包含调节序列，包括例如与ORF可操作连接的启动子。大量适宜的载体和启动子对于本领域技术人员是熟知的，并且可通过商业途径获得以产生本发明的重组构建体。以举例方式提供了下述载体。细菌载体pBs，phagescript，PsiX74，pBluescript SK，pBs KS，pNH8a，pNH16a，pNH18a，pNH46a(Stratagene)；pTrc99A，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核载体pWLneo，pSV2cat，pOG44，PXTI，pSG(Stratagene)pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL(Pharmacia)。在一个实施方案中，SEQ ID NO3的核酸插入到本发明实施例所述的CKP2KI载体中。
本发明的分离多核苷酸可与表达调控序列可操作连接，如Kaufman etal.，Nucleic Acids Res.19，4485-4490(1991)所述的pMT2或pED表达载体，以产生重组蛋白。许多适当的表达调控序列是本领域已知的。表达重组蛋白的一般方法也是已知的，在R.Kaufman，Methods in Enzyniology185，537-566(1990)中有表述。此处定义的“可操作连接”指本发明的分离多核苷酸和表达调控序列在载体或细胞中的定位，使得用连接的多核苷酸/表达调控序列转化(转染)的宿主细胞表达所述蛋白质。
用CAT载体或其它有选择性标记的载体可以从任何所需基因中选择启动子区域。两个合适的载体为pKK232-8和pCM7。特别命名的细菌启动子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，λPR和trc。真核启动子包括立即早期CMV，HSV胸苷激酶，早期或晚期SV40，逆转录病毒的LTRs，和小鼠金属硫蛋白-1。选择合适的载体和启动子属于本领域技术人员技术范围内。一般的，重组表达载体包括复制起始点和允许转化宿主细胞的选择性标记，例如大肠杆菌青霉素抗性基因和啤酒酵母TRP1基因，以及指导下游结构序列转录的来自高度表达的基因的启动子。这类启动子源于编码糖酵解酶，如3-磷酸甘油酸酯激酶(PGk)，α因子、酸性磷酸酯酶或热休克蛋白的操作子。异源结构序列由翻译起始序列和终止序列，以及优选指导翻译蛋白分泌至周质空间或胞外基质的先导序列，在合适的时间组装而成。任选的，异源序列能够编码包括氨基末端识别肽的融合蛋白，该识别肽赋予特殊性质，如稳定表达的重组产物或简化其纯化。通过插入编码预期蛋白的结构DNA序列、在开放阅读期插入合适的转录起始信号和终止信号以及功能性启动子，可以构建用于细菌的表达载体。载体包含一个或多个表型选择标记和的复制起始点以确保载体在宿主中保持，如果需要，还在宿主中扩增。适当的用于转化的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和假单胞菌属、链霉菌属、葡萄球菌属各种菌种，尽管其它仅是作为选择用宿主。
一个代表性但非局限性的例子是，细菌用表达载体可包括选择性标记和细菌复制起始点，该起始点源自包含已知克隆载体pBR322(ATCC37017)遗传元件的商品化质粒。这类商业化载体包括，例如pKK223-3(PharmaciaFine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotech，Madison，WI，USA)。pBR322“骨架”部分由合适的启动子和要表达的结构序列组成。转化合适的宿主菌株并且宿主菌株生长到合适的细胞密度后，诱导选择的启动子或用适当方法(如变换温度或化学诱导)进行抑制，细胞再培养一段时间。典型的，通过离心收获细胞，用物理或化学方法破碎细胞，得到的粗提物进行下一步纯化。
除了用表达载体实现本发明，本发明还包括含有与编码目的蛋白的多核苷酸序列可操作连接的启动子元件的新表达载体。这类载体的一个例子是pcDNA/载体，在实施例8中描述。
4.2.2宿主 本发明还提供了用本发明载体进行遗传改造的宿主细胞，载体可以是，例如克隆载体或含有本发明多核苷酸的表达载体。例如，这类宿主细胞含有用已知转化、转染或感染方法引入宿主细胞的本发明核酸。载体可以是，例如质粒、病毒颗粒或噬菌体等形式。工程化宿主细胞可以在常规营养培养基培养，培养基可进行改良以适于激活启动子、选择转化子或扩增GIPF基因。培养条件，如温度、pH等，是先前培养用于表达的宿主细胞的培养条件，对于本领域技术人员是熟知的。本发明还提供了经过遗传改造表达本发明多核苷酸的宿主细胞，其中所述多核苷酸和与宿主细胞异源的、驱动多核苷酸在宿主细胞中表达的调节序列可操作连接。
宿主细胞可以是更高级的真核宿主细胞，如哺乳动物细胞，低等真核宿主细胞，如酵母细胞，宿主细胞也可以是原核细胞，如细菌细胞。磷酸钙转染、DEAE、葡聚糖介导的转染、或电穿孔实现重组构建体引入宿主细胞(Davis，L.et al.，Basic Methods in Molecular Biology(1986))。含有一种本发明多核苷酸的宿主细胞可以常规方法使用以产生分离片段(在ORF情况下)编码的基因产物或者用于在EMF调控下产生异源蛋白。
任何宿主/载体系统可用于表达一种或多种GIPF多肽。这些包括但不限于，真核宿主，如HeLa细胞，Cv-1细胞，COS细胞和Sf9细胞，以及原核宿主，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。最优选的细胞是正常情况下不表达特定多肽或蛋白质或者低水平表达所述多肽或蛋白质的细胞。在合适启动子调控下，哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞可以表达成熟蛋白。用源于本发明DNA构建体的RNAs，利用无细胞翻译系统可以产生这类蛋白。Sambrook，et al.在Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，New York(1989)中描述了用于原核宿主和真核宿主的适宜克隆载体和表达载体，引入此处作为参考。
各种哺乳动物细胞培养系统可用于表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的例子包括Gluzman，Cell 23175(1981)所述的猴肾成纤维细胞COS-7系和能够表达相容载体的其它细胞系，例如C127，3T3，CHO，HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包括复制起始点、合适启动子、必需的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪切供体和受体位点、转录终止序列和5′侧翼非转录序列。源于SV40病毒基因组的DNA序列，如SV40起始点、早期启动子、增强子、剪切点和多腺苷酸化位点可用于提供需要的非转录遗传元件。细菌培养得到的重组多肽和蛋白质通常从细胞沉淀的最初提取物中分离，然后进行一次或多次盐析、含水离子交换或分子排阻色谱。如果需要，用蛋白重折叠步骤完成成熟蛋白的构型。最后，用高效液相色谱(HPLC)进行最终的纯化步骤。表达蛋白的微生物细胞可用任何简便方法进行破坏，包括反复冻融、超声破碎、机械破碎或使用细胞裂解剂。
一些类型的细胞可用作表达蛋白的合适宿主细胞。哺乳动物宿主细胞包括，例如猴COS细胞、人上皮A431细胞、人Colo205细胞、3T3细胞、CV-1细胞、其它转化的灵长类细胞系、正常的二倍体细胞、原代组织体外培养的细胞株、原代外植体、HeLa细胞、小鼠L细胞、BHK、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。优选用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和人胚胎肾293细胞表达GIPF蛋白。
另外，在低等真核细胞如酵母，或原核细胞如细菌中也可能产生蛋白质。潜在合适的酵母株包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、念珠菌、毕赤酵母或能够表达异源蛋白的任意酵母株。潜在合适的细菌株包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或能够表达异源蛋白的任意细菌株。如果在酵母或细菌中制备蛋白，需要修饰所产生的蛋白，例如在合适位点进行磷酸化或糖基化，以便获得功能性蛋白。这种共价连接可用已知化学方法或酶法完成。
4.2.3嵌合蛋白和融合蛋白 本发明还提供了GIPF嵌合蛋白或融合蛋白。本文中GIPF“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含与非GIPF多肽有效连接的GIPF多肽。“GIPF多肽”指具有GIPF蛋白相应氨基酸序列的多肽，“非GIPF多肽”指具有与GIPF蛋白基本不同源的蛋白的氨基酸序列的多肽，例如不同于GIPF蛋白的蛋白和来源于相同或不同生物体的GIPF蛋白。GIPF融合蛋白中的GIPF多肽对应全部或部分GIPF蛋白。在一个实施方案中，GIPF融合蛋白含有至少一种GIPF蛋白生物活性部分。在另一实施方案中，GIPF融合蛋白含有至少两种GIPF蛋白生物活性部分。在另一实施方案中，GIPF融合蛋白包含至少三种GIPF蛋白生物活性部分。在融合蛋白中，“有效连接”指GIPF多肽和非GIPF多肽彼此在框内融合。非GIPF多肽可与GIPF多肽的N端或C端融合。
在一个实施方案中，融合蛋白是GST-GIPF融合蛋白，其中GIPF序列与GST(谷胱甘肽S-转移酶)序列的C端融合。这类融合蛋白有利于重组GIPF多肽的纯化。在另一实施方案中，融合蛋白是N端含有异源信号序列的GIPF蛋白。在某些宿主细胞中(如哺乳动物宿主细胞)，使用异源信号序列可以提高GIPF的表达和/或分泌。优选GIPF多肽与V5-His标签融合，以便利用抗V5抗体方便地进行检测和快速纯化，如实施例中所述。
本发明的GIPF嵌合蛋白或融合蛋白可用标准重组DNA技术制备。例如，用常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段在框内(in-frame)连接起来，例如利用齐平末端或粘性末端进行连接，限制性酶消化以产生合适的末端、如需要补齐粘性末端、用碱性磷酸酶处理以避免不必要的连接、以及酶催化连接。在另一实施方案中，融合基因可用包括自动DNA合成的常规技术合成。或者，用锚定引物对基因片段进行PCR扩增，使两个连续基因片段之间产生互补悬突，随后退火并再次扩增产生嵌合基因序列(见Ausubel，et al.(eds.)CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，1992)。此外，许多编码融合部分(如GST多肽)的表达载体是商品化的。GIPF编码核酸可克隆到这类表达载体中，使得融合部分与GIPF蛋白在框内连接。
4.2.4多肽组合物 本发明药物组合物包含分离的GIPF多肽，包括但不限于，包含SEQ IDNO4，6，8，10，12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105或178任意氨基酸序列的多肽，或包含SEQ ID NO2，3，5，7，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177任意核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽。本发明多肽还优选包括具有生物或免疫活性的、由下列核苷酸编码的多肽(a)具有SEQ ID NO2，3，5，7，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102或104任意核苷酸序列的多核苷酸，或(b)编码SEQ ID NO4，6，8，10，12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105或178任何氨基酸序列的多核苷酸，或(c)在严谨条件下与(a)或(b)多核苷酸互补链杂交的多核苷酸。本发明还提供了SEQ ID NO4，6，8，10，12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105或178任意氨基酸序列的生物活性或免疫活性突变体；及其保留了生物活性的“基本等价物”(如具有至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，或89％，更典型的至少约90％，91％，92％，93％或94％，甚至更典型的至少约95％，96％，97％，98％或99％，最典型至少约99％氨基酸同一性)。与包含SEQ ID NO4，6，8，10，12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105或178的多肽相比，等位突变体编码的多肽具有相似、提高或降低的活性。
本发明还包括表现生物活性的本发明蛋白的片段。蛋白片段可以是线性形式或用已知方法，例如H.U.Saragovi，et al.，Bio/Technology 10，773-778(1992)和R.S.McDowell，et al.，J.Amer.Chem.Soc.114，9245-9253(1992)(引入此处作为参考)所述方法进行环化。这类片段可与载体分子，如免疫球蛋白相融合，其目的包括增加蛋白结合位点的效价。
本发明还提供了所述蛋白的全长和显性成熟形式(如不含信号序列或前体序列)或成熟形式(如缺少信号序列和弗林蛋白酶切割位点)。通过翻译所公开的核苷酸序列可以鉴别序列表中的蛋白编码序列。通过在适宜的哺乳动物细胞或其它宿主中表达全长多肽可以获得这类蛋白的成熟形式。成熟蛋白的序列可从全长形式的氨基酸序列中确定。
本发明蛋白组合物还包含可接受载体，如亲水性的、药物可接受的载体。
本发明还提供了由本发明核酸片段或本发明核酸片段的简并变体编码的分离多肽。“简并变体”指核苷酸序列与本发明核酸片段(如ORF)不同，但由于遗传密码简并性编码相同多肽序列的核苷酸片段。本发明优选的核酸片段是编码蛋白的ORFs。
可以使用各种本领域已知方法获得任一本发明的分离多肽或蛋白质。在最简单的水平上，用商品化肽合成仪合成氨基酸序列。由于合成构建的蛋白序列具有蛋白的一级、二级或三级结构和/或构象特征，因此拥有蛋白通常具有的生物学性质，包括蛋白质活性。该技术在获得小肽或较长多肽的片段时尤其有用。例如，片段可用于产生针对天然多肽的抗体。因此在筛选治疗化合物和开发抗体的免疫过程中，可作为天然的纯化蛋白的生物活性或免疫活性替代物。
本发明多肽和蛋白质还可以从已被转变为表达目的多肽或蛋白质的细胞中纯化得到。本文中，在正常情况下细胞不产生或以低水平产生多肽和蛋白质，而当通过基因工程操作使细胞产生多肽或蛋白质时，称细胞被改变成表达目的多肽和蛋白。本领域技术人员可以容易地调整步骤，将重组或合成序列引入到真核或原核细胞并表达，从而产生合成本发明多肽或蛋白之一的细胞。
本发明还涉及制备多肽的方法，包括在合适的培养基中培养本发明宿主细胞，从细胞或细胞生长的培养基中纯化蛋白质。例如，本发明方法包括制备多肽的过程，包括在所编码多肽可表达的条件下，培养含有本发明多核苷酸的合适表达载体的宿主细胞。可以从培养物中收集多肽，从培养基中收集多肽更方便，或者从宿主细胞的裂解物中收集并进一步纯化。优选实施方案包括制备全长或成熟形式蛋白的方法。
在另一方法中，由转化了GIPF编码DNA的细菌细胞中纯化多肽或蛋白从而制备多肽或蛋白质。本领域技术人员可以很容易地按照这些方法分离多肽和蛋白质以获得一种本发明的分离多肽或蛋白质。这些技术包括但不限于，免疫色谱、HPLC、分子大小排阻层析、离子交换色谱和免疫亲和色谱。参见Scopes，Protein PurificationPrinciples and Practice，Springer-Verlag(1994)；Sambrook，et al.，in Molecular CloningA LaboratoryManual；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology。保留了生物活性/免疫活性的多肽片段包括含有大于约100个氨基酸或大于约200个氨基酸的片段，以及编码特定蛋白结构域的片段。
纯化多肽可用于体外结合试验，这是本领域已知的鉴别与多肽结合的分子的试验。这些分子包括但不限于，例如小分子、组合文库的分子、抗体或其它蛋白质。在结合试验中鉴定出的分子用已知的体内组织培养或动物模型检验其拮抗或激动活性。简单来说，将分子滴入细胞培养物或动物中，然后检测细胞/动物死亡率或动物/细胞的延长存活能力。
本发明蛋白还可以作为转基因动物产物的形式表达，如作为转基因奶牛、山羊、猪或绵羊的奶液成分，这些转基因动物的特征是体细胞或生殖细胞含有编码蛋白的核苷酸序列。
本发明提供的蛋白质还包括与纯化蛋白有相似氨基酸序列的蛋白，该蛋白可能进行了自然修饰或人工修饰。例如，肽或DNA序列的修饰可由本领域技术人员用已知技术来完成。对蛋白序列进行的目的修饰包括改变、取代、替换、插入或缺失编码序列中的所选氨基酸残基。例如，可以缺失或用其它氨基酸替换一个或多个半胱氨酸残基从而改变分子构象。这些改变、取代、替换、插入或缺失的技术是本领域技术人员熟知的(参见US4518584)。优选这种改变、取代、替换、插入或缺失保留了蛋白的所需活性。用各种已知方法可以确定对于蛋白质功能十分重要的区域，包括丙氨酸扫描方法，即用丙氨酸系统地取代一个或一串氨基酸，然后检测获得的含丙氨酸的突变体的生物活性。这种分析方法可以确定被取代氨基酸对蛋白质生物活性的重要性。对蛋白功能十分重要的蛋白区域也可以用eMATRIX程序来确定。
预期整体或部分保留蛋白活性的蛋白序列的其他片段和衍生物对于筛选或其他免疫方法很有用，并且本领域技术人员根据本文的内容可以容易地制备。本发明包括这种修饰。
通过在一个或多个昆虫表达载体中，将本发明的分离多核苷酸与合适调控序列有效连接，并利用昆虫表达系统，可以制备蛋白质。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法均以商品化试剂盒形式提供，例如Invitrogen，San Diego，Calif.，U.S.A.(MaxBatTM试剂盒)，这些方法是本领域公知的，如Summers和Smith，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)所述，引入此处作为参考。本文中，能够表达本发明多核苷酸的昆虫细胞是“转化的”。
在适合表达重组蛋白的培养条件下培养转化的宿主细胞，可以制备本发明蛋白质。然后用已知纯化方法从这种培养物中(即培养基或细胞提取物)纯化获得的表达蛋白质，如凝胶过滤和离子交换色谱。蛋白质的纯化还包括含有与所述蛋白结合的试剂的亲和色谱；用亲和树脂如刀豆素A-琼脂糖、肝素-toyopearlTM或Cibacrom blue 3GA琼脂糖TM进行一次或多次层析步骤；包括用树脂如苯基醚、丁基醚或丙醚进行疏水相互作用色谱的一个或多个步骤，或免疫亲和色谱。
另外，本发明蛋白质可以有利于纯化的形式表达。例如，以融合蛋白形式表达，如麦芽糖结合蛋白(MBP)，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或硫氧还原蛋白(thioredoxin)(TRX)或以组氨酸标签的融合蛋白的形式表达。NewEngland BioLab(Beverly，Mass.)，Pharmacia(Piscataway，N.J.)和Invitrogen分别提供纯化和表达这类融合蛋白的商品化试剂盒。还可以用抗原表位标记蛋白，再用针对这种抗原表位的特异性抗体纯化。其中一种抗原表位(FLAG_)由Kodak(New Haven，Conn.)提供。
最后，用疏水性RP-HPLC基质，例如含有悬垂甲基或其它脂肪族基团的硅胶，进行一个或多个反相高效液相(RP-HPLC)步骤，可以进一步纯化蛋白质。上述全部或部分纯化步骤可以各种方式组合，可用于提供基本同质的分离的重组蛋白。如此纯化的蛋白基本不含其它哺乳动物蛋白，在本发明中定义为“分离的蛋白”。
本发明的多肽包括GIPF类似物。它包括GIPF多肽片段，以及包含一个或多个氨基酸缺失、插入或取代的GIPF多肽。同样，本发明GIPF多肽的类似物包括GIPF多肽融合蛋白或GIPF多肽修饰物，其中GIPF多肽或其类似物与另一个部分，例如目标部分或其它治疗剂融合。这种类似物表现出改善的性质，如改善的活性和/或稳定性。与GIPF多肽或其类似物融合的部分的例子包括，将多肽传递至小肠的靶向部分，例如小肠抗体或胃肠细胞表达的受体和配体的抗体。可与GIPF多肽融合的其它部分包括用于治疗胃肠道疾病和本文所述其它疾病的治疗剂，例如细胞因子或其它药物。
4.2.5基因治疗 本发明提供了治疗本文所述疾病的基因疗法。用载体在回体(exvivo)、原位或体内将编码本发明多肽的功能基因传递到合适的细胞中，尤其是利用病毒载体(如腺病毒、腺伴随病毒或逆转录病毒)，或用人工DNA转化方法(如脂质体或化学处理)在回体传递基因。参见，例如Anderson，Nature，supplement to vol.392，no.6679，pp.25-20(1998)。更多基因治疗技术方面的综述参见Friedmann，Science，2441275-1281(1989)；Verma，ScientificAmerican68-84(1990)；and Miller，Nature，357455-460(1992)。
如前所述，“载体”指将本发明核酸传递到宿主细胞的任一方式。优选载体是病毒载体，如逆转录病毒，疱疹病毒，腺病毒和腺伴随病毒。因此，利用病毒载体在体内、回体或体外引入编码GIPF蛋白或其多肽结构域片段的基因或核酸序列或直接引入DNA。通过将转基因载体定向到特定细胞，如利用病毒载体或受体配基，或利用组织特异性启动子或二者均用，可以实现在目标组织中的表达。
通常用于体内或回体定位和治疗的病毒载体是基于DNA的载体和逆转录载体。构建和使用病毒载体的方法是本领域已知的[参见Miller和Rosman，BioTeclmiques 7980-990(1992)]。优选病毒载体是复制缺陷型的，也就是说，它们不能在目的细胞中自主复制。一般地，本发明的复制缺陷型病毒载体的基因组缺少病毒在感染细胞中复制所必需的至少一个区域。这些区域可以被消除(整体的或部分的)，或者用本领域技术人员知道的任意技术将其变为非功能性的。这些技术包括整体移除、取代(用其它序列，尤其是用插入的核酸)、部分删除或向必需区域(用于复制的)添加一个或多个碱基。这些技术可以在体外(在分离的DNA上)或原位操作，利用基因操作技术或用突变剂处理。优选复制缺陷病毒保留了包装病毒颗粒所必需的基因组序列。
DNA病毒载体包括减弱的或缺陷的DNA病毒，例如但不限于，单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒、EB病毒(EBV)、腺病毒，腺伴随病毒(AAV)等。优选全部或几乎全部缺少病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒引入细胞后是非传染性的。利用缺陷型病毒载体可以使其到达细胞内特定、局部区域，不需考虑载体会感染其它细胞。因此，可以特异性定位于特定组织。特定载体的例子包括但不限于，缺陷型疱疹病毒1载体[Kaplitt et al.，Molec.Cell.Neurosci.2320-330(1991)]，缺少糖蛋白L基因的缺陷型疱疹病毒载体[RD 371005A]，或其它缺陷型疱疹病毒载体[WO 94/21807，1994-9-29公开；WO 92/05263，2，1994-4-2公开]；减毒腺病毒载体，如Stratford-Perricaudet al所述的载体[J.Clin.Invest.90626-630(1992)；还可参见La Salle et al.，Science 259988-990(1993)]；缺陷型腺伴随病毒载体[Samulski et al.，J.Virol.613096-3101(1987)；Samulski et al.，J.Virol.633822-3828(1989)；Lebkowski et al.，Mol.Cell.Biol.83988-3996(1988)]。
体内给予时，优选联合使用适当的免疫抑制治疗和病毒载体，例如腺病毒载体，以避免病毒载体和转化细胞的免疫激活。例如，可以给予免疫抑制细胞因子，如白介素-12(IL-12)、干扰素γ(IFNγ)或抗CD4抗体从而阻断对病毒载体的体液免疫应答或细胞免疫应答[参见Wilson，NatureMedicine(1995)]。另外，利用通过改造表达最少量抗原的病毒载体是有优势的。
在一个优选实施方案中，载体是腺病毒载体。如实施例所示，腺病毒载体传递GIPF多肽尤其有效，表现在刺激肠上皮细胞增殖方面具有意想不到的有效性，导致隐窝上皮细胞增生引起粘膜显著的、扩散性增厚以及隐窝长度显著增长和分枝复杂。腺病毒是真核DNA病毒，可以修饰成将本发明核酸高效传递到各种细胞类型。存在各种血清型的腺病毒。在这些血清型中，本发明优选利用2型或5型人腺病毒(Ad 2或Ad 5)或动物源的腺病毒(参见WO94/26914)。能够用于本发明的动物源腺病毒包括犬、牛、鼠(例如Mavl，Beard et al.，Virology 75(1990)81)、羊、猪、鸟和猿(如SAV)来源的腺病毒。
优选本发明的复制缺陷型腺病毒载体包括ITRs，包装序列和目的核酸。更优选，至少腺病毒载体的E1区域是非功能性的。其它区域可以被修饰，尤其是E3区(WO95/02697)，E2区(WO94/28938)，E4区(WO94/28152，WO94/12649和WO95/02697)或晚期基因L1-L5中的任一个。
在一个优选实施方案中，腺病毒载体的E1区和E3区缺失。缺失E1区的腺病毒的例子见EP 185,573，引入此处作为参考。
本发明的复制缺陷型重组型腺病毒可通过本领域技术人员已知的任一技术制备(Levrero et al.，Gene 101(1991)195，EP 185 573；Graham，EMBO J.3(1984)2917)。尤其是通过腺病毒和携带目的DNA的质粒进行同源重组来制备。将所述腺病毒和质粒共转染合适的细胞系后产生同源重组。所使用的细胞株优选(i)用所述元件转化，和(ii)包含与复制缺陷型腺病毒的部分基因组互补的序列，优选以整合形式以避免重组。使用的细胞系的例子包括人胚胎肾细胞系293(Graham et al.，J.Gen.Virol.36(1977)59)，其基因组整合了Ad5腺病毒基因组的左手部分(12％)，以及可以互补E1和E4功能的细胞系，如WO94/26914和WO95/02697中描述的。用标准分子生物学技术收集和纯化重组腺病毒，这些技术对于专业技术人员是熟知的。
用于本发明的启动子包括组成型启动子和调节型(可诱导型)启动子。启动子固有地用于核酸表达。也可以是异源的。具体地，可以是真核或病毒基因的启动子序列。例如，可以是源自要转染细胞的基因组的启动子序列。同样，可以是源自所使用的病毒基因组的启动子序列，包括所使用的腺病毒。在这方面，可以提及的启动子包括例如ElA，MLP，CMV和RSV基因等的启动子。
另外，通过增加激活或调节序列或允许组织特异性或优势表达(enolase和GFAP启动子等)的序列，来修饰启动子。此外，当所述核酸不包含启动子序列时，可以插入启动子，如将序列插入病毒基因组下游。
用于本发明的一些启动子是遍在启动子(例如HPRT，波形蛋白(vimentin)，肌动蛋白，微管蛋白)，中间丝启动子(如结蛋白(desmin)，神经微丝，角蛋白，GFAP)，治疗基因启动子(如MDR型，CFTR，因子VIII)，组织特异性启动子(如平滑肌细胞的肌动蛋白启动子)，优先激活分裂的细胞的启动子，应答刺激的启动子(如类固醇激素受体，视黄酸受体)、四环素调节转录调整基因，巨细胞病毒立即早期启动子，逆转录病毒LTR，金属硫蛋白，SV-40，Ela和MLP启动子。四环素调节转录调整基因和CMV启动子在WO 96/01313、美国专利5,168,062以及US 5,385,839中有描述，引入此处作为参考。
因此，用于调节基因表达的启动子包括但不限于，巨细胞病毒(CMV)启动子，SV40早期启动子区域(Benoist和Chambon，1981，Nature 290304-310)，包含在劳斯肉瘤病毒3′长末端重复中的启动子(Yamamoto，et al.，1980，Cell 22787-797)，疱疹胸苷激酶启动子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781441-1445)，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster et al.，1982，Nature 29639-42)；原核表达载体，如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff，et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)或tac启动子(DeBoer，et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)；还可参见″Useful proteins from recombinant bacteria″in Scientific American，1980，24274-94；来自酵母或其它真菌的启动子元件，如Gal4启动子，ADC(醇脱氢酶)启动子，PGK(甘油磷酸激酶)启动子，碱性磷酸酶启动子；表现出组织特异性、用于转基因动物的动物转录控制区域在胰腺腺泡细胞中活跃的弹性蛋白酶I基因控制区域(Swift et al.，1984，Cell 38639-646；Ornitz et al.，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7425-515)；在胰脏β细胞中活跃的胰岛素基因控制区域(Hanahan，1985，Nature 315115-122)，在淋巴细胞中活跃的免疫球蛋白基因控制区域(Grosschedl et al.，1984，Cell38647-658；Adames et al.，1985，Nature318533-538；Alexander et al.，1987，Mol.Cell.Biol.71436-1444)，在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中活跃的小鼠乳腺瘤病毒控制区域(Leder et al.，1986，Cell 45485-495)，在肝脏活跃的白蛋白基因控制区域(Pinkert et al.，1987，Genes and Devel.1268-276)，在肝脏活跃的α-胎蛋白基因控制区域(Krumlaufet al.，1985，Mol.Cell.Biol.51639-1648；Hammer et al.，1987，Science 23553-58)，在肝脏活跃的α1-抗胰蛋白酶基因控制区域(Kelsey et al.，1987，Genes and Devel.1161-171)，在髓细胞中活跃的β-球蛋白基因控制区域(Mogram et al.，1985，Nature 315338-340；Kolliaset al.，1986，Cell 4689-94)，在脑的少突胶质细胞中活跃的髓鞘碱性蛋白基因控制区域(Readhead et al.，1987，Cell 48703-712)，在骨骼肌中活跃的肌球蛋白轻链2基因控制区域(Sani，1985，Nature 314283-286)，在下丘脑活跃的促性腺释放激素基因控制区域(Mason et al.，1986，Science2341372-1378)。
通过染色体外物质(瞬时表达)或人工染色体(稳定表达)可以引入本发明的任一核苷酸或编码本发明多肽的基因。在本发明蛋白质存在的情况下，可以体外培养细胞以使细胞增殖或在细胞中产生预期的作用或活性。处理的细胞随后引入体内用于治疗。除了用病毒载体实现本发明，本发明还包括新载体，包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列可操作连接的操纵子和启动子元件。所述新的腺病毒载体是pAdenoVator-CMV5-Intron载体，在实施例中有详细描述。
4.2.6转基因动物 本发明的多核苷酸也可用于产生其B细胞中特异性表达GIPF多肽的嵌合动物。这种动物可用作研究本发明多肽体内活性的模型以及研究多肽调节物的模型。本发明优选实施方案涉及转基因敲入(KI)小鼠模型，设计用于快速测定GIPF的生物学功能。转基因KI动物模型如PCT/JP02/1123和WO2003/041495中所公开的。转基因模型涉及在免疫球蛋白κ轻链启动子调控下编码B细胞特异性表达GIPF的GIPF转基因。包含完整的免疫球蛋白重链和轻链基因座的TT2F ES细胞中引入转基因，将含有GIPF转基因的ES细胞植入缺乏抗体重链等位基因(IgH-KOΔH-/-)的小鼠体内(Kitamura etal.，Nature 350423-426(1991)，引入此处作为参考)。因此，只有源自表达IG链的ES细胞的功能性B细胞，才能表达免疫球蛋白κ轻链(WO 00/10383；EP1106061A1)。同样的，B细胞表达GIPF只发生在GIPF-KI嵌合小鼠。与含有通过种系传递的转基因的杂合或纯合动物相比，本发明的转基因动物模型可以快速分析嵌合动物表型。另外，转基因的表达局限于B细胞，将GIPF蛋白分泌到动物的循环系统，因此使每个组织均暴露于GIPF，可以快速评价GIPF或任意其它编码蛋白的生物活性。本发明的转基因系统有望用于表达和评价任意多肽的生物学功能。本发明转基因模型的另一优势是转基因的瞬时表达。κ轻链启动子的活性起始于妊娠后约14天，断奶后观察到循环的免疫球蛋白浓度显著提高，因此避免了GIPF对小鼠早期发育的任何潜在的有害作用。本发明转基因动物的实例见实施例。
4.2.6.1制备转基因非人哺乳动物的一般方法 本发明所有转基因动物的多种细胞中都含有本发明的转基因，该转基因改变了“宿主细胞”的表型，相对于特异性表达GIPF的B细胞，它将GIPF多肽分泌到转基因动物的循环系统中。转基因动物的各方面技术是本领域已知的，在下列文献中有详细描述，如Hogan et al.，Manipulating the MouseEmbryo(Cold Spring Harbor Laboratorr，Cold Spring Harbor，N.Y.，[1986])。尽管制备转基因动物在此以转基因小鼠为例，但这仅仅是为了说明，并不是局限本发明的范围。本领域技术人员可以很容易地调整本文公开的具体内容，利用前面提及的方法和材料将GIPF转基因序列引入非人哺乳动物。适于转基因实验的动物可通过标准商业来源，如Taconic(Germantown，N.Y.)获得。
A.转基因构建体 运用本领域已知的任意合适的基因工程技术可以构建转基因，这些技术包含但不限于，限制性内切酶消化、连接、转化、质粒纯化、DNA测序等标准技术，如Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，(1989))描述的。
本发明的转基因一般与转录调节序列，如启动子和/或增强子可操作连接，从而以特定方式调节转基因的表达。在一些实施方案中，有用的转录调节序列是能够从时间和空间方面具有高度调节活性的序列。因此，选择的启动子是仅在特定组织或细胞类型有活性的启动子。用于在体内调节转基因表达的启动子/增强子包括但不限于，人巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子(Karasuyama et al.，J.Exp.Med.16913[1989])，人β-肌动蛋白启动子(Gunning et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 844831-4835[1987])，存在于小鼠乳腺瘤病毒长末端重复中的糖皮质激素诱导型启动子(MMTV LTR)(Kiessig et al.，Mol.Cell Biol.41354-1362[1984])，Moloney鼠白血病病毒的长末端重复序列(MuLV LTR)(Weiss et al.[1985]RNA Tumor Viruses，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)，SV40早期或晚期区域启动子(Benoist et al.Nature 290304-310[1981]；Templeton et al.Mol.CellBiol.，4817[1984]；and Sprague et al.，J.Virol.，45773[1983])，包含劳斯肉瘤病毒(RSV)3′长末端重复中的启动子(Yamamoto etal.，Cell 22787-797[1980])，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动子/增强子(Wagner et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823567-71[1981])，金属硫蛋白(MT)启动子(Palmiter etal.，Nature 300611-615[1982])和单纯疱疹病毒LAT启动子(Wolfe et al.NatureGenetics1379-384[1992])。优选启动子是免疫球蛋白κ轻链(REF)的P2启动子。
除了转基因和转录调控序列，用于制备本发明转基因的载体一般含有一种或多种用于优化转基因在宿主动物中表达的其它元件。因此转基因构建可包括转录终止元件，如指导mRNA转录物多腺苷酸化，以及内含子序列。例如，转基因的3′末端可以侧接SV40序列(SV40内含子/PA)，从而在转基因转录物上增加转录终止信号和多腺苷酸化信号。在另一实施方案中，转基因可以包括内含子序列。在许多情况中，编码序列中存在一种或多种内含子时，转基因的表达提高。
在其它实施方案中，转基因构建体可以包括其它元件，使得在插入预期受体细胞之前有助于在细胞中操作(如在细菌细胞中)。例如，载体可以包括在原核细胞中扩增的复制起始元件。另外，转基因构建体可以包括选择性标记，用于从受体动物或从制备转基因动物过程中产生的中间体细胞中(即用于扩增构建体的细菌细胞或用于引入转基因的ES细胞)分离细胞。选择性标记基因可以编码在选择性培养条件下转染细胞生存和/或生长所必需的蛋白质。典型的选择性标记基因编码具有下列性质的蛋白，例如(i)能够赋予抵抗抗生素或其它毒素，如对于原核宿主细胞，氨苄青霉素、四环素或卡那霉素的抗性，对于哺乳动物细胞，赋予抗新霉素、均霉素或甲氨蝶呤的抗性，或(ii)补偿细胞的营养缺陷。
B.用于引入转基因的细胞 在一个具体实施方案中，通过将GIPF转基因引入非人哺乳动物的生殖细胞系来制备本发明的转基因非人哺乳动物。处于各个发育阶段的胚胎靶细胞可以用来引入GIPF转基因。依据胚胎靶细胞发育阶段采用不同的方法。选择健康、胚胎产量好、胚胎原核可见度高、生殖适合度(reproductive fitness)好的动物的特定细胞系实施本发明。
在一个实施方案中，转基因构建体引入单阶段胚胎(single stage embryo)中。总体来说，用激素处理雌性动物增加排卵、交配、收集受精卵。例如对六周龄雌性小鼠注射5IU血清促性腺激素(PMSG；Sigma)，48小时后再注射(0.1ml i.p.)5IU人绒毛膜促性腺激素(hCG；Sigma)诱导增加排卵。该例子中采用FVB系小鼠。雌鼠立即与雄性种鼠过夜交配。然后检测这些雌鼠的阴道塞。经过交配的小鼠通过CO2窒息或颈脱位法处死，从离体输卵管中获得胚胎并置于含有0.5％小牛血清(BSA；Sigma)的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液中。用透明质酸酶(1mg/ml)去除周围的丘细胞(cumulus cell)。洗涤原核胚胎并置于含有0.5％BSA的Earle’s平衡盐溶液(EBSS)中，于37.5℃，5％CO2、95％空气的潮湿环境中培养直至注射。
正常情况下，在合适的培养基中培养受精胚胎直至前核(pronuclei)出现。此时，如前所述将转基因引入雌性或雄性前核中。某些种属，如小鼠，优选雄性前核。例如，一旦形成雄性前核，即雄性原核和雌性原核很好的分离且二者都靠近细胞膜时，就将外源性遗传物质加入到早期雄性前核中。另外，外源遗传物质经诱导去凝缩后可以加入到精子的细胞核中。含有外源遗传物质的精子随后被加入到卵中或者转基因构建物加入到卵中之后尽快加入去凝缩的精子。
除了类似的生物方面的考虑，也要考虑物理方面的因素，如加入到受精卵细胞核的外源遗传物质的量(如体积)，或形成受精卵细胞核一部分的遗传物质。一般来说，插入的外源遗传物质的体积不超过约10pl。加入物质的物理影响不能大到破坏受精卵的成活力。DNA序列数量和多样性的生物学限制根据特定受精卵和外源遗传物质的功能不同而变化，这对于本领域技术人员而言是显而易见的，因为获得的受精卵的遗传物质，包括外源遗传物质，必须是生物学上能够激发和保持受精卵分化和发育成一个有功能的生物体。
加入到受精卵中的转基因构建体的拷贝数取决于加入的外源遗传物质的总数，并且是能够进行遗传转化的量。理论上讲，仅需要一个拷贝，但通常使用许多拷贝，例如1000-2000个转基因构建体拷贝，以保证一个拷贝是功能性的。
C.引入转基因的方法 插入细胞的每一个转基因构建体首先必须是线性的，因为线性DNA分子的重组频率比环状分子高。因此，如果构建体已被插入到载体中，用合适的限制性内切酶消化DNA使其线性化，该酶选择性切割载体序列，而不切割转基因序列。
可以用任何本领域已知方法将转基因引入胚胎中，只要该方法不破坏细胞、核膜或其它存在的细胞或遗传结构。广泛采用的方法包括微注射、电穿孔或脂质转染。引入转基因后，胚胎在体外孵育不同时间或重植入代理宿主或两者皆有。一种常用的方法是依其种类将胚胎在体外培养约1-7天，然后重植入代理宿主。
通过微注射方法引入转基因构建体最好用受精卵作目的受体。在小鼠体内，雄性原核直径达到约20μm，可以重复注射1-2pl DNA溶液。使用受精卵作为基因转化的靶有很大优势，因为大多数情况下，注射的DNA在第一次切割前被整合到宿主基因中(Brinster et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824438-4442(1985))。因此，转基因动物的全部细胞将携带整合的转基因。这也通常反映在转基因有效地传递到创始者的子代中，因为50％的生殖细胞包含转基因 逆转录病毒转染可用于将转基因引入非人哺乳动物。正在发育的非人胚胎可以在体外培养到胚泡期。在此阶段中，裂球可作为逆转录病毒转染的目的细胞(Jaenich，R.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 731260-1264(1976))。用酶处理除去透明带可以有效的感染所述裂球(Manipulating the MouseEmbryo，Hogan eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，(1986))。用于引入转基因的病毒载体系统一般是携带转基因的复制缺陷型逆转录病毒。(Jahner et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 826927-6931(1985)).Van derPutten et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 826148-6152(1985))。在单层病毒产生细胞上培养卵裂细胞可以简单有效的进行转染(Van der Putten，supra；Stewart et al.EMBO J.6383-388(1987))。另外，转染可以在稍晚的阶段进行。将病毒或病毒产生细胞注射入囊胚腔中(Jahner et al.Nature298623-628(1982))。大多数创始者对于转基因而言是嵌合的，因为整合仅发生在形成转基因动物的细胞亚群中。此外，创始者基因组的不同位点含有各种转基因逆转录病毒插入物，通常在后代中将会分离。另外，通过对中度妊娠胚胎进行子宫内逆转录病毒转染，也可能将转基因引入生殖系(Jahner et al.(1982)出处同上)。
运用本领域已知的各种方法，包括例如电穿孔、微注射和磷酸钙处理，可以将转基因构建体插入ES细胞内。优选的插入方法是电穿孔，其中用电穿孔仪器将ES细胞和转基因构建体DNA置于电脉冲下，并按照生产商的指导使用。电穿孔后，一般合适的培养条件下收集ES细胞。然后筛选存在转基因的细胞。
D.胚胎植入 为了植入已引入转基因的胚胎，准备了假孕者、养育者和代理者。一般养育者是通过与切除输精管的同种雄性动物交配来制备的。养育者的假孕阶段对于移成功植是重要的，并且是种属依赖性的。对于小鼠来说，假孕阶段约2-3天。雌性受体交配同时作为雌性供体。尽管以下描述与小鼠有关，但可被本领域技术人员调整用于其它任何非人哺乳动物。胚胎转移时，腹腔注射0.015ml 2.5％三溴乙醇(avertin)/g体重，麻醉受体雌性动物。在背侧正中切开一个切口暴露出输卵管。在输卵管正上方切开整个体壁。用watchmaker’s钳子剥开卵巢囊。要转移的胚胎放在DPBS(Dulbecco′s磷酸盐缓冲液)中，用移液管移取(约10-12个胚胎)。移液管尖插入漏斗中，转移胚胎。转移后缝合两针封闭切口。移植入特定宿主的胚胎数量依种属而不同，但通常与自然出生的后代数量是相当的。
当ES细胞用于引入转基因时，转化的ES细胞整合到如前所述的胚胎中，胚胎移植进假孕养育者的子宫中培育。
E.转基因存在或表达的筛选 用任一合适的方法筛选代理宿主转基因后代中转基因的存在和/或表达。当采用表皮颜色筛选策略时(如前所述)，最初可以用嵌合表皮颜色筛选代理者孵育的后代。另外，通常用与至少一部分转基因互补的探针，对从尾组织制备的DNA进行Southern印迹或PCR扩增也可以进行筛选。利用针对转基因编码的蛋白的抗体进行Western印迹分析或免疫组化是筛选转基因产物是否存在的另一方法。或者，用Northern分析或RT-PCR检测以最高水平表达转基因的组织或细胞，检测其中转基因的RNA表达。
评价转基因存在的其它方法包括但不限于，合适的生化检测，如酶和/或免疫检测，特定标记物或酶活性的组织学染色，流式细胞分析等等。血液分析也可用于检测血液中转基因产物的存在，以及用于评价转基因对于各种类型血液细胞和其它血液成分的影响水平。
F.转基因动物的繁殖 通过转基因动物与合适的配偶体交配，或使转基因动物的卵和/或精子体外受精可以获得转基因动物的后代。当与配偶体交配时，配偶体可以是转基因的，也可以是非转基因的；如是转基因配偶体，它可以包含相同或不同的转基因，或二者均包括。另外，配偶体可以是亲本品系。当用体外受精时，受精后的胚胎可以植入代理宿主或体外孵育或共同利用。无论用哪种方法，均需用前面提及方法或其它适当方法评价后代中转基因是否存在。通常，根据繁殖过程中每一特定步骤的目的，将同胞或亲本系与后代交配进行杂交和回交。
本发明优选实施方案涉及缺少抗体重链等位基因(IgH-KOΔH-/-)，并且循环抗体水平很低的小鼠(Kitamura et al.，Nature 350423-426(1991))。一方面，本发明关注在B细胞中产生GIPF蛋白或其片段的转基因非人哺乳动物。转基因动物基因组内已经稳定整合了编码GIPF或具有天然蛋白生物活性的片段的核酸序列，该序列与转录调节序列可操作连接，引导其在B细胞中表达。优选转录调节序列包括B细胞特异性启动子，如免疫球蛋白κ链启动子。非人转基因动物包括但不限于例如小鼠、大鼠、兔子、猪、山羊或牛。
4.2.7隐窝细胞和组织生长活性 本发明的GIPF多肽表现出生长因子活性，并参与肠隐窝细胞的增殖和分化。GIPF还表现出对胃肠道其它上皮细胞的生长因子活性。将本发明多肽体内或回体给予隐窝细胞可以保持和扩增处于全能阶段的细胞群体，有利于损伤或疾病组织的重新修复、移植、制造生物药物和研制生物传感器。产生大量人细胞的能力的重要工业应用是生产目前必须从非人来源或供体获得的人蛋白，植入细胞，如胃肠细胞，以进行组织移植治疗。
多个不同的外源生长因子和/或细胞因子可与本发明多肽联合使用以达到预期目的，包括此处列出的任意生长因子、其它干细胞维持因子，特别包括干细胞因子(SCF)，白血病抑制因子(LIF)，Flt-3配体(Flt-3L)，任一白介素，融合于IL-6的重组可溶性IL-6受体，巨噬细胞炎症蛋白1-α(MIP-1-α)，G-CSF，GM-CSF，血小板生成素(TPO)，血小板因子4(PF-4)，血小板衍生生长因子(PDGF)，神经生长因子，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，角质细胞生长因子-2(KGF2)，胰高血糖素样肽2(GLP-2)。
可以用本发明多核苷酸转染肠上皮细胞，包括隐窝细胞，来诱导本发明多肽的自分泌表达。这可以产生有用的未分化细胞系或可分化为所需的成熟细胞类型。这些稳定的细胞系可以作为未分化mRNA的来源以产生cDNA文库和PCR实验模板。这些研究有助于分离和鉴别隐窝细胞群中差异表达的基因，该基因调节隐窝增殖和/或维持。
上皮干细胞群体的扩增和维持对于处理许多病理状况是有用的。例如本发明多肽可用于处理培养的隐窝细胞来产生胃肠上皮细胞，用于增加或替换由于疾病、自身免疫性疾病、意外伤害或遗传疾病、离子辐射引起的炎症、化疗、感染和炎症损伤的细胞。
还可以操控本发明多肽的表达及其对隐窝细胞的影响，使隐窝细胞受控分化为更多的分化的细胞类型。一种广泛应用的从未分化干细胞群体获得纯的特定分化的细胞类型的方法涉及利用驱动选择性标记的细胞类型特异性启动子。
体外培养肠上皮细胞，包括隐窝细胞，可用于确定本发明多肽是否表现出生长因子活性。从人的解聚结肠隐窝和鼠结肠粘膜中分离隐窝细胞，用Whitehead et al.，Gastroenterology 117858-865(1999)描述的方法(引入此处作为参考)检测GIPF的克隆活性。在本发明多肽单独存在或与其它生长因子或细胞因子共同存在的情况下可以检测生长因子活性。
本发明药物组合物有利于肠上皮细胞，包括隐窝细胞的增殖，以及口腔与胃肠组织的再生，即治疗由于上皮隐窝细胞退化、死亡或创伤造成的上皮层持久创伤。更具体地，该药物组合物用于治疗此处提及的胃肠道疾病。
本发明的药物组合物也可用于促进未愈合伤口更好更快地愈合，包括但不限于压迫性溃疡、血管功能不全导致的溃疡、外科和创伤性伤口等。伤口愈合活性的检测包括但不限于下列所述方法Winter，Epidermal WoundHealing，pp.71-112(Maibach，H.1.and Rovee，D.T.，eds.)，Year Book MedicalPublishers，Inc.，Chicago，as modified by Eaglstein and Mertz，J.Invest.Dermatol71382-84(1978)。
4.2.8免疫调节活性 本发明多肽表现出调节免疫系统成分的活性，包括但不限于，细胞因子产生和/或活性和/或免疫系统细胞。本发明多核苷酸编码表现出这些性质的多肽。细胞因子和/或免疫系统细胞的调节包括提高和/或降低细胞因子水平或免疫系统特定细胞的数量。
由于这种免疫调节活性，本发明多肽可用于治疗各种免疫疾病。这些疾病包括但不限于，炎症性肠疾病(IBD)包括溃疡性结肠炎和/或Crohn′s病，抗癌治疗包括放疗和/或化疗导致的粘膜炎。这些免疫疾病的诱因可能是，例如原发性(未知原因)、遗传性、感染试剂引起(如病毒、细菌、真菌)，和/或抗癌治疗(如放疗和/化疗)引起的损伤。
对免疫应答和/或免疫系统成分的调节可以通过许多方式来实现。下调的形式可以是抑制或阻断已经进行的免疫应答或阻止诱导免疫应答。抑制T细胞应答或诱导T细胞的特异性免疫耐受或二者同时作用可以抑制活化的T细胞的功能。T细胞应答的免疫抑制通常是一种主动的(active)、非抗原特异性的过程，该过程需要T细胞连续暴露于抑制剂。诱导T细胞不应答或无反应的耐受性可以与免疫抑制区别，因为耐受通常是抗原特异性的，并且不再暴露于耐受原之后仍能持续。从操作上来讲，不存在耐受原的情况下，将T细胞重新暴露于特异性抗原，T细胞并无应答可以验证耐受。
炎症性肠疾病几乎都是由以下两个途径之一介导的过量T辅助细胞1(Th1)-细胞应答伴随高水平IL-12、IFN-γ和/或TNF；或过量T辅助细胞2(Th2)-细胞应答伴随高水平IL-4、IL-5和/或IL-13(Bouma et al.，引入此处作为参考)。因此本发明多肽在疾病治疗中介导免疫调节活性的机制是下调Th1和/或Th2细胞群体的数量。或者，还可能降低其它活性，如与炎症应答有关和/或介导炎症应答的细胞因子(如IL-12，IFN-γ，TNF，IL-4，IL-5和/或IL-13)的水平。
本发明多肽的活性可通过以下方法检测 T细胞或胸腺细胞增殖试验，包括但不限于如下所述的Current Protocolsin Immunology，Ed by J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W.Strober，Pub.Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(Chapter 3，Ira Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19；Chapter7，Immunologic studies in Humans)；Takai et al.，J.Immunol.1373494-3500，1986；Bertagnolli etal.，J.Immunol.1451706-1712，1990；Bertagnolli etal.，Cellular Immunology 133327-341，1991；Bertagnolli，et al.，I.Immunol.1493778-3783，1992；Bowman et al.，1.Immunol.1521756-1761，1994.。
细胞因子产生和/或脾细胞、淋巴结细胞或胸腺细胞增殖试验，包括但不限于如下所述Polyclonal T cell stimulation，Kruisbeek，A.M.and Shevach，E.M.In Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan eds.Vol 1 pp.3.12.1-3.12.14，John Wiley and Sons，Toronto.1994；and Measurement of mouse andhuman interferon-′y，Schreiber.R.D.In Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan eds.Vol1 pp.6.8.1-6.8.8，John Wiley and Sons，Toronto.1994。
针对抗原的T细胞克隆应答试验(通过检测增殖和细胞因子产生从而识别影响APC-T细胞相互作用和直接T细胞效应的蛋白质)，包括但不限于如下所述Current Protocols in Immunology，Ed by J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W Strober，Pub.GreenePublishing Associates and Wiley-Interscience(Chapter 3，111 Vitro assays forMouse Lymphocyte Function；Chapter 6，Cytokines and their cellular receptors；Chapter 7，Immunologic studies in Humans)；Weinberger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 776091-6095，1980；Weinberger et al.，Eur.J.Immun.11405-411，1981；Takai et al.，J.Immunol.1373494-3500，1986；Takai et al.，J.Immunol.140508-512，1988.)。
4.2.9趋化性/化学激动活性 本发明多肽对哺乳动物细胞具有趋化性或化学激动活性(chemokineticactivity)，哺乳动物细胞包括例如单核细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、T细胞、肥大细胞、嗜酸粒细胞、上皮和/或内皮细胞。本发明多核苷酸编码具有这类性质的多肽。趋化性和化学激动性受体活化作用可用于驱动或引发所需细胞群体到达所需作用部位。趋化性或化学激动性组合物(例如本发明的蛋白质、抗体、结合配偶体或调节剂)在治疗伤口或其它组织创伤以及治疗局部感染方面有独特优势。例如，吸引淋巴细胞、单核细胞或中性粒细胞到达肿瘤或感染部位可以改善针对肿瘤或感染因子的免疫应答。
如果蛋白质或多肽能够直接或间接刺激特定细胞群体定向或运动，则该蛋白质或多肽对该细胞群体具有趋化活性。优选蛋白质或多肽具有直接刺激细胞定向运动的能力。用蛋白或肽通过任何已知的细胞趋化性实验可以很容易地确定特定蛋白是否对细胞群体有趋化活性。
趋化活性检测(可以鉴别诱导或阻止趋化作用的蛋白质)包括检测蛋白质诱导细胞跨膜转移能力的试验和检测蛋白质诱导细胞群体与另一细胞群体粘附能力的试验。检测移动和粘附的合适试验包括但不限于如下所述Current Protocols in Immunolo gy，Ed by J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Marguiles，E.M.Shevach，W.Strober，Pub.Greene Publishing Associates andWiley-Interscience(Chapter 6.12，Measurement of alpha and beta Chemokines6.12.1-6.12.28；Taub et al.J.Clin.Invest.951370-1376，1995；Lind etal.APMIS 103140-146，1995；Muller et al Eur.J.Immunol.251744-1748；Gruber et al.J.of knmunol.1525860-5867，1994；Johnson et al.J.ofImmunol.1531762-1768，1994。
4.2.10药物筛选 本发明的转基因非人哺乳动物及其后代提供了一些重要用途，并且对本领域技术人员是显然的。转基因动物在筛选调节(提高或降低)GIPF多肽活性的化合物方面尤其重要。筛选有效化合物包括将候选化合物以一系列剂量给予转基因动物，在不同时间点检测化合物对GIPF活性的影响。化合物可以提前给予或在腹腔膨胀开始时给予。给药形式可以是口服或通过合适方法注射，取决于被检测化合物的化学性质。利用合适的生化和/或组织学检测评价一段时间内细胞对化合物的反应。
用于筛选结合本发明多肽或调节(即提高或降低)本发明多肽活性的测试化合物的来源包括(1)无机和有机化合物库，(2)天然产物库和(3)包含随机或模拟肽、寡核苷酸或有机分子的组合文库。
很容易合成或通过许多商业途径购买化合物库，它包括已知化合物的结构类似物或通过天然产物筛选被确认为先导物(hits or leads)的化合物。
天然产物库的来源是微生物(包括细菌和真菌)、动物、植物或其它营养体(vegetation)、或海洋生物，以及通过以下几种方法筛选得到的组合文库(1)从土壤、植物或海洋微生物培养液中得到的发酵产物和提取物，或(2)生物体自身的提取物。天然产物库包括聚酮化合物、非核糖体肽及其(非天然)突变体。综述参见Science28263-68(1998)。
组合文库包括大量的肽、寡核苷酸或有机化合物，并可通过传统的自动化合成方法、PCR、克隆或专有合成方法制备。人们对肽和寡核苷酸组合文库特别感兴趣。其它文库包括肽、蛋白质、肽模拟物、多途径合成的集合体、重组物和多肽文库。组合化学和由此产生的组合化学文库的综述参见Myers，Curr.Opin.Bioteclznol.8701-707(1997)。肽模拟物文库的综述和实例参见Al-Obeidi et al.，Mol.BotecAlnol，9(3)205-23(1998)；Hruby etal.，Curr Opin Chem Biol，1(1)114-19(1997)；Dorner et al.，Bioorg Med Cliem，4(5)709-15(1996)。
4.3GIPF可治疗的疾病 一方面，本发明提供了用于治疗需要上皮形成的疾病和病症的药物试剂和方法。GIPF多肽可用于提高口腔和胃肠道上皮细胞的细胞保护、增殖和/或分化作用。具体地，GIPF多肽可用于治疗或预防以下疾病或病症，包括但不限于胃肠道疾病、胃肠道粘膜炎、口咽部、嘴唇和食道粘膜炎(口腔粘膜炎)、炎症性肠疾病、短肠综合症、胃及十二指肠溃疡、胃肠道糜烂，包括糜烂性胃炎、食管炎、食管反流，以及其它疾病包括创伤、烧伤、眼病和需要刺激上皮细胞增殖或再生的任何其它病症。还包括治疗由于口腔和胃肠道粘液分泌不足而导致的疾病。
粘膜炎，包括口腔和胃肠道粘膜炎，是一些癌症治疗的并发症，其中消化系统的内衬组织(lining)发生炎症。GIPF可用于防止和/或改善由于癌症病人化疗和/或放疗引起的消化道粘膜变性，或作为摘除肿瘤后的辅助疗法。化疗剂的例子包括但不限于BCNU、白消安(busulfan)、卡铂、环磷酰胺、tannorubicin，多柔比星(doxorubicin)、依托泊苷(etoposide)、5-氟尿嘧啶、gemcytabine，异环磷酸胺(ifophamide)、依立替康(irinotecan)、美法仑(melphalan)、甲氨蝶呤、诺维本(navelbine)、totpotecan和紫杉醇。治疗方法的例子包括但不限于BEAM(白消安、依托泊苷、胞嘧啶、阿糖胞苷和甲氨蝶呤)；环磷酰胺和全身辐射；环磷酰胺、全身辐射和依托泊苷；环磷酰胺和白消安；5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸或左旋咪唑。在治疗时、治疗前或治疗后使用GIPF有利于，例如小肠和结肠粘膜产生细胞保护作用或促进其再生或两者皆有，当降低其可能的副作用时可增加治疗剂量。
用GIPF治疗的炎症性肠疾病包括一般性的炎症性肠疾病，其特征为慢性、复发性、未知原因，用GIPF治疗的炎症性肠疾病还包括克罗恩氏病、与炎症性肠疾病有关的发育不良、过渡性结肠炎、溃疡性结肠炎；非感染性结肠炎，包括活动性结肠炎、抗生素引起的结肠炎、胶原性结肠炎、改道性结肠炎(diversion colitis)、嗜酸性结肠炎、移植物抗宿主反应疾病、肉芽肿性结肠炎、缺血性结肠炎、出血性结肠炎、软化斑(malakoplakia)、坏死性小肠结肠炎、放射性肠炎、盲肠炎(typhlitis)；感染性结肠炎，包括腺病毒和阿米巴虫结肠炎、纤毛虫病(balantidiasis)、HSV/AIDS相关的结肠炎和由锥虫、大肠杆菌、鸟分枝杆菌、Sotavirus、沙门氏菌属细菌、志贺杆菌属细菌、空肠弯曲杆菌、梭状芽胞杆菌属细菌、肉毒杆菌属细菌引起的结肠炎，以及与血吸虫病、螺旋体病、梅毒、鞭虫病、结核伤寒、霍乱弧菌和耶尔森菌相关的结肠炎。
短肠综合症是影响切除了一半或一半以上小肠的人的一组问题。切除部分小肠的最普遍原因是为了治疗克罗恩氏病(Crohn’s disease)。另外，可能需用外科手术切除部分小肠以便消除癌性生长。腹泻是短肠综合症的主要症状。其它症状包括绞痛、胀气和胃灼热(heartburn)。许多患有短肠综合症的病人都是营养不良的，因为他们体内所保留的小肠不能够从食物中吸收足够的水份、维生素和其它营养物质。病人可能会发生威胁生命的脱水。与脱水和营养不良相关的问题包括身体虚弱、疲劳、抑郁、体重减轻、细菌感染和食物过敏等。通过改变饮食、静脉内补充营养、维生素和矿物质以及使用缓解症状的药物来治疗短肠综合症。GIPF多肽有利于促进未切除小肠组织增殖，因此提高肠组织的表面吸收面积，改善短肠综合症的症状。
GIPF多肽的细胞保护和/或再生活性可以在如下模型中检测辐射引发粘膜炎的体内模型(Withers and Elkind，Int J Radiat 17261-267(1970)，引入此处作为参考)；化疗引发粘膜炎的体内模型(Soris etal.，Oral Surg Oral MedOral Pathol 69437-443(1990)；Moore，CancerChemother Pharmacol 1511-15(1985)；Farell etal.，Cell Prolif 3578-85(2002)引入此处作为参考)；结肠炎和小肠溃疡或发炎的葡聚糖硫酸钠(DSS)模型(Jeffers et al.，Gastroenterology 1231151-1162(2002)，Han etal.，Am J Physiol GastrointestLiver Physiol 279G1011-G1022(2000)；和短肠综合症(SBS)的外科模型(Scott et al.Am J PhysiolG911-G921(1998)；Helmrath et al.，J Am Coll Surg183441-449(1996))，引入此处作为参考)。
通过比较疾病细胞、组织和相应正常样品的GIPF mRNA和蛋白表达水平，可以确定个体对于GIPF治疗是否有反应。检测和定量GIPF多肽mRNA或蛋白表达水平的方法是本领域熟知的标准核酸和蛋白检测和定量技术，见Sambrook，etal.，MolecularCloningX Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，NY(1989)or Ausubel，etal.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，NewYork，NY(1989)，引入此处作为参考。检测和定量GIPF mRNA的标准方法包括用标记的GIPF核糖探针进行原位杂交(Gemou-Engesaeth，etal.，Pediatrics 109E24-E32(2002)，引入此处作为参考)，用GIPF多核苷酸探针进行Northern印迹和相关技术(Kunzli，etal.，Cancer 94228(2002)，引入此处作为参考)，用GIPF特异性引物进行RT-PCR分析(Angchaiskisiri，etal.，Blood 99130(2002))，以及其它扩增检测方法，如支链DNA溶液杂交试验(Jardi，etal.，J.Viral Hepat.8465-471(2001)，引入此处作为参考)，转录介导的扩增(Kimura，et al.，J.Clin.Microbiol.40439-445(2002))，微阵列产物，如寡聚物、cDNA和单抗以及实时PCR(Simpson，et al.，Molec.Vision，6178-183(2000)，引入此处作为参考)。检测和定量GIPF蛋白的标准方法包括Western印迹分析(Sambrook，et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY(1989)，Ausubel，et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY(1989))，免疫细胞化学(Racila，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 954589-4594(1998)supra)及各种免疫测定法，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和特异性酶免疫测定(EIA)(Sambrook，etal.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY(1989)，Ausubel，etal.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY(1989))。
用本发明方法治疗的疾病和病症优选发生在哺乳动物中。哺乳动物包括，例如人类和其它灵长类动物，宠物或陪伴动物如狗和猫，实验动物如大鼠、小鼠和兔子，以及牲畜如马、猪、羊和牛。
4.3.1治疗方法 本发明药物组合物(包括多肽片段、类似物、突变体和抗体，或其它结合配体或调节因子包括反义多核苷酸)可应用于各种治疗方法。治疗应用的例子包括但不限于本文中举例说明的例子。
本发明的一个实施方案是将有效量的本发明GIPF多肽或其它药物组成合物给予个体，该个体患有可用本发明肽治疗的疾病。虽然给药方式不是非常重要，但优选非胃肠道给药。给药方式的例子是皮下或静脉大药丸方式(bolus)给药。本发明GIPF多肽或其它药物组合物的剂量通常由处方医生决定。剂量根据个体患者的年龄、体重、疾病状况和对药物的反应而变化。一般地，每剂给予的多肽量是约0.01μg/kg体重至100mg/kg体重，优选约0.1μg/kg体重至10mg/kg体重。非胃肠道给药时，本发明GIPF多肽与非胃肠道可接受载体共同制成注射用制剂。这类载体是现有技术中已知的，实例包括水、盐溶液、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液和含有少量人血清白蛋白的溶液。载体可以包含少量维持多肽或其它活性成分等渗性和稳定性的添加剂。这类溶液的制备在本领域专业知识范围内。
4.3.2药物制剂 本发明蛋白或其它组合物(无论来源如何，包括但不限于重组和非重组来源，包括本发明多肽的抗体和其它结合配体)可以单独给予病人，还可与适当载体或赋形剂以治疗或改善各种疾病的剂量混合制成药物制剂给予病人。这类组合物任选地包含(除了蛋白或其它活性成分和载体外)稀释剂、赋形剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂和其它本领域已知物质。名词“药学可接受”指不干扰活性成分生物活性效应的无毒物质。载体的性质取决于给药途径。本发明的药物组合物还可包括细胞因子、淋巴因子或其它血细胞生成因子和各种生长因子，如FGF、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-α和TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、角质细胞生长因子(KGF)等，以及本文所述的细胞因子。
药物组合物还可包括提高蛋白或其它活性成分的活性的其它试剂，或补充其活性或用于治疗的其它试剂。包含在药物组合物中的这类添加因子和/或试剂可以和本发明蛋白质或其它活性成分产生协同作用或降低副作用。相反地，制剂中包含的本发明蛋白质或其它活性成分可以是细胞因子、淋巴因子或其它血细胞生成因子、溶血栓或抗血栓因子、或使凝固因子副作用最小化的抗炎物质(如IL-1Ra，IL-1 Hy1，IL-1 Hy2，抗TNF，皮质类固醇激素，免疫抑制剂)。本发明蛋白质可与自身或其它蛋白形成活性多聚体(例如异二聚体或同二聚体)或活性复合物。
本发明药物组合物还可包括第一蛋白、与第一蛋白同时给予的第二蛋白或治疗剂(例如同时给予，或者如果试剂组合在治疗位点达到了治疗浓度时，可以不同时间给予)。本申请化合物的制剂技术和给药方式可参见最新版“Remington′s Pharmaceutical Sciences，″Mack Publishing Co.，Easton，PA。治疗有效量指化合物的量足以缓解症状，例如治愈、愈合、预防或改善相关疾病状况，或者提高治愈、愈合、预防或改善这种疾病的机率。当活性成分单独给予个体时，治疗有效量单指活性成分的量。当以组合物形式给予时，无论是联合、顺序或同时给药，治疗有效量指产生治疗效果的活性成分的组合用量。
当实施本发明治疗方法和应用时，将治疗有效量的本发明蛋白质或其它活性成分给予发生疾病的哺乳动物。可以根据本发明方法单独给予本发明蛋白质或其它活性成分或与其它治疗方式联合使用，如使用细胞因子、淋巴因子或其它血细胞生成因子的治疗方法。当与一个或多个细胞因子、淋巴因子或其它血细胞生成因子共同给予时，本发明蛋白质或其它活性成分可与细胞因子、淋巴因子或其它血细胞生成因子、溶血栓或抗血栓因子同时给药或顺序给药。如果是顺序给药，主治医师将决定本发明蛋白质或其它活性成分与细胞因子、淋巴因子或其它血细胞生成因子、溶血栓或抗血栓因子的适当给药顺序。
4.3.3给药途径 适宜的给药途径包括，例如口腔给药、直肠给药、经粘膜给药或肠内给药；非胃肠道给药包括肌肉注射、皮下注射、髓内注射和鞘内注射、直接心室给药、静脉注射、腹膜内注射、鼻腔给药或眼内注射。可以各种常规方法给予药物组合物中的本发明蛋白质或其它活性成分或以各种常规方法实施本发明的方法，如口服法、吸入法、局部用药或皮内注射、皮下注射、腹膜内注射(IP)、非胃肠道给药或静脉注射。优选静脉注射给药。
另外，可以局部而非全身形式给药，例如以积存库或持续释放形式将化合物直接注射到组织中。
在另一实施方案中，将产生GIPF的细胞植入需要增殖和/或刺激上皮细胞的个体内(细胞治疗)。用编码GIPF的多核苷酸转化通常不表达GIPF或低水平表达GIPF的细胞以产生治疗水平的GIPF。细胞可以是与所述个体细胞同种属的，或者衍生于另一种属。优选细胞衍生于需要GIPF治疗的个体。用生物相容的、半渗透性多聚体外包封物将人细胞或非人细胞植入个体使GIPF蛋白释放，或不经过包封直接植入。
在另一实施方案中，考虑体内基因治疗。编码GIPF的核苷酸序列直接引入个体中以分泌蛋白来预防或治疗本文所述的疾病。编码GIPF的核苷酸可以直接注射到需要治疗的组织中，或通过病毒载体，如腺病毒载体或逆转录病毒载体，导入患病的组织细胞内。包含GIPF编码核酸的合适载体可通过许多方法完成物理传递，包括脂质体介导的传递、直接注射裸DNA、受体介导的传递或微粒轰击。
采用将有效量物质传递到期望的作用部位的任意途径都可以应用于本发明多肽。每一特定适应症的合适给药途径和有效剂量的确定在本领域专业知识范围内。对于治疗伤口，优选将治疗化合物直接施用到伤口位置。本发明多肽的合适剂量范围可根据适当动物模型的相似研究中推断。临床医师根据需要可调整给药剂量已达到最佳的治疗效果。
4.3.4组合物/制剂 本发明所用的药物组合物可以常规方法制成制剂，其中使用包括赋形剂和辅料的一种或多种生理可接受载体。这些药物组合物可用已知方法制造，如常规的混合、溶解、制粒、制糖衣片、研磨、乳化、包裹或冻干过程。根据给药途径选择正确的制剂。当口服给予治疗有效量的本发明蛋白质或其它活性成分时，本发明蛋白质或其它活性成分可以是片剂、胶囊、粉末、溶液或酏剂形式。当以片剂形式给药时，本发明的药物组合物另外包括如明胶的固体载体或佐剂。片剂、胶囊和粉剂包含约5～95％本发明蛋白质或其它活性成分，优选约25～90％本发明蛋白质或其它活性成分。当以液体形式给药时，可添加液体载体如水、石油(petroleum)、动物油或植物油，如花生油、矿物油、豆油或麻油或合成油。液体形式的药物组合物还可包括生理盐水、葡萄糖、或其它糖溶液、甘油如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式给药时，药物组合物含有约0.5～90％(重量)本发明蛋白质或其它活性成分，优选含有约1～50％本发明蛋白质或其它活性成分。
当通过静脉注射、表皮注射或皮下注射给予治疗有效量的本发明蛋白质或其它活性成分时，本发明蛋白质或其它活性成分是无热源、非胃肠道可接受的溶液形式。制备这种非胃肠道可接受的蛋白质或其它活性成分溶液与pH、等渗性、稳定性等方面有关，并在专业技术知识范围内。优选的静脉注射、表皮注射或皮下注射的药物组合物，除了包含本发明蛋白质或其它活性成分，还包含等张赋形剂如NaCl注射液、Ringer’s注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和NaCl注射液、乳酸化的Ringer’s注射液或其它本领域已知赋形剂。本发明药物组合物还包括稳定剂、防腐剂、缓冲液、抗氧化剂或本领域技术人员已知的添加剂。当以注射形式给药时，本发明试剂制成水溶液制剂，优选生理相容的缓冲液，如Hank’s液、Ringer’s液或生理盐水。当经粘膜给药时，制剂中需添加适于穿透屏障的穿透剂。这类穿透剂对于专业人员是熟知的。
当口服给药时，将活性物质与本领域公知的药物可接受载体混合可以很容易的将化合物制成制剂。这类载体将本发明化合物制成制剂，如病人口服消化的片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、悬液等。制备口服药物如下进行固体赋形剂，任选地碾碎获得的混合物，根据需要加入适当辅料后，加工混合物制粒，获得片剂或糖衣片核心。具体地，合适的赋形剂有填充剂，如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品，如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、土豆淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯酮(PVP)。如需要也可以添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐如海藻酸钠。糖衣片核心用适当的糖衣包裹。为此使用浓缩糖溶液，任选包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、紫胶漆溶液(lacquer solution)、合适的有机溶剂或溶剂混合物。可在片剂或糖衣中加入染料或色素以辨别或标识活性化合物的不同组合。
口服的药物制品包括以明胶制备的挤压胶囊、用明胶和增塑剂，如甘油或山梨醇制成的软密封胶囊。挤压胶囊中活性成分与下列成分混合，填充剂如乳糖，粘合剂如淀粉，和/或润滑剂，如滑石粉或硬脂酸镁，和任选地稳定剂。软胶囊中，活性成分溶解或混悬于适当的液体，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外也可加入稳定剂。所有口服制剂应制成适合这种给药方式的剂量。口腔含化法给药时，组合物可采用常规方式制成片剂或糖锭制剂。
吸入给药时，本发明化合物以喷雾剂形式给予，从加压瓶或喷雾器中喷射并使用适合的喷射剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当气体。以加压气溶胶形式给药时，由阀门传递定量的药物来确定剂量单位。用于吸入器或吹入器的例如明胶胶囊和药筒可以配制成包含化合物和适当粉剂基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。化合物可配制成通过注射以非胃肠道给药方式给药，如快速浓注(bolus injection)或连续输注。注射制剂可以是单位剂量形式，可以存在于例如添加了防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物可以是下列形式混悬液、溶液或油状或水状载体的乳剂，可以含有配制试剂，如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。
非胃肠道给药的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的液态溶液。另外，活性化合物的混悬液可由适当的油状注射混悬剂制得。适宜的亲脂溶剂或载体包括脂肪油，如芝麻油，或者合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯或者脂质体。液态注射混悬液包含提高混悬液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。任选地，混悬液还可包含合适的稳定剂或提高化合物溶解性的试剂，以制备高浓度溶液。另外，活性成分可制备成粉剂形式，使用前与适宜载体，如灭菌无热源水混合。
化合物还可配制成直肠给药的组合物，例如含有常规栓剂基质如可可脂或其它甘油酯的栓剂或保留灌肠剂。除了前面描述的制剂，化合物还可配制成长效制品。这种长期作用的制剂可通过植入(如皮下或肌内)或肌肉注射给予。例如，化合物可用适当的多聚物或疏水材料(如可接受油制成的乳剂)或离子交换树脂进行配制，或作为略溶衍生物，如略溶盐。
本发明疏水化合物的药物载体是包括苯甲醇、非极性表面活性剂、水混合有机聚合物和水相的共溶体系。共溶体系可以是VPD共溶系统。VPD是3％w/v苯甲醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨酯80和65％聚乙二醇300的混合溶液，用纯的醇定容至一定体积。VPD共溶体系(VPD∶5W)含有用5％葡萄糖1∶1稀释的VPD水溶液。该共溶系统能够很好的溶解疏水化合物，并且在全身用药时本身是低毒的。通常，共溶体系的比例在不破坏其溶解度和毒性的情况下是可变的。而且，共溶成分有所不同如聚山梨酯80可用其它低毒非极性表面活性剂替代；PEG的片段大小可有所不同；其它生物相容性多聚物如聚乙烯吡咯烷酮可代替聚乙二醇；其它糖类或多糖可替代葡萄糖。另外，可采用其它疏水药物化合物传递体系。脂质体和乳剂是已知的疏水药物传递载体。尽管通常毒性较高，某些有机溶剂还可以使用，如二甲亚砜。另外，用持续释放体系，如含有治疗剂的固体疏水聚合物的半渗透性基质也可以传递化合物。已有多种持续释放材料，且是本领域技术人员公知的。持续释放胶囊依据其化学性质可以持续几周至超过100天释放化合物。依据治疗药物化学性质和生物稳定性，可采取其它策略稳定蛋白质或其它活性成分。
药物组合物也可以包括适当的固体或凝胶态载体或赋形剂。这类载体或赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶、多聚物如PEG。许多本发明活性成分与药学相容性平衡离子形成盐。这类药物可接受碱加成盐指保留游离酸生物有效性和特性的盐，通过与无机或有机碱反应获得，所述碱如氢氧化钠、氢氧化镁、铵、三烷基胺、二烷基胺、一烷基胺、二元氨基酸、乙酸钠、苯甲酸钾、三乙醇胺等等。
本发明药物组合物可以是本发明蛋白或其它活性成分与蛋白质或多肽抗原的混合物形式。蛋白质和/或多肽抗原可以将刺激性信号传递到B淋巴细胞和T淋巴细胞。B淋巴细胞通过其表面免疫球蛋白受体对抗原作出反应。MHC蛋白递呈抗原后，T淋巴细胞通过T细胞受体(TCR)对抗原作出反应。MHC和结构相关蛋白，包括宿主细胞I类和II类MHC基因编码的蛋白，可将肽抗原递呈至T淋巴细胞。抗原成分也可以是单纯的纯化MHC-肽复合物或者是与直接向T细胞传递信号的共刺激分子的复合物。可以与表面免疫球蛋白和其它B细胞分子结合的其它抗体，以及与TCR和其它T细胞分子结合的抗体，可以与本发明药物组合物组合。
本发明药物组合物可以是脂质体形式，其中除了其它药物可接受载体，本发明蛋白与两亲物质，如以聚集形式存在的脂质组合，所述聚集形式如胶束、不可溶单层分子、液晶或水溶液中片层。配制脂质体的适宜脂质包括但不限于单甘油酯、二葡基甘油二酯、脂类、溶血卵磷脂、磷脂、皂甙、胆酸等等。制备这类脂质体制剂属于专业技术知识范围内，US 4,235,871、US 4,501,728、US 4,837,028、US 4,737,323(引入此处作为参考)中有描述。
本发明药物组合物中本发明蛋白质或其它活性成分的量根据治疗疾病的严重程度和性质、病人先前接收的治疗的性质而决定。最终，主治医师决定治疗每个病人的本发明蛋白质或其它活性成分的用量。起初，主治医师会给予低剂量本发明蛋白质或其它活性成分，并观察病人的反应。然后给予较大剂量本发明蛋白质或其它活性成分直到达到最佳治疗效果，之后剂量将不再升高。实施本发明方法的各种药物组合物含有约0.01μg-约100mg/kg体重(优选约0.1μg-约10mg，更优选约0.1μg-约1mg)本发明蛋白质或其它活性成分。本发明组合物用于骨、软骨、腱或韧带再生时，治疗方法包括局部、系统用药或局部植入。给药时，本发明的治疗组合物应该是无热源生理可接受形式。而且，药物组合物可以被包裹或以粘稠形式注入从而传递到骨、软骨或损伤组织部位。局部用药适于伤口愈合和组织修复。除了本发明蛋白质或其它活性成分，如前所述可任意包括在组合物中的治疗用试剂，可与本发明方法的组合物同时或连续给药。优先用于骨和/软骨的药物组合物包括能够将含有蛋白质或其它活性成分的组合物传递到骨和/或软骨损伤的部位的基质，为骨和软骨发育提供框架并且最好的情况是还能被身体吸收。这种基质由目前用于其它移植用途的材料制成。
选择基质材料是基于生物相容性、生物降解性、机械特性、美观性和界面性质。组合物的特定用途决定其适宜的制剂形式。组成的潜在基质是生物可降解性的，化学上定义为硫酸钙、磷酸三钙、羟磷灰石、聚乳酸、聚乙醇酸和聚酸酐。其它潜在材料是生物可降解的，生物学上早有定义，如骨胶原或皮胶原。其它基质包括纯化蛋白或细胞外基质成分。其余潜在基质是非生物可降解的，化学上定义为烧结羟磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其它陶土。基质可包含上述任意类型材料的组合，如聚乳酸和羟磷灰石或胶原和磷酸三钙。组合物中，生物陶土可以改变成钙-铝-磷形式并经过加工改变孔径、颗粒大小、颗粒形状和生物降解性。优先乳酸和羟乙酸以50∶50(摩尔质量)比例形成多孔颗粒的共聚物，直径在150～800微米。在一些应用中，可使用螯合剂，如羧甲基纤维素或自体血块以阻止蛋白组合物与基质分离。
一组优选的多价螯合剂是纤维素质材料，如烷基纤维素(包括羟基烷基纤维素)，包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素羧甲基，最优选羧甲基纤维素(CMC)的阳离子盐。其它优选的多价螯合剂包括透明质酸酶、海藻酸、PEG、聚氧乙烯、羧基乙烯聚合物和聚乙烯醇。本文所用的多价螯合剂的量是制剂总重的0.5-20wt％，优选1-10wt％，该量是防止蛋白质由多聚基质解析且易于操作的必需量，但又不会多到阻止祖细胞浸润基质，因此使蛋白质可以促进祖细胞的成骨活性。另一药物组合物中，本发明蛋白质或其它活性成分可与有利于治疗骨骼和/或软骨缺陷、创伤(wound)或问题组织的其它试剂组合。这些试剂包括各种生长因子，如表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-α和TGF-β)和胰岛素样因子(IGF)。
治疗组合物可用于兽医。除了人，特定家畜、良种马都是用本发明蛋白质或其它活性成分治疗的对象。用于组织再生的含蛋白的药物组合物的给药方案由主治医师考虑各种影响蛋白活性的因素来确定，所述因子例如希望生成的组织重量、损伤部位、损伤组织的情况、伤口大小、组织损伤的类型(如骨)、患者年龄、性别、饮食、感染严重程度、给药时间及其它临床因素等。剂量根据重塑所用的基质类型和药物组合物中含有的其它蛋白而不同。例如，最终组合物中加入了其它已知的生长因子，如IGF I(胰岛素样生长因子)，可能影响剂量。例如用X光、组织形态测定和四环素标记通过周期性评价组织/骨生长和/或修复，来监测进程。
本发明多核苷酸可用于基因治疗。这类多核苷酸可以在体内或体外引入哺乳动物细胞中进行表达。可以用将核酸引入细胞或生物体的其它已知方法(包括但不限于以病毒载体或裸DNA的形式)给予本发明多核苷酸。细胞也可以在存在本发明蛋白的情况下进行回体培养使细胞增殖或产生预期的效果或活性。处理后的细胞随后引入体内用于治疗。
4.3.5有效剂量 适用于本发明的药物组合物包括包含有效量的活性物质以达到预期目的的组合物。具体的，治疗有效量指有效防止接受治疗的个体的症状发展或改善已有症状的剂量。确定有效量在本领域技术人员能力范围内，尤其本文提供了详细描述。对于任何用于本发明的化合物，治疗有效剂量开始可通过适当的体外试验来估计。例如，计算动物模型中达到循环浓度范围的剂量，可用于更加精确地确定人体用量。例如，计算动物模型中达到循环浓度范围的剂量，包括从细胞培养确定的IC50(即被检测化合物达到对蛋白质生物活性最大抑制作用一半时的浓度)。这类信息可用于更加精确地确定人体有效剂量。
治疗有效剂量指缓解病人症状或延长生命的化合物的量。该化合物的毒性和治疗有效性可通过细胞培养或试验动物中的常规药物检测过程来确定，例如测定LD50(50％群体死亡的剂量)和ED50(50％群体治疗有效的剂量)。毒性和治疗有效性的剂量比是治疗指数，可以用LD50/ED50的比值表示。优选表现出高治疗指数的化合物。由这些细胞培养试验和动物研究中得到的数据可用于制定人的用药剂量。这类化合物的剂量优选在包括ED50且低毒或无毒的循环浓度范围内。剂量在此范围内根据所使用的剂型和给药途径而变化。实际的剂型、给药途径和剂量由医生根据病人情况选择。参见例如Fingl et al.，1975，“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，Ch.1 p.l。分别调整给药量和给药间隔使活性成分的血药浓度足以达到预期效果或最小有效浓度(MEC)。MEC随不同化合物而变化，但可由体外数据估计。达到MEC所需的剂量依个体情况和给药途径而不同。然而，可用HPLC检测或生物检测来确定血药浓度。
给药间隔也可用MEC值来确定。给予化合物的方案应使血药水平在10～90％时间内保持在MEC之上，优选30～90％，更优选50～90％。局部给药或选择吸收时，药物的局部有效浓度可能与血药浓度无关。
本发明多肽或其它组合物的剂量方案的例子是每天约0.01μg-约100mg/kg体重，优选约0.1μg/kg-25mg/kg，成人和儿童给药剂量不同。可以每天给药一次或在较长或较短间隔内给予等量药物。
当然，给药量应根据治疗个体、患者年龄和体重、病症严重性、给药方式和处方医生的判断而定。
4.3.6诊断检测和试剂盒 本发明还提供了利用本发明的核酸探针或抗体，任意地结合或联合适当标记，来鉴定测试样品中本发明ORFs或其同系物存在或表达的方法。
通常，检测本发明多核苷酸的方法包括将样品和与本发明多核苷酸结合并形成复合物的化合物接触足够长的时间以形成复合物，并检测该复合物，如果能检测到复合物，则在样品中检测到本发明的多核苷酸。这类方法还包括在严格杂交条件下，将样品与在此条件下与本发明多核苷酸退火的核酸引物接触，扩增退火的多核苷酸，因此如果多核苷酸被扩增，则在样品中检测到本发明的多核苷酸。
总体来说，检测本发明多核苷酸的方法包括将样品和与本发明多肽结合并形成复合物的化合物接触足够长的时间以形成复合物，并检测该复合物，如果能检测到复合物，则在样品中检测到本发明的多肽。
具体说来，这种方法包括将测试样品与本发明的一种或多种抗体或者一种或多种核酸探针一起温育，检测核酸探针或抗体与测试样品成分的结合。
核酸探针或抗体与测试样品温育的条件可以变化。温育条件取决于所使用的检测形式、检测方法、以及核酸探针或抗体的类型或性质。本领域技术人员知道，任意一种通用的杂交、扩增或免疫检测方法可以很容易地调整为适合于本发明核酸探针或抗体。这类检测的例子参见Chard，T.，AnIntroduction to Radioimmunoassay and Related Techniques，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands(1986)；Bullock，G.R.et al.，Techniques inImmunocytochemistry，Academic Press，Orlando，FL Vol.1(1982)，Vol.2(1983)，Vol.3(1985)；Tijssen，P.，Practice and Theory of imrnunoassaysLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands(1985)。本发明的测试样品包括细胞、细胞的蛋白质或膜提取物、或生物液体如痰、血液、血清、血浆或尿液。用于上述方法的测试样品根据检测形式、检测方法的性质、用作测试样品的组织或提取物而有所不同。制备细胞的蛋白质提取物或膜提取物的方法是现有技术中已知的，并很容易进行改良以获得与所用系统相容的样品。
在本发明的另一实施方案中，提供了含有实施本发明检测所必需的试剂的试剂盒。具体的，本发明提供了分室试剂盒以容纳一个或多个密闭容器，包括(a)含有一种本发明探针或抗体的第一个容器；和(b)包含一种或多种下列物质的一个或多个其它容器洗涤液、能检测结合探针或抗体存在的试剂。
具体的，分室试剂盒包括试剂保存于分隔的容器中的任意试剂盒。这类容器包括小玻璃容器、塑料容器、塑料条带或纸质条带。这类容器可允许将一个间隔内的试剂有效转移至另一间隔内，使样品和试剂不至于交叉污染，每个容器内的试剂或溶液可以定量方式从一个间隔加入到另一个间隔内。这类容器包括容纳测试样品的容器、装有检测用抗体的容器、容纳洗涤液(如磷酸钠缓冲液、Tris缓冲液等)的容器，以及装有用于检测结合抗体或探针的试剂的容器。检测试剂的种类包括标记核酸探针、标记的二抗或者如果一抗被标记时，能够与标记抗体反应的酶或抗体结合试剂。本领域技术人员知道本发明公开的探针和抗体可以轻易地合并到现有技术中已知的已经确定的试剂盒内。
4.3.7筛选实验 本发明进一步提供了一种方法，用本发明的分离蛋白质和多核苷酸获得和鉴定与SEQ ID NO2，3，5，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177核苷酸序列的开放阅读框所编码的多肽、或与该核酸编码多肽的特定结构域结合的调节物质的方法。具体的，所述方法包括以下步骤 (a)将该物质与本发明开放阅读框或本发明核酸编码的分离蛋白质相接触；和 (b)确定该物质是否与所述蛋白质或所述核酸结合。
调节因子可增加或降低GIPF对上皮细胞的增殖活性。
一般说来，这种鉴别与本发明多核苷酸结合的化合物的方法包括将该化合物与本发明多核苷酸接触足够长时间以形成多核苷酸/化合物复合物，检测该复合物，如果检测到多核苷酸/化合物的复合物，就鉴别出与本发明多核苷酸结合的化合物。
同样，这种鉴别与本发明多肽结合的化合物的方法包括将该化合物与本发明多肽接触足够长时间以形成多肽/化合物的复合物，检测该复合物，如果检测到多肽/化合物的复合物，就鉴别出与本发明多肽结合的化合物。
识别与本发明多肽结合的化合物的方法包括将该化合物与细胞中的本发明多肽接触足够长时间以形成多肽/化合物复合物，该复合物驱动细胞内目的基因序列的表达，通过检测报告基因序列的表达检测该复合物，如果检测到多肽/化合物复合物，就鉴别出与本发明多肽结合的化合物。
经由这种方法鉴定的化合物包括调节本发明多肽活性的化合物(即相对于没有该化合物时的活性，活性提高或降低)。或者，经由这种方法鉴定的化合物包括调节本发明多核苷酸表达的化合物(即相对于没有该化合物时的表达水平，表达提高或降低)。化合物，如通过本发明方法鉴定的化合物，可以用本领域技术人员熟知的标准检测方法来测定其调节活性/表达的能力。
上述方法中筛选的物质包括但不限于肽、糖、维生素衍生物或其它药学试剂。用蛋白质模型技术可以随机地或合理地筛选或设计该药学试剂。
对于随机筛选，随机选择肽、糖、药学试剂等，检测其与本发明ORF编码的蛋白结合的能力。另外，也可以合理地选择或设计药学物质。此处，根据特定蛋白的构型选择药学物质时，称“合理地选择或设计药学物质”。例如，本领域技术人员能够容易地采用目前已有的方法来制备能够与特定肽序列结合的肽、药学物质等，从而产生合理设计的抗肽的肽，或药学物质等，例如参见Hurby etal.，Application of Synthetic PeptidesAntisense Peptides，″In Synthetic Peptides，A User′s Guide，W.H.Freeman，NY(1992)，pp.289-307，and Kaspczak etal.，Biochemistry 289230-8(1989)。
除了上述内容，本发明充分描述的一类物质，可通过与本发明的ORFs或EMFs之一结合而调控基因表达。如前所述，这类物质可以随机筛选或合理设计/选择。以ORF或EMF为目标，本领域技术人员可以设计序列特异性或元件特异性物质，调节单个ORF或依赖于同一EMF进行表达调控的多个ORFs的表达。一类DNA结合物质是含有碱基残基可与DNA或RNA杂交或形成三股螺旋的物质。这类物质以标准磷酸二酯、核糖核酸骨架为基础，或者是各种具有碱基吸附能力的巯基或多聚物衍生物。
适用于这些方法的物质通常包含20～40个碱基，与转录相关基因的某一区域互补(triple helix-see Lee et al.，Nucl.Acids Res.63073(1979)；Cooneyet al.，Science241456(1988)；and Dervan et al.，Science 2511360(1991))，或与自身mRNA互补(antisense-Okano，J.Neurochem.56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。三股螺旋的形成易导致DNA到RNA转录的中断，而反义RNA杂交阻断mRNA分子翻译为多肽。已证实这两种技术在模型系统中是有效的。本发明序列所包含的信息对于设计反义或三股螺旋寡核苷酸和其它DNA结合物质的是必需的。
与本发明ORFs之一所编码的蛋白质结合的物质可用作诊断试剂。与本发明ORFs之一编码的蛋白质结合的物质可用已知技术配制成药物组合物。
5.实施例 实施例1从人cDNA文库中分离SEQ ID NO1 从胎儿皮肤制备的人cDNA文库(Invitrogen)中获得SEQ ID NO1的新核酸，其使用标准PCR，用杂交序列特征分析和Sanger测序技术进行测序。用对插入子两侧的载体序列特异的引物经PCR扩增文库的插入子。将这些样品点在尼龙膜上并用寡核苷酸探针检测以得到序列特征(sequencesignature)。将克隆聚类为相似或相同序列的组，并从每组选择一个代表性的克隆进行凝胶测序。然后用经典Sanger测序方法，使用反向M13测序引物推导扩增的插入子的5’序列。将PCR产物纯化并进行荧光染料终止子循环测序。用377应用生物系统(ABI)测序仪进行一步法凝胶测序。在WO03/(029405)的国际公开中，将SEQ ID NO1的插入子描述为新序列。
实施例2 SEQ ID NO2的集合 将本发明的核酸(SEQ ID NO2)从一些序列中集合(assemble)，其中所述序列是通过上面实施例1描述的方法从cDNA文库获得的，某些情况下从一个或多个公共数据库获得的。用EST序列作为种子(seed)集合最后的序列。然后通过从属于这个集合的不同数据库(即含有EST序列的Nuvelo的数据库，dbEST版本124，gbpri124，和UniGene版本124)中拖出额外的序列，用速归算法将种子扩展到更大的集合(assemblage)中。当从上面的数据库中没有能扩大集合的额外序列时，算法终止。集合中序列成分的纳入以BLASTN命中扩展集合为基础，其BLAST评分超过300并且相同百分比超过95％。
使用PHRAP(华盛顿大学)或CAP(Paracel)，从集合产生全长基因的cDNA序列和其相应的蛋白质序列。手工编辑纠正任何框架移位和不正确的终止密码子。在编辑过程中，使用FASTY和BLAST对Genebank(即dbEST版本124，gbpri124，和UniGene版本124，Genpept release 124)检查序列。可能已经用于编辑过程的其它计算机程序是phredPhrap和Consed(华盛顿大学)以及ed-ready，ed-ext和cg-zip-2(Hyseq，Inc.)。全长的核酸和氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NOS2和4所示。
为了表达GIPF(SEQ ID NO4)，将全长GIPF DNA从Marathon-readycDNA文库(Clontech)PCR扩增。将初次的PCR产物用锚定PCR引物(nestedPCR primer)进一步扩增，如下面描述的，当在合适的细胞系中表达时其产生GIPF多肽。
实施例3 GIPF在鼠类和人类组织中的表达 A.GIPF mRNA的组织分布 图2显示来源于人(A)和鼠(B)组织的GIPF mRNA的相对表达。
按照生产商(Qiagen，Valencia，CA)提供的方法从图2所示的组织提取总mRNA。将RNA进行定量实时PCR(TaqMan)(Simpson等，Molec Vision6178-183(2000))以判定在所示组织中GIPF的相对表达。在人类RNA的PCR反应中使用的正向和反向引物分别是5′GACCATGCTGCCTGCTCTGACAC3′(正向；SEQ ID NO29)，和5′CACCCGCCTCCTTGCTCTCC3′(反向；SEQ ID NO30)；在鼠RNA的PCR反应中使用的正向和反向引物分别是5′GGGGGAGACCACACCACCTGCT3′(SEQ ID NO31)，和5′TTGGACCTCGGCTCCTTGCTGTTC3′(SEQ IDNO32)。在所有样品中，将编码延长因子1，β-肌动蛋白，和ATP合酶6的DNA序列用作阳性对照和标准化因子。所有实验进行三次重复，并将所得结果的值平均。
Y轴表示每个细胞中GIPF mRNA的拷贝数，假定每个细胞有中等长度(median length)1.2kb的mRNA转录本400,000个，并且细胞中总RNA的2％是mRNA。图2显示在实验的所有组织中GIPF mRNA以低水平表达。观察到的GIPF mRNA的最高水平是在小鼠皮肤、肺、卵巢和脑，以及人小肠、皮肤、皮肤、卵巢、睾丸和乳腺。
B.GIPF蛋白的分布 用兔多克隆抗-GIPF抗体检测人类组织标本中GIPF的表达(表1)。兔多克隆抗体是通过用肽免疫兔产生的，其中预测所述的肽是免疫原性的，并具有氨基酸序列Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser Arg Arg Arg Lys GlyGln(SEQID NO67)。用偶联于Affi-Gel 10(Bio-Rad)的GIPF肽从兔血清中将抗GIPF抗体亲和纯化，并贮存于含0.1％叠氮钠的磷酸盐缓冲的盐水中。为免疫组织化学分析(IHC)(LifeSpan Biosciences，Inc.，Seatlle，WA)，通过将组织在10％福尔马林中固定，石蜡包埋，和用标准技术切片制备肾上腺、膀胱、乳腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胎盘、前列腺、皮肤、小肠、脾、胃、睾丸、甲状腺、扁桃体和子宫组织标本。将切片用GIPF-特异的抗体检测并用生物素偶联的抗兔二抗使用AEC作为底物显色。
人类组织中GIPF的细胞定位如表1所示。观察到的最强的染色在胰岛细胞亚群的细胞质中，和小肠和胃的上皮内神经内分泌细胞的细胞质中。明显的染色也存在于肾上腺皮质，胃小凹上皮，和肾小管上皮。经常有淋巴细胞阳性并表现出强的核染色。在皮肤，局部阳性存在于颗粒层和毛囊皮脂腺单位中。一些细胞类型表现为低强度细胞质和核染色，包括呼吸道上皮，II型肺细胞、前列腺上皮，和乳腺上皮。局部弱的核染色存在于肝细胞、结肠上皮、胎盘滋养层、乳腺上皮、卵巢和甲状腺滤泡上皮。神经节细胞表现为blush染色，而其它实验的细胞类型为GIPF阴性，包括腺上皮、平滑肌、内皮、血管内中性粒细胞、和成纤维细胞。
表1 实施例4 GIPF转基因动物 A.GIPF-KI载体的构建 转基因GIPF-基因敲入(GIPF-KI)载体(图5A)的构建按照下面描述的方法进行，并描绘在图5B-5R中。
通过扩增下面的两个片段获得编码小鼠免疫球蛋白kappa恒定区(IgCκ)和邻近区域的DNA 图5B IgCκ片段1的制备 根据从GeneBank(giV00777；SEQ ID NO33)获得的小鼠免疫球蛋白kappa恒定区(IgCκ)和邻近区域的序列合成用于PCR的正向(igkc1；SEQID NO34)和反向(igkc2；SEQ ID NO35)引物，并用于扩增编码IgCκ片段1的DNA。通过在5’端位点添加Xho I识别序列制备igkc1ATCTCGAGGAACCACTTTCCTGAGGACACAGTGATAGG(SEQ ID NO34)，并且通过在5’端位点添加EcoR I识别序列制备igkc2ATGAATTCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAC(SEQ ID NO35)。用25ng含有小鼠恒定区和铰链区的pBluescript SK II(+)的克隆(WO00/10383)作为模板进行PCR。将PCR产物用限制酶EcoR I和Xho I消化，并连接到已经用限制酶EcoR I和Xho I预消化的pBluescript IIKS(-)载体中(Stratagene)。所得到的质粒pIgCκA含有特定的小鼠IgCκ片段1的cDNA，且在Xho I和EcoRI之间区域没有核苷酸序列取代。
图5C IgCκ片段2的制备 根据从GeneBank(giV00777；SEQ ID NO33)获得的小鼠免疫球蛋白kappa恒定区(IgCκ)的下游区域的序列合成用于PCR的正向(igkc3；SEQID NO36)和反向(igkc4；SEQ ID NO37)引物，并用于扩增编码IgCκ片段2的DNA。通过在5’端位点添加EcoR I识别序列制备Igkc3ATGAATTCAGACAAAGGTCCTGAGACGCCACC(SEQ ID NO36)，并且通过在5’端位点添加BamH I，Xho I，和Sal I识别序列制备igkc4ATGGATCCTCGAGTCGACTGGATTTCAGGGCAACTAAACATT(SEQ IDNO37)。用25ng含有小鼠恒定区和铰链区的pBluescript SK II(+)的克隆(WO00/10383)作为模板进行PCR。将PCR产物用限制酶EcoR I和BamH I消化，并连接到已经用限制酶EcoR I和BamH I预消化的pIgCκA载体(见上面)中。所得到的质粒pIgCκAB含有源自小鼠免疫球蛋白恒定区的特定cDNA片段1和2，且在EcoR I和BamH I之间区域没有核苷酸序列取代。
图5D嘌呤霉素基因插入pIgCκAB 将Lox-P Puro质粒(WO00/10383)用限制酶EcoR I和Xho I消化并用T4DNA聚合酶处理。将所得片段连接到用限制酶Sal I预消化并用T4DNA聚合酶处理的pIgCκAB载体(见上面)中。验证pIgCκAB和Lox-P Puro片段间的连接区域后，获得质粒pIgCκABP。
图5E IRES cDNA插入pIgCκABP 根据pIREShyg质粒(Clontech)的IRES区序列合成用于PCR的下列正向(iresfw；SEQ ID NO38)和反向(iresrv；SEQ ID NO39)引物。通过向5’端位点添加EcoR I识别序列制备iresfwATGAATTCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTA(SEQID NO38)，并且通过向5’端位点添加EcoR I和Sal I识别序列制备iresrvATGAATTCGTCGACTTGTGGCAAGCTTATCATCGTGTT(SEQID NO39)。用150ng pIREShyg质粒(Clontech)作为模板进行PCR。将PCR产物用限制酶EcoR I消化，并连接到已经预先用限制酶EcoR I消化的pGEM-T载体(Promega)中。获得了含有无核苷酸序列取代的特定cDNA序列的质粒IRES-Sal/PGEM。将IRES-Sal/PGEM质粒用限制酶EcoR I消化，并连接到已经预先用限制酶EcoR I消化的pIgCκABP质粒(见上面)中。验证pIgCκABP和IRES-Sal间连接区域的序列后，获得质粒pIgCκABP IRES。
图5F PΔCκSal质粒的构建 将IgCk KO载体(WO 00/10383)用限制酶SacII消化，然后用限制酶EcoRI部分消化。为了用Sal I限制位点取代LoxP-PGKPuro区，分离缺失LoxP-PGK Puro区域的14.6Kb带，并与SacII/EcoRI相容性接头连接，该接头为通过下列两个寡核苷酸(Sal 1正和Sal 1负)退火产生的。在序列验证后获得pΔCκSal质粒。
Sal 1正5′AGTCGACA3′(SEQ ID NO40)和 Sal 1负5′AATTTGTCGACTGC3′(SEQ ID NO41)。
图5G pKIκ质粒的构建 将pIgCκABP IRES质粒用限制酶XhoI消化，将所得的包括C区、IRES和LoxP-嘌呤霉素的片段与预先用限制酶SalI消化的PΔCκSal载体(见上面)连接。序列验证后，获得pKIκ质粒。
图5H pIgCκΔIRES片段的制备 将pIgCκABPIRES质粒用限制酶EcoRI和BglII部分消化，并分离所得的缺失IRES基因部分的pIgCκΔIRES片段。
图5I用PCR制备小鼠P2启动子片段 根据从GeneBank(giaj231225；SEQ ID NO42)获得的小鼠免疫球蛋白kappa启动子序列合成用于PCR的下列引物。
通过向5’端位点添加Hind III识别序列制备P2FCCCAAGCTTTGGTGATTATTCAGAGTAGTTTTAGATGAGTGCAT(SEQ IDNO43)，并且通过向5’端位点添加Sal I识别序列制备P2RACGCGTCGACTTTGTCTTTGAACTTTGGTCCCTAGCTAATTACTA(SEQID NO44)。使用25ng小鼠基因组DNA(来自TT2F ES细胞的基因组DNA)作为模板进行PCR。将PCR产物用限制酶Hind III和Sal I消化，并连接入已经用限制酶Hind III和Sal I预先消化的pBluescript II KS(-)载体中(Stratagene)。序列验证后，将所得质粒用限制酶Hind III和Sal I消化，并分离含有小鼠P2启动子片段的Hind III-Sal I片段。
图5J通过PCR制备部分CκPolyA片段 根据从GeneBank(giV00777)获得的小鼠免疫球蛋白kappa polyA区序列合成用于PCR的下列引物。通过在5’端位点添加Sal I、Fse I和Nhe I识别序列制备PPFACGCGTCGACGCGGCCGGCCGCGCTAGCAGACAAAGGTCCTGAGACGCCACCACCAGCTCCCC(SEQ ID NO45)，并通过在5’端位点添加Bgl II识别序列制备PPRGAAGATCTCAAGTGCAAAGACTCACTTTATTGAATATTTTCTG(SEQIDNO46)。使用25ng小鼠基因组DNA(来自TT2F ES细胞的基因组DNA)作为模板进行PCR。将PCR产物用限制酶Sal I和Bgl II消化，并连接到已经用限制酶Sal I和Bgl II预先消化的psp72载体中(Promega KK)。序列验证后，将纯化的质粒用限制酶Sal I和Bgl II消化以产生“部分CκPolyA片段”。
图5K通过PCR制备全长CκPolyA片段 根据从GeneBank(giV00777)获得的小鼠免疫球蛋白kappa polyA区序列合成用于PCR的下列引物。通过在5’端位点添加EcoR I识别序列制备TPFGGAATTCAGACAAAGGTCCTGAGACGCCACCACCAGCTCCCC(SEQ ID NO47)，并通过在5’端位点添加Hand III识别序列制备TPRCCCAAGCTTGCCTCCTCAAACCTACCATGGCCCAGAGAAATAAG(SEQID NO48)。使用25ng小鼠基因组DNA(来自TT2F ES细胞的基因组DNA)作为模板进行PCR。将PCR产物用限制酶EcoR I和Hand III消化，并连接到已经用限制酶EcoR I和Hand III预消化的pBluescript II KS-载体中(Stratagene)。序列验证后，将质粒用限制酶EcoR I和Hand III消化以产生“全长CκPolyA片段”。
图5L由全长CκPolyA片段、P2启动子片段、和部分CκPolyA片段组成的DNA片段A的构建 将如上面所述产生的“全长CκPolyA片段”、“P2启动子片段”、和“部分CκPolyA片段”按照所述顺序连接到已经预先用限制酶EcoR I和Bgl II消化的pBluescript II KS-载体中(Stratagene)。序列验证后，将纯化的质粒用限制酶EcoR I和Bgl II消化以产生“DNA片段A”。
图5M pIgCκΔIRES ProA质粒的构建 将“DNA片段A”连接到如上面描述分离的“pIgCκΔIRES片段”中。序列验证后获得质粒pIgCκΔIRES ProA。
图5N.CκP2 H质粒的构建 将pIgCκΔIRES ProA质粒用Xho I消化，并将因此分离的主要片段和预先用限制酶Sal I消化的pΔCκSal连接，其中所述主要片段含有小鼠IgCκ的上游基因组区、小鼠IgCκ、DNA片段A和Lox-P Puro。序列验证后获得质粒CκP2 H。
图5O.Cκ5’基因组质粒的构建 根据从GeneBank(giV00777)获得的含有小鼠免疫球蛋白kappa J和C区的DNA片段序列合成用于PCR的下列引物。通过在5’端位点添加Not I识别序列制备5GFATAAGAATGCGGCCGCCTCAGAGCAAATGGGTTCTACAGGCCTAACAACCT(SEQID NO49)，并通过在5’端位点添加EcoR I识别序列制备5GRCCGGAATTCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGG，(SEQID NO50)。使用25ng小鼠基因组DNA(来自TT2F ES细胞的基因组DNA作为模板)进行PCR。将PCR产物用限制酶Not I和EcoR I消化，并连接到已经用限制酶Not I和EcoR I预消化的pBluescript II KS-载体中(Stratagene)。序列验证后，获得Cκ5’基因组质粒。
图5P.CκP2 KIΔDT质粒的构建 将CκP2 H质粒用限制酶EcoR I和Xho I消化，获得11Kb片段，并连接到预先用限制酶EcoR I和Xho I消化的Cκ5’基因组质粒中。序列验证后获得CκP2 KIΔDT质粒。
图5Q.CκP2 KI载体的构建 使用限制酶Xho I和Kpn I将DT-A片段从pKIκ质粒分离，并连接到已经预先用限制酶Xho I和Kpn I消化的CκP2 KIΔDT质粒中。序列验证后，获得CκP2 KI载体。
图5R.GIPF-KI载体的组装 使用下列根据人GIPF cDNA序列(SEQ ID NO2)合成的PCR引物扩增GIPF cDNA片段。通过在5’端位点添加Sal I识别序列和Kozak序列制备SA3FACGCGTCGACCCACATGCGGCTTGGGCTGTGTGT(SEQ ID NO51)，并且通过在5’端位点添加Sal I识别序列制备SA3RACGCGTCGACGTCGACCTAGGCAGGCCCTG(SEQID NO52)。用Marathon-Ready cDNA库(胎儿皮肤和胎肺，BD Biosciences CLONTECH)作为模板进行PCR。将PCR产物用限制酶Sal I消化，并与已经用限制酶Sal I预消化的pBluescript II KS-载体(Stratagene)连接。序列验证后，获得了克隆，并证实含有正确的GIPF cDNA序列而没有核苷酸序列取代。将克隆用限制酶Sal I消化，将GIPF cDNA片段纯化并连接到已经预先用限制酶Sal I消化的CκP2 KI载体中。序列验证后，获得GIPF-KI载体(图5A)。
B.GIPF-KI转基因动物的生产 按照Aizawa Shinichi，″Biomanual Series 8，Gene Targeting″，Yodosha出版，1995描述的方法进行获取小鼠胚胎、培养、将ES细胞注射入胚胎、移植到代孕母亲子宫的一般程序。
按照Aizawa Shinichi，″Biomanual Series 8，Gene Targeting″，Yodosha出版，1995描述的方法，将GIPF-KI载体用Not I线性化并经电穿孔转移入C57BL/6X CBA F1源小鼠TT2F ES细胞((Uchida，1995)，Lifetech oriental)中。将电穿孔的ES细胞悬在20ml ES培养基中[DMEM(GIBCO)，18％胎牛血清(GIBCO)，0.1mM 2-巯基乙醇(GIBCO)，1000U/ml LIF(白血病抑制因子，CHEMICON International，Inc.)]，并接种在两个100mm的已经预先种有饲养细胞(Invitrogen)的组织培养塑料板(Corning)上。一天后，将培养基更换为含有0.75g/ml嘌呤霉素(Sigma)的培养基。此后7到9天，挑取形成的共119个克隆。将每个克隆在12孔板中长至汇合，然后将五分之四培养物悬在0.2ml冻存培养基中[ES培养基+10％DMSO(Sigma)]并冻存于-80℃。将余下的五分之一接种在明胶包被的12孔板中并培养2天。然后，用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra System)分离基因组DNA。将从嘌呤霉素抗性的TT2F细胞分离的基因组DNA用限制酶EcoR I(Takara Shuzo)消化，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。将分离的DNA片段转移到膜上(GeneScreen，NENTM Life Science Products)，然后用从IgJK-CK基因组DNA3′区(X720I-EcoR I，1.3Kb(SEQ ID NO67)WO 00/10383，实施例48)制备的DNA片段作为探针进行杂交。未杂交上的ES克隆的带型表现为一条分子量大约15Kb的带，而杂交上的ES克隆表现为分子量大约15Kb和13.4Kb的两条带(图6)。Southern分析后选择48个杂交上的ES克隆中的两个#10，12(同源重组率是大约4.2％)。也对选择的ES克隆进行核型分析，其按照Aizawa Shinichi，″Biomanual Series 8，Gene Targeting″，Yodosha出版，1995描述的方法进行。将表现正常核型的两个ES克隆#10，12用于向胚胎植入。
将冻存的杂交上的ES细胞克隆#10，12的细胞融化，开始培养并注射到从免疫球蛋白重链敲除小鼠种系的雄性和雌性小鼠交配获得的8个细胞阶段的胚胎(Tomizuka et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97722-727，2000)中；注射率为每个胚胎10-12个细胞。为使ES细胞发育成胚泡而将胚胎在培养基中培养过夜后，将大约10个TT2F细胞-注射的胚胎移植入代孕母亲ICR小鼠(CREA JAPAN，INC.)的每一侧子宫，其中已经将该小鼠进行2.5天的假孕处理。作为总计120个注射胚胎的移植结果，有24个子代小鼠出生。子代中嵌合性的判断通过在宿主胚胎(ICR)-源白化体外表颜色中TT2F细胞-源野灰色外表颜色(深棕色)的程度进行。全部24只子代中，认为11只小鼠(基因敲入鼠)有部分野灰色外表颜色，说明有ES细胞的作用。将从基因敲入鼠尾分离的基因组DNA用于PCR分析。用于PCR的下列2个引物根据GIPF-KI载体序列合成SACFCTGACTAGACTCTATCTTGC(SEQID NO53)，和SACRCCACGGAGACCACTCGCTCATT(SEQ NID NO54)。用25ng鼠尾基因组DNA作为模板进行PCR。将所得的反应溶液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测到606bp的带。将正常TT2F细胞克隆用作嵌合鼠产生的对照。
将鼠保持在12/12-小时黑暗/光照循环(在上午8:00光照)，并随意接受5μm过滤的水和CE-2食物(CLEA JAPAN，INC.)。断乳期后将雄性鼠单独饲养。
实施例5 用转基因GIPF-KI鼠评价GIPF的生物学活性 如下评价上面描述的转基因鼠小肠和结肠的大体病理改变和组织学改变。
证实GIPF转基因KI鼠在4周龄时开始小肠增大性生长和发育中明显的腹部膨胀。图7显示当与相应的对照KI鼠相比时，15周龄GIPF转基因KI鼠有明显的小肠扩张(intestinal distension)和增大的小肠质量(mass)。使用苏木精和伊红(H&E)染色(Issacson，P.G.，and Wright，D.H.，1983)对各种组织的石蜡包埋切片(5μm厚)进行组织病理学评价，包括肝，脾，肺，肾，心脏，小肠和大肠。小肠的H&E切片如图8(低倍)和图9(高倍)所示。IDEXX实验室提供组织病理学报告，并描述如下。
发现对照鼠和基因敲入小鼠组织之间组织学表现的唯一明显不同在小肠。该改变包括明显的粘膜弥漫性增厚，其由于有隐窝长度和分支复杂性明显增加的隐窝上皮增生。隐窝排列有丰满的柱状上皮细胞，其有嗜碱性的细胞质和位于基底部的有丝分裂易见的大的卵圆形异质性细胞核。许多凋亡小体散在于整个隐窝上皮，表明细胞倍增率升高。隐窝上皮通常也分化为潘氏细胞(paneth cell)和遍布隐窝长度的粘液-分泌性杯细胞。绒毛上皮没有明显改变。在淋巴集结(peyer’s patch)相关小肠粘膜中也观察到相似的改变。小肠粘膜以正常外观排列并可以形成向淋巴集结的淋巴组织的小凹。在GIPF-KI小鼠，在表面和小凹中也观察到增生性改变，在该处其与轻度急性炎症和隐窝内坏死细胞堆积，即隐窝微脓肿有关。所述淋巴集结被切向切片，因此难以评价淋巴组织的量和特点。但是，有少数意味着B-淋巴细胞转化成抗体-产生细胞的浆细胞。在小肠和其它组织中淋巴细胞或炎细胞群没有其它可见改变。
为测定KI小鼠中小肠上皮细胞增生，按照生产商的说明和以前描述的方法(Scholzen，T.et al.2000)，在对照和GIPF KI小鼠的小肠石蜡包埋切片上用单克隆的大鼠抗小鼠Ki67抗原(Dako Ltd.，High Wycombe，UK)进行免疫组织化学。如图10所示，证实GIPF KI小鼠小肠中Ki67阳性上皮细胞增加，表明通过GIPF蛋白表达使增生增强。
在12个月时收获3只GIPF KI小鼠。这些12个月龄小鼠表现典型的腹部膨胀和在更年轻动物中观察到的小肠体积增加。制备各种组织H&E切片，包括脾，肝，肾上腺，肾，胸腺，心脏，肺，小肠，大肠，胃和脑。
12个月龄GIPF-KI小鼠的小肠切片的组织学显示，GIPF已经诱导了明显的隐窝长度增加，并且达到相同于15周龄GIPF-KI动物中观察到的程度。此外，从其它器官切片的组织学分析显示，再延长12个月以后GIPF没有出现任何明显致瘤活性。有时观察到的某些小鼠的自发肿瘤形成与小鼠是正常的还是KI转基因动物无关。在12个月龄对照小鼠观察到低发生率的肝腺瘤。
实施例6 GIPF腺病毒载体 用多克隆位点(MCS)中的Nhe I和Xba I位点，将GIPF cDNA(SEQ IDNO2)克隆入pAdenoVatorCMV5-Intron以产生V5His6标签的GIPF重组腺病毒。通过修饰pAdenoVatorCMV5-IRES-GFP(Qbiogene，Carlsbad，CA，U.S.A)获得pAdenoVator-CMV5-Intron。将pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP用SpeI消化以去除其MCS、IRES和GFP，并与从cDNA/Intron载体PCR扩增的Intron-MCS-V5His-BGH polyA连接，其中PCR使用引物5′-CACCCCTAGGTCAATATTGGCCATTAGC-3′(SEQ ID NO55)和5′CACCCCT-AGGTAGGCATCCCCAGCATGC-3′(SEQ ID NO56)。
按照生产商的说明使用电穿孔进行线性化的转移载体向细菌细胞BJ5183(Qbiogene，Carlsbad，CA，U.S.A)的转化，该细胞携带编码腺病毒-5基因组(E1/E3删除)的AdEasy-1质粒。将重组腺病毒在QBI-293A细胞(Qbiogene，Carlsbad，CA，U.S.A)中生产和扩增，并通过以前描述的(Garnier，A.，J.Cote et al.1994)CsCl banding纯化。使用抗-V5抗体(Invitrogene Inc.，Carlsbad，CA)利用Western分析测定用重组腺病毒感染了的293A细胞中重组蛋白的表达。按照生产商的方法，使用Adeno-X快速滴定试剂盒(BDbiosciences，Palo Alto，U.S.A.)测定CsCl纯化的重组病毒的滴度。简言之，通过用系列稀释的重组腺病毒贮存物感染293A细胞，然后在感染后48小时固定并用小鼠抗-六邻体(hexon)抗体染色转导的细胞测定病毒贮存物。用偶联了辣根过氧化物酶的山羊抗-小鼠抗体检测信号并用金属增强的3，3’-二氨基联苯胺(DAB)显色。
实施例7 给予GIPF腺病毒作为模型评价GIPF的生物学活性 将GIPF重组腺病毒给予正常小鼠以判定GIPF对小肠和结肠上皮的作用，并确认在GIPF转基因鼠上观察到的表型可以在非转基因动物上建立。注射腺病毒前将6-8周龄BALB/C小鼠用异氟烷麻醉。将每只小鼠1×1010的病毒颗粒通过眶后静脉注射。将同样滴度的对照病毒(空病毒)或单独PBS用作对照。在病毒注射后3天或5天时将小鼠处死(对于所有组，n＝3)。处死前4小时，腹膜内注射(IP)1mg溴脱氧尿苷(BrdU)以判定体内上皮细胞的增殖。收集包括小肠、结肠、脾、肝和骨髓的各种组织，并固定于福尔马林中。将石蜡包埋的切片用苏木精和伊红(H&E)染色进行组织学评价。如以前描述(McKinley，J.N.et al.2000)的按照生产商(Oncogene Researchproduct，Boston，U.S.A.)的说明，也将切片进行对BrdU的免疫组织化学。如以前描述(Scholzen，T.et al.2000)的按照生产商的说明，也进行用单克隆大鼠抗小鼠Ki67抗原(Dako Ltd.，High Wycombe，UK)的免疫组织化学以评价小肠上皮细胞的增殖。
腺病毒注射后3天处死鼠小肠切片的H&E染色(图11)显示接受GIPF腺病毒小鼠的小肠改变明显，并展现出与GIPF转基因鼠中观察到的相同组织学特征(图8和9)。由GIPF引起的组织学改变包括粘膜明显的弥漫性增厚，其由于有隐窝长度和分支复杂性明显增加的隐窝上皮增生。隐窝排列有丰满的柱状上皮，其有嗜碱性的细胞质和位于基底部的有丝分裂易见的大的卵圆形异质性细胞核。隐窝上皮通常也分化为潘氏细胞和遍布隐窝长度的粘液-分泌性杯细胞。GIPF对隐窝上皮增生的影响在病毒注射后5天进一步增强，如图12所示。为评价GIPF对小肠上皮细胞增生的影响，在对照和接受GIPF腺病毒小鼠的小肠切片上进行BrdU掺入和Ki67免疫染色。如图13和14所示，接受GIPF腺病毒的小鼠有分别BrdU明显增多和Ki67阳性细胞的小肠隐窝。在每只鼠1×109病毒颗粒的低病毒剂量时也观察到GIPF对隐窝上皮细胞增殖的生物学作用(图15)。除了在小肠观察到的作用外，GIPF也诱导结肠中隐窝上皮增生，其有隐窝长度明显增加和杯状细胞数目和体积增加(图16)。
实施例8 编码GIPF和GIPF类似物的表达载体 用KpnI和XbaI位点将编码GIPF(SEQID NO3)的cDNA克隆到pcDNA/Intron载体中以产生野生型和羧基端V5His6-标签的GIPF(SEQ IDNO5)。通过导入设计的源自pCI哺乳动物表达载体(Promega，Madison，WI)的嵌合体内含子，将pcDNA3.1TOPO载体(Invitrogene Inc.，Carlsbad，CA)遗传修饰获得哺乳动物表达载体pcDNA/Intron。将pCI用BG1II和KpnI消化，并将内含子序列克隆到已经用BG1II和KpnI消化的pcDNA3.1中。通过PCR将SEQ ID NO2的GIPF读码框(SEQ ID NO3)首先克隆到pcDNA3.1V5His-TOPO(Invitrogen)中，其使用下列引物正向5′CACCATGCGGCTTGGGCTGTCTC3′(SEQID NO57)，反向5′GGCAGGCCCTGCAGATGTGAGTG3′(SEQID NO58)，然后将含有全部GIPF读码框的pcDNA 3.1/V5His-TOPO来源的KpnI-XbaI插入子连接到修饰的pcDNA/Intron载体中以产生pcDNA/Intron构建物。
如下生产全长GIPF蛋白的类似物。用引物5′-GATCAAGGGGAAACAGCAGAGGCGGATCAG-3′(SEQID NO59)和5′-CTGATCCGCCTCTGCTGTTTCCCCTTGATC-3′(SEQID NO60)进行定点诱变突变，来实现对预测的pcDNA/Intron中GIPF的共有弗林蛋白酶切割位点的突变(氨基酸28R/Q)。用stitching方法产生GIPF删除突变体(删除氨基酸残基21-31)(SEQID NO16)。使用引物set15′-CACCGCTAGCCTCGAGAATTCACGCGTG-3′(SEQ ID NO61)和磷酸5′-GCTGATGGTGAGGTGCGTC-3′(SEQID NO62)，set2磷酸5′-ATCAGTGCCGAGGGGAGCCAG-3′(SEQID NO63)和5′-GCCCTCTAGAGCGGCAGGCCCTGCAGATG-3′(SEQIID NO64)，用PCR扩增两个片段，随后将所述两个片段连接。将携带氨基酸21-31删除的GIPFcDNA分别使用SEQ ID NO61和64的正向和反向引物PCR扩增，用NheI和XbaI消化，并用其多克隆位点中NheI和XbaI位点亚克隆到pcDNA/Intron中。确认两种突变体的序列。
为了在哺乳动物表达，也将血小板反应蛋白(TSP)结构域(GIPF读码框的核苷酸451至核苷酸618(SEQ ID NO13)克隆到pcDNA/Intron载体中。用下列引物PCR扩增编码TSP结构域的cDNANheI正向引物CCGGCTAGCCACCATGGCGCAATGTGAAATGA(SEQ ID NO65)和NotI反向引物CCATGCGGCCGCCCTCCTCACTGTGCACCT(SEQID NO66)。将NheI和NotI限制酶消化的PCR产物连接到NheI和NotI消化的pcDNA/Intron载体中。为产生重组腺病毒，使用NheI和NotI限制酶将如上描述的PCR扩增来的TSP结构域克隆到pAdeno Vator-CMV5-Intron中。验证PCR-扩增的TSP结构域的序列。
在实施例19中描述缺失GIPF的弗林蛋白酶样富含半胱氨酸区的不同部分的其它类似物。
使用下面实施例中描述的方法，在体内和体外评价上面描述的GIPF类似物的生物学活性。用GIPF转基因模型评价GIPF类似物的生物学活性。
实施例9 重组GIPF的纯化 A.在真核细胞中GIPFt的表达和纯化 将V5-His标签GIPF(GIPFt)(SEQ ID NO5)在HEK293和CHO细胞中表达并如下纯化 将HEK293细胞的稳定细胞培养物生长在无血清293free-style培养基中(GIBCO)，其中所述HEK293细胞已经用包含编码V5-His-标签GIPF多肽(SEQID NO5)的DNA的GIPF pcDNA/Intron构建物转染。将悬浮培养物以细胞密度1百万细胞/毫升接种，并在4-6天后收获。用ELISA测定已经分泌到培养基中的V5-His标签GIPF的水平。
将CHO细胞的稳定培养物生长在无血清EX-CELL302培养基中(JRH)，其中所述CHO细胞已经用包含编码V5-His-标签GIPF(SEQID NO5)的核苷酸序列的pDEF 2S载体转化。表达载体含有编码DHFR的DNA序列，其中DHFR允许在氨甲喋呤(MTX)存在时阳性筛选和扩增。用ELISA测定已经分泌到培养基中的V5-His标签GIPF水平。
收获含有分泌的GIPF蛋白的培养基并冻存于-80℃。将培养基在4℃融化，并且为了防止GIPF降解，以每种物质终浓度1mM加入蛋白酶抑制剂，EDTA和Pefabloc(Roche，Basel，Switzerland)。将培养基通过0.22μm滤器(Corning)过滤，并用有10kDa分子量截留(cut-off)膜的TFF系统(PallFiltron)浓缩10倍。将浓缩的培养基缓冲液与20mM磷酸钠，0.5M NaCl，pH 7交换。纯化过程中，在磷酸盐缓冲液中加入0.5M NaCl对在纯化过程中pH 7时保持V5-His标签GIPF的完全溶解性是重要的。在超滤和透析过滤后，以最终稀释度1∶500(v/v)加入哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)。
将HiTrap Ni2+-鳌合亲和柱(Pharmacia)用20mM磷酸钠盐，pH 7，0.5MNaCl平衡。将缓冲液交换的培养基用0.22μmPES滤器过滤并装载到Ni2+-鳌合亲和柱上。将Ni2+柱用10倍柱体积(CV)的20mM咪唑洗涤10个柱体积，并且用超过35CV的梯度20mM至300mM的咪唑将蛋白洗脱。用SDS-PAGE和Western印迹分析级分。将含有V5-His标签GIPF的级分分析并混合以生产纯度在75-80％之间的GIPF蛋白溶液。
将用Ni2+柱分离的含有GIPF蛋白的缓冲液与20mM磷酸钠，0.3M精氨酸，pH 7交换以去除NaCl。在随后的纯化步骤中，在磷酸盐缓冲液中用0.3M精氨酸置换了NaCl以维持V5-His加标签GIPF蛋白的完全溶解性。将用Ni2+柱分离的GIPF蛋白装载到已经用20mM磷酸钠，0.3M精氨酸，pH 7平衡过的SP琼脂糖凝胶高效阳离子交换柱上(Pharmacia，Piscataway，NJ)。将柱用0.1M NaCl洗涤8CV，用超过30CV的梯度0.1M至1M NaCl洗脱。将含有V5-His标签GIPF的级分混合以生产纯度在90-95％之间的GIPF蛋白溶液。
将混合的级分缓冲液与20mM磷酸钠，pH 7，0.15M NaCl交换，将蛋白浓缩至1或2mg/ml，并通过无菌0.22μm滤器。将纯的GIPF制备物贮存于-80℃。
用ELISA、蛋白Bradford测定和HPLC分析并定量每个纯化步骤末获得的蛋白产量。在纯化过程的每一步判定GIPFt蛋白的回收率，并表示于下面的表2中。
表2 在还原和非还原条件下进行纯化的GIPF蛋白的SDS-PAGE分析，并且显示源自CHO和293细胞的V5-His加标签GIPF蛋白都以单体存在。GIPF蛋白是糖基化的并且以分子量(MW)大约42kDa在非还原条件下SDS-PAGE上迁移。从CHO细胞纯化的GIPF蛋白和从HEK293细胞纯化的在分子量上有微小差别。这种差别可以用不同细胞类型中GIPF被糖基化的程度来解释。N-端序列分析显示HEK293细胞产生两种形式肽优势成熟型(dominantmature form)(SEQ ID NO10)，其相当于缺失信号序列的SEQ ID NO4的GIPF蛋白，和成熟型(SEQ ID NO12)，其相当于既缺少信号肽又缺少弗林蛋白酶切割序列的SEQ ID NO4的GIPF蛋白。在SP柱上，两种形式分离良好，并以成熟型对优势成熟型大约1∶2的比例显示。
判定pH 7时NaCl和精氨酸(Arg)对GIPF蛋白溶解性的影响，表示于图17A。确定出在没有0.3M Arg时引起纯化期间蛋白的50％丢失。图17B显示纯化的蛋白在PBS(20mM磷酸钠，0.15M NaCl，pH 7)中的溶解性。浓度高达8mg/ml，4℃，pH 7时，GIPF蛋白在溶液中保持7天。
简言之，从HEK293或CHO细胞培养物进行V5-His-标签GIPF纯化通过1)浓缩和渗析存在于培养基中的GIPF蛋白，2)进行Ni2+-鳌合亲和层析，和3)SP阳离子交换层析。纯化方法生产＞90％纯度的GIPF蛋白。目前纯化方法的总回收率大约是50％。在培养基渗析和Ni-柱的纯化过程中向缓冲液中加入0.5M NaCl对保持pH 7时GIPF完全溶解是重要的。为将GIPF结合到SP柱上，去除NaCl，加入0.3M Arg以维持高的溶解性和提高蛋白回收率。在第一和第二纯化步骤中加入0.5M NaCl和0.3M Arg表现出总回收率至少从25％增加至50％。
如实施例10描述的条件，将V5-His加标签GIPF蛋白的优势成熟形式和成熟形式用于测试体内GIPF的生物学活性。通过本实施例方法纯化的蛋白始终如一地诱导小肠隐窝上皮细胞明显增生，这意味着接受纯化GIPF蛋白给药的小鼠的小肠扩张。
B.在真核细胞中GIPFwt的表达和纯化 以与描述的用于加标签GIPF蛋白相似的方式表达和纯化未加标签的、野生型GIPF蛋白(GIPFwt；SEQ ID NO4)。HEK293细胞的稳定细胞培养物适应于悬浮生长并且生长在有25μg/ml遗传霉素的无血清293free-style培养基(GIBCO)中，其中所述HEK293细胞已经用含有编码全长GIPF多肽(GIPFwt)(SEQ ID NO4)的DNA的pcDNA/Intron载体转染。
在旋转器中细胞培养生长对于在旋转器中小规模生产，将一份细胞冻存物在添加了0.5％胎牛血清(FBS)的293free-style培养基中生长并扩增。将细胞在旋转器中以每代0.3-0.5百万/毫升的细胞密度接种和扩增。当积累足够生产的细胞并且细胞密度达1百万/毫升时，将培养基与无血清293free-style培养基交换以去除0.5％FBS，并于6天后收获。起始细胞活力在80-90％，在收获时它降至30％。用ELISA和Western印迹测定已经分泌到培养基中的GIPFwt的水平。GIPFwt生长物在旋转器中产率为1.2-1.5mg/ml。
将在Bioreactors-Fed-batch模式中的细胞培养生长物用于生物反应器中的大规模生产。在细胞传代时，将HEK293细胞的适应无血清的悬浮培养物以0.2-0.4百万/毫升的细胞密度接种。将细胞生长在无血清293free-style培养基中，并且为接种2001和5001生物反应器从50-500ml摇动瓶扩增至20-50搅拌桶。当积累了足够的细胞时，将细胞以0.2-0.4百万细胞/ml的密度接种到生物反应器中。当细胞密度达到1百万细胞/ml时，加入维生素和MEM氨基酸(GIBCO)以促进和维持生长。6-7天后当细胞活力降至25-30％时，从生物反应器收获细胞。用ELISA和Western印迹测定已经分泌到培养基中的GIPFwt的水平。分泌的GIPF的Western分析显示没有蛋白降解发生。Western分析的进行使用纯化的抗-GIPF多克隆抗体，经ELISA的蛋白检测的进行使用纯化的鸡抗-GIPF多克隆抗体作为俘获抗体，兔抗-GIPF多克隆抗体作为检测抗体。针对完整蛋白制备兔和鸡多克隆抗体。GIPFwt生长物在生物反应器中产量为2.6-3mg/ml。
超滤-渗滤离心收获含有分泌的GIPFwt蛋白的培养基。加入蛋白酶抑制剂，1mM EDTA和0.2mM Pefabloc(Roche，Basel，Switzerland)以防止GIPF降解。将培养基通过0.22μm PES滤器(Corning)过滤，并用TFF系统(PallFiltron)或有10kDa分子量截留膜的中空纤维系统(Spectrum)浓缩10倍。将浓缩的培养基缓冲液与20mM磷酸钠，0.3M Arg，pH 7交换。纯化过程中，在磷酸盐缓冲液中加入0.3M Arg对保持pH 7时GIPFwt完全可溶是重要的。在超滤和渗滤后，以稀释度1∶500(v/v)加入哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)。
Q阴离子交换层析将阴离子交换Q琼脂糖凝胶HP柱(Amersham)用pH 7的含有0.3M Arg的20mM磷酸钠(NaP)缓冲液平衡。将10倍浓缩的并且缓冲液交换过的培养基用0.22μm PES滤器过滤并装载到Q琼脂糖凝胶柱上以结合杂质和核酸。
SP阳离子交换层析收集含有GIPFwt的Q-琼脂糖凝胶流出物并装载至结合GIPF蛋白的阳离子交换SP琼脂糖凝胶HP(Amersham)上。用15倍柱体积(CV)的20mM NaP，0.3M Arg，0.1M NaCl，pH 7洗涤SP琼脂糖凝胶柱，并用超过40倍柱体积的梯度0.1M至0.7M NaCl将GIPF洗脱。用SDS-PAGE和Western印迹分析级分。将含有GIPFwt的级分分析并混合。将混合的级分缓冲液与20mM磷酸钠，pH 7，0.15M NaCl交换。当用SDS凝胶的考马斯亮兰染色分析时，判定纯化蛋白的纯度是92-95％。将蛋白浓缩至1mg/ml，通过无菌0.22μm滤器过滤并贮存于-80℃。
用ELISA和Bradford测定定量纯化过程每个步骤末获得的蛋白产量，计算GIPF蛋白的回收率，并表示于表3中。
表3 用发色LAL(Limulus Amebocyte Lysate)测定试剂盒(Charles River)分析最终制剂的GIPF蛋白溶液的内毒素水平，并且判定为0.24EU每毫克GIPF。
C.在酵母中GIPFt的表达和纯化 从酵母培养物中表达和纯化GIPFt，并对比其与上面描述的从HEK293细胞培养物纯化的GIPFt的生物学活性。
将编码GIPFt(SEQ ID NO5)的核酸序列克隆到含有酵母α-因子分泌信号序列的Pichia表达载体pPICZαA中。将Pichia Pastoris野生型X-33株用来表达GIPFt。对于Pichia载体的使用，重组蛋白的表达和纯化的方法可以从Invitrogen Life Technologies(Carlsbad，CA，USA)得到，也描述于“PichiaProtocolsMethods in Molecular Biology”(D.R.Higgins and J.Creggeds.，TheHumana Press，Totowa，NJ1998))。
简言之，GIPFt的纯化使用SP阳离子交换层析，随后在IMAC Ni2+柱上亲和层析。将Ni2+柱用20mM咪唑洗涤，并用超过30倍柱体积的梯度20-300mM咪唑洗脱GIPF。纯化产物的SDS-PAGE展现大约50kDa的宽而弥散的蛋白条带，表明GIPFt被不同程度糖基化。体外和体内生物学活性分析分别如实施例17和20描述。
在Pichia Pastoris中表达的GIPFt蛋白诱导小鼠小肠上皮增生，稳定β-连环蛋白，虽然其程度比用HEK293细胞纯化的GIPF蛋白获得的差些(结果未显示)。
D.GIPF的小鼠直向同源物-mGIPFt的纯化 将编码人类GIPF的小鼠直向同源物的SEQ ID NO68克隆到pcDNA/Intron载体以表达V5-His标签的蛋白mGIPFt。将标签的小鼠蛋白在HEK293细胞表达，并按照上面描述的纯化人类GIPFt蛋白的方法纯化。将蛋白纯化成80％纯度，并在PBS中制备制剂。分析mGIPFt体内和体外生物学活性，表明具有与人类GIPF同样的增生特性(实施例20)。
E.纯化的重组GIPF的特征 在还原和非还原条件下进行纯化的GIPF蛋白(GIPFt和GIPFwt)的SDS-PAGE分析，并显示源自293细胞的V5-His标签的GIPF蛋白以单体存在。GIPFt和GIPFwt蛋白是糖基化的，在非还原条件下分别以大约42kDa和38kDa的分子量(MW)在SDS-PAGE上迁移。基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI)显示GIPFt和GIPFwt分别的分子量是37.8kDa和32.9kDa，而对于缺少信号肽的GIPFt和GIPFwt分子量分别是30.2kDa和26.8kDa。分子量的差异表明可能由于蛋白质的糖基化。随后，按照生产商的说明，使用N-和O-聚糖酶(Prozyme，San Leandro，CA，USA)进行N-连接和O-连接寡糖的完全去糖基化。去糖基化蛋白的SDS-PAGE分析导致分子量明显降低4-5kDa。当分别按照实施例17和20描述的在体外和体内测定时，去糖基化不影响GIPF的生物学活性。
蛋白质稳定性-为测定变性后GIPF的活性，将GIPF煮沸5分钟，并在冰上迅速冷却。体外(见实施例17)和体内(见实施例21)判定GIPF保留了全部活性。这些发现说明GIPF是一种稳定的蛋白。
半胱氨酸残基的帽化-进行半胱氨酸残基的还原和烷基化以取消GIPF的活性。在30mM DTT，pH 8中将GIPF 37℃保温1h获得GIPF(1mg/ml)的二硫键还原。随后，用20mM碘乙酰胺于37℃黑暗中保持30分钟将游离的巯基S-羧甲基化反应(Crestfield AM；Moore S；Stein W H.J.Biol.Chem.1963；238，622)。冷冻终止反应，用PBS透析去除过量的DTT和碘乙酰胺。既用体外也用体内测定分析加帽后的GIPF的生物学活性。GIPF的生物学活性被帽化所消除(见实施例17和20)。
N-端序列分析显示HEK293细胞产生或者GIPFt或者GIPFwt的两种形式多肽优势成熟型(SEQ ID NO10)，其相当于缺失信号序列的SEQ ID NO4的GIPF蛋白，和成熟型(SEQ ID NO12)，其相当于既缺少信号肽又缺少弗林蛋白酶切割序列的SEQ ID NO4的GIPF蛋白。在SP柱上，两种形式分离良好，并以成熟型对优势成熟型大约1∶2的比例表达。既然优势成熟型和成熟型GIPFt体内都诱导小肠隐窝上皮增生，将优势成熟型用于测试在实施例11，12，13，和14描述的疾病动物模型中GIPF的治疗作用。CHO细胞只表达GIPF的优势成熟型。
弗林蛋白酶断裂位点(Arg28-＞Gln)的诱变作用-为显示从HEK293细胞生产的成熟型GIPF是经弗林蛋白酶天然加工产生的，将弗林蛋白酶断裂位点的保守序列突变以致用Gln28-QRR取代Arg28-QRR。将突变蛋白(SEQ IDNO18)在HEK293细胞表达并按照用于GIPFt纯化的方法(实施例9A)纯化。纯化蛋白的N-末端序列证实在培养物中仅表达优势成熟型。这一发现证实成熟型的产生是经细胞内弗林蛋白酶活性的蛋白水解切割的结果。此外，纯化的优势成熟型的总回收率从50％增加至68％。
简言之，纯化过程产生＞90％纯的GIPFt蛋白，和92-95％纯的GIPFwt。使用任一种纯化过程的GIPF优势成熟型的总回收率大约是50％。但是，通过表达有突变的弗林蛋白酶断裂位点的蛋白可以增加产量。在培养基渗滤和Ni柱的纯化过程中，向缓冲液加入0.5M NaCl对于保持pH 7时GIPF的完全可溶是重要的。为了GIPF结合于SP柱，将NaCl去除，加入0.3M Arg以维持高溶解性和增加蛋白回收率。
将优势成熟型和成熟型的GIPFt和GIPFwt用于测试体内GIPF的生物学活性。通过本实施例方法纯化的蛋白始终如一地诱导小肠隐窝上皮细胞的明显增生，这是导致接受纯化GIPF蛋白给药的小鼠的小肠扩张的原因。
GIPF的生物学活性不受糖基化或煮沸的影响，但是被碘乙酰胺帽化半胱氨酸残基所消除。
实施例10 HEK293和CHO细胞表达的重组GIPF蛋白的体内生物学测试 如下在正常小鼠内评价源自HEK293和CHO细胞的GIPFt蛋白的体内生物学作用。
判断小鼠内重组GIPF V5His6-标签的蛋白(GIPFt)的药代动力学(PK)。将6-8周龄BALB/c小鼠经尾静脉单剂量注射或者40mg/KG GIPFt蛋白或者制剂缓冲液作为对照。在注射后0、30分钟、1小时、3小时、6小时和24小时放血，并用抗V5抗体(Invitrogene Inc.，Carlsbad，CA)经Western分析每个时间点血清蛋白水平(图18A)。图18A显示未检测到血清GIPF蛋白的明显降解。血清中GIPF蛋白半衰期的计算通过用Positope(InvitrogeneInc.，Carlsbad，CA)作为标准V5标签蛋白的注射后蛋白浓度的半对数曲线，并且估计为5.3小时(图18B)。
为研究是否纯化的重组GIPFt蛋白会产生相似于在GIPF基因敲入小鼠和已经用重组腺病毒注射的小鼠上观察到的表型，将6-8周龄BALB/c小鼠每天一次经尾静脉注射或者4mg/KG GIPFt蛋白或者制剂缓冲液作为对照，共7天。在第8天，末次注射后24小时将小鼠处死。处死前4小时，腹膜内注射1mg溴脱氧尿苷(BrdU)以判定体内GIPF的增殖活性。收集包括小肠、结肠、脾、肝和骨髓的各种组织，并固定于福尔马林中。将石蜡包埋的切片用苏木精和伊红(H&E)染色进行组织学评价。按照生产商(OncogeneResearch product，Boston，U.S.A.)的说明和以前描述(McKinley，J.N.et al.2000)的，也将切片进行处理以用于BrdU的免疫组织化学。在所有实验中，每组至少分析3只动物，并且实验至少重复2次。
胃肠切片的H&E染色显示，在接受GIPF的小鼠的观察到小肠和结肠(分别见图19和21)中小肠隐窝上皮细胞明显增生。这一结果与在转基因GIPF基因敲入小鼠和接受GIPF腺病毒(见上面的实施例)鼠中获得的结果一致。通过既测定小肠(图20)也测定结肠(图22)中BrdU的掺入证实GIPF蛋白的增生作用。
实施例11 GIPF对辐射诱导的黏膜炎的预防作用 在辐射诱导的黏膜炎动物模型上测试GIPF作为预防和治疗药物的效果。
使用48只成年雄性BDF1小鼠，年龄10-12周。在从供应商送货和实验前，将动物单独饲养在通风的笼子中2周，并且12小时昼夜循环以稳定生物节律。允许动物随意进食进水。
将动物分成8组，每组6只动物，如下处理 1.暴露于13戈瑞X-线(全身)前72、48和24小时用2mg/kg GIPF静脉注射； 2.暴露于13戈瑞X-线(全身)前72、48和24小时用5mg/kg GIPF静脉注射； 3.暴露于13戈瑞X-线(全身)前72、48和24小时用125μg KGF静脉注射； 4.暴露于13戈瑞X-线(全身)前72、48和24小时用盐水载体静脉注射； 5.未处理，非辐射对照； 6.暴露于13戈瑞X-线(全身)后24、48和72小时用2mg/kg GIPF静脉注射； 6.暴露于13戈瑞X-线(全身)后24、48和72小时用5mg/kg GIPF静脉注射； 6.暴露于13戈瑞X-线(全身)后24、48和72小时用盐水静脉注射。
所有的注射在15:00点给予。于15:00点用单剂量13戈瑞X-线辐射(以0.7戈瑞/分钟给予)诱导小肠损害。
辐射后4天将动物处死。取下小肠并在进行组织分析前固定于Carnoy’s固定液中。切成3μm厚横断切片，用苏木精和伊红染色。处死后也立即取十二指肠，中结肠，肝，肺，舌，脾，胃，和胰腺，并在贮存于70％酒精中之前在福尔马林盐水中固定过夜。
对于每只动物分析10个小肠圆周(circumferences)(每组60个)-圆周相当于小肠的给定长度，因此是方便的长度基线单位。计数每个圆周存活的隐窝数目并判断每组的平均值(表4)。只计数含10个或更多强H&E染色细胞(除外潘氏(Paneth)细胞)的隐窝和不含有淋巴集结的完整圆周。
为了纠正因隐窝大小差异的计算误差，也测量平均隐窝宽度(测量其最宽点)。如下进行校正
所有动物处理后存活并且未出现明显副作用。图23A-D显示下列组动物小肠的切片未处理组5(A)，盐水预处理组4(B)，KGF-处理组3(C)和GIPF-处理组2(D)。盐水处理组动物(组4)的组织切片中再生灶(有一个或多个克隆生成细胞的存活隐窝)清晰可见(图23B)。除了这些灶，间充质完全暴露，并且如果允许这些动物辐射后生存4天以上，它们发展成腹泻并死于黏膜炎。GIPF(图23D)以与KGF(图23C)的相同方式起到对小肠结构的保护。
表4 用GIPF预处理大大增加13戈瑞辐射后存活的隐窝数是相当明显的。用2mg/kg剂量的GIPF预处理(第1组)比未处理的第4组存活增加1.95倍(也称作保护因子)，并且用5mg/kg剂量的GIPF(第2组)进一步增加隐窝存活2.66倍。这非常好并且几乎赶上用已知最佳剂量KGF(第3组)处理所观察到的效果，其增加隐窝存活3.16倍。
因此，表明GIPF保护小肠上皮细胞不受辐射损伤的影响，并且可将其用作已经安排做放射治疗患者的有效预防药。
实施例12 化疗诱导的黏膜炎模型 在健康和荷瘤小鼠上评价重组人GIPF(GIPFwt)治疗化疗诱导的黏膜炎的效率。实验方法以Boushey等(Cancer Res 61687-693(2001))先前描述的为基础。
将1百万CT26鼠结肠癌细胞(ATCC，Manassas，VA，USA)皮下注射到同系雌性BALB/c小鼠，允许肿瘤生长5天。将健康的和荷瘤的动物分成实验组，每组6只，并进行下列处理 1.荷瘤鼠，从第1天到第5天腹膜内注射载体(50％DMSO)，从第0天到第7天静脉内注射盐水(TVS)； 2.荷瘤鼠，从第1天到第5天腹膜内注射载体(50％DMSO)，从第0天到第7天每天静脉内注射溶于100μl盐水的50μg GIPF(TVG)； 3.荷瘤鼠，从第1天到第5天腹膜内注射50mg/kg 5-FU，从第0天到第7天静脉内注射盐水(TDS)； 4.荷瘤鼠，从第1天到第5天腹膜内注射50mg/kg 5-FU，从第0天到第7天每天静脉内注射溶于100μl盐水的50μg GIPF(TDG)； 5.健康鼠，从第1天到第5天腹膜内注射50mg/kg 5-FU，从第0天到第7天静脉内注射盐水(NDS)； 6.健康鼠，从第1天到第5天腹膜内注射50mg/kg 5-FU，从第0天到第7天每天静脉内注射溶于100μl盐水的50μg GIPF(NDG)。
在第0、2、4、6和8天记录测量的动物体重，腹泻的严重度，和肿瘤的大小。腹泻的0-3级反映从0为正常到3为严重的相应症状严重性。体重的改变计算成与未处理组体重的百分比。用测径器测量肿瘤的长、宽和高，肿瘤体积计算成(长×宽×高)/2。
将所有动物在第8天时安乐死。切下大和小肠并称重，测量它们的长度，并记录中空肠的直径。切下距幽门大约14-15cm的一段(1cm)中空肠，切下距回盲连接大约4cm的一段(1cm)横结肠。将肠段用10％中性缓冲福尔马林灌流并固定以进行组织学分析。用ImagePro软件(Imagepro，Ltd.，Ashford，Middlesex，UK)在组织切片上进行粘膜的组织学检查和形态测量。
将GIPFwt对腹泻的严重性、体重和肿瘤大小的影响总结如下 腹泻评分(均数±标准差) 体重(％未处理组) 第3组TDS 2.83±0.4174.7±5.2 第4组TDG 0.33±0.5285.1±5.7 第5组NDS 3±0 73.2±4.3 第6组NDG 0.5±0.55 87.0±6.0 肿瘤体积(均数±标准差；mm3) 第1组TVS 95.8±8.1 第2组TVG 95.1±4.2 第3组TDS 21.8±3.0；p＜0.05 第4组TDG 16.7±8.6；p＜0.05 当与未接受GIPF的第5和3组的正常和荷瘤鼠的评分相比，GIPF显著降低第6和4组的健康和荷瘤鼠由5-FU引起腹泻的严重性。相似地，GIPF减轻由5-FU处理动物经历的体重降低。
未处理的荷瘤鼠(第1组)的肿瘤和GIPF处理的荷瘤鼠(第2组)的肿瘤大小相似。因此，GIPF不影响肿瘤生长。如所预料，5-FU减小第3组小鼠的肿瘤体积，并且也减小第4组小鼠的肿瘤体积。因此，GIPF不抑制5-FU减小肿瘤体积的活性(图24)。
GIPF对小肠大体表现的影响如图25所示，相应的测量的小肠直径、重量和长度列于表5。接受5-FU的正常和荷瘤小鼠的小肠萎缩(图25E)，并且观察到大量与出血相关的损害，而已经接受GIPF的小鼠小肠外观明显正常，并伴有由于GIPF对小肠上皮的增生作用引起的典型扩张(图25B，C，D，和F)。
表5 *p＜0.05(ANOVA，第2组对第1组) #p＜0.05(ANOVA，第4组对第3组) **p＜0.05(ANOVA，第6组对第4组) 所有实验组小肠和结肠的肠切片组织学分析显示，通过防止5-FU引起肠粘膜绒毛和隐窝间隔的大量破坏，GIPF保护了接受5-FU小鼠的肠结构(图26)。图26A显示5-FU对小肠的影响，图26B显示5-FU对结肠的影响。中空肠内绒毛高度和隐窝深度的显微形态测量确认GIPF的作用显著(图27)。
GIPF保护小肠和结肠免受5-FU的破坏作用，并且它不妨碍5-FU的治疗作用。因此，可以将GIPF用于化疗药物的联合以减轻抗肿瘤治疗的破坏性副作用。
实施例13 GIPF对化疗和辐射诱导的口腔黏膜炎的预防作用 用分别如实施例11和12描述的接受X-线照射或接受5-FU的小鼠研究GIPF对舌背侧(颊侧)和腹侧上皮增生的影响。
按照生产商的说明以前描述的方法(Scholzen，T.et al.2000)，使用单克隆的大鼠抗小鼠Ki67抗原(Dako Ltd.，High Wycombe，UK)在未照射和照射的小鼠(实施例11中第1，2和3组)的舌石蜡包埋切片上进行免疫组织化学。
当与未给予GIPF动物的相比时，GIPF明显增加照射动物腹侧和背侧舌上皮中Ki67染色的细胞核数目(图28和29)。上皮增生指数，其计算为Ki67染色阳性腹侧上皮细胞百分比，证实GIPF显著降低由辐射引起的腹侧舌上皮的细胞丢失(图30)。用5-FU处理动物(实施例12的第2-6组)的舌切片的组织学分析显示GIPF维持了已经用5-FU处理的正常和荷瘤动物背侧和腹侧上皮层的形态(图31)。
所有已经用GIPF处理动物的舌上皮层受5-FU的损害明显少于未接受GIPF实验动物的上皮层。
因此，可以将GIPF用作治疗和/或预防化疗和放射治疗诱导的口腔黏膜炎的治疗药物。当与其它细胞毒物质联合给予时，可以用口腔黏膜炎的定量动物模型(例如Wardly etal.，Arch Oral Biol 43567-577(1998)；Potten etal.，Cell Prolif 3532-47(2002))进一步研究GIPF的治疗特性，以进一步评价GIPF减少细胞消除(deletion)的严重性和增加口腔和肠上皮的上皮层再生率的潜在作用。
实施例14 GIPF对右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎的治疗作用 在右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导结肠炎的小鼠模型上测试重组人GIPF(GIPFwt)治疗结肠炎的效果，并与GLP-2的效果比较(L′Heureux andBrubaker J Pharmacol Exp Ther 306347-354(2003)；Kriegelstein et al.，J ClinInvest 1101773-1782(2002)；Siegmund et al.，J Pharmacol Exp Ther29699-105(2001))。
将6-8周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA，USA)饲养在通风的笼子中，适应1周12小时昼夜循环。将24只有相似体重(大约20g，＜5％差别)的小鼠饲养在4只笼子中并随意进食4％DSS(v/w)饮用溶液7天。
于第7天，记录每只动物的体重，如下面表6所示判断体重下降、粪便稠度和肛门出血的评分。
表6 将评分用于计算IBD活动指数(IBDAI)，该指数被用作结肠炎严重性的指示，并且计算为给出列表参数的评分平均数。每天判断体重下降，粪便稠度和直肠出血的评分，并在实验期间每天记录IBDAI。
在第7天，用1％(v/w)DSS溶液代替4％(v/w)DSS饮用溶液以维持疾病活动状态而不加重DSS的效果。选择一致的和相当的疾病状态的16只进食DSS动物，并分成4只一组进行如下处理 1.水，每天(上午10点)静脉注射盐水7天 2.DSS(1％)7天，每天(上午10点)静脉注射盐水7天 3.DSS(1％)7天，每天(上午10点)静脉注射100μg GIPF 7天 4.DSS(1％)7天，每天(上午10点)静脉注射50μg GIPF 7天 5.DSS(1％)7天，每天两次(上午10点和下午6点)皮下注射10μg GLP-27天。
用于这些实验中的GIPF蛋白是人重组GIPF蛋白(SEQ ID NO4；GIPFwt)，其按照实施例9中描述的方法表达和纯化。GLP-2的类似物，h[Gly2]GLP-2是合成的并购自Biosource International(Camarillo，CA，USA)。
在第14天，从笼中取走食物以允许肠排空，并将所有动物颈脱位处死。所有动物在处死前2小时注射4mg/0.1ml BrdU。切下大和小肠并称重，测量它们的长度，并记录中空肠的直径。切下距幽门大约14-15cm的一段(1cm)中空肠，切下距回盲连接大约4cm的一段(1cm)横结肠。将肠段用10％中性缓冲福尔马林灌流并固定以进行组织学分析。用ImagePro软件(Imagepro，Ltd.，Ashford，Middlesex，UK)在组织切片上进行粘膜的组织学检查和形态测量。实验组2-5小鼠的IBDAIs如图32所示，相应的体重下降、粪便稠度和直肠出血评分分别如图33、34和35所示。这些数据表明GIPF通过早在第11天减轻结肠炎的严重性而起到治疗作用。到第14天，GIPF处理的第3和4组小鼠比未处理的第2组小鼠(3.75)有明显低的IBDAI(分别为1.75和1.83)。GLP-2对结肠炎严重性起到中等作用，到第14天它降低DSS处理小鼠的IBDAI至3.25。
第1、2、3和5组小鼠肠和结肠大体病理的例子如图36所示。与对照组相比，接受DSS盐水的动物发展成通常与萎缩、充血和腹泻有关的严重结肠炎。用GIPF处理的动物的小肠和大肠显示出一些扩张，但与对照组的明显相似。这些发现表明可以将GIPF用作治疗炎症性肠疾病的有效治疗药物。而GLP-2起到一定治疗作用，这组的小和大肠似乎比对照组动物的损害稍轻。小和大肠测量反映出改变的显著性如下面表7所示。
表7 *p＜0.05(ANOVA，第2组对第1组) #p＜0.05(ANOVA，第3或4组对第2组) **p＜0.05(ANOVA，第5组对第2组) 石蜡包埋切片的H&E染色显示DSS引起小肠和结肠粘膜的大量炎性细胞浸润以及绒毛和隐窝间隔瓦解(图37)。与上面描述的大体病理观察一致，GIPF逆转DSS引起的作用，并重建肠隐窝和绒毛的结构。与对照组的相比，GIPF处理动物的隐窝扩大。虽然远远低于GIPF的水平，GLP-2起到一定的治疗作用(结果未显示)。绒毛和隐窝的显微形态学测量(图38)证实GIPF的疗效反映在被结肠炎严重破坏的绒毛高度和隐窝深度的明显重建。隐窝细胞的明显增生强调了(underscore)GIPF对粘膜结构的修复(图39和40)。隐窝增生指数，其计算为BrdU染色阳性隐窝细胞百分比，在接受GIPFwt的DSS处理小鼠明显高于注射盐水的DSS处理小鼠(P＜0.5)(图40)。
实施例15 大段肠切除后GIPF的治疗作用 在短肠综合征(SBS)的大鼠动物模型上测试GIPF增强大段肠切除的适应性反应的作用。已经描述了该动物模型用于研究肠营养物质作用(Scottet al.Am J PhysiolG911-G921(1998)；Helmrath et al.，J Am Coll Surg 183441-449(1996))，这里将实验方法引入以作参考。
将动物分成75％中空肠外科切除的切除组，肠切开并再吻合的假切除手术对照组，和非手术对照组。给予动物盐水或2mg/kg的GIPF。选择75％肠切除以使任何适应反应最大化，并且保留等量的近端空肠和远端回肠是以去除回肠末端对维生素B12和胆酸的特定吸收能力和回肠闸的营养并发症为基础。在大鼠，保留包括回肠远端部分的25％小肠足以允许切除的动物达到与对照动物相同生长速度。
实验期间评价消化道对切除和GIPF处理的代谢、形态学、组织学、和功能性反应，并也在第10天作为结束点分析。如描述的(Scott et al.，出处同上)评价食物摄取和生长，大体和显微镜下的小肠形态学，和粘膜吸收特性的功能评价。
GIPF明显增加食物消耗并减轻小肠切除常伴有的体重下降。GIPF也增加剩余肠的长度、直径、湿重、和粘膜湿重，并且增加剩余小肠的吸收能力。小肠横切面的H&E染色显示GIPF既延长绒毛高度也延长隐窝深度，并增加切除小肠的动物消化道中隐窝细胞增生。因此，GIPF通过增强肠适应性而减轻肠切除的效应。
实施例16 GIPF对肿瘤细胞增生的影响 在体内GIPF诱导对肠隐窝上皮细胞的强烈增生作用。为研究体外的增生作用，在体外测试重组GIPFwt对多种肿瘤和正常细胞系增殖的影响。通过测定3H-胸腺嘧啶掺入测定下列细胞系(ATCC)的细胞增殖速率 根据细胞系将细胞以每孔10,000-50,000个细胞接种，并用按比例剂量的GIPFwt(1.37-1000ng/ml)处理。将GIPF处理细胞的增殖率与未处理细胞的对比，或与生长在10％完全培养基(生长培养基，2.5％透析的胎牛血清，和青霉素/链霉素)中的细胞的对比。将细胞于37℃保温48小时，并在最后的20-24小时保温中用0.5μCi3H-胸腺嘧啶冲击。收获细胞，判断已经掺入的3H-胸腺嘧啶的量，从重复实验的平行双份样本判断结果。
GIPF不影响测试的大多数肿瘤细胞的增殖率。在IEC28、T84、HCT116和HT29细胞，只有较高剂量的GIPF诱导增殖率升高。增殖的程度低于未处理细胞速率的40％。
因此，这些发现表明GIPF不会加速体内存在的肿瘤的增殖速度，并且可将GIPF用于治疗患有因抗肿瘤治疗引起的黏膜炎的癌症患者。
实施例17 GIPF对细胞内信号的影响 wnt/β-连环蛋白信号通路在发育和稳态中起到枢纽作用。在小肠，已知wnt信号作为肠隐窝增生的调节者通过稳定β-连环蛋白起到关键作用，其之后诱导T-细胞因子(TCF)靶基因的反式激活(Wetering etal.，Cell 111241-250(2002)；Batle et al.，Cell，111251-263，(2002)；Perreault et al.，J Biol Chem 27643328-43333(2001)；Booth et al.，Nat Med81360-1361(2002))。
为评价GIPF对wnt/β-连环蛋白信号通路的影响，在多种培养的细胞系测定β-连环蛋白的稳定性。将细胞以每孔1百万个细胞接种于6孔板中，用添加了10％FBS的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基。第二天，将细胞生长在无血清培养基中，并用50ng/ml的GIPF或者10mM的LiCl2(阳性对照)在低血清条件下(0.1％FBS)处理。按照Haertel-Weismann等(J Biol Chem17532046-32051(2000))描述的制备细胞质部分。将蛋白用梯度(4-20％)SDS-PAGE分辨，β-连环蛋白的水平的评价使用β-连环蛋白的兔抗体(Abcam)，用辣根过氧化物酶偶联的第二抗体(Cell Signaling)显示。
在测试的细胞系中，GIPF以剂量依赖和时间相关方式诱导人内分泌的L细胞系(NCI-H716，结果未显示)，和HEK293细胞内β-连环蛋白的稳定(分别图41A和B)。与实施例18描述的发现一致，煮沸的GIPF不影响其稳定β-连环蛋白的能力，但是，该作用被蛋白酶K处理和被DTT还原所取消(图41C)。
为进一步研究GIPF导致β-连环蛋白堆积经由的信号通路，分析HEK293细胞中GSK3β的活性。在经典的wnt信号通路中，wnt通过抑制GSK3β激活β-连环蛋白，GSK3β另外磷酸化β-连环蛋白并将其标记以被蛋白体破坏。
GIPF以时间依赖的方式增加HEK293细胞中GSK3β的磷酸化(图42)。这些数据显示GIPF可以通过抑制β-连环蛋白被GSK3磷酸化而通过经典的wnt信号通路激活β-连环蛋白。但是，GIPF不诱导其它细胞系中β-连环蛋白的稳定，包括已经表明其中wnt3A对诱导β-连环蛋白激活具有有效作用的小鼠上皮细胞系C57MG。而且，Dickkopf-1(Dkk1)，Wnt信号通路的有效抑制剂(Kuhnert，PNAS 101266-271，2004)，不能完全抑制293细胞中GIPF对β-连环蛋白的稳定(结果未显示)。这些数据表明GIPF可能通过不同于已知的经典wnt/β-连环蛋白通路的途径稳定β-连环蛋白。
实施例18 GIPF对β-连环蛋白靶基因表达的影响 β-连环蛋白的堆积导致其转座至核内，在核里它与TCF/LEF家族的转录因子结合。由于它的反式激活能力，β-连环蛋白-转录因子-复合物结合于DNA并激活wnt靶基因。为进一步研究GIPF-诱导的β-连环蛋白信号，我们用定量PCR判断HEK293和NCI-H716细胞中下游靶基因的激活。
将1×106HEK-293细胞和2×106NCI-H716细胞(ATCC)接种于6-孔板并允许在完全培养基中贴附6小时。然后将细胞换成0.1％FBS测定培养基并保温过夜。测定当天，用额外的1ml测定培养基向细胞添加处理。将细胞用20mMLiCl(Sigma)，100ng/ml Wnt-3A(R&D Systems)，250ng/ml GIPFt或者250ng/ml加帽的GIPF蛋白于37℃/5％CO2保温8小时。包含维持在测定培养基中未处理孔的细胞作为基因表达的本底。用RNeasy Mini试剂盒和DNaseI试剂盒(Qiagen)从两类细胞分离总RNA，定量总RNA的性质和浓度。对每个样本，将4μg总RNA用3μg随机六聚体和2mM每种dNTP在70℃引导3分钟。将反应在冰上冷却1分钟。用5X M-MLV缓冲液(Promega)，25mM MgCl2，0.1M DTT和RNaseOut(Invitrogen)将反应体积加至22μl。一旦加入400单位M-MLV逆转录酶(Promega)，将反应在23℃保温10分钟，42℃50分钟，并在70℃5分钟以终止反应。然后将cDNA稀释并用1单位的RNaseH(Invitrogen)处理以消化剩余的RNA。OD260nm定量cDNA浓度。对每10μl定量SYBR Green PCR反应，使用2μl cDNA(440ng)，和每种1.25μM的正向和反向引物，以及2X SYBR Green mastermix(Eurogentec)。将反应重复进行三次。设计下列人类β-连环蛋白靶基因的定量PCR引物Axin-2(SEQ ID NOs70和71)，CD44(SEQ ID NOs 72和73)，EpherinB2(SEQ ID NOs74和75)，c-myc(SEQ ID NOs76和77)，胰高糖素原(SEQ ID NOs78和79)，和Cox-2(SEQ ID NOs80和81)。将人EF1(SEQ ID NOs82和83)用作管家基因以标准化表达水平。
GIPF增加HEK293和NCI-H716细胞中Axin-2的表达，并引起CD44和EphrinB2上调至远远高于用wnt3A或锂刺激所致的水平。Cox-2，c-myc和胰高糖素原基因的表达水平不受GIPF的影响(结果未显示)。
这些数据提供了参与GIPF诱导靶基因激活的机制的线索。进行进一步的研究以阐明GIPF信号的下游事件。
实施例19 GIPF活性的体外测定 将11个GIPF的删除突变体(SEQ ID NOs84，86，88，90，92，94，96，98，100，102和104)亚克隆到pIntron/IgK载体中，并在HEK293细胞中瞬时表达。所编码的在全长GIPF多肽中每个多肽片段(SEQ ID NOs85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105和178)的位置如图43所示。通过导入源自pCI哺乳动物表达载体(Promega，Madison，WI)的工程嵌合内含子，将pSectag载体(Invitrogene Inc.，Carlsbad，CA)遗传修饰获得哺乳动物表达载体pIntron/IgK。将pcDNA/Intron载体用BG1II和NheI消化，并将内含子序列克隆到已经用BG1II和NheI消化的pSectag中。用于扩增和亚克隆相当于SEQ ID NOs106-119的多核苷酸片段的正向和反向引物如序列表所示。将SEQ ID NO106的正向引物和片段1-7的反向引物一起使用(引物SEQ IDNOs107-113)；将SEQ ID NO114的正向引物和片段8-10(SEQ ID NOs115-117)的反向引物一起使用。
将多肽片段瞬时表达在HEK293细胞中并如实施例17描述的测定片段稳定β-连环蛋白的活性。与其它测试的片段相比，SEQ ID NO91的多肽片段诱导了最稳定的β-连环蛋白。这一发现表明GIPF的弗林蛋白酶样富含半胱氨酸结构域可能对介导GIPF增生活性是必需的。但是，SEQ ID NO91的多肽的活性低于全长GIPF(图44)。因此，要使β-连环蛋白最大程度稳定成为可能，GIPF的其它部分是必需的。
实施例20 重组GIPF活性的快速体内测定 开发快速体内测定以检测纯化的GIPF的生物活性。在已经分组并如下处理的小鼠上测试人和小鼠GIPF(GIPFwt和mGIPFt)的活性 1.盐水，静脉注射 2.GIPFwt，100μg静脉注射 3.GIPFwt，50μg静脉注射 4.mGIPFt，100μg静脉注射 5.mGIPFt，50μg静脉注射 6.GIPFwt，煮沸的，100μg静脉注射 7.GIPFwt，加帽的，100μg静脉注射 8.GIPFwt，100μg皮下注射 实验中使用24只雌性BALB/c小鼠。每天1次注射GIPF共3天。在第4天将动物处死。处死前，收集0.5ml血液进行血液学分析，并于处死前2小时，将所有动物腹膜内注射0.4ml的1mg/ml BrdU溶液。如上面描述的将小肠和结肠切下并测量，并且按前面实施例描述的将中空肠和结肠段进行组织学分析。
结果如图45所示。接受小鼠GIPF蛋白的小鼠的小肠扩张与接受人GIPFwt的相似。此外，接受GIPFwt皮下给药的小鼠的肠表型与接受GIPFwt静脉途径给药者相似。如以前所述，GIPFwt的煮沸不影响其引起肠扩张(distension)的能力。这些发现与所有动物组的肠长度、重量、和直径的测量一致(表8)。
表8 *P＜0.05(ANOVA，第1-8组对第1组) 动物的所有血液学结果在正常范围内，因此表明GIPF不产生任何直接不良反应。GIPFwt和mGIPFt对绒毛高度和隐窝深度的影响显示在3日治疗后GIPF明显增加健康小鼠的隐窝深度。与GIPF增加患病动物小肠肠绒毛高度的作用相反，GIPF不影响正常的，健康动物的绒毛高度(图46)。
这些数据显示人重组GIPF的增生作用不是异位作用的结果。此外，无论静脉内还是皮下给药GIPF都发挥其生物学活性。
实施例21 在分离的隐窝细胞上体外测定GIPF的活性 按照Fujimoteo等(Fujimoto et al.，Gastroenterology 117858-865(2002))的方法，在分离的小鼠结肠隐窝细胞上测定GIPF对隐窝上皮细胞信号传导和增殖的影响。
将结肠从小鼠上切下并用0.04％次氯酸钠溶液灭菌15分钟。用PBS冲洗后，将结肠在DTT/EDTA溶液(含0.5mM DTT，3mM EDTA的PBS)中于室温保温90分钟。保温后，将组织在PBS中洗涤一次并加入10ml PBS。将管子用力震荡以从粘膜下分离隐窝。将含有隐窝的PBS转移到离心管中并重复震荡直到隐窝产量减少。将隐窝轻轻离心(400转/分，5分钟)并用新鲜PBS洗涤。将隐窝重悬于20ml 0.3％胰酶制剂(Sigma)的PBS中，并于室温保温90分钟，其中前30分钟每10分钟摇动一次，此后每30分钟摇动一次。保温结束时，加入等体积PBS并于1000转/分离心5分钟，再用EDTA/DTT溶液洗涤1-2次直到所有粘膜被去除。将隐窝细胞重悬于1×培养基中(RPMI 1640，添加了5％FCS，谷氨酰胺，碳酸氢钠，胰岛素，转铁蛋白，硒，青霉素/链霉素)。先用连有注射器的21G针头然后用23G针头将细胞团打散。将细胞计数并用于以下测定β-连环蛋白的稳定性，通过3H-胸腺嘧啶掺入判断增殖活性，和用于测定GIPF影响隐窝细胞克隆形成的能力。
A.在隐窝细胞上研究体内GIPF对β-连环蛋白活性的影响，其中从如上所述用100μg GIPFwt静脉注射后6小时的BALB/c小鼠分离隐窝细胞。
如图47所示，当与从对照鼠隐窝细胞观察到的相比，GIPFwt诱导分离的隐窝细胞胞质中β-连环蛋白的明显稳定。图47A表示未磷酸化的活性β-连环蛋白水平，图47B显示存在于细胞质中的总β-连环蛋白水平。用购自Upstate(Waltham，MA，USA)的β-连环蛋白抗体识别未磷酸化的β-连环蛋白，而用购自Abcam(Cambridge，MA，USA)的抗体测定总β-连环蛋白的水平，该抗体既识别磷酸化的也识别未磷酸化的蛋白。这一结果显示GIPF诱导的小鼠隐窝上皮细胞增生可能由β-连环蛋白信号介导。
B.用3H-胸腺嘧啶掺入体外测定GIPFwt对分离的隐窝细胞增殖的影响。结果显示GIPFwt蛋白以剂量依赖的方式增强分离的隐窝细胞的增殖。
因此，GIPF通过稳定β-连环蛋白诱导分离的隐窝细胞增殖，而且可以将分离的肠细胞用于阐明支持GIPF增殖作用的信号通路。
C.进行Whitehead等(Whitehead et al.Gastroenterology，117858-865(1999))描述的克隆形成测定以研究GIPF控制肠粘膜增殖和/或分化的能力。简言之，将含有1％琼脂和含10％FBS的2×RPMI培养基等量混合加至35mm平皿中形成底层。以每毫升50,000个细胞将分离的克隆的隐窝细胞加至上层培养基(等量的0.8％琼脂糖和加有10％FBS的2X RPMI培养基)，每孔分装2ml细胞悬液。将板在有50，100，和200ng/ml GIPF情况下于37℃保温3-4周。保温后，检查板并计数克隆数。定义克隆是多于40个细胞的团。
GIPF刺激克隆形成。将克隆形成测定用于体外测试GIPF和GIPF类似物的增殖活性。
实施例22 GIPF对TNBS-诱导的结肠炎的影响 半抗原物质2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导慢性结肠炎，其特征是与腹泻、直肠脱垂和体重下降有关的严重透壁性炎症。这些临床和组织病理学特点表明TNBS诱导的结肠炎类似于人克罗恩氏病的特征(Neurath et al.，JExp Med 1821281-1290(1995))。
在用TNBS诱导结肠炎的小鼠上测试GIPF的治疗效果。如Neurath等所述(出处同上)，通过单次直肠给予1mg TNBS在6-8周龄雌性BALB/c小鼠(第2组)上诱导肠炎症。对照组动物(第1组)接受单独载体(45％乙醇)的直肠给药。通过向已经接受TNBS 3天的动物每天一次皮下给予剂量100μg(第3组)或50μg(第4组)的hGIPF(4mg/kg或2mg/kg)测试hGIPF的治疗作用。7天后将小鼠处死，评价TNBS对结肠炎的诱导。hGIPF明显减弱TNBS在第2组动物上诱导的体重下降(图48)。hGIPF也减轻TNBS处理的第2组动物所患的严重腹泻、结肠溃疡、出血和萎缩的严重性(结果未显示)。
用对照组和TNBS组结肠的石蜡包埋切片的H&E染色评价组织学改变。hGIPF减弱TNBS诱导的小鼠结肠粘膜透壁性浸润和粘膜隐窝结构破坏(图49)。图49的柱状图代表用如下的结肠炎组织分级判断的hGIPF的效果 此外，hGIPF减弱TNBS诱导的小鼠结肠中作为中性粒细胞标志的髓过氧化物酶的增加。相对于未用GIPF处理的动物，GIPF处理明显减轻TNBS诱导的腹泻，炎症和结肠壁的增厚，以及杯状细胞的丢失。因此，可以将GIPF用作有效的治疗剂来治疗患克罗恩氏病的患者。
实施例23 GIPF对慢性的右旋糖酐硫酸钠诱导的小鼠结肠炎的治疗作用 在慢性的右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导结肠炎的小鼠模型(L′Heureux andBrubaker J Pharmacol Exp Ther 306347-354(2003)；Kriegelstein et al.，J ClinInvest 1101773-1782(2002)；Siegmund et al.，J Pharmacol Exp Ther29699-105(2001))上测试重组人GIPF(GIPFwt)治疗结肠炎的效果。
将6-8周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA，USA)饲养在通风的笼子中，适应1周12小时昼夜循环。从第0天至第7天在饮用水中喂给小鼠4％DSS(v/w)以诱导结肠炎。从第7天到第21天，给予小鼠无DSS的水以诱导第一缓解期。从第21天到第28天，再次给予小鼠4％DSS以诱导第一复发期。从第28天到第35天，再次给予小鼠无DSS的水以诱导第二缓解期。在第35天，将小鼠随机分组并在第35天开始GIPF治疗直到第42天。从第35天到第42天每天监测小鼠疾病活动的表现。在第42天，结束实验，将小鼠处死并收集肠组织以分析。
GIPF以剂量依赖的方式明显减轻DSS-诱导的小鼠结肠炎，其反映在明显降低炎症性肠疾病活性指数(inflammatory bowel disease activity index)(IBDAI)(图50*P＜0.05(ANOVA，DSS/盐水对DSS/hGIPF组)；#P＜0.05(ANOVA，DSS/盐水DSS/KGF)；**P＜0.05(ANOVA，DSS/盐水对DSS/GLP-2))。在实施例14中给出了IBDAI的定义。小肠和结肠的H&E染色切片显示hGIPF预防了DSS-诱导的小鼠肠粘膜破坏，并逆转了DSS-诱导的绒毛高度和隐窝深度缩短(图51)。GIPF也消除了DSS对小肠隐窝细胞增殖的抑制作用(图52；*P＜0.05(ANOVA，DSS/盐水对水/盐水)；#P＜0.05(ANOVA，DSS/hGIPF对DSS/盐水)**P＜0.05(ANOVA，DSS/KGF对DSS/盐水)；##P＜0.05(ANOVA，DSS/GLP-2对DSS/盐水))。在实施例14中定义了隐窝增殖指数。
简言之，GIPF的治疗性作用明显降低小鼠长期DSS-诱导的结肠炎，说明GIPF可能是治疗人炎症性肠疾病的非常有用的疗法。
实施例24 hGIPF减轻5-氟尿嘧啶诱导的毒性 在正常BDF-1小鼠上评价hGIPF减轻5-氟尿嘧啶的胃肠毒性的效果。
将小鼠分成以下组 1)注射载体加盐水处理 2)5-FU注射加盐水处理 3)5-FU注射加GIPF处理 在第3天开始，每天皮下注射给予11-13周龄的雌性BDF-1小鼠或者盐水或者每剂100μg的hGIPF。从第0天到第4天，连续4天给每只鼠腹膜内注射剂量50mg/kg的5-FU。每天监测小鼠体重，腹泻的发生，和死亡率。
GIPF处理明显降低5-FU诱导的胃肠毒性，包括减少最大体重下降，腹泻评分，和死亡率(表9)，因此说明在小鼠上GIPF有效降低化疗诱导的胃肠毒性。
表9 *P＜0.05(ANOVA，5-FU/hGIPF，5-FU/KGF或5-FU/GLP-2对5-FU/盐水) 实施例25 非人类灵长类体内GIPF的活性 在短尾猴上进行GIPF活性的重复剂量研究以判断在非人类灵长类中GIPF的活性。
由SNBL USA(Everett，Washington，USA)的兽医人员或兽医技术人员对9只雌性

猴进行健康筛选，并进行血液学和血清化学筛选。确认是健康的9只动物中，选择了8只并分给研究组。在开始研究前，将以前检疫的动物在有SNBL USA设施的研究室顺应至少14天。
方法按照下面表格规划的将8只雌性分成4个处理组并经静脉内快速浓注GIPF蛋白给药，每天1次进行3天。在第4天，于尸检前大约4小时给予所有动物一次静脉内推注溴脱氧尿苷(BrdU)(50mg/kg)。尸检时收集选择的组织。
研究设计 观察和检测在顺应期间和实验全程如下进行临床观察。从顺应期开始到生命结束为止，每天一次在早晨进行死亡率和粪便检查，每天一次在下午进行一般健康和外表的临床观察。如果需要，还可进行额外的临床观察并记录。如果临床观察显示衰落的情况(declining condition)，兽医人员或兽医技术人员评价每只动物并报告实验负责人。
血液标本收集；在顺应期收集一次和在尸检当天于给予BrdU前收集一次血液以进行血液学和血清化学。
大体病理检查尸检时，检查身体外表面，所有孔，和颅腔，胸腔，腹腔及其内容物。肉眼进行器官重量和组织病理学检查，收集并用10％中性缓冲福尔马林固定进行组织病理学检查。检查的组织列在下面。
通过使用BrdU免疫组织化学的组织增生测定为BrdU测定制备石蜡包埋的切片。
结果尸检时大体病理检查发现检查的器官没有明显改变，表明在这一治疗方案中没有hGIPF的急性毒性。此外，在对hGIPF处理前和后收集的血液标本血液学和血清化学证明血液细胞成分以及测试的血清生化参数没有改变。
在小肠长度上显示剂量相关的增加。第1，2，3和4组平均肠长度(cm)分别是120.65，122.555，133.350和142.875。此外，如下面表中总结的(表10)，各种组织的组织学显微镜下评价证实在所有GIPF处理组中，十二指肠，空肠和回肠的隐窝增生。在盲肠，结肠和直肠也观察到剂量相关方式的隐窝增生。这一结果表明hGIPF对猴的肠隐窝上皮细胞具有增殖作用，这与在小鼠和大鼠上观察到的一致。
为确认hGIPF的增殖作用，进行免疫组织化学检测以分析在小肠和大肠中BrdU的掺入。在小肠和结肠hGIPF都增加BrdU阳性增生指数。
这些发现显示在非人类灵长类中，hGIPF增加隐窝上皮的增生。
各个组织病理学发现 分级 _无异常改变 ±很轻 +轻度 2+中度 3+明显 表10 在雌性短尾猴上的各个组织病理学发现 实施例26 用放射活性标记的125I-HGIPF蛋白的吸收分布代谢排泄(ADME)研究 研究目的判定小鼠内[125I]-hGIPF的血浆药代动力学和组织分布。
蛋白标记用IODO-GEN标记方法(Amersham)将hGIPF蛋白用[125I]标记。标记时最初的特异活性是35uCi/ug(1020Ci/mmol)。在给小鼠注射前将标记的蛋白进一步纯化。
动物在注射前使雄性CD-1_[Crl:CD-1_(ICR)BR小鼠顺应环境7天，并单独饲养在悬挂的洁净铁丝笼中。将笼子提升到笼架子之上或其它合适的物质上，每周至少改变3次。以1.67mg/kg的剂量给予每只小鼠含有3μCi125I-hGIPF蛋白的hGIPF。接受放射性标记的剂量后，将按时间表收集尿液和粪便的动物在代谢单元中单独饲养。
研究设计 将接受研究的所有动物用碘化钠处理以阻止甲状腺对源自标记受试物的游离碘化物的摄取。在给予放射标记蛋白前大约48，24和1小时口服(强饲法)给予0.1ml 1％NaI溶液。每只动物接受静脉注射给予的单次剂量的[125I]-hGIPF。将动物分成两组并如上面研究设计中列出的进行分析。在所示的安乐死的时间点，收集血液标本，并分离细胞级分和血浆以分析。收集肝，肾，肺，舌，脾，脑，食管，胃，小肠，大肠，和包括内容物的大肠的组织标本，判定在所述组织中[125I]-hGIPF的掺入。
按照WIL标准操作步骤在DPC GAMMA-C12多晶体γ计数仪上进行[125I]-hGIPF掺入的分析。γ计数的结果用同位素半衰期进行校正。按照WIL标准操作步骤，研究中产生的各种物质里放射活性量的计算使用WIL毒理学数据管理系统或表格程序(spreadsheet)进行。一般地，只使用描述统计学(例如，总计，算术均数，标准差，标准误，变异系数，百分比)。可能的话，用标准药代动力学方程计算标准药物动力学参数(例如，Cmax，tmax，AUC(曲线下面积)，T1/2(半衰期))。
结果表11-14显示了下列标本中[125I]-hGIPF浓度和动力学的数据小鼠血浆，红细胞，肝，肾，肺，心，脑，脾，食管，胃，小肠，和大肠。
表11 静脉给予1.67MG/KG后小鼠血浆和血红细胞中[125I]-hGIPF当量的浓度和动力学 末期动力学 (Log浓度对3-24小时时间的线性回归) N＝3除了24小时的N＝6。
表12 静脉给予1.67MG/KG后小鼠肝，肾，肺，心，脑，和脾中[125I]-hGIPF当量的浓度和动力学 末期动力学 (Log浓度对3-24小时时间的线性回归) N＝3除了24小时的 N＝6。
表13A和B 静脉给予1.67MG/KG后小鼠食管，胃，小肠，和大肠中[125I]-hGIPF当量的浓度和动力学 A B 末期动力学 (Log浓度对3-24小时时间的线性回归) **N＝3除了24小时的N＝6。
表14A和B 静脉给予1.67MG/KG 24小时后小鼠hGIPF当量的回收 A B 如所希望的，在高度灌注的组织例如肝，肾，脾和肺观察到最早Tmax和最大Cmax，并且在肾和肝观察到最长的半衰期(表11)。
胃肠道包括食管，胃和小肠的组织都表现延长的Tmax(表12)。表13A显示放射标记的hGIPF给药后24小时动物各种器官的组织和肠内容物，尿液，粪便和尸体中放射标记的hGIPF回收百分率。从各种器官组织的hGIPF回收列于表13B。数据显示静脉途径给药后，放射标记的hGIPF的分布通常在胃肠道器官高，因此说明hGIPF可能对胃肠组织有高亲和性。
实施例27 辐射诱导的黏膜炎最佳治疗方案的评价 本研究的目的是确定提供GIPF抗辐射诱导的黏膜炎最大预防效果的治疗方案。
成年雄性BDF-1小鼠在使用时为10-12周龄。将动物在12小时昼/夜循环饲养1周，并允许全程随机进食进水。将动物随机分成6组，每组5只(共30只小鼠)，进行如下处理 1.未处理，未辐射的对照。
2.在暴露于13Gy X-线全身照射)前3，2，1天静脉注射4mg/kg hGIPF。
3.在暴露于13Gy X-线全身照射)前4，3，2天静脉注射4mg/kg hGIPF。
4.在暴露于13Gy X-线全身照射)前5，4，3天静脉注射4mg/kg hGIPF。
5.在暴露于13Gy X-线全身照射)前6，5，4天静脉注射4mg/kg hGIPF。
6.在暴露于13Gy X-线全身照射)前72，48，24小时静脉注射盐水。
将动物暴露于以2.7Gy/分钟发射的单剂量13Gy X-线的全身照射。
照射4天后将动物处死。处死前2小时，将所有动物注射体积0.4ml的4mg BrdU。解剖时，测量小肠和大肠的长度和重量，并将约1cm的小肠(中空肠)，结肠(横结肠)组织段，舌，食管和胃固定在10％福尔马林中。
分析小肠横切面的BrdU摄取。计数每个切片的存活隐窝数目并判定每组的平均数。只计数含10个或更多个强H&E染色的细胞(除外Paneth细胞)的隐窝和不含有淋巴集结的完整切面。
为了校正因隐窝大小差异的计算误差，也测量平均隐窝宽度(测量其最宽点)。如下进行校正
结果暴露于辐射后hGIPF对隐窝存活的影响如图53所示。数据显示，当在全身照射前24小时或48小时给予hGIPF时，hGIPF明显减轻辐射诱导的肠黏膜炎(表15)。
这些发现证实可以将hGIPF用作预防药物以弥补辐射诱导的肠黏膜炎的不良作用，并且全身照射前24小时给药提供对肠隐窝的最大保护。
表15 *P＜0.05(ANOVA，13Gy/hGIPF对13Gy/盐水) 实施例28 小鼠小肠上细胞谱系依赖的增生测定 研究hGIPF对肠隐窝的影响以判定在形态学改变出现前hGIPF是否通过既影响隐窝干细胞也影响过渡型增生细胞，还是通过影响它们之一起作用。
将动物随机分成下列组 1.PBS(每组一只小鼠)注射后1，3，6，12，24或48小时 2.hGIPF(每组2只小鼠，100ug单次注射)注射后1，3，6，12，24或48小时 将每只动物在处死前2小时注射BrdU(4mg/kg)。对小肠的中空肠切片进行隐窝深度，隐窝增生指数和细胞位置的增生分析。通过单次注射hGIPF(100μg)后在所示的时间(3，6，12，24和48小时)通过BrdU免疫组织化学测定隐窝增生指数。分析2只小鼠的40个隐窝的BrdU掺入，结果表示为均值±标准差(*P＜0.01，ANOVA)。
结果如表16所示，hGIPF早在3小时增加小肠隐窝细胞的增生，并且增生在hGIPF处理后24小时达到顶峰。在48小时内hGIPF诱导的隐窝增生被逆转。此外，BrdU阳性细胞的位置分析(Potten et al.，Int J Exp Path78219-243(1997))证明在位置3-5(从干细胞存在的隐窝底部)以及隐窝的较上面的部分隐窝细胞的增生明显增加。
这些数据表明hGIPF既可以影响干细胞也影响正在分裂的过渡细胞群。
表16 实施例29 hGIPF对隐窝细胞分化和迁移的影响 用hGIPF处理小鼠后计数杯状细胞和潘氏细胞以判定是否hGIPF影响小肠内这些细胞类型的总数和分布。
进行阿新蓝(Alcian)染色以显示PBS和hGIPF处理小鼠(n＝3)的中空肠切片中杯状细胞。将动物每天注射hGIPF(100μg)或PBS 3或7天。为显示潘氏细胞(Paneth cell)，用抗溶菌酶抗体在同样动物中空肠切片上进行免疫组织化学(IHC)。
结果小肠的免疫组织化学分析和阿新蓝染色证明在hGIPF处理小鼠的小肠上潘氏细胞和杯状细胞数没有明显改变。hGIPF不影响分化的细胞沿隐窝/绒毛轴成熟和迁移。
实施例30 在肠上皮细胞表达hGIPF的转基因嵌合小鼠 1.小鼠绒毛蛋白基因启动子长片段的制备(图54A) 绒毛蛋白，发现于吸收组织的顶部刷状缘的肌动蛋白维管束蛋白(actinbundling protein)，是在胚胎肠内胚层中被转录激活的第一个结构基因。在成年，绒毛蛋白广泛表达于肠垂直轴(隐窝到绒毛尖)和水平轴(十二指肠到结肠)的肠上皮的每个细胞。Madison等证明小鼠绒毛基因的12.4kb区域趋动转基因鼠全部肠上皮中两种不同报道基因(LacZ和Cre重组酶)的高水平表达(J.Biol.Chem.277，p33275-33283，2002)。为产生在肠上皮表达人GIPF的转基因嵌合鼠，我们构建表达载体其中将GIPF cDNA连接于指导其在肠上皮表达的此转录调节序列。
从公共数据库(ensembl)获得小鼠绒毛基因的上游区域的核苷酸序列信息。将小鼠BAC(RP23-278N11；GenBank登录号AC098570)DNA用EcoRI和BamHI(Roche)消化，并进行0.8％琼脂糖凝胶电泳以分离大约11kb的片段。将pBluescriptIISK(-)(STRATAGENE)用EcoRI和BamHI(Roche)消化后，将载体片段用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离并用牛肠碱性磷酸酶处理以使其两端都去磷酸化。将上面大约11kb的DNA片段连接于去磷酸化的载体片段，并用连接混合物转染XL10-Gold Ultracompetenet细胞(STRATAGENE)。使用下面描述的引物(SEQ ID NO120和121)将从所得转化物制备的DNA样品进行PCR扩增。扩增片段的序列分析显示包括大约11.2kb的小鼠绒毛蛋白基因启动子片段(pPvil 11.2)。将pPvil 11.2用限制酶ClaI和BamHI消化，并将反应混合物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳以分离大约11.2kb的片段。
PvilEIBI-FW1(SEQ ID NO120)GATCAGCAGCTGGAACAAACACAG PvilEIBI-RV1(SEQ ID NO121)TGCACAATCAGTCAATCAACAGAGC (2)小鼠绒毛蛋白基因启动子短片段的制备(图54B) 以从公共数据库(ensembl)获得的小鼠绒毛基因上游区域的核苷酸序列为基础，合成两种合成的DNAs(SEQ ID NO122和123)。
PvilBI-FW(SEQ ID NO122)GGCGGATCCCTGAGTTGGAGGCCAGTTTGG PvilBI-NcoIXbaIRV(SEQ ID NO123)GCTCTAGACCATGGTGGACGAGCCTAGAGGAGAAGGCAT 将KOD-puls(TOYOBO)用于PCR反应。PCR反应混合物含有10pM的每种引物和小鼠BAC(RP23-278N11；GenBank登录号AC098570)DNA作为模板。用起始变性保温为94℃2分钟进行PCR扩增。然后通过94℃15秒和68℃2分钟的保温进行30循环的变性，退火和扩增。将PCR产物(大约1.9kb)用0.8％琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化。将分离的PCR产物用BamHI和XbaI消化后，将消化的片段用0.8％琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化。将纯化的片段连接于用XhoI和XbaI消化并用牛肠碱性磷酸酶处理以使其两端都去磷酸化的pBluescriptIISK(-)(STRATAGENE)。将连接混合物转染DH5α，并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。将包括正确核苷酸序列片段的克隆用NcoI消化。将消化的片段用Klenow片段(TAKARA BIO)消化处理以抹平其两端，将其进一步用XbaI消化并用0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化。将所得的片段用E.Coli C75碱性磷酸酶处理以将其两端去磷酸化。
(3)GIPF片段的制备(图54C) Hy01XhISphIFW(SEQ ID NO124)CCGCTCGAGGCATGCGGCTTGGGCTGTGTGTGGTGGCCCTG Hy01BgXb-RV(SEQ ID NO125)GCTCTAGAAGATCTCTAGGCAGGCCCTGCAGATGTGAGTGGCCC 将KOD-puls-(TOYOBO)用于PCR反应。PCR反应混合物含有10pM的每种引物(SEQ ID NO124和125)和GIPF cDNA作为模板。用起始变性保温为94℃3分钟进行PCR扩增。然后通过94℃15秒和68℃2分钟的保温进行30循环的变性，退火和扩增。将PCR产物(大约800kb)用0.8％琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化。将分离的PCR产物用XhoI和XbaI消化后，将其连接于用XhoI和XbaI消化并用牛肠碱性磷酸酶处理以使其两端都去磷酸化的pBluescriptIISK(-)。将连接混合物转染DH5α，并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。将包括正确核苷酸序列片段的克隆用SphI消化。将消化的片段用Blunting high(TOYOBO)消化处理以抹平其两端后，将其进一步用XbaI消化并用0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化。
(4)pPvil 2-01的构建(图54D) 将(3)中制备的GIPF片段连接于(2)中制备的pPvil2，并将连接混合物转染DH5α。并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。选择包括正确核苷酸序列片段的克隆(pPvil 2-01)。
(5)pIRES-GFP的制备(图54E) 用EcoRI和NotI消化pIRES2-EGFP(BD Bioscience Clontech)后，通过用0.8％琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化包括IRES-GFP区域的片段。将纯化的片段连接于用XhoI和XbaI消化并用牛肠碱性磷酸酶处理以使其两端都去磷酸化的pcDNA3(Invitrogen)。将连接混合物转染DH5α，并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。选择包括正确核苷酸序列片段的克隆(pIRES-GFP)。
(6)pUC119 IRES-GFP的构建(图54F) 用BamHI和XbaI消化pIRES-GFP后，通过用0.8％琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化包括IRES-GFP区域的片段。将纯化的片段(IRES-GFP)连接于用用BamHI和XbaI消化并用牛肠碱性磷酸酶处理以使其两端都去磷酸化的pUC119。将连接混合物转染DH5α，并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。选择包括正确核苷酸序列片段的克隆(pUC119 IRES-GFP)。
(7)pUC119 IRES-GFP+As的构建(图54G) 将通过下面描述的合成的寡核苷酸(SEQ ID NO126和127)退火制备的DNA连接于用EcoRI和BamHI消化并用牛肠碱性磷酸酶处理以使其两端都去磷酸化的pUC119 IRES-GFP。将连接混合物转染DH5α，并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。选择包括正确核苷酸序列片段的克隆(pUC119 IRES-GFP+As)。
EI-BIAscI-(BI)S(SEQ ID NO126)AATTCGGATCCGGCGCGCC EI-BIAscI-(BI)AS(SEQ ID NO127)GATCGGCGCGCCGGATCCG (8)pUC119 IRES-GFP+loxP的构建(图54H) 将通过下面描述的合成的寡核苷酸(SEQ ID NO128和129)退火制备的DNA连接于用NotI和XhoI消化并用牛肠碱性磷酸酶处理以使其两端都去磷酸化的pUC119 IRES-GFP+As。将连接混合物转染DH5α，并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。选择包括正确核苷酸序列片段的克隆(pUC119 IRES-GFP+loxP)。
Nt-PmloxP-XhS(SEQ ID NO128)GGCCGTTTAAACATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATC Nt-PmloxP-XhAS(SEQ ID NO129)TCGAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGTTTAAAC (9)牛生长激素(BGH)polyA片段的制备(图54I) BGHpAFW(SEQ ID NO130)CGGGATCCGTTTAAACCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATC BGHpARV(SEQ ID NO131)CGGATATCCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGC 将KOD-puls-(TOYOBO)用于PCR反应。PCR反应混合物含有10pM的每种引物(SEQ ID NO130和131)和(6)中制备的IRES-GFP作为模板。用起始变性保温为94℃3分钟进行PCR扩增。然后通过94℃15秒和68℃2分钟的保温进行30循环的变性，退火和扩增。将PCR产物(大约0.2kb)用0.8％琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化。将分离的PCR产物用BamHI和EcoRV消化后，将其连接于用BamHI和EcoRV消化并用牛肠碱性磷酸酶处理以使其两端都去磷酸化的pBluescriptIISK(-)。将连接混合物转染DH5α，并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。将包括正确核苷酸序列片段的克隆用PmeI和EcoRV消化，并将包括牛生长激素(BGH)poly A的区域用0.8％琼脂糖电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化。
(10)包括IRES-GFP，牛生长激素polyA和loxP序列的DNA片段的制备(图54J) 将pUC119 IRES-GFP+loxP用PmeI消化并通过0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化。将(9)中制备的BGH polyA片段连接于纯化的并用牛肠碱性磷酸酶处理以使其两端都去磷酸化的pUC119 IRES-GFP+loxP载体。将连接混合物转染DH5α，并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。选择包括BGHpoly A片段与GIPF编码序列同一方向的克隆(pIRES-GFP+pA)。将pIRES-GFP+pA用BamHI和XbaI消化，并将包括IRES-GFP，牛生长激素polyA和loxP序列的片段用0.8％琼脂糖电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化。
(11)pPvil 2-01GFP的构建(图54K) 将包括IRES-GFP，牛生长激素polyA和loxP序列的DNA片段[见(10)]连接于用BglII和XbaI消化并用牛肠碱性磷酸酶处理以使其两端都去磷酸化的pPvil2GIPF。将连接混合物转染DH5α，并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。选择包括正确核苷酸序列片段的克隆(pPvil 2-01GFP)。
(12)pPv-total的构建(图54L) 将大约11.2kb的小鼠绒毛蛋白基因启动子的长片段[见(1)]连接于用BglII和ClaI消化并用E.coli C75碱性磷酸酶处理以使其两端都去磷酸化的pPvil2-01GFP。将连接混合物转染XL10-Gold Ultracompetent细胞(STRATAGENE)，并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。选择包括正确核苷酸序列片段的克隆(pPv-total)。
(13)pLoxP-StneoR的构建(图54M) 将WO 00/10383描述的pLoxP-STneo用XhoI消化并用Blunting high(TOYOBO)处理以抹平其两端。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化包括loxP-Neor-loxP单位的所得DNA片段。将通过下面描述的合成的寡核苷酸(SEQ ID NO132和133)退火制备的DNA片段连接于用PacI和FseI消化并用0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化的pBlueLAB(WO 00/10383)。将连接混合物转染DH5α，并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。选择包括正确核苷酸序列片段的克隆(pBlueLAB2)。将上面包括loxP-Neor-loxP单位的DNA片段连接于用EcoRV消化并用牛肠碱性磷酸酶处理以使其两端都去磷酸化的的pBlueLAB2。将连接混合物转染DH5α，并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。选择包括与pLoxP-STneo(WO 00/10383)反向的片段的克隆(pLoxP-STneoR)。
AsiSI-S(SEQ ID NO132)TAACCGCGATCGCGGCCGG AsiSI-AS(SEQ ID NO133)CCGCGATCGCCCTTAAT (14)pPv01GFP的构建(图54N) 将pPv-全长质粒DNA用限制酶ClaI和XhoI消化，并将包括Pv-GIPF单位的DNA片段通过0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化。将纯化的DNA片段连接于用ClaI和XhoI消化并用牛肠碱性磷酸酶处理以使其两端都去磷酸化的pLoxP-StneoR。将连接混合物转染XL10-Gold Ultracompetent细胞(STRATAGENE)，并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。选择包括正确核苷酸序列片段的克隆(pPv01GFP)。
(15)用于小鼠ES细胞电穿孔的pPv01GFP质粒DNA的制备 在含有1mM精脒(pH7.0，Sigma)的反应混合物中将pPv01GFP的质粒DNA(60μg)用ClaI于37℃消化5小时。然后将反应混合物进行酚/氯仿抽提和于-20℃乙醇沉淀(0.3M NaHCO3)16小时。将线性化的载体片段溶解在HBS缓冲液中(0.5μg/μl)并用于下面的电穿孔实验。
(16)肠上皮细胞表达人GIPF和GFP的转基因嵌合鼠的生产 按照1995年Yodosha出版的Shinichi Aizawa，″Biomanual Series 8，GeneTargeting″中描述的方法完成获取小鼠胚胎，培养，将ES细胞注射到胚胎，移植到代孕母亲子宫的一般步骤。
按照1995年Yodosha出版的Shinichi Aizawa，″Biomanual Series 8，GeneTargeting″中描述的方法，通过电穿孔将线性化的pPv01GFP载体转染源自小鼠TT2F ES细胞((Uchida，1995)，Lifetech oriental)的C57BL/6X CBA F1株。将经电穿孔的ES细胞悬在20ml ES培养基中并接种于两个事先接种了饲养细胞的100mm组织培养塑料板(Corning)。1天后，将培养基更换为含有200μg/ml的G418(Invitrogen)的培养基。此后7-9天，挑选每种载体的共24个克隆。使每个克隆在12孔板中生长至汇合，然后将五分之四的培养物悬浮在0.2ml冻存培养基中[ES培养基+10％DMSO(Sigma)]并冻存于-80℃。将余下的五分之一接种在明胶包被的12孔板中并培养2天。然后，用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra System)分离基因组DNA。将从G418抗性的TT2F细胞分离的基因组DNA用限制酶EcoRI和XhoI消化，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。使用EcoRI-XhoI消化，通过检测大约16kb的带判断在G418抗性克隆中保留了完整表达单元(包括绒毛蛋白启动子，人GIPF cDNA，pPv01GFP的GFP cDNA和BGH polyA序列)。将分离的DNA片段转移到膜上(GeneScreen，NEN Life Science Products)，然后用探针进行杂交，其中探针是用下面描述的引物(SEQ ID NO134和135)通过PCR从pPV01GFP[见(13)]的IRES区域制备的DNA片段(IRESprobeF1，R1)。我们选择在Southern印迹上显示单一16kb条带的克隆。也对选择的ES克隆进行核型分析，其按照Aizawa Shinichi，″Biomanual Series 8，Gene Targeting″，Yodosha出版，1995描述的方法进行。将表现正常核型者用于向胚胎植入。
IRESprobeF1(SEQ ID NO134)CTAACGTTACTGGCCGAAGC IRESprobeR1(SEQ ID NO135)ATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAA 将冻存的转染的ES细胞克隆#2的细胞融化，开始培养并注射到从MCH(ICR)小鼠种系(CREA JAPAN，INC.)的雄性和雌性小鼠交配获得的8个细胞阶段的胚胎中；注射率为每个胚胎10-12个细胞。为了ES细胞发育成胚泡而将胚胎在培养基中培养过夜后，将大约10个ES细胞-注射的胚胎移植入代孕母亲ICR小鼠(CREA JAPAN，INC.)的每一侧子宫，其中已经将该小鼠进行2.5天的假孕处理。TT2F(野灰色)ES克隆-源的组织在宿主胚胎(白化)源的组织中的作用可以通过胚胎中眼睛的色素沉着和存活的后代的被毛颜色判断。
(17)转基因嵌合鼠中人GIPF-GFP mRNA的表达 从各种发育阶段(E13.5，E16.5，E19.5，第3天，第7天)pPv01GFP/TT2F-#2来源的嵌合体的肠道制备总RNA样品，并进行半定量RT-PCR分析以检测GIPF-GFP mRNA的表达。使用Superscript III(Invitrogen)合成第一链cDNA，其中使用随机六聚体和用Isogen(NipponGene)和RNasy Mini(QIAGEN)从pPv01GFP/TT2F-#2源嵌合体以及TT2F-源嵌合体对照肠道提取的500ng的总RNA。在每种引物对特异的退火温度使用cDNA进行半定量RT-PCR分析。将PCR产物在2％琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙啶染色。通过鼠GAPDH产生的cDNA的扩增控制RNA的完整性。用于GIPF(Pv01RT F1，R1；SEQ ID NO136和137)，Axin 2(Axin2 F，R；SEQ ID NO138和139))和mGAPDH(mGAP DH5，3；SEQ ID NO140和141)核苷酸序列和引物的退火温度列在下面。
Pv01RT F1(SEQ ID NO136)GCTCTGACACCAAGGAGACC Pv01RT R1(60℃)(SEQ ID NO137)CCCTAGGAATGCTCGTCAAG Axin2 F(MUS)(SEQ ID NO138)CAGGAGCCTCACCCTTCG Axin2 R(MUS)(60℃)(SEQ ID NO139)ACGCCGAGGTGCTTGCCC mGAPDH5(SEQ ID NO140)CACCATGGAGAAGGCCGGGGCCCAC mGAPDH3(65℃)(SEQ ID NO141) ATCATACTTGGCAGGTTTCTCCAGG 如图55所示，在pPv01GFP/TT2F-#2源嵌合体的肠道在E13.5时可检测到GIPF-GFP，而在所有检测的肝脏标本中未检测到，这与以前的研究(Madison et al.，J.Biol.Chem.277，p33275-33283，2002)非常一致，其描述由13kb绒毛蛋白启动子驱动的转基因的表达最早在12.5dpc.胚胎后肠和中肠中检测到，并且表达主要是肠上皮特异的。在发育期间GIPF-GFP转录本的表达水平随年龄逐渐升高是明显的。Eek-hoon等报道内源性Axin2 mRNA表达不被Wnt信号通路激活所诱导(Mol.Cell Biol.22，1172-1183，2002)。也已知Wnt信号在肠道发育中起到重要作用。因此我们检测pPv01GFP/TT2F-#2源嵌合体肠道中Axin2的表达。结果(图55)显示当与对照嵌合体相比时，Axin2 mRNA的表达在第3天和第7天明显升高，表明人GIPF在新生儿肠道的表达导致Wnt信号通路的激活。
(18)转基因嵌合鼠肠道中β-连环蛋白的稳定性 为评价GIPF对Wnt/β-连环蛋白信号通路的影响，在第10天测定pPv01GFP/TT2F-#2源嵌合鼠的小肠和结肠标本中β-连环蛋白的稳定性。实施例17中描述了测定β-连环蛋白稳定性的方法。如图56所示，与对照嵌合体(野生型)对比时，GIPF的表达强烈诱导pPv01GFP/TT2F-#2(Pv01#2)源嵌合体小肠和结肠标本中β-连环蛋白的稳定。
(19)转基因嵌合鼠肠道中表型改变的评价 新生的pPv01GFP/TT2F-#2源嵌合体幼仔在第3天表现明显的腹部膨胀，并且这种表型的程度随年龄逐渐加强。在第3天嵌合体尸检时肉眼观察显示小肠全长直径明显增大，其中直径与增强的表面血管化有关。将整个胚胎，幼仔或胃肠道固定在Bouin液中。为进行组织学评价，将石蜡包埋的切片用苏木精和伊红(H&E)染色。如图57所示，pPv01GFP/TT2F-#2(Pv01#2)的H&E切片的组织病理学分析显示，与对照相比从胚胎第19.5天(E19.5)到第14天(d14)，隐窝数目和分支增加。
实施例31 肠道上皮细胞表达GIPF和Wnt3a的转基因嵌合鼠 (1)Wnt3a片段的制备(图58A) Wnt3aFW(SEQ ID NO142)CGGGATCCCCATGGCTCCTCTCGGATACCTCTTAGTGCT Wnt3aRV(SEQ ID NO143)GCTCTAGAGTTTAAACCTACTTGCAGGTGTGCACGTCATAG 将KOD-puls(TOYOBO)用于PCR反应。PCR反应混合物含有10pM的每种引物(SEQ ID NO142和143)和Wnt3a cDNA作为模板。用起始变性保温为94℃3分钟进行PCR扩增。然后通过94℃15秒和68℃2分钟的保温进行30循环的变性，退火和扩增。将PCR产物(大约1.06kb)用0.8％琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化。将分离的PCR产物用BamHI和EcoRI消化后，将其连接于用BamHI和XbaI消化并用牛肠碱性磷酸酶处理以使其两端都去磷酸化的pBluescriptIISK(-)。将连接混合物转染DH5α，并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。将包括正确核苷酸序列片段的克隆用NcoI和PmeI消化。通过0.8％琼脂糖电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化包括Wnt3a cDNA的片段。
(2)IRES/Wnt3a+pA片段的制备(图58B) 将pIRES/GFP+pA质粒DNA[见实施例30-(13)]用NcoI和PmeI消化，并用0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化不包括GFP编码序列的载体片段。将包括Wnt3a cDNA[见(1)]的片段连接于纯化的载体片段，其用E.coli C75碱性磷酸酶处理以使其两端都去磷酸化。将连接混合物转染DH5α，并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。将包括正确核苷酸序列片段(pIRES/Wnt3a+pA)的克隆用AscI和XhoI消化，并通过0.8％琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化包括IRES/Wnt3a+pA单位的DNA片段。
(3)pPv01Wnt3a的构建(图58C) 将pPv01-GFP质粒DNA[见实施例30-(13)]用限制酶AscI和XhoI消化，并将消化的反应混合物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。分离无IRES/GFP+pA区域的载体片段并用牛肠碱性磷酸酶处理以使其两端都去磷酸化。将IRES/Wnt3a+pA片段[见(2)]和上面载体片段的连接混合物转染XL10-GoldUltracompetent细胞(STRATAGENE)。并通过核苷酸测序分析从所得转化物制备的DNA样品以确认插入片段的结构。选择包括正确核苷酸序列片段的克隆(pPv01 Wnt3a)。
(4)用于电穿孔小鼠ES细胞的pPv01 Wnt3a质粒DNA的制备 在含有1mM精脒(pH7.0，Sigma)的反应混合物中将pPv01 Wnt3a的质粒DNA(60μg)用ClaI于37℃消化5小时。然后将反应混合物进行酚/氯仿抽提和于-20℃乙醇沉淀(0.3M NaHCO3)16小时。将线性化的载体片段溶解在HBS缓冲液中(0.5μg/μl)并用于下面的电穿孔实验。
(5)肠上皮细胞中表达人GIPF和Wnt3a的转基因嵌合鼠的生产 按照1995年Yodosha出版的Shinichi Aizawa，″Biomanual Series 8，GeneTargeting″中描述的方法完成获取小鼠胚胎，培养，将ES细胞注射到胚胎，移植到代孕母亲子宫的一般步骤。
按照1995年Yodosha出版的Shinichi Aizawa，″Biomanual Series 8，GeneTargeting″中描述的方法，通过电穿孔将线性化的pPv01 Wnt3a载体转染源自小鼠TT2F ES细胞((Uchida，1995)，Lifetech oriental)的C57BL/6X CBA F1株。将经电穿孔的ES细胞悬在20ml ES培养基中并接种于两个事先接种了饲养细胞的100mm组织培养塑料板(Corning)。1天后，将培养基更换为含有200μg/ml的G418(Invitrogen)的培养基。此后7-9天，挑选每种载体的共24个克隆。使每个克隆在12孔板中生长至汇合，然后将五分之四的培养物悬浮在0.2ml冻存培养基中[ES培养基+10％DMSO(Sigma)]并冻存于-80℃。将余下的五分之一接种在明胶包被的12孔板中并培养2天。然后，用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra System)分离基因组DNA。将从G418抗性的TT2F细胞分离的基因组DNA用限制酶EcoRI和XhoI消化，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。使用EcoRI-XhoI消化，通过检测大约16kb的带判断在G418克隆中保留了完整表达单元，该表达单元包括pPv01 Wnt3a绒毛蛋白启动子，人GIPF cDNA，Wnt3a cDNA和BGH poly A序列。将分离的DNA片段转移到膜上(GeneScreen，NEN Life Science Products)，然后用探针进行杂交，其中探针是用实施例30-(16)描述的引物通过PCR从pPV01GFP[见实施例30-(13)]的IRES区域制备的DNA片段(IRESprobeF1，R1)。我们选择在Southern印迹上显示单一16kb条带的克隆。也对选择的ES克隆进行核型分析，其按照Aizawa Shinichi，″Biomanual Series 8，GeneTargeting″，Yodosha出版，1995描述的方法进行。将表现正常核型的#7和#13用于向胚胎植入。
将冻存的转染的ES细胞克隆#7和#13的细胞融化，开始培养并注射到从MCH(ICR)小鼠种系(CREA JAPAN，INC.)的雄性和雌性小鼠交配获得的8个细胞阶段的胚胎中；注射率为每个胚胎10-12个细胞。为了ES细胞发育成胚泡而将胚胎在培养基中培养过夜后，将大约10个ES细胞-注射的胚胎移植入代孕母亲ICR小鼠(CREA JAPAN，INC.)的每一侧子宫，其中已经将该小鼠进行2.5天的假孕处理。TT2F(野灰色)ES克隆-源的组织在宿主胚胎(白化)源的组织中的作用可以通过胚胎中眼睛的色素沉着和存活的后代的被毛颜色判断。
(6)转基因嵌合鼠中人GIPF/Wnt3a mRNA的表达 从pPv01 Wnt3a/TT2F-#7，和#13源新生嵌合体的肠道制备总RNA样品，并进行半定量RT-PCR分析以检测GIPF-GFP mRNA的表达。使用Superscript III(Invitrogen)合成第一链cDNA，其中使用随机六聚体和用Isogen(Nippon Gene)和RNasy Mini(QIAGEN)从pPv01 Wnt3a/TT2F-#7，和#13源嵌合体以及TT2F-源嵌合体对照肠道提取的500ng的总RNA。在每种引物对特异的退火温度使用cDNA进行半定量RT-PCR分析。将PCR产物在2％琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙啶染色。通过鼠GAPDH产生的cDNA的扩增控制RNA的完整性。用于GIPF(Pv01RT F1，R1)，Axin 2(Axin2 F，R)和mGAPDH(mGAPDH5，3)核苷酸序列和引物的退火温度列在下面。
Pv01RT F1(SEQ ID NO136)GCTCTGACACCAAGGAGACC Pv01RT R1(60℃)(SEQ ID NO137)CCCTAGGAATGCTCGTCAAG Axin2 F(MUS)(SEQ ID NO138)CAGGAGCCTCACCCTTCG Axin2 R(MUS)(60℃)(SEQ ID NO139)ACGCCGAGGTGCTTGCCC mGAPDH5(SEQ ID NO140)CACCATGGAGAAGGCCGGGGCCCAC mGAPDH3(65℃)(SEQ ID NO141)ATCATACTTGGCAGGTTTCTCCAGG 如图59所示，pPv01 Wnt3a/TT2F-#7和-#13源的新生嵌合体(Pv01 Wnt3a1至4)的肠组织中可检测到GIPF-Wnt3a转录本。结果(图59)也显示与对照嵌合体(TT2F5和6)相比时，Axin2 mRNA表达明显升高。
(7)转基因嵌合鼠肠道中β-连环蛋白的稳定性 为评价GIPF对Wnt/β-连环蛋白信号通路的影响，测定pPv01 Wnt3a/TT2F-#7和-#13源嵌合体的小肠和结肠标本中β-连环蛋白的稳定性。实施例17中描述了测定β-连环蛋白稳定性的方法。如图60所示，与对照嵌合体(野生型3和4)对比时，GIPF和Wnt3a共表达诱导pPv01 Wnt3a/TT2F-#7胚胎(E20.51和2)十二指肠和结肠标本中β-连环蛋白的稳定。
(8)转基因嵌合鼠肠道中表型改变的评价 新生的pPv01 Wnt3a/TT2F-#7和-#13源嵌合体幼仔在表现明显的腹部膨胀。新生嵌合体尸检时肉眼观察显示小肠全长直径明显增大，其中直径与增强的表面血管化有关。将整个胚胎，幼仔或胃肠道固定在Bouin液中。为进行组织学评价，将石蜡包埋的切片用苏木精和伊红(H&E)染色。如图61所示，pPv01 Wnt3a/TT2F-#13胚胎的第20.5天胚胎(E20.5)的H&E切片的组织病理学分析显示绒毛细胞数目，不规则分支和绒毛的增生增加。这些表型的程度强于pPv01 GFP/TT2F-#2源嵌合体[实施例30-(19)]者，表明通过Wnt3a表达增强GIPF的作用。
实施例32 RS-KO小鼠ES细胞 A.RS-KO载体的构建 RS-KO载体的构建(Figure 62A)按照下面描述的方法进行，并描绘于图62B-1K。
Figure 62B向pBluescript II SK(-)(Stratagene)添加新的限制性酶切位点(NruI，SgrAI和AscI)。
合成用于在pBluescript II SK(-)中添加新的限制性酶切位点的寡DNA片段(SEQ ID NO144和145)。
接头A1TCGAGTCGCGACACCGGCGGGCGCGCCC(SEQ ID NO144) 接头A2TCGAGGGCGCGCCCGCCGGTGTCGCGAC(SEQ ID NO145) 将制备的接头A1和接头A2连接到用限制酶SalI和XhoI预消化的pBluescript II SK(-)中。所得到的质粒pBlueLA含有新添加的限制性酶切位点(NruI，SgrAI和AscI)。
图62C 向pBlueLA添加新的限制性酶切位点(PacI，FseI和SalI)。
合成用于在pBlueLA中添加新的限制性酶切位点的寡DNA片段(SEQID NO146和147)。
接头B1GGCCGCTTAATTAAGGCCGGCCGTCGACG(SEQ ID NO146) 接头B2AATTCGTCGACGGCCGGCCTTAATTAAGC(SEQ ID NO147) 将制备的接头B1和接头B2连接到用限制酶NotI和EcoRI预消化的pBlueLA中。所得到的质粒pBlueLAB含有新添加的限制性酶切位点(PacI，FseI和SalI)。
图62D LoxP-Neo-B片段的制备 LoxP-Neo-B片段的制备通过用T4DNA聚合酶处理LoxP-Neo，其从XhoI消化的pLoxP-STneo(WO 00/10383)获得。
图62E pBlueLAB-LoxP-Neo质粒的制备 将LoxP-Neo-B片段连接于用限制酶EcoRV预消化的pBlueLAB。所得质粒pBlueLAB-LoxP-Neo含有LoxP-Neo-B片段。
图62F DT-A片段的制备 将pMC1DT-A(GIBCO BRL)用XhoI和SalI消化，将所得的DT-A片段用琼脂糖凝胶电泳分离并回收。
图62G pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A质粒的制备 将DT-A片段连接到用限制酶XhoI预消化的pBlueLAB-LoxP-Neo中。所得质粒pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A含有DT-A片段。
图62H RS元件3’基因组区的制备 以从GenBank(登录号AC090291)获得的小鼠序列为根据合成用于PCR的上游(RS3′FW2；SEQ ID NO148)和下游(RS3′RV3；SEQ ID NO149)引物，并用于扩增RS元件3’基因组区的DNA。
RS3′FW2TTGGCGCGCCCTCCCTAGGACTGCAGTTGAGCTCAGATTTGA(SEQ IDNO148)的制备通过在5’末端位点添加AscI识别序列，RS3′RV3CCGCTCGAGTCTTACTGTCTCAGCAACAATAATATAAACAGGGG(SEQID NO149)的制备通过在5’末端位点添加XhoI识别序列。用酵母人工染色体(BAC)克隆RP23-435I4(GenBank登录号AC090291)作为模板进行PCR。将PCR产物用限制酶AscI和XhoI消化，并连接于用限制酶AscI和XhoI预消化的pBlueLAB。所得到的质粒含有特定的RS元件的3’基因组区的DNA序列并在AscI和XhoI之间区域没有核苷酸序列取代，将此质粒用AscI和XhoI消化，然后获得了RS元件的3’基因组区(大约2Kb)。
图62I向pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A中插入RS元件的3’基因组区 将RS元件的3’基因组区连接到用AscI和XhoI预消化的pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A中。验证pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A和RS元件的3’基因组区之间的连接区后，获得质粒pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A-3’RS。
图62J RS元件的5’基因组区的制备 以从GenBank(登录号AC090291)获得的小鼠序列为根据合成用于PCR的上游(RS5′FW3；SEQ ID NO150)和下游(RS5′RV3；SEQ ID NO151)引物，并用于扩增RS元件5’基因组区的DNA。
RS5′FW3ATAAGAATGCGGCCGCAAAGCTGGTGGGTTAAGACTATCTCGTGAAGTG(SEQ ID NO150)的制备通过在5’末端位点添加NotI识别序列，RS5′RV3ACGCGTCGACTCACAGGTTGGTCCCTCTCTGTGTGTGGTTGCTGT(SEQID NO151)的制备通过在5’末端位点添加SclI识别序列。用酵母人工染色体(BAC)克隆RP23-435I4(GenBank登录号AC090291)作为模板进行PCR。将PCR产物用限制酶NotI和SalI消化，并连接于用限制酶NotI和SalI预消化的pBlueLAB。所得到的质粒含有所指定的RS元件5’基因组区DNA序列并在NotI和SalI之间区域没有核苷酸序列取代，将此质粒用NotI和SalI消化，然后获得了RS元件的5’基因组区(大约5Kb)。
图62K向pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A-3’RS中插入RS元件5’基因组区 将RS 5’元件基因组区连接到用NotI和SalI预消化的pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A-3’RS中。验证pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A-3’RS和RS元件5’基因组区之间的连接区后，构建了RS-KO载体。
B.RS-KO小鼠ES细胞的制备 按照Aizawa Shinichi，″Biomanual Series 8，Gene Targeting″，Yodosha出版，1995描述的方法进行获取小鼠胚胎和培养的一般程序。按照AizawaShinichi，″Biomanual Series 8，Gene Targeting″，Yodosha出版，1995描述的方法，将将RS-KO载体用NotI线性化并经电穿孔转移入C57BL/6X CBA F1源小鼠TT2F ES细胞((Uchida，1995)，Lifetech oriental)中。将电穿孔的ES细胞悬在20ml ES培养基中[DMEM(GIBCO)，18％胎牛血清(GIBCO)，0.1mM2-巯基乙醇(GIBCO)，1000U/ml LIF(白血病抑制因子，CHEMICONInternational，Inc.)]，并接种在两个100mm的已经预先种有饲养细胞(Invitrogen)的组织培养塑料板(Corning)上。一天后，将培养基更换为含有0.75g/ml嘌呤霉素(Sigma)的培养基。此后7天，挑取形成的嘌呤霉素抗性的克隆。将每个克隆在24孔板中长至汇合，然后将三分之二培养物悬在0.2ml冻存培养基中[FBS+10％DMSO(Sigma)]并冻存于-80℃。将余下的三分之一接种在明胶包被的12孔板中并培养2天。然后，用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra System)分离基因组DNA。
如下制备用于Southern分析的3’KO-探针。以从GenBank(登录号AC090291)获得的小鼠序列为根据合成RS3’Southern FW1(SEQ ID NO152)和RS3’Southern RV2(SEQ ID NO153)引物，并用于扩增大约600mer长的RS元件3’基因组区的DNA。
RS3′Southern FW1TCTTACTAGAGTTCTCACTAGCTCT(SEQ ID NO152) RS3′Southern RV2GGAACCAAAGAATGAGGAAGCTGTT(SEQ IDNO153) 将从嘌呤霉素抗性的TT2F细胞分离的基因组DNA用限制酶EcoR I(Takara Shuzo)消化，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。
将分离的DNA片段转移到膜上(GeneScreen，NENTM Life ScienceProducts)，然后用从RS元件DNA 3’基因组区制备的DNA片段(3’KO-探针)作为探针进行杂交。未杂交上的ES克隆的带型表现为一条分子量大约5.7Kb的带，而杂交上的ES克隆表现为分子量大约5.7Kb和7.4Kb的两条带(图63)。也对选择的RS-KO小鼠ES克隆进行核型分析，其按照AizawaShinichi，″Biomanual Series 8，Gene Targeting″，Yodosha出版，1995描述的方法进行。将表现正常核型的RS-KO小鼠ES克隆用于进一步实验。
实施例33 转基因的GIPF删除的突变体动物 A.pCk m4 KI载体的构建。
GIPF删除突变体4Ck基因敲入(pCk m4 KI)载体(图64A)的构建按照下面描述的方法进行，并描绘于图64B-64K。
图64B Ck P2 KI+AS KI的制备 合成用于在Ck P2 KI中添加新的限制性酶切位点的寡DNA片段(SEQID NO154和155)。
AscI上面(top)接头GGCCAGGCGCGCCTTGC(SEQ ID NO154) AscI下面(bottom)接头GGCCGCAAGGCGCGCCT(SEQ ID NO155) 将制备的AscI上面接头和AscI下面接头连接到用限制酶NotI预消化的Ck P2 KI中。所得到的质粒Ck P2 KI+AS KI含有新添加的限制性酶切位点(AscI)。
图64C pBlueLAB+Nh的制备 合成用于在pBlueLA中添加新的限制性酶切位点的寡DNA片段(SEQID NO156和157)。
Pac-Nhe-Fse STAAGGGCTAGCTAGGGCCGG(SEQ ID NO156) Pac-Nhe-Fse ASCCCTAGCTAGCCCTTAAT(SEQ ID NO157) 将制备的Pac-Nhe-Fse S和Pac-Nhe-Fse AS连接到用限制酶PacI和FseI预消化的pBlueLAB中。所得到的质粒pBlueLAB+Nh含有新添加的限制性酶切位点(NheI)。
图64D pBlueLAB+NhHp的制备 合成在pBlueLAB+Nh中添加新的限制性酶切位点的寡DNA片段(SEQID NO158的159)。
S/HpaI/Hd-STCGAGTTAAC(SEQ ID NO158) S/HpaI/Hd-ASAGCTGTTAAC(SEQ ID NO159) 将制备的S/HpaI/Hd-S和S/HpaI/Hd-AS连接到用限制酶SalI和HindIII预消化的pBlueLAB+Nh中。所得到的质粒pBlueLAB+NhHp中含有新添加的限制性酶切位点(HpaI)。
图64E pCkpAP2的制备 将pCkP2+As KI用HpaI和NheI消化并将所得的952bp片段用琼脂糖凝胶电泳分离并回收。将952bp片段连接到用限制酶HpaI和NheI预消化的pBlueLAB+NhHp中。所得的质粒pCkpAP2含有952bp片段。
图64F pCkpAMCS的制备 合成在pCkpAP2中添加限制性酶切位点的寡DNA片段(SEQ ID NO160和161)。
SPFN接头-SAGCTGTCGACTTAATTAAGGCCGGCCG(SEQ ID NO160) SPFN接头-ASCTAGCGGCCGGCCTTAATTAAGTCGAC(SEQ ID NO161) 将制备的SPFNlinker-S和SPFNlinker-AS连接到用限制酶HindIII和NheI预消化的CkpAMCS中。所得的质粒CkpAMCS含有新添加的限制性酶切位点(PacI)。
图64G pCkP2ΔP的制备 将pCkpAMCS用HpaI和NheI消化，将所得的大约700bp长的片段分离并从琼脂糖凝胶电泳回收。将700bp片段连接到用限制酶HpaI和NheI预消化的pCkP2+As KI中。所得的质粒pCkP2ΔP含有该700bp片段。
图64H pBS+PFN的制备 合成在pBluescript II SK(-)中添加新的限制性酶切位点的寡DNA片段(SEQ ID NO162和163)。
S/PFN/Hd-STCGACTTAATTAAGGCCGGCCCTAGCTAGCA(SEQ IDNO162) S/PFN/Hd-ASAGCTTGCTAGCTAGGGCCGGCCTTAATTAAG(SEQ IDNO163) 将制备的S/PFN/Hd-S和S/PFN/Hd-AS连接到用限制酶SalI和HindIII预消化的pBluescript II SK(-)中。所得的质粒pBS+PFN含有新添加的限制性酶切位点(PacI，Fse，和NheI)。
图64I pPSs3.8的制备 以从GenBank(登录号K02159)获得的小鼠序列为根据合成用于PCR的上游(PsecSP FW1；SEQ ID NO164)和下游(PsecSP RV；SEQ ID NO165)引物，并用于扩增编码Igκ的启动子和前导序列编码区的DNA。前导序列编码区含有内在的内含子序列。
通过在5’末端位点添加PacI识别序列制备PsecSP FW1CCTTAATTAAAGTTATGTGTCCTAGAGGGCTGCAAACTCAAGATC(SEQID NO164)，通过在5’末端位点添加FseI识别序列制备PsecSP RVTTGGCCGGCCTTGGCGCCAGTGGAACCTGGAATGATAAACACAAAGATTATTG(SEQ ID NO165)。用源自TT2F ES细胞((Uchida，1995)，Lifetechoriental)的小鼠基因组作为模板进行PCR。将PCR产物用限制酶PacI和FseI消化，并连接到用限制酶PacI和FseI预消化的pBS+PFN中。所得的质粒pPSs3.8含有Igκ的启动子和前导序列编码区的DNA片段。
图64J m4(+SP)和m4(-SP)的制备 以删除突变体#4的序列(图43；SEQ ID NO91)为基础合成用于PCR的上游(Sal kozak GIPF F；SEQ ID NO166)和下游(GIPF m4 RV Fse；SEQ IDNO167)引物，并用于扩增GIPF的前导序列和GIPF的删除突变体#4序列的DNA。
通过在5’末端位点添加SalI识别序列制备Sal kozak GIPF FAAG CGTCGA CCA CCA TGC GGC TTG GGC TGT GTG(SEQ ID NO166)，通过在5’末端位点添加FseI识别序列制备GIPF m4 RV FseATG GCC GGC CCT ACATGG TGC CAT TGG CAG(SEQ ID NO167)。用GIPF KI载体作为模板进行PCR。将PCR产物用限制酶SalI和FseI消化，然后获得m4(+SP)片段。
以删除突变体#4的序列(Figure 43；SEQ ID NO91)为基础合成用于PCR的上游(Hy01(-SP)FW；SEQ ID NO168)和下游(GIPF m4 RV Fse；SEQ ID NO169)引物，并用于扩增GIPF的删除突变体#4序列的DNA。
通过在5’末端位点添加磷酸制备Hy01(-SP)FWAGCCGGGGGATCAAGGGGAAAAGGCAGAGG(SEQ ID NO168)，通过在5’末端位点添加FseI识别序列制备GIPF m4 RV FseATG GCC GGC CCTACA TGG TGC CAT TGG CAG(SEQ ID NO169)。用GIPF KI载体作为模板进行PCR。将PCR产物用限制酶FseI消化，然后获得m4(-SP)片段。
图64K pCk m4 KI载体的构建 将m4(+SP)片段连接到用限制酶SalI和FseI预消化的pCkP2+As KI中。所得到的pCk m4 KI载体含有m4(+SP)片段，其被用于生产GIPF删除突变体小鼠。
B.pPSm4 KI载体的构建 GIPF删除突变体4PS基因敲入(pPS m4 KI)载体(图65A)的构建按照下面描述的方法进行，并描绘于图65B-65C。
图65B pPSs3.8m4的制备 将m4(-SP)片段连接到用限制酶SfoI和FseI预消化的pPSs3.8中。所得的pPSs3.8m4含有m4(-SP)片段。
图65C pPSm4 KI载体的构建 将pPSs3.8m4用PacI和FseI消化，将所得的大约1.2Kb长的片段分离并从琼脂糖凝胶电泳回收。将1.2Kb片段连接到用限制酶PacI和FseI预消化的CkP2ΔP中。所得的pPSm4 KI载体含有该1.2Kb片段，其被用于生产GIPF删除突变体小鼠。
C.GIPF删除突变体小鼠的生产 按照Aizawa Shinichi，″Biomanual Series 8，Gene Targeting″，Yodosha出版，1995描述的方法进行获取小鼠胚胎、培养、将ES细胞注射入胚胎、移植到代孕母亲子宫的一般程序。
按照Aizawa Shinichi，″Biomanual Series 8，Gene Targeting″，Yodosha出版，1995描述的方法，将pCkm4 KI载体和pPSm4 KI载体用Not I线性化，并经电穿孔转移入RS-KO小鼠ES细胞内。将电穿孔的RS-KO小鼠ES细胞悬在20ml ES培养基中[DMEM(GIBCO)，18％胎牛血清(GIBCO)，0.1mM2-巯基乙醇(GIBCO)，1000U/ml LIF(白血病抑制因子，CHEMICONInternational，Inc.)]，并接种在两个100mm的已经预先种有饲养细胞(Invitrogen)的组织培养塑料板(Corning)上。一天后，将培养基更换为含有0.75g/ml嘌呤霉素(Sigma)的培养基。此后7到9天，分别挑取pCkm4 KI载体电穿孔RS-KO小鼠ES细胞形成的24个克隆，和pPSm4 KI载体电穿孔RS-KO小鼠ES细胞形成的24个克隆。将每个克隆在12孔板中长至汇合，然后将三分之二培养物悬在0.2ml冻存培养基中[FBS+10％DMSO(Sigma)]并冻存于-80℃。将余下的三分之一接种在明胶包被的12孔板中并培养2天。然后，用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra System)分离基因组DNA。将从嘌呤霉素抗性的RS-KO小鼠ES细胞分离的基因组DNA用限制酶EcoR I(Takara Shuzo)消化，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。将分离的DNA片段转移到膜上(GeneScreen，NENTM Life Science Products)，然后用从IgJk-Ck基因组DNA3′区(XhoI-EcoR I，1.3Kb(SEQ ID NO67)WO00/10383，实施例48)制备的DNA片段作为探针进行杂交。未杂交上的ES克隆的带型表现为一条分子量15.6Kb的带。分别地，pCkm4 KI杂交上的RS-KO克隆表现为分子量15.6Kb和12.9Kb的两条带，pPSm4 KI杂交上的RS-KO克隆表现为分子量15.6Kb和12.5Kb的两条带(图66和67)。Southern分析后(同源重组率大约为41.7％)挑取pCkm4 KI杂交上的10个RS-KO小鼠ES克隆#3中的一个，和Southern分析后(同源重组率大约为29.2％)pPSm4 KI杂交上的7个RS-KO小鼠ES克隆#7中的一个。也对选择的ES克隆进行核型分析，其按照Aizawa Shinichi，″Biomanual Series 8，GeneTargeting″，Yodosha出版，1995描述的方法进行。分别将表现正常核型的pCkm4 KI杂交上RS-KO小鼠ES克隆#3中的一个克隆和pPSm4 KI杂交上的RS-KO小鼠ES克隆#7中的一个克隆用于向胚胎植入。
将冻存的pCkm4 KI杂交上RS-KO小鼠ES细胞克隆#3和pPSm4 KI杂交上的RS-KO小鼠ES细胞克隆#7的细胞融化，开始培养并注射到从免疫球蛋白重链敲除小鼠种系的雄性和雌性小鼠交配获得的8个细胞阶段的胚胎(Tomizuka et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97722-727，2000)中；注射率为每个胚胎10-12个细胞。为了ES细胞发育成胚泡而将胚胎在培养基中培养过夜后，将大约10个ES细胞注射的胚胎移植入代孕母亲ICR小鼠(CREAJAPAN，INC.)的每一侧子宫，已经将该小鼠进行2.5天的假孕处理。作为每种80个注射胚胎的移植结果，分别有15和20个子代小鼠出生。子代中嵌合性通过在宿主胚胎(ICR)-源白化外表颜色中TT2F细胞-源野灰色外表颜色(深棕色)的程度判断。全部15只子代中，认为9只小鼠(pCkm4基因敲入鼠)有部分野灰色外表颜色，和全部20只子代中，认为16只小鼠(pPSm4基因敲入鼠)有部分野灰色外表颜色，说明有RS-KO ES细胞的作用。如上面描述的，从pCkm4 KI杂交上RS-KO小鼠ES细胞和pPSm4 KI杂交上的RS-KO小鼠ES细胞的其它克隆获得GIPF生产突变体。
将鼠保持在12/12-小时黑暗/光照循环(在上午8:00光照)，并随意接受5μm过滤的水和CE-2食物(CLEA JAPAN，INC.)。断乳期后将雄性鼠单独饲养。
实施例34 转基因的GIPF突变体动物 A.pCk VR KI载体的构建 GIPF变体Ck基因敲入(pCk VR KI)载体(图68A)的构建按照下面描述的方法进行，并描绘于图68B-68C。
图68B有kozak(VR+kz)的GIPF变体和GIPF变体(VR)的制备 以GenBank(登录号AK098225)的序列为基础合成用于PCR的上游(VRCk Fw；SEQ ID NO170)和下游(VR KI Rv；SEQ ID NO171)引物，并用于扩增5’末端位点有kozak的GIPF变体的DNA。
通过在5’末端位点添加SalI识别序列制备VR Ck FwACG CGT CGACCA CCA TGA TAT TCC GAG TCA GTG C(SEQ ID NO170)，通过在5’末端位点添加FseI识别序列制备VR KI RvGGC CGG CCC TAG GCA GGCCCT GCA GAT GTG AGT GG(SEQ ID NO171)。用GIPF KI载体作为模板进行PCR。将PCR产物用限制酶SalI和FseI消化，然后获得VR+kz。
以GenBank(登录号AK098225)的序列为基础合成用于PCR的上游(VRCk Fw；SEQ ID NO172)和下游(VR KI Rv；SEQ ID NO173)引物，并用于扩增GIPF变体的DNA。
通过在5’末端位点添加磷酸制备VR FwATG ATA TTC CGA GTC AGTGCC GAG GGG AGC CAG(SEQ ID NO172)，通过在5’末端位点添加FseI识别序列制备VR KI RvGGC CGG CCC TAG GCA GGC CCT GCA GATGTG AGT GG(SEQ ID NO173)。用GIPF KI载体作为模板进行PCR。将PCR产物用限制酶FseI消化，然后获得VR。
图68C pCk VR KI载体的构建 将VR+kz连接到用SalI和FseI预消化的pCkP2+As KI中。所得的pCkVR KI载体含有VR+kz，其被用于生产GIPF变体小鼠。
B.pPS VR KI载体的构建 GIPF变体PS基因敲入(pPS VR KI)载体的构建(图69A)按照下面描述的方法进行，并描绘于图69B-69C。
图69B pPSs3.8VR的制备 将VR连接于用限制酶SfoI和FseI预消化的pPSs3.8中。所得的质粒pPSs3.8VR含有VR。
图69C pPS VR KI载体的构建 将pPSs3.8VR用SalI和FseI消化，并将所得的大约1.5Kb长的片段用琼脂糖凝胶电泳分离并回收。将1.5Kb片段连接到用限制酶SalI和FseI预消化的pCkP2ΔP中。所得的pPS VR KI载体含有1.5Kb片段，其被用于生产GIPF变体小鼠。
C.GIPF变体小鼠的生产 按照Aizawa Shinichi，″Biomanual Series 8，Gene Targeting″，Yodosha出版，1995描述的方法进行获取小鼠胚胎、培养、将ES细胞注射入胚胎、移植到代孕母亲子宫的一般程序。
按照Aizawa Shinichi，″Biomanual Series 8，Gene Targeting″，Yodosha出版，1995描述的方法，将pCkVR KI载体和pPSVR KI载体用Not I线性化，并经电穿孔转移入RS-KO小鼠ES细胞内。将电穿孔的RS-KO小鼠ES细胞悬在20ml ES培养基中[DMEM(GIBCO)，18％胎牛血清(GIBCO)，0.1mM2-巯基乙醇(GIBCO)，1000U/ml LIF(白血病抑制因子，CHEMICONInternational，Inc.)]，并接种在两个100mm的已经预先种有饲养细胞(Invitrogen)的组织培养塑料板(Corning)上。一天后，将培养基更换为含有0.75g/ml嘌呤霉素(Sigma)的培养基。此后7到9天，分别挑取pCkVRKI载体电穿孔RS-KO小鼠ES细胞形成的24个克隆，和pPSVR KI载体电穿孔RS-KO小鼠ES细胞形成的24个克隆。将每个克隆在12孔板中长至汇合，然后将三分之二培养物悬在0.2ml冻存培养基中[FBS+10％DMSO(Sigma)]并冻存于-80℃。将余下的三分之一接种在明胶包被的12孔板中并培养2天。然后，用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra System)分离基因组DNA。将从嘌呤霉素抗性的RS-KO小鼠ES细胞分离的基因组DNA用限制酶EcoR I(Takara Shuzo)消化，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。将分离的DNA片段转移到膜上(GeneScreen，NENTM Life Science Products)，然后用从IgJk-Ck基因组DNA3′区(XhoI-EcoR I，1.3Kb(SEQ ID NO67)WO00/10383，实施例48)制备的DNA片段作为探针进行杂交。未杂交上的ES克隆的带型表现为一条分子量15.6Kb的带。分别地，pCkVR KI杂交上的RS-KO克隆表现为分子量15.6Kb和13.1Kb的两条带，pPSVR KI杂交上的RS-KO克隆表现为分子量15.6Kb和12.9Kb的两条带(图70和71)。Southern分析后(同源重组率大约为37.5％)挑取pCkVR KI杂交上的12个RS-KO小鼠ES克隆#3中的一个，和Southern分析后(同源重组率大约为25％)pPSVRKI杂交上的8个RS-KO小鼠ES克隆#14中的一个。也对选择的ES克隆进行核型分析，其按照Aizawa Shinichi，″Biomanual Series 8，Gene Targeting″，Yodosha出版，1995描述的方法进行。分别将表现正常核型的pCkVR KI杂交上RS-KO小鼠ES克隆的一个克隆#3和pPSVR KI杂交上的RS-KO小鼠ES克隆的一个克隆#14用于向胚胎植入。
将冻存的pCkVR KI杂交上RS-KO小鼠ES克隆#3和pPSVR KI杂交上的RS-KO小鼠ES克隆#14的细胞融化，开始培养并注射到从免疫球蛋白重链敲除小鼠种系的雄性和雌性小鼠交配获得的8个细胞阶段的胚胎(Tomizuka et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97722-727，2000)中；注射率为每个胚胎10-12个细胞。为了ES细胞发育成胚泡而将胚胎在培养基中培养过夜后，将大约10个ES细胞注射的胚胎移植入代孕母亲ICR小鼠(CREAJAPAN，INC.)的每一侧子宫，已经将该小鼠进行2.5天的假孕处理。作为每种220个注射胚胎的移植结果，分别有68和60个子代小鼠出生。子代中嵌合性通过在宿主胚胎(ICR)-源白化外表颜色中TT2F细胞-源野灰色外表颜色(深棕色)的程度判断。全部68只子代中，认为47只小鼠(pCkVR基因敲入鼠)有部分野灰色外表颜色，说明有RS-KO小鼠ES细胞的作用，和全部60只子代中，认为38只小鼠(pPSVR基因敲入鼠)有部分野灰色外表颜色，说明有RS-KO小鼠ES细胞的作用。如上面描述的，从pCkVR KI杂交上RS-KO小鼠ES细胞和pPSVR KI杂交上的RS-KO小鼠ES细胞的其它克隆获得GIPF变体小鼠。
将鼠保持在12/12-小时黑暗/光照循环(在上午8:00光照)，并随意接受5μm过滤的水和CE-2食物(CLEA JAPAN，INC.)。断乳期后将雄性鼠单独饲养。
实施例35 用转基因GIPF删除突变体-KI小鼠评价GIPF删除突变体的生物学活性 如下评价上面描述的转基因鼠小肠和结肠的大体病理改变和组织学改变。在4周龄时收获GIPF删除突变体-KI(Ckm4-KI和PSm4-KI)小鼠。GIPF删除突变体-KI胃肠道的大体表现与对照组相比略有不同(图72)。为组织病理学评价，将胃肠道切下并固定在福尔马林中。为组织学评价，将石蜡包埋的切片用苏木精和伊红(H&E)染色。小肠的H&E切片如图73(低倍)和图74(高倍)所示。
与对照的相比，GIPF删除突变体-KI小鼠小肠的H&E切片显示隐窝长度和数目中度升高。在PSm4-KI上隐窝长度和数目的升高程度倾向于比Ckm4-KI的高。
用GIPF删除突变体-KI小鼠来源的小肠和结肠标本分析GIPF删除突变体#4基因表达和对β-连环蛋白靶向Axin-2基因表达的诱导。切下50mg的回肠，结肠和肝标本并用液氮快速冷冻。将冷冻的切片用1ml ISOGEN(NIPPON GENE)匀浆，并在建议的条件下提取总RNA。为去除基因组DNA，将RNA溶液用DNA酶(WAKO；脱氧核糖核酸酶RT级)于37℃处理15分钟。然后将总RNA用RNasy Mini(QIAGEN)在建议的条件下纯化。对于每个样品，在建议的条件下使用Super Script III(Invitrogen)从500ng的总RNA合成cDNA。然后将cDNA用1单位的RNaseH(Invitrogen)于37℃处理20分钟以消化残留的RNA。用合成的cDNA作为模板进行PCR。下面的两个引物用于检测GIPF删除突变体PSm4RT F1ATCAAGGGGAAAAGGCAGAG(SEQ ID NO174)，和CkpolyA R2CGCTTGTGGGGAAGCCTCCAAGACC(SEQ ID NO175)。为检测Axin-2，使用下面的两个引物Axin2 F(MUS)CAGGAGCCTCACCCTTCG(SEQID NO138)，和Axin2 R(MUS)ACGCCGAGGTGCTTGCCC(SEQ ID NO139)。小鼠GAPDH引物mGAPDH5CACCATGGAGAAGGCCGGGGCCCAC(SEQ ID NO140)，和mGAPDH3ATCATACTTGGCAGGTTTCTCCAGG(SEQ ID NO141)用于检测管家基因的基因表达。PCR反应混合物的制备通过加入下列物质2.5ul的10X LAPCR缓冲液II(Takara Shuzo)，4ul的2.5mM每种dNTP混合物(TakaraShuzo)，0.5ul的10mM每种引物，2ul的用无菌蒸馏水稀释的10X cDNA和0.5ul的LA Taq(Takara Shuzo)，加入无菌蒸馏水至25μl。为检测GIPF删除突变体和Axin-2，将PCR反应混合物在94℃保温2分钟，用94℃30秒，60℃30秒和72℃30秒进行33个循环的反应。为检测GAPDH，将PCR反应混合物在94℃保温2分钟，用94℃30秒，65℃30秒和72℃30秒进行22个循环的反应。
检测PSm4-KI小鼠回肠和结肠中GIPF删除突变体基因表达。与对照相比，PSm4-KI小鼠中Axin-2的表达水平升高(图75)。这一结果表明GIPF的删除突变型具有诱导β-连环蛋白靶向基因表达的活性，并与β-连环蛋白的下游信号通路激活有关。
因此这表明GIPF删除突变体#4具有刺激β-连环蛋白信号通路的活性。
实施例36 用转基因GIPF变体-KI小鼠评价GIPF变体的生物学活性 如下评价上面描述的转基因鼠小肠和结肠的大体病理改变和组织学改变。在4周龄时收获GIPF变体-KI(CkVR-KI和PSVR-KI)小鼠。与对照小鼠相比较时，收获的PSVR-KI的大体观察表现出其具有明显的肠扩张和增加的小肠重量(图76)。为组织病理学评价，将胃肠道切下并固定在福尔马林中。为组织学评价，将石蜡包埋的切片用苏木精和伊红(H&E)染色。小肠的H&E切片如图77(低倍)和图78(高倍)所示。
小肠的H&E切片显示PSVR-KI和对照明显不同。如图76所示，与对照小鼠相比，证实的PSVR-KI的隐窝细胞增生增加了隐窝长度和潘氏细胞的数目。另一方面，CkVR-KI未表现出明显的肠扩张或隐窝长度增加(结果未显示)。估计观察到的CkVR-KI和PSVR-KI的表型差别是由于其KI-载体结构的不同。
用GIPF变体-KI小鼠来源的小肠和结肠标本分析GIPF变体基因表达和β-连环蛋白靶向Axin-2基因表达的诱导。切下50mg的回肠，结肠和肝标本并用液氮快速冷冻。将冷冻的切片用1ml ISOGEN(NIPPON GENE)匀浆，并在建议的条件下提取总RNA。为去除基因组DNA，将RNA溶液用DNA酶(WAKO；脱氧核糖核酸酶RT级)于37℃处理15分钟。然后将总RNA用RNasy Mini(QIAGEN)在建议的条件下纯化。对于每个样品，在建议的条件下使用Super Script III(Invitrogen)从500ng的总RNA合成cDNA。然后将cDNA用1单位的RNaseH(Invitrogen)于37℃处理20分钟以消化残留的RNA。用合成的cDNA作为模板进行PCR。下面的两个引物用于检测GIPF变体PSFLJRT F1ATAACTTCTGCACCAAGTGTAAGGA(SEQ ID NO176)，和CkpolyA R2CGCTTGTGGGGAAGCCTCCAAGACC(SEQ ID NO175)。为检测Axin-2，使用下面的两个引物Axin2 F(MUS)CAGGAGCCTCACCCTTCG(SEQ ID NO138)，和Axin2 R(MUS)ACGCCGAGGTGCTTGCCC(SEQ ID NO139)。小鼠GAPDH引物mGAPDH5CACCATGGAGAAGGCCGGGGCCCAC(SEQ ID NO140)，和mGAPDH3ATCATACTTGGCAGGTTTCTCCAGG(SEQ ID NO141)用于检测管家基因的基因表达。PCR反应混合物的制备通过加入下列物质2.5ul的10X LA PCR缓冲液II(Takara Shuzo)，4ul的2.5mM每种dNTP混合物(Takara Shuzo)，0.5ul的10mM每种引物，2ul的用无菌蒸馏水稀释的10XcDNA和0.5ul的LA Taq(Takara Shuzo)，加入无菌蒸馏水至25μl。为检测GIPF变体和Axin-2，将PCR反应混合物在94℃保温2分钟，用94℃30秒，60℃30秒和72℃30秒进行33个循环的反应。为检测GAPDH，将PCR反应混合物在94℃保温2分钟，用94℃30秒，65℃30秒和72℃30秒进行23个循环的反应。
检测PSVR-KI小鼠回肠和结肠中GIPF变体基因表达。与对照相比，PSVR-KI小鼠中Axin-2的表达水平升高(图79)。这一结果表明GIPF变体具有诱导β-连环蛋白靶向基因表达的活性，并与β-连环蛋白的下游信号通路激活有关。
因此这表明GIPF变体具有刺激β-连环蛋白信号通路的活性。
实施例37 CD4+CD45RBhighT-细胞转移模型 Aranda等报道通过向免疫缺陷的SCID小鼠转移CD4+CD45RBhigh T淋巴细胞亚群诱导与炎症性肠疾病相似的慢性肠炎(J Immunol1583464-3473)。因此，如下在CD4+CD45RBhigh T细胞转移模型上测试GIPF对免疫诱导的结肠炎的治疗效果。
使7周龄的成年雌性C.B-17/Icr Crj-scid/scid小鼠(CHARLES RIVERJAPAN，INC.)。在从供应商送货到实验前，将动物单独饲养在通风的笼子中2周，并且12小时昼∶夜循环以稳定生物节律。允许动物随意进食进水。
在细胞转移当天(第0天)，从20只BALB/c雌性小鼠脾收集CD4+CD45RBhigh T-细胞。将脾细胞悬于2％FBS，2mM EDTA，PBS分选缓冲液中，并用FACS(Becton Dickinson FACS Aria)分选CD4阳性细胞。然后将分选的CD4阳性细胞以2×107细胞/ml重悬于分选缓冲液中并门控CD4阳性和CD45RBhigh细胞级分。将收集的CD4+CD45RBhigh T-细胞离心并以1.1×106细胞/ml悬于6ml PBS中。通过腹膜内注射将CD4+CD45RBhigh T-细胞以4.5×105细胞/小鼠转移给13只雌性C.B-17/Icr Crj-scid/scid小鼠。
T-细胞转移后，监测血清淀粉状蛋白A(SAA)的浓度以监测炎症进展。而且，通过体重减轻，粪便稠度和潜血试验监测结肠炎的进展。SAA浓度从转移后7天升高并且在T-细胞转移小鼠上炎症明显。T-细胞转移后12天出现稀的粪便和潜血试验阳性个体。T-细胞转移后30天，在T-细胞转移小鼠观察到腹泻和肉眼可见的出血。进一步到40天，在T-细胞转移小鼠观察到体重减轻。从T-细胞转移后61天，向4只T-细胞转移小鼠静脉注射100μg/一次剂量的GIPF注射3天。也向T-细胞转移的小鼠静脉注射3天PBS作为阴性对照。在T-细胞转移后70天，将这些动物处死。切下肠并固定于福尔马林中。为组织学评价，将石蜡包埋的切片用苏木精和伊红(H&E)染色。
如图80所示，与用PBS注射的小鼠相比，注射100μg/一次剂量GIPF鼠的大肠切片的H&E染色显示清晰的腺体结构，增加的有丝分裂细胞数目和减少的坏死细胞碎片。T-细胞转移引起的大肠粘膜的组织病理学改变确实被GIPF注射所减轻。因此，可以将GIPF用于治疗患有炎症性肠疾病包括克罗恩氏病引起的黏膜炎的患者。
序列表
<110>纽维洛股份有限公司(Nuvelo，Inc.and Kirin Beer Kapushiko Kaisha)
<120>胃肠增殖因子及其用途
<130>11926-194WO1
<150>US 60/539,605
<151>2004-01-27
<150>US 60/619,241
<151>2004-10-15
<160>178
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>380
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
ttcccgggtc gacttcacgc gtcggaggaa gggaggccag ggccggcggg agaatgccaa 60
caggaacctg gccaggaagg agagcaagga ggcgggtgct ggctctcgaa gacgcaaggg120
gcagcaacag cagcagcagc aagggacagt ggggccactc acatctgcag ggcctgccta180
gggacactgt ccagcctcca ggcccatgca gaaagagttc agtgctactc tgcgtgattc240
aagctttcct gaactggaac gtcgggggca aagcatacac acacactcca atccatccat300
gcatacacag acacaagaca cacacgctca aacccctgtc cacatataca accatacata360
cttgcacatg tgtgttcatg380
<210>2
<211>2339
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
cgggtcgacg atttcgtcgc gccctcgccc ctcccgggcc tgcccccgtc gcgactggca 60
gcacgaagct gagattgtgg tttcctggtg attcaggtgg gagtgggcca gaagatcacc120
gctggcaagg actggtgttt gtcaactgta aggactcatg gaacagatct accagggatt180
ctcagacctt agtttgagaa atgctgcaat taaaggcaaa tcctatcact ctgagtgatc240
gctttggtgt cgaggcaatc aaccataaag ataaatgcaa atatggaaat tgcataacag300
tactcagtat taaggttggt ttttggagta gtccctgctg acgtgacaaa aagatctctc360
atatgatatt ccgaggtatc tttgaggaag tctctctttg aggacctccc tttgagctga420
tggagaactg ggctccccac accctctctg tccccagctg agattatggt ggatttgggc480
tacggcccag gcctgggcct cctgctgctg acccagcccc agaggtgtta gcaagagccg540
tgtgctatcc accctccccg agaccacccc tccgaccagg ggcctggagc tggcgcgtga600
ctatgcggct tgggctgtgt gtggtggccc tggttctgag ctggacgcac ctcaccatca660
gcagccgggg gatcaagggg aaaaggcaga ggcggatcag tgccgagggg agccaggcct 720
gtgccaaagg ctgtgagctc tgctctgaag tcaacggctg cctcaagtgc tcacccaagc 780
tgttcatcct gctggagagg aacgacatcc gccaggtggg cgtctgcttg ccgtcctgcc 840
cacctggata cttcgacgcc cgcaaccccg acatgaacaa gtgcatcaaa tgcaagatcg 900
agcactgtga ggcctgcttc agccataact tctgcaccaa gtgtaaggag ggcttgtacc 960
tgcacaaggg ccgctgctat ccagcttgtc ccgagggctc ctcagctgcc aatggcacca1020
tggagtgcag tagtcctgcg caatgtgaaa tgagcgagtg gtctccgtgg gggccctgct1080
ccaagaagca gcagctctgt ggtttccgga ggggctccga ggagcggaca cgcagggtgc1140
tacatgcccc tgtgggggac catgctgcct gctctgacac caaggagacc cggaggtgca1200
cagtgaggag agtgccgtgt cctgaggggc agaagaggag gaagggaggc cagggccggc1260
gggagaatgc caacaggaac ctggccagga aggagagcaa ggaggcgggt gctggctctc1320
gaagacgcaa ggggcagcaa cagcagcagc agcaagggac agtggggcca ctcacatctg1380
cagggcctgc ctagggacac tgtccagcct ccaggcccat gcagaaagag ttcagtgcta1440
ctctgcgtga ttcaagcttt cctgaactgg aacgtcgggg gcaaagcata cacacacact1500
ccaatccatc catgcataca cagacacaag acacacacgc tcaaacccct gtccacatat1560
acaaccatac atacttgcac atgtgtgttc atgtacacac gcagacacag acaccacaca1620
cacacataca cacacacaca cacacgcaca cctgaggcca ccagaagaca cttccatccc1680
tcgggcccag cagtacacac ttggtttcca gagctcccag tggacatgtc agagacaaca1740
cttcccagca tctgagacca aactgcagag gggagccttc tggagaagct gctgggatcg1800
gaccagccac tgtggcagat gggagccaag cttgaggact gctggtggcc tgggaagaaa1860
ccttcttccc atcctgttca gcactcccag ctgtgtgact ttatcgttgg agagtattgt1920
taccttccag gatacatatc agggttaacc tgactttgaa aactgcttaa aggtttattt1980
caaattaaaa caaaaaaatc aacgacagca gtagacacag gcaccacatt cctttgcagg2040
gtgtgagggt ttggcgaggt atgcgtagga gcaagaaggg acagggaatt tcaagagacc2100
ccaaatagcc tgctcagtag agggtcatgc agacaaggaa gaaaacttag gggctgctct2160
gacggtggta aacaggctgt ctatatcctt gttactcaga gcatggcccg gcagcagtgt2220
tgtcacaggg cagcttgtta ggaatgataa tctcaggtct cattccagac ctggagagcc2280
atgagtctaa attttaagat tcctgatgat tggcatgtta cccaaatttg agaagtgct 2339
<210>3
<211>789
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>3
atgcggcttg ggctgtgtgt ggtggccctg gttctgagct ggacgcacct caccatcagc 60
agccggggga tcaaggggaa aaggcagagg cggatcagtg ccgaggggag ccaggcctgt120
gccaaaggct gtgagctctg ctctgaagtc aacggctgcc tcaagtgctc acccaagctg180
ttcatcctgc tggagaggaa cgacatccgc caggtgggcg tctgcttgcc gtcctgccca240
cctggatact tcgacgcccg caaccccgac atgaacaagt gcatcaaatg caagatcgag300
cactgtgagg cctgcttcag ccataacttc tgcaccaagt gtaaggaggg cttgtacctg360
cacaagggcc gctgctatcc agcttgtccc gagggctcct cagctgccaa tggcaccatg420
gagtgcagta gtcctgcgca atgtgaaatg agcgagtggt ctccgtgggg gccctgctcc480
aagaagcagc agctctgtgg tttccggagg ggctccgagg agcggacacg cagggtgcta540
catgcccctg tgggggacca tgctgcctgc tctgacacca aggagacccg gaggtgcaca600
gtgaggagag tgccgtgtcc tgaggggcag aagaggagga agggaggcca gggccggcgg660
gagaatgcca acaggaacct ggccaggaag gagagcaagg aggcgggtgc tggctctcga720
agacgcaagg ggcagcaaca gcagcagcag caagggacag tggggccact cacatctgca780
gggcctgcc789
<210>4
<211>263
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Met Arg Leu Gly Leu Cys Val Val Ala Leu Val Leu Ser Trp Thr His
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile
20 25 30
Ser Ala Glu Gly Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser
35 40 45
Glu Val Asn Gly Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu
50 55 60
Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro
65 70 75 80
Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys
85 90 95
Cys Lys Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr
100 105 110
Lys Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala
115 120 125
Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser
130 135 140
Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser
145 150 155 160
Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr
165 170 175
Arg Arg Val Leu His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp
180 185 190
Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val Pro Cys Pro Glu
195 200 205
Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn
210 215 220
Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser Arg
225 230 235 240
Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Thr Val Gly Pro
245 250 255
Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala
260
<210>5
<211>927
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GIPF V5His标记
<400>5
atgcggcttg ggctgtgtgt ggtggccctg gttctgagct ggacgcacct caccatcagc 60
agccggggga tcaaggggaa aaggcagagg cggatcagtg ccgaggggag ccaggcctgt120
gccaaaggct gtgagctctg ctctgaagtc aacggctgcc tcaagtgctc acccaagctg180
ttcatcctgc tggagaggaa cgacatccgc caggtgggcg tctgcttgcc gtcctgccca240
cctggatact tcgacgcccg caaccccgac atgaacaagt gcatcaaatg caagatcgag300
cactgtgagg cctgcttcag ccataacttc tgcaccaagt gtaaggaggg cttgtacctg360
cacaagggcc gctgctatcc agcttgtccc gagggctcct cagctgccaa tggcaccatg420
gagtgcagta gtcctgcgca atgtgaaatg agcgagtggt ctccgtgggg gccctgctcc480
aagaagcagc agctctgtgg tttccggagg ggctccgagg agcggacacg cagggtgcta540
catgcccctg tgggggacca tgctgcctgc tctgacacca aggagacccg gaggtgcaca600
gtgaggagag tgccgtgtcc tgaggggcag aagaggagga agggaggcca gggccggcgg660
gagaatgcca acaggaacct ggccaggaag gagagcaagg aggcgggtgc tggctctcga720
agacgcaagg ggcagcaaca gcagcagcag caagggacag tggggccact cacatctgca780
gggcctgcca agggcaattc tgcagatatc cagcacagtg gcggccgctc gagtctagag840
ggcccgcggt tcgaaggtaa gcctatccct aaccctctcc tcggtctcga ttctacgcgt900
accggtcatc atcaccatca ccattga927
<210>6
<211>308
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>GIPF V5His标记
<400>6
Met Arg Leu Gly Leu Cys Val Val Ala Leu Val Leu Ser Trp Thr His
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile
20 25 30
Ser Ala Glu Gly Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser
35 40 45
Glu Val Asn Gly Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu
50 55 60
Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro
65 70 75 80
Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys
85 90 95
Cys Lys Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr
100 105 110
Lys Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala
115 120 125
Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser
130 135 140
Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser
145 150 155 160
Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr
165 170 175
Arg Arg Val Leu His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp
180 185 190
Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val Pro Cys Pro Glu
195 200 205
Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn
210 215 220
Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser Arg
225 230 235 240
Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Thr Val Gly Pro
245 250 255
Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala Lys Gly Asn Ser Ala Asp Ile Gln His
260 265 270
Ser Gly Gly Arg Ser Ser Leu Glu Gly Pro Arg Phe Glu Gly Lys Pro
275 280 285
Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His
290 295 300
His His His His
305
<210>7
<211>60
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(60)
<400>7
atg cgg ctt ggg ctg tgt gtg gtg gcc ctg gtt ctg agc tgg acg cac48
Met Arg Leu Gly Leu Cys Val Val Ala Leu Val Leu Ser Trp Thr His
1 5 10 15
ctc acc atc agc60
Leu Thr Ile Ser
20
<210>8
<211>20
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>8
Met Arg Leu Gly Leu Cys Val Val Ala Leu Val Leu Ser Trp Thr His
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser
20
<210>9
<211>732
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(729)
<400>9
agc cgg ggg atc aag ggg aaa agg cag agg cgg atc agt gcc gag ggg 48
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
agc cag gcc tgt gcc aaa ggc tgt gag ctc tgc tct gaa gtc aac ggc 96
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
tgc ctc aag tgc tca ccc aag ctg ttc atc ctg ctg gag agg aac gac144
Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp
35 40 45
atc cgc cag gtg ggc gtc tgc ttg ccg tcc tgc cca cct gga tac ttc192
Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe
50 55 60
gac gcc cgc aac ccc gac atg aac aag tgc atc aaa tgc aag atc gag240
Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu
65 70 75 80
cac tgt gag gcc tgc ttc agc cat aac ttc tgc acc aag tgt aag gag288
His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu
85 90 95
ggc ttg tac ctg cac aag ggc cgc tgc tat cca gct tgt ccc gag ggc336
Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly
100 105 110
tcc tca gct gcc aat ggc acc atg gag tgc agt agt cct gcg caa tgt384
Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys
115 120 125
gaa atg agc gag tgg tct ccg tgg ggg ccc tgc tcc aag aag cag cag432
Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln
130 135 140
ctc tgt ggt ttc cgg agg ggc tcc gag gag cgg aca cgc agg gtg cta480
Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu
145 150 155 160
cat gcc cct gtg ggg gac cat gct gcc tgc tct gac acc aag gag acc528
His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr
165 170 175
cgg agg tgc aca gtg agg aga gtg ccg tgt cct gag ggg cag aag agg576
Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val Pro Cys Pro Glu Gly Gln Lys Arg
180 185 190
agg aag gga ggc cag ggc cgg cgg gag aat gcc aac agg aac ctg gcc624
Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn Arg Asn Leu Ala
195 200 205
agg aag gag agc aag gag gcg ggt gct ggc tct cga aga cgc aag ggg672
Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser Arg Arg Arg Lys Gly
210 215 220
cag caa cag cag cag cag caa ggg aca gtg ggg cca ctc aca tct gca720
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Thr Val Gly Pro Leu Thr Ser Ala
225 230 235 240
ggg cct gcc tag732
Gly Pro Ala
<210>10
<211>243
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>10
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp
35 40 45
Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe
50 55 60
Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu
65 70 75 80
His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu
85 90 95
Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly
100 105 110
Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys
115 120 125
Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln
130 135 140
Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu
145 150 155 160
His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr
165 170 175
Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val Pro Cys Pro Glu Gly Gln Lys Arg
180 185 190
Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn Arg Asn Leu Ala
195 200 205
Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser Arg Arg Arg Lys Gly
210 215 220
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Thr Val Gly Pro Leu Thr Ser Ala
225 230 235 240
Gly Pro Ala
<210>11
<211>696
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(696)
<400>11
atc agt gcc gag ggg agc cag gcc tgt gcc aaa ggc tgt gag ctc tgc 48
Ile Ser Ala Glu Gly Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys
1 5 10 15
tct gaa gtc aac ggc tgc ctc aag tgc tca ccc aag ctg ttc atc ctg 96
Ser Glu Val Asn Gly Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu
20 25 30
ctg gag agg aac gac atc cgc cag gtg ggc gtc tgc ttg ccg tcc tgc144
Leu Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys
35 40 45
cca cct gga tac ttc gac gcc cgc aac ccc gac atg aac aag tgc atc192
Pro Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile
50 55 60
aaa tgc aag atc gag cac tgt gag gcc tgc ttc agc cat aac ttc tgc240
Lys Cys Lys Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys
65 70 75 80
acc aag tgt aag gag ggc ttg tac ctg cac aag ggc cgc tgc tat cca288
Thr Lys Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro
85 90 95
gct tgt ccc gag ggc tcc tca gct gcc aat ggc acc atg gag tgc agt336
Ala Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser
100 105 110
agt cct gcg caa tgt gaa atg agc gag tgg tct ccg tgg ggg ccc tgc384
Ser Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys
115 120 125
tcc aag aag cag cag ctc tgt ggt ttc cgg agg ggc tcc gag gag cgg432
Ser Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg
130 135 140
aca cgc agg gtg cta cat gcc cct gtg ggg gac cat gct gcc tgc tct480
Thr Arg Arg yal Leu His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser
145 150 155 160
gac acc aag gag acc cgg agg tgc aca gtg agg aga gtg ccg tgt cct528
Asp Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val Pro Cys Pro
165 170 175
gag ggg cag aag agg agg aag gga ggc cag ggc cgg cgg gag aat gcc576
Glu Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala
180 185 190
aac agg aac ctg gcc agg aag gag agc aag gag gcg ggt gct ggc tct624
Asn Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser
195 200 205
cga aga cgc aag ggg cag caa cag cag cag cag caa ggg aca gtg ggg672
Arg Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Thr Val Gly
210 215 220
cca ctc aca tct gca ggg cct gcc696
Pro Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala
225 230
<210>12
<211>232
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>12
Ile Ser Ala Glu Gly Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys
1 5 10 15
Ser Glu Val Asn Gly Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu
20 25 30
Leu Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys
35 40 45
Pro Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile
50 55 60
Lys Cys Lys Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys
65 70 75 80
Thr Lys Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro
85 90 95
Ala Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser
100 105 110
Ser Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys
115 120 125
Ser Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg
130 135 140
Thr Arg Arg Val Leu His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser
145 150 155 160
Asp Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val Pro Cys Pro
165 170 175
Glu Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala
180 185 190
Asn Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser
195 200 205
Arg Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Thr Val Gly
210 215 220
Pro Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala
225 230
<210>13
<211>168
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(168)
<400>13
agc gag tgg tct ccg tgg ggg ccc tgc tcc aag aag cag cag ctc tgt 48
Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln Leu Cys
1 5 10 15
ggt ttc cgg agg ggc tcc gag gag cgg aca cgc agg gtg cta cat gcc 96
Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu His Ala
20 25 30
cct gtg ggg gac cat gct gcc tgc tct gac acc aag gag acc cgg agg144
Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr Arg Arg
35 40 45
tgc aca gtg agg aga gtg ccg tgt168
Cys Thr Val Arg Arg Val Pro Cys
50 55
<210>14
<211>56
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>14
Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln Leu Cys
1 5 10 15
Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu His Ala
20 25 30
Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr Arg Arg
35 40 45
Cys Thr Val Arg Arg Val Pro Cys
50 55
<210>15
<211>756
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GIPF+sigP-弗林蛋白酶
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(756)
<400>15
atg cgg ctt ggg ctg tgt gtg gtg gcc ctg gtt ctg agc tgg acg cac48
Met Arg Leu Gly Leu Cys Val Val Ala Leu Val Leu Ser Trp Thr His
1 5 10 15
ctc acc atc agc atc agt gcc gag ggg agc cag gcc tgt gcc aaa ggc 96
Leu Thr Ile Ser Ile Ser Ala Glu Gly Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly
20 25 30
tgt gag ctc tgc tct gaa gtc aac ggc tgc ctc aag tgc tca ccc aag144
Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys
35 40 45
ctg ttc atc ctg ctg gag agg aac gac atc cgc cag gtg ggc gtc tgc192
Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val Cys
50 55 60
ttg ccg tcc tgc cca cct gga tac ttc gac gcc cgc aac ccc gac atg240
Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met
65 70 75 80
aac aag tgc atc aaa tgc aag atc gag cac tgt gag gcc tgc ttc agc288
Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe Ser
85 90 95
cat aac ttc tgc acc aag tgt aag gag ggc ttg tac ctg cac aag ggc336
His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly
100 105 110
cgc tgc tat cca gct tgt ccc gag ggc tcc tca gct gcc aat ggc acc384
Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr
115 120 125
atg gag tgc agt agt cct gcg caa tgt gaa atg agc gag tgg tct ccg432
Met Glu Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro
130 135 140
tgg ggg ccc tgc tcc aag aag cag cag ctc tgt ggt ttc cgg agg ggc480
Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly
145 150 155 160
tcc gag gag cgg aca cgc agg gtg cta cat gcc cct gtg ggg gac cat528
Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu His Ala Pro Val Gly Asp His
165 170 175
gct gcc tgc tct gac acc aag gag acc cgg agg tgc aca gtg agg aga576
Ala Ala Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg
180 185 190
gtg ccg tgt cct gag ggg cag aag agg agg aag gga ggc cag ggc cgg624
Val Pro Cys Pro Glu Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg
195 200 205
cgg gag aat gcc aac agg aac ctg gcc agg aag gag agc aag gag gcg672
Arg Glu Asn Ala Asn Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala
210 215 220
ggt gct ggc tct cga aga cgc aag ggg cag caa cag cag cag cag caa720
Gly Ala Gly Ser Arg Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
225 230 235 240
ggg aca gtg ggg cca ctc aca tct gca ggg cct gcc756
Gly Thr Val Gly Pro Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala
245 250
<210>16
<211>252
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>16
Met Arg Leu Gly Leu Cys Val Val Ala Leu Val Leu Ser Trp Thr His
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ile Ser Ala Glu Gly Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly
20 25 30
Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys
35 40 45
Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val Cys
50 55 60
Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met
65 70 75 80
Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe Ser
85 90 95
His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly
100 105 110
Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr
115 120 125
Met Glu Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro
130 135 140
Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly
145 150 155 160
Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu His Ala Pro Val Gly Asp His
165 170 175
Ala Ala Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg
180 185 190
Val Pro Cys Pro Glu Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg
195 200 205
Arg Glu Asn Ala Asn Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala
210 215 220
Gly Ala Gly Ser Arg Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
225 230 235 240
Gly Thr Val Gly Pro Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala
245 250
<210>17
<211>789
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GIPF-发生突变的弗林蛋白酶切割位点
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(789)
<400>17
atg cgg ctt ggg ctg tgt gtg gtg gcc ctg gtt ctg agc tgg acg cac 48
Met Arg Leu Gly Leu Cys Val Val Ala Leu Val Leu Ser Trp Thr His
1 5 10 15
ctc acc atc agc agc cgg ggg atc aag ggg aaa cag cag agg cgg atc 96
Leu Thr Ile Ser Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Gln Gln Arg Arg Ile
20 25 30
agt gcc gag ggg agc cag gcc tgt gcc aaa ggc tgt gag ctc tgc tct144
Ser Ala Glu Gly Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser
35 40 45
gaa gtc aac ggc tgc ctc aag tgc tca ccc aag ctg ttc atc ctg ctg192
Glu Val Asn Gly Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu
50 55 60
gag agg aac gac atc cgc cag gtg ggc gtc tgc ttg ccg tcc tgc cca240
Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro
65 70 75 80
cct gga tac ttc gac gcc cgc aac ccc gac atg aac aag tgc atc aaa288
Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys
85 90 95
tgc aag atc gag cac tgt gag gcc tgc ttc agc cat aac ttc tgc acc336
Cys Lys Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr
100 105 110
aag tgt aag gag ggc ttg tac ctg cac aag ggc cgc tgc tat cca gct384
Lys Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala
115 120 125
tgt ccc gag ggc tcc tca gct gcc aat ggc acc atg gag tgc agt agt432
Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser
130 135 140
cct gcg caa tgt gaa atg agc gag tgg tct ccg tgg ggg ccc tgc tcc480
Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser
145 150 155 160
aag aag cag cag ctc tgt ggt ttc cgg agg ggc tcc gag gag cgg aca528
Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr
165 170 175
cgc agg gtg cta cat gcc cct gtg ggg gac cat gct gcc tgc tct gac576
Arg Arg Val Leu His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp
180 185 190
acc aag gag acc cgg agg tgc aca gtg agg aga gtg ccg tgt cct gag624
Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val Pro Cys Pro Glu
195 200 205
ggg cag aag agg agg aag gga ggc cag ggc cgg cgg gag aat gcc aac672
Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn
210 215 220
agg aac ctg gcc agg aag gag agc aag gag gcg ggt gct ggc tct cga720
Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser Arg
225 230 235 240
aga cgc aag ggg cag caa cag cag cag cag caa ggg aca gtg ggg cca768
Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Thr Val Gly Pro
245 250 255
ctc aca tct gca ggg cct gcc789
Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala
260
<210>18
<211>263
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>18
Met Arg Leu Gly Leu Cys Val Val Ala Leu Val Leu Ser Trp Thr His
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Gln Gln Arg Arg Ile
20 25 30
Ser Ala Glu Gly Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser
35 40 45
Glu Val Asn Gly Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu
50 55 60
Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro
65 70 75 80
Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys
85 90 95
Cys Lys Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr
100 105 110
Lys Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala
115 120 125
Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser
130 135 140
Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser
145 150 155 160
Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr
165 170 175
Arg Arg Val Leu His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp
180 185 190
Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val Pro Cys Pro Glu
195 200 205
Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn
210 215 220
Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser Arg
225 230 235 240
Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Thr Val Gly Pro
245 250 255
Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala
260
<210>19
<211>12
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(12)
<400>19
agg cag agg cgg 12
Arg Gln Arg Arg
1
<210>20
<211>4
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>20
Arg Gln Arg Arg
1
<210>21
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>突变的弗林蛋白酶切割位点
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(12)
<400>21
cag cag agg cgg 12
Gln Gln Arg Arg
1
<210>22
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>22
Gln Gln Arg Arg
1
<210>23
<211>272
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>23
Met His Leu Arg Leu Ile Ser Trp Leu Phe Ile Ile Leu Asn Phe Met
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Gly Ser Gln Asn Ala Ser Arg Gly Arg Arg Gln Arg Arg
20 25 30
Met His Pro Asn Val Ser Gln Gly Cys Gln Gly Gly Cys Ala Thr Cys
35 40 45
Ser Asp Tyr Asn Gly Cys Leu Ser Cys Lys Pro Arg Leu Phe Phe Ala
50 55 60
Leu Glu Arg Ile Gly Met Lys Gln Ile Gly Val Cys Leu Ser Ser Cys
65 70 75 80
Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly Thr Arg Tyr Pro Asp Ile Asn Lys Cys Thr
85 90 95
Lys Cys Lys Ala Asp Cys Asp Thr Cys Phe Asn Lys Asn Phe Cys Thr
100 105 110
Lys Cys Lys Ser Gly Phe Tyr Leu His Leu Gly Lys Cys Leu Asp Asn
115 120 125
Cys Pro Glu Gly Leu Glu Ala Asn Asn His Thr Met Glu Cys Val Ser
130 135 140
Ile Val His Cys Glu Val Ser Glu Trp Asn Pro Trp Ser Pro Cys Thr
145 150 155 160
Lys Lys Gly Lys Thr Cys Gly Phe Lys Arg Gly Thr Glu Thr Arg Val
165 170 175
Arg Glu Ile Ile Gln His Pro Ser Ala Lys Gly Asn Leu Cys Pro Pro
180 185 190
Thr Asn Glu Thr Arg Lys Cys Thr Val Gln Arg Lys Lys Cys Gln Lys
195 200 205
Gly Glu Arg Gly Lys Lys Gly Arg Glu Arg Lys Arg Lys Lys Pro Asn
210 215 220
Lys Gly Glu Ser Lys Glu Ala Ile Pro Asp Ser Lys Ser Leu Glu Ser
225 230 235 240
Ser Lys Glu Ile Pro Glu Gln Arg Glu Asn Lys Gln Gln Gln Lys Lys
245 250 255
Arg Lys Val Gln Asp Lys Gln Lys Ser Val Ser Val Ser Thr Val His
260 265 270
<210>24
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>24
Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser
1 5 10 15
<210>25
<211>32
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>25
Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly Ser Gln Ala Cys Ala
1 5 10 15
Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly Cys Leu Lys Cys Ser
20 25 30
<210>26
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>26
Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys
1 5 10 15
Lys
<210>27
<211>4
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>27
Asn Gly Thr Met
1
<210>28
<211>1170
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>28
Met Gly Leu Ala Trp Gly Leu Gly Val Leu Phe Leu Met His Val Cys
1 5 10 15
Gly Thr Asn Arg Ile Pro Glu Ser Gly Gly Asp Asn Ser Val Phe Asp
20 25 30
Ile Phe Glu Leu Thr Gly Ala Ala Arg Lys Gly Ser Gly Arg Arg Leu
35 40 45
Val Lys Gly Pro Asp Pro Ser Ser Pro Ala Phe Arg Ile Glu Asp Ala
50 55 60
Asn Leu Ile Pro Pro Val Pro Asp Asp Lys Phe Gln Asp Leu Val Asp
65 70 75 80
Ala Val Arg Thr Glu Lys Gly Phe Leu Leu Leu Ala Ser Leu Arg Gln
85 90 95
Met Lys Lys Thr Arg Gly Thr Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Asp His
100 105 110
Ser Gly Gln Val Phe Ser Val Val Ser Asn Gly Lys Ala Gly Thr Leu
115 120 125
Asp Leu Ser Leu Thr Val Gln Gly Lys Gln His Val Val Ser Val Glu
130 135 140
Glu Ala Leu Leu Ala Thr Gly Gln Trp Lys Ser Ile Thr Leu Phe Val
145 150 155 160
Gln Glu Asp Arg Ala Gln Leu Tyr Ile Asp Cys Glu Lys Met Glu Asn
165 170 175
Ala Glu Leu Asp Val Pro Ile Gln Ser Val Phe Thr Arg Asp Leu Ala
180 185 190
Ser Ile Ala Arg Leu Arg Ile Ala Lys Gly Gly Val Asn Asp Asn Phe
195 200 205
Gln Gly Val Leu Gln Asn Val Arg Phe Val Phe Gly Thr Thr Pro Glu
210 215 220
Asp Ile Leu Arg Asn Lys Gly Cys Ser Ser Ser Thr Ser Val Leu Leu
225 230 235 240
Thr Leu Asp Asn Asn Val Val Asn Gly Ser Ser Pro Ala Ile Arg Thr
245 250 255
Asn Tyr Ile Gly His Lys Thr Lys Asp Leu Gln Ala Ile Cys Gly Ile
260 265 270
Ser Cys Asp Glu Leu Ser Ser Met Val Leu Glu Leu Arg Gly Leu Arg
275 280 285
Thr Ile Val Thr Thr Leu Gln Asp Ser Ile Arg Lys Val Thr Glu Glu
290 295 300
Asn Lys Glu Leu Ala Asn Glu Leu Arg Arg Pro Pro Leu Cys Tyr His
305 310 315 320
Asn Gly Val Gln Tyr Arg Asn Asn Glu Glu Trp Thr Val Asp Ser Cys
325 330 335
Thr Glu Cys His Cys Gln Asn Ser Val Thr Ile Cys Lys Lys Val Ser
340 345 350
Cys Pro Ile Met Pro Cys Ser Asn Ala Thr Val Pro Asp Gly Glu Cys
355 360 365
Cys Pro Arg Cys Trp Pro Ser Asp Ser Ala Asp Asp Gly Trp Ser Pro
370 375 380
Trp Ser Glu Trp Thr Ser Cys Ser Thr Ser Cys Gly Asn Gly Ile Gln
385 390 395 400
Gln Arg Gly Arg Ser Cys Asp Ser Leu Asn Asn Arg Cys Glu Gly Ser
405 410 415
Ser Val Gln Thr Arg Thr Cys His Ile Gln Glu Cys Asp Lys Arg Phe
420 425 430
Lys Gln Asp Gly Gly Trp Ser His Trp Ser Pro Trp Ser Ser Cys Ser
435 440 445
Val Thr Cys Gly Asp Gly Val Ile Thr Arg Ile Arg Leu Cys Asn Ser
450 455 460
Pro Ser Pro Gln Met Asn Gly Lys Pro Cys Glu Gly Glu Ala Arg Glu
465 470 475 480
Thr Lys Ala Cys Lys Lys Asp Ala Cys Pro Ile Asn Gly Gly Trp Gly
485 490 495
Pro Trp Ser Pro Trp Asp Ile Cys Ser Val Thr Cys Gly Gly Gly Val
500 505 510
Gln Lys Arg Ser Arg Leu Cys Asn Asn Pro Thr Pro Gln Phe Gly Gly
515 520 525
Lys Asp Cys Val Gly Asp Val Thr Glu Asn Gln Ile Cys Asn Lys Gln
530 535 540
Asp Cys Pro Ile Asp Gly Cys Leu Ser Asn Pro Cys Phe Ala Gly Val
545 550 555 560
Lys Cys Thr Ser Tyr Pro Asp Gly Ser Trp Lys Cys Gly Ala Cys Pro
565 570 575
Pro Gly Tyr Ser Gly Asn Gly Ile Gln Cys Thr Asp Val Asp Glu Cys
580 585 590
Lys Glu Val Pro Asp Ala Cys Phe Asn His Asn Gly Glu His Arg Cys
595 600 605
Glu Asn Thr Asp Pro Gly Tyr Asn Cys Leu Pro Cys Pro Pro Arg Phe
610 615 620
Thr Gly Ser Gln Pro Phe Gly Gln Gly Val Glu His Ala Thr Ala Asn
625 630 635 640
Lys Gln Val Cys Lys Pro Arg Asn Pro Cys Thr Asp Gly Thr His Asp
645 650 655
Cys Asn Lys Asn Ala Lys Cys Asn Tyr Leu Gly His Tyr Ser Asp Pro
660 665 670
Met Tyr Arg Cys Glu Cys Lys Pro Gly Tyr Ala Gly Asn Gly Ile Ile
675 680 685
Cys Gly Glu Asp Thr Asp Leu Asp Gly Trp Pro Asn Glu Asn Leu Val
690 695 700
Cys Val Ala Asn Ala Thr Tyr His Cys Lys Lys Asp Asn Cys Pro Asn
705 710 715 720
Leu Pro Asn Ser Gly Gln Glu Asp Tyr Asp Lys Asp Gly Ile Gly Asp
725 730 735
Ala Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asn Asp Lys Ile Pro Asp Asp Arg Asp
740 745 750
Asn Cys Pro Phe His Tyr Asn Pro Ala Gln Tyr Asp Tyr Asp Arg Asp
755 760 765
Asp Val Gly Asp Arg Cys Asp Asn Cys Pro Tyr Asn His Asn Pro Asp
770 775 780
Gln Ala Asp Thr Asp Asn Asn Gly Glu Gly Asp Ala Cys Ala Ala Asp
785 790 795 800
Ile Asp Gly Asp Gly Ile Leu Asn Glu Arg Asp Asn Cys Gln Tyr Val
805 810 815
Tyr Asn Val Asp Gln Arg Asp Thr Asp Met Asp Gly Val Gly Asp Gln
820 825 830
Cys Asp Asn Cys Pro Leu Glu His Asn Pro Asp Gln Leu Asp Ser Asp
835 840 845
Ser Asp Arg Ile Gly Asp Thr Cys Asp Asn Asn Gln Asp Ile Asp Glu
850 855 860
Asp Gly His Gln Asn Asn Leu Asp Asn Cys Pro Tyr Val Pro Asn Ala
865 870 875 880
Asn Gln Ala Asp His Asp Lys Asp Gly Lys Gly Asp Ala Cys Asp His
885 890 895
Asp Asp Asp Asn Asp Gly Ile Pro Asp Asp Lys Asp Asn Cys Arg Leu
900 905 910
Val Pro Asn Pro Asp Gln Lys Asp Ser Asp Gly Asp Gly Arg Gly Asp
915 920 925
Ala Cys Lys Asp Asp Phe Asp His Asp Ser Val Pro Asp Ile Asp Asp
930 935 940
Ile Cys Pro Glu Asn Val Asp Ile Ser Glu Thr Asp Phe Arg Arg Phe
945 950 955 960
Gln Met Ile Pro Leu Asp Pro Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Pro Asn
965 970 975
Trp Val Val Arg His Gln Gly Lys Glu Leu Val Gln Thr Val Asn Cys
980 985 990
Asp Pro Gly Leu Ala Val Gly Tyr Asp Glu Phe Asn Ala Val Asp Phe
995 1000 1005
Ser Gly Thr Phe Phe Ile Asn Thr Glu Arg Asp Asp Asp Tyr Ala
1010 1015 1020
Gly Phe Val Phe Gly Tyr Gln Ser Ser Ser Arg Phe Tyr Val Val
1025 1030 1035
Met Trp Lys Gln Val Thr Gln Ser Tyr Trp Asp Thr Asn Pro Thr
1040 1045 1050
Arg Ala Gln Gly Tyr Ser Gly Leu Ser Val Lys Val Val Asn Ser
1055 1060 1065
Thr Thr Gly Pro Gly Glu His Leu Arg Asn Ala Leu Trp His Thr
1070 1075 1080
Gly Asn Thr Pro Gly Gln Val Arg Thr Leu Trp His Asp Pro Arg
1085 1090 1095
His Ile Gly Trp Lys Asp Phe Thr Ala Tyr Arg Trp Arg Leu Ser
1100 1105 1110
His Arg Pro Lys Thr Gly Phe Ile Arg Val Val Met Tyr Glu Gly
1115 1120 1125
Lys Lys Ile Met Ala Asp Ser Gly Pro Ile Tyr Asp Lys Thr Tyr
1130 1135 1140
Ala Gly Gly Arg Leu Gly Leu Phe Val Phe Ser Gln Glu Met Val
1145 1150 1155
Phe Phe Ser Asp Leu Lys Tyr Glu Cys Arg Asp Pro
1160 1165 1170
<210>29
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>29
gaccatgctg cctgctctga cac23
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>30
cacccgcctc cttgctctcc20
<210>31
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>31
gggggagacc acaccacctg ct 22
<210>32
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>32
ttggacctcg gctccttgct gttc 24
<210>33
<211>5495
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(5495)
<223>n＝G，A，T，或C
<400>33
cttatctttc tcctttatta acggttgctg ttgtatccat aactcaattc caaaggatat 60
aaaccttaac atatagatat aattttgtgt accttctatg aaacagcatt aaagcaaaga120
agttcaaata gaaagactgg cttagttatt attaactaag agatgctagt gagttctaaa180
ttaataccat ttaaaattta taatttgcag aattaccacc accaccacca ctcagcccag240
gaaaagttac aaagaactgg ctgtaccatt tgtttgtttt cctccttttt agagttcttt300
tatttatgtg tgagtgaatg ccatgtactt gtggatgcag aggctgtcag attccttgca360
gctggagtaa cagacagttg tgagctactt atagtactag aactaagatc ctatggaaga420
gcagcgagtg ccactaactg ctgagccacc tctccagccc atttctttat ttttcaatga480
acaaataata agcagtccta tgtgacatgc ttctaaagca aaagatataa tatttagtat540
tatatacatt aataataaaa tacattatct tctaagaatt gaagtctcaa ctatgaaaat600
cagcagttct ctgtcagaga agcccaagcg cttccacgca tgcttggaga gggggttaag660
ctttcgccta cccactgctc tgttcctctt cagtgaggag ggtttttgta cagccagaca720
gtggagtact accactgtgg tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgta780
agtagaatcc aaagtctctt tcttccgttg tctatgtctg tggcttctat gtctaaaaat840
gatgtataaa atcttactct gaaaccagat tctggcactc tccaaggcaa agatacagag900
taactccgta agcaaagctg ggaataggct agacatgttc tctggagaat gaatgccagt960
gtaataatta acacaagtga tagtttcaga aatgctcaaa gaagcagggt agcctgccct 1020
agacaaacct ttactcggtg ctcagaccat gctcagtttt tgtatggggg ttgagtgaag 1080
ggacaccagt gtgtgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggaaataaa acgtaagtag 1140
tcttctcaac tcttgttcac taagtctaac cttgttaagt tgttctttgt tgtgtgtttt 1200
tcttaaggag atttcaggga tttagcaaat tccattctca gatcaggtgt taaggaggga 1260
aaactgtccc acaagaggtt ggaatgattt tcaggctaaa ttttaggctt tctaaaccaa 1320
agtaactaaa ctaggggaag agggataatt gtctacctag ggagggtttt gtggaggtaa1380
agttaaaata aatcactgta aatcacattc agtgatggga ccagactgga aataaaacct1440
aagtacattt ttgctcaact gcttgtgaag ttttggtccc attgtgtcct ttgtatgagt1500
ttgtggtgta cattagataa atgaactatt ccttgtaacc caaaacttaa atagaagaga1560
accaaaaatc tagctactgt acaagctgag caaacagact gacctcatgt cagatttgtg1620
ggagaaatga gaaaggaaca gtttttctct gaacttagcc tatctaactg gatcgcctca1680
ggcaggtttt tgtaaagggg ggcgcagtga tatgaatcac tgtgattcac gttcggctcg1740
gggacaaagt tggaaataaa acgtaagtag acttttgctc atttacttgt gacgttttgg1800
ttctgtttgg gtaacttgtg tgaatttgtg acattttggc taaatgagcc attcctggca1860
acctgtgcat caatagaaga tcccccagaa aagagtcagt gtgaaagctg agcgaaaaac1920
tcgtcttagg cttctgagac cagttttgta aggggaatgt agaagaaaga gctgggcttt1980
tcctctgaat ttggcccatc tagttggact ggcttcacag gcaggttttt gtagagaggg2040
gcatgtcata gtcctcactg tggctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac2100
gtaagtacac ttttctcatc tttttttatg tgtaagacac aggttttcat gttaggagtt2160
aaagtcagtt cagaaaatct tgagaaaatg gagagggctc attatcagtt gacgtggcat2220
acagtgtcag attttctgtt tatcaagcta gtgagattag gggcaaaaag aggctttagt2280
tgagaggaaa gtaattaata ctatggtcac catccaagag attggatcgg agaataagca2340
tgagtagtta ttgagatctg ggtctgactg caggtagcgt ggtcttctag acgtttaagt2400
gggagatttg gaggggatga ggaatgaagg aacttcagga tagaaaaggg ctgaagtcaa2460
gttcagctcc taaaatggat gtgggagcaa actttgaaga taaactgaat gacccagagg2520
atgaaacagc gcagatcaaa gaggggccta gagctctgag aagagaagga gactcatccg2580
tgttgagttt ccacaagtac tgtcttgagt tttgcaataa aagtgggata gcagagttga2640
gtgtnagccg tanagtatac tctcttttgt ctcctaagat ttttatgact acaaaaatca2700
gtagtatgtc ctgaaataat cattaagctg tttgaaagta tgactgcttg ccatgtagat2760
accatggctt gctgaatgat cagaagaggt gtgactctta ttctaaaatt tgtcacaaaa2820
tgtcaaaatg agagactctg taggaacgag tcccttgaca gacagctgca aggggttttt2880
ttcctttgtc tcatttctac atgaaagtaa atttgaaatg atcntttttt attataagag2940
tagaaataca gttgggtttg aactatatgt tttaatnggc cncacggttt tgtaagacat3000
ttggtccttt gttttcccag ttattactcg attgtaattt tatatcgcca gcantggtct3060
gaaacggtnn nnnncgcaac ctcttcgttt actaactggg tgaccttcgg ctgtgccagc3120
catttggcgt tcaccctgcc gcnggccnat gagaaccccc gcggtagnnc ccttgctccg3180
cgggaaccac tttcctgagg acacagtgat aggaacagag ccactaatct gaagagaaca3240
gagatgtgac agactacact aatgtgagaa aaacaaggaa agggtgactt attggagatt3300
tcagaaataa aatgcattta ttattatatt cccttattta atttctattg ggaattagaa3360
agggcataaa ctgctttatc cagtgttata ttaaaagctt aatgtatata atcttttaga3420
ggtaaaatct acagccagca aaagtcatgg taaatattct ttgactgaac tctcactaaa3480
ctcctctaaa ttatatgtca tattaactgg ttaaattaat ataaatttgt gacatgacct3540
taactggtta ggtaggatat ttttcttcat gcaaaaatat gactaataat aatttagcac3600
aaaaatattt cccaatactt taattctgtg atagaaaaat gtttaactca gctactataa3660
tcccataatt ttgaaaacta tttattagct tttgtgtttg acccttccct gccaaaggca3720
actatttaag gaccctttaa aactcttgaa actactttag agtcattaag ttatttaacc3780
acttttaatt actttaaaat gatgtcaatt cccttttaac tattaattta ttttaagggg3840
ggaaaggctg ctcataattc tattgttttt cttggtaaag aactctcagt ttctgtttta3900
ctacctctgt cacccaagag ttggcatctc aacagagggg actttccgag agccatctgg3960
cagttgctta agatcagaag tgaagtctgc cagttcctcc taggcaggtg gcccagatta4020
cagttgacct gttctggtgt ggctaaaaat tgtcccatgt ggttacaaac cattagacca4080
gggtctgatg aattgctcag aatatttctg gacacccaaa tacagaccct ggcttaaggc4140
ctgtccatac agtaggttta gcttggctac accaaaggaa gccatacaga ggctaatatc4200
agagtattct tggaagagac aggagaaaat gaaagccagt ttctgctctt accttatgtg4260
cttgtgttca gactcccaaa catcaggagt gtcagtaaac tggtctgaat ctctgtctga4320
agcatggaac tgaaaagaat gtagtttcag ggaagaaagg caatagaagg aagcctgaga4380
atatcttcaa agggtcagac tcnnnaattt actttctaaa gaagtagcta ggaactaggg4440
aataacttag aaacaacaag attgtatata tgtgcatcct ggcccattgt tccttatctg4500
tagggataag cgtgcttttt tgtgtgttgt atataacata actgtttaca cataatacac4560
tgaaatggag cccttccttg ttacttcata ccatcctctg tgcttccttc ctcaggggct4620
gatgctgcac caactgtatc catcttccca ccatccagtg agcagttaac atctggaggt4680
gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc taccccaaag acatcaatgt caagtggaag4740
attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa4800
gacagcacct acagcatgag cagcaccctc acgttgacca aggacgagta tgaacgacat4860
aacagctata cctgtgaggc cactcacaag acatcaactt cacccattgt caagagcttc4920
aacaggaatg agtgttagag acaaaggtcc tgagacgcca ccaccagctc cccagctcca4980
tcctatcttc ccttctaagg tcttggaggc ttccccacaa gcgacctacc actgttgcgg5040
tgctccaaac ctcctcccca cctccttctc ctcctcctcc ctttccttgc cttttatcat5100
gctaatattt gcagaaaata ttcaataaag tgagtctttg cacttgagat ctctgtcttt5160
cttactaaat ggtagtaatc agttgttttt ccagttacct gggtttctct tctaaagaag5220
ttnaatgttt agttgccctg aaatccacca cacttaaagg ataaataaaa ccctccactt5280
gccctggttg gctgtccact acatggcagt cctttctaag gttcacgagt actattcatg5340
gcttatttct ctggccatgg taggtttgag gaggcatacc tcctagtttt cttcccctaa5400
gtcgtcaaag tcctgaaggg ggacagtctt tacaagcaca tgttctgnnc tgattcaacc5460
tacccagtaa acttggcgaa gcagtagcat catta 5495
<210>34
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>34
atctcgagga accactttcc tgaggacaca gtgatagg 38
<210>35
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>35
atgaattcct aacactcatt cctgttgaag ctcttgac 38
<210>36
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>36
atgaattcag acaaaggtcc tgagacgcca cc32
<210>37
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>37
atggatcctc gagtcgactg gatttcaggg caactaaaca tt 42
<210>38
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>38
atgaattcgc ccctctccct cccccccccc ta32
<210>39
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>39
atgaattcgt cgacttgtgg caagcttatc atcgtgtt 38
<210>40
<211>8
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>40
agtcgaca8
<210>41
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>41
aatttgtcga ctgc14
<210>42
<211>798
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>42
tggtgattat tcagagtagt tttagatgag tgcatcttca tgaatctcca gcccatattc 60
tcccatgtgt ttatcagtta agaactgact agactctatc ttgctatttg catattacat120
tttcagtaac cacaaatatc tcacagttgg tttatagcaa agtacttatg agaatagtag180
taattagcta gggaccaaag ttcaaagaca aaatggattt tcaagtgcag attttcagct240
tcctgctaat cagtgcctca ggtaacagag ggcagggaat ttgagatcag aatccaacca300
aaattatttt ccctggggaa tttgagtcta aaatacagtt ttttcatttt ctttcatctg360
aatgttgggt ggtataaaat tatttttgta tctctatttc tactaatccc tctctctcta420
ttttgctttt ttctagtcat actgtccaga ggacaaattg ttctcaccca gtctccagca480
atcatgtctg catctccagg ggagaaggtc accatgacct gcagtgccag ctcaagtgta540
agttacatgt actggtacca gcagaagcca ggatcctccc ccagactcct gatttatgac600
acatccaacc tggcttctgg agtccctgtt cgcttcagtg gcagtgggtc tgggacctct660
tactctctca caatcagccg aatggaggct gaagatgctg ccacttatta ctgccagcag720
tggagtagtt acccacccac acagtgatac agactggaac aaaaaccctc taagtcctta780
gggtctagct acttcctc 798
<210>43
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>43
cccaagcttt ggtgattatt cagagtagtt ttagatgagt gcat 44
<210>44
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>44
acgcgtcgac tttgtctttg aactttggtc cctagctaat tacta 45
<210>45
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>45
acgcgtcgac gcggccggcc gcgctagcag acaaaggtcc tgagacgcca ccaccagctc 60
ccc63
<210>46
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>46
gaagatctca agtgcaaaga ctcactttat tgaatatttt ctg43
<210>47
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>47
ggaattcaga caaaggtcct gagacgccac caccagctcc cc 42
<210>48
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>48
ccaagcttgc ctcctcaaac ctaccatggc ccagagaaat aag43
<210>49
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>49
ataagaatgc ggccgcctca gagcaaatgg gttctacagg cctaacaacc t 51
<210>50
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>50
ccggaattcc taacactcat tcctgttgaa gctcttgaca atgg 44
<210>51
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>51
acgcgtcgac ccacatgcgg cttgggctgt gtgt 34
<210>52
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>52
acgcgtcgac gtcgacctag gcaggccctg 30
<210>53
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>53
ctgactagac tctatcttgc 20
<210>54
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>54
ccacggagac cactcgctca tt 22
<210>55
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>55
cacccctagg tcaatattgg ccattagc 28
<210>56
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>56
cacccctagg taggcatccc cagcatgc 28
<210>57
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>57
caccatgcgg cttgggctgt ctc 23
<210>58
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>58
ggcaggccct gcagatgtga gtg 23
<210>59
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>59
gatcaagggg aaacagcaga ggcggatcag 30
<210>60
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>60
ctgatccgcc tctgctgttt ccccttgatc 30
<210>61
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>61
caccgctagc ctcgagaatt cacgcgtg 28
<210>62
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>62
gctgatggtg aggtgcgtc 19
<210>63
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>63
atcagtgccg aggggagcca g21
<210>64
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>64
gccctctaga gcggcaggcc ctgcagatg29
<210>65
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>65
ccggctagcc accatggcgc aatgtgaaat g 31
<210>66
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>66
ccatgcggcc gccctcctca ctgtgcacct 30
<210>67
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>GIPF肽
<400>67
Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser Arg Arg Arg Lys Gly Gln
1 5 10 15
<210>68
<211>798
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(61)..(795)
<400>68
atgcggcttg ggctgtgcgt ggtggccctg gttctgagct ggacacacat cgccgtgggc60
agc cgg ggg atc aag ggc aag aga cag agg cgg arc agt gct gag ggg 108
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
agc caa gcc tgc gcc aag ggc tgt gag ctc tgt tca gaa gtc aac ggt156
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
tgc ctc aag tgc tcg ccc aag ctc ttc att ctg ctg gag agg aac gac204
Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp
35 40 45
atc cgc cag gtg ggc gtc tgc ctg ccg tcc tgc cca cct gga tac ttt252
Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe
50 55 60
gat gcc cgc aac ccc gac atg aac aaa tgc atc aaa tgc aag atc gag300
Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu
65 70 75 80
cac tgt gag gcc tgc ttc agc cac aac ttc tgc acc aag tgt cag gag348
His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Gln Glu
85 90 95
gcc ttg tac tta cac aag ggc cgc tgc tat cca gcc tgc cct gag ggc396
Ala Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly
100 105 110
tct aca gcc gct aac agc acc atg gag tgc ggc agt cct gca caa tgt444
Ser Thr Ala Ala Asn Ser Thr Met Glu Cys Gly Ser Pro Ala Gln Cys
115 120 125
gaa atg agc gag tgg tcc ccg tgg gga ccc tgc tcc aag aag agg aag492
Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Arg Lys
130 135 140
ctg tgc ggt ttc cgg aag gga tcg gaa gag cgg aca cgc aga gtg ctc540
Leu Cys Gly Phe Arg Lys Gly Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu
145 150 155 160
cat gct ccc ggg gga gac cac acc acc tgc tcc gac acc aaa gag acc588
His Ala Pro Gly Gly Asp His Thr Thr Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr
165 170 175
cgc aag tgt acc gtg cgc agg acg ccc tgc cca gag ggg cag aag agg636
Arg Lys Cys Thr Val Arg Arg Thr Pro Cys Pro Glu Gly Gln Lys Arg
180 185 190
agg aag ggg ggc cag ggc cgg agg gag aat gcc aac agg cat ccg gcc684
Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn Arg His Pro Ala
195 200 205
agg aag aac agc aag gag ccg agg tcc aac tct cgg aga cac aaa ggg732
Arg Lys Asn Ser Lys Glu Pro Arg Ser Asn Ser Arg Arg His Lys Gly
210 215 220
caa cag cag cca cag cca ggg aca aca ggg cca ctc aca tca gta gga780
Gln Gln Gln Pro Gln Pro Gly Thr Thr Gly Pro Leu Thr Ser Val Gly
225 230 235 240
cct acc tgg gca cag tga798
Pro Thr Trp Ala Gln
245
<210>69
<211>245
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>69
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp
35 40 45
Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe
50 55 60
Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu
65 70 75 80
His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Gln Glu
85 90 95
Ala Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly
100 105 110
Ser Thr Ala Ala Asn Ser Thr Met Glu Cys Gly Ser Pro Ala Gln Cys
115 120 125
Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Arg Lys
130 135 140
Leu Cys Gly Phe Arg Lys Gly Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu
145 150 155 160
His Ala Pro Gly Gly Asp His Thr Thr Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr
165 170 175
Arg Lys Cys Thr Val Arg Arg Thr Pro Cys Pro Glu Gly Gln Lys Arg
180 185 190
Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn Arg His Pro Ala
195 200 205
Arg Lys Asn Ser Lys Glu Pro Arg Ser Asn Ser Arg Arg His Lys Gly
210 215 220
Gln Gln Gln Pro Gln Pro Gly Thr Thr Gly Pro Leu Thr Ser Val Gly
225 230 235 240
Pro Thr Trp Ala Gln
245
<210>70
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>70
gtgtgaggtc cacggaaac 19
<210>71
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>71
ggtgcaaaga catagccaga20
<210>72
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>72
gcaaacaaca caggggtgta20
<210>73
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>73
ggcaggtctg tgactgatgt20
<210>74
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>74
tatgcagaac tgcgatttcc20
<210>75
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>75
ccaatttgtc tcctatctgt gg 22
<210>76
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>76
tgctccatga ggagacacc 19
<210>77
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>77
cctgcctctt ttccacaga 19
<210>78
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>78
caacgttccc ttcaagacac20
<210>79
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>79
cgcttgtcct cgttcatct 19
<210>80
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>80
ctcaacaccg gaatttttga20
<210>81
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>81
aattgcattt cgaaggaagg20
<210>82
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>82
gtagattcgg gcaagtccac cac23
<210>83
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>83
ttcccatctc agcagcctcc tt 22
<210>84
<211>105
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(105)
<400>84
agc cgg ggg atc aag ggg aaa agg cag agg cgg atc agt gcc gag ggg 48
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
agc cag gcc tgt gcc aaa ggc tgt gag ctc tgc tct gaa gtc aac ggc 96
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
tgc ctc aag105
Cys Leu Lys
35
<210>85
<211>35
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>85
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
Cys Leu Lys
35
<210>86
<211>180
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(180)
<400>86
agc cgg ggg atc aag ggg aaa agg cag agg cgg atc agt gcc gag ggg 48
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
agc cag gcc tgt gcc aaa ggc tgt gag ctc tgc tct gaa gtc aac ggc 96
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
tgc ctc aag tgc tca ccc aag ctg ttc atc ctg ctg gag agg aac gac144
Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp
35 40 45
atc cgc cag gtg ggc gtc tgc ttg ccg tcc tgc cca180
Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro
50 55 60
<210>87
<211>60
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>87
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp
35 40 45
Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro
50 55 60
<210>88
<211>270
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(270)
<400>88
agc cgg ggg atc aag ggg aaa agg cag agg cgg atc agt gcc gag ggg 48
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
agc cag gcc tgt gcc aaa ggc tgt gag ctc tgc tct gaa gtc aac ggc 96
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
tgc ctc aag tgc tca ccc aag ctg ttc atc ctg ctg gag agg aac gac144
Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp
35 40 45
atc cgc cag gtg ggc gtc tgc ttg ccg tcc tgc cca cct gga tac ttc192
Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe
50 55 60
gac gcc cgc aac ccc gac atg aac aag tgc atc aaa tgc aag atc gag240
Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu
65 70 75 80
cac tgt gag gcc tgc ttc agc cat aac ttc270
His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe
85 90
<210>89
<211>90
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>89
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp
35 40 45
Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe
50 55 60
Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu
65 70 75 80
His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe
85 90
<210>90
<211>360
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(360)
<400>90
agc cgg ggg atc aag ggg aaa agg cag agg cgg atc agt gcc gag ggg 48
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
agc cag gcc tgt gcc aaa ggc tgt gag ctc tgc tct gaa gtc aac ggc 96
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
tgc ctc aag tgc tca ccc aag ctg ttc atc ctg ctg gag agg aac gac144
Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp
35 40 45
atc cgc cag gtg ggc gtc tgc ttg ccg tcc tgc cca cct gga tac ttc192
Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe
50 55 60
gac gcc cgc aac ccc gac atg aac aag tgc atc aaa tgc aag atc gag240
Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu
65 70 75 80
cac tgt gag gcc tgc ttc agc cat aac ttc tgc acc aag tgt aag gag288
His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu
85 90 95
ggc ttg tac ctg cac aag ggc cgc tgc tat cca gct tgt ccc gag ggc336
Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly
100 105 110
tcc tca gct gcc aat ggc acc atg360
Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met
115 120
<210>91
<211>120
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>91
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp
35 40 45
Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe
50 55 60
Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu
65 70 75 80
His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu
85 90 95
Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly
100 105 110
Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met
115 120
<210>92
<211>450
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(450)
<400>92
agc cgg ggg atc aag ggg aaa agg cag agg cgg atc agt gcc gag ggg 48
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
agc cag gcc tgt gcc aaa ggc tgt gag ctc tgc tct gaa gtc aac ggc 96
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
tgc ctc aag tgc tca ccc aag ctg ttc atc ctg ctg gag agg aac gac144
Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp
35 40 45
atc cgc cag gtg ggc gtc tgc ttg ccg tcc tgc cca cct gga tac ttc192
Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe
50 55 60
gac gcc cgc aac ccc gac atg aac aag tgc atc aaa tgc aag atc gag240
Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu
65 70 75 80
cac tgt gag gcc tgc ttc agc cat aac ttc tgc acc aag tgt aag gag288
His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu
85 90 95
ggc ttg tac ctg cac aag ggc cgc tgc tat cca gct tgt ccc gag ggc336
Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly
100 105 110
tcc tca gct gcc aat ggc acc atg gag tgc agt agt cct gcg caa tgt384
Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys
115 120 125
gaa atg agc gag tgg tct ccg tgg ggg ccc tgc tcc aag aag cag cag432
Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln
130 135 140
ctc tgt ggt ttc cgg agg450
Leu Cys Gly Phe Arg Arg
145 150
<210>93
<211>150
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>93
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp
35 40 45
Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe
50 55 60
Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu
65 70 75 80
His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu
85 90 95
Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly
100 105 110
Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys
115 120 125
Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln
130 135 140
Leu Cys Gly Phe Arg Arg
145 150
<210>94
<211>540
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(540)
<400>94
agc cgg ggg atc aag ggg aaa agg cag agg cgg atc agt gcc gag ggg 48
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
agc cag gcc tgt gcc aaa ggc tgt gag ctc tgc tct gaa gtc aac ggc 96
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
tgc ctc aag tgc tca ccc aag ctg ttc atc ctg ctg gag agg aac gac144
Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp
35 40 45
atc cgc cag gtg ggc gtc tgc ttg ccg tcc tgc cca cct gga tac ttc192
Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe
50 55 60
gac gcc cgc aac ccc gac atg aac aag tgc atc aaa tgc aag atc gag240
Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu
65 70 75 80
cac tgt gag gcc tgc ttc agc cat aac ttc tgc acc aag tgt aag gag288
His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu
85 90 95
ggc ttg tac ctg cac aag ggc cgc tgc tat cca gct tgt ccc gag ggc336
Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly
100 105 110
tcc tca gct gcc aat ggc acc atg gag tgc agt agt cct gcg caa tgt384
Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys
115 120 125
gaa atg agc gag tgg tct ccg tgg ggg ccc tgc tcc aag aag cag cag432
Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln
130 135 140
ctc tgt ggt ttc cgg agg ggc tcc gag gag cgg aca cgc agg gtg cta480
Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu
145 150 155 160
cat gcc cct gtg ggg gac cat gct gcc tgc tct gac acc aag gag acc528
His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr
165 170 175
cgg agg tgc aca 540
Arg Arg Cys Thr
180
<210>95
<211>180
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>95
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp
35 40 45
Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe
50 55 60
Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu
65 70 75 80
His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu
85 90 95
Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly
100 105 110
Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys
115 120 125
Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln
130 135 140
Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu
145 150 155 160
His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr
165 170 175
Arg Arg Cys Thr
180
<210>96
<211>630
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(630)
<400>96
agc cgg ggg atc aag ggg aaa agg cag agg cgg atc agt gcc gag ggg 48
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
agc cag gcc tgt gcc aaa ggc tgt gag ctc tgc tct gaa gtc aac ggc 96
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
tgc ctc aag tgc tca ccc aag ctg ttc atc ctg ctg gag agg aac gac144
Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp
35 40 45
atc cgc cag gtg ggc gtc tgc ttg ccg tcc tgc cca cct gga tac ttc192
Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe
50 55 60
gac gcc cgc aac ccc gac atg aac aag tgc atc aaa tgc aag atc gag240
Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu
65 70 75 80
cac tgt gag gcc tgc ttc agc cat aac ttc tgc acc aag tgt aag gag288
His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu
85 90 95
ggc ttg tac ctg cac aag ggc cgc tgc tat cca gct tgt ccc gag ggc336
Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly
100 105 110
tcc tca gct gcc aat ggc acc atg gag tgc agt agt cct gcg caa tgt384
Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys
115 120 125
gaa atg agc gag tgg tct ccg tgg ggg ccc tgc tcc aag aag cag cag432
Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln
130 135 140
ctc tgt ggt ttc cgg agg ggc tcc gag gag cgg aca cgc agg gtg cta480
Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu
145 150 155 160
cat gcc cct gtg ggg gac cat gct gcc tgc tct gac acc aag gag acc528
His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr
165 170 175
cgg agg tgc aca gtg agg aga gtg ccg tgt cct gag ggg cag aag agg576
Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val Pro Cys Pro Glu Gly Gln Lys Arg
180 185 190
agg aag gga ggc cag ggc cgg cgg gag aat gcc aac agg aac ctg gcc624
Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn Arg Asn Leu Ala
195 200 205
agg aag630
Arg Lys
210
<210>97
<211>210
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>97
Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile Ser Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly
20 25 30
Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp
35 40 45
Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe
50 55 60
Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu
65 70 75 80
His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu
85 90 95
Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly
100 105 110
Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys
115 120 125
Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln
130 135 140
Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu
145 150 155 160
His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr
165 170 175
Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val Pro Cys Pro Glu Gly Gln Lys Arg
180 185 190
Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn Arg Asn Leu Ala
195 200 205
Arg Lys
210
<210>98
<211>615
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(615)
<400>98
aag ctg ttc atc ctg ctg gag agg aac gac atc cgc cag gtg ggc gtc 48
Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val
1 5 10 15
tgc ttg ccg tcc tgc cca cct gga tac ttc gac gcc cgc aac ccc gac 96
Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp
20 25 30
atg aac aag tgc atc aaa tgc aag atc gag cac tgt gag gcc tgc ttc144
Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe
35 40 45
agc cat aac ttc tgc acc aag tgt aag gag ggc ttg tac ctg cac aag192
Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys
50 55 60
ggc cgc tgc tat cca gct tgt ccc gag ggc tcc tca gct gcc aat ggc240
Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly
65 70 75 80
acc atg gag tgc agt agt cct gcg caa tgt gaa atg agc gag tgg tct288
Thr Met Glu Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser
85 90 95
ccg tgg ggg ccc tgc tcc aag aag cag cag ctc tgt ggt ttc cgg agg336
Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg
100 105 110
ggc tcc gag gag cgg aca cgc agg gtg cta cat gcc cct gtg ggg gac384
Gly Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu His Ala Pro Val Gly Asp
115 120 125
cat gct gcc tgc tct gac acc aag gag acc cgg agg tgc aca gtg agg432
His Ala Ala Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg
130 135 140
aga gtg ccg tgt cct gag ggg cag aag agg agg aag gga ggc cag ggc480
Arg Val Pro Cys Pro Glu Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly
145 150 155 160
cgg cgg gag aat gcc aac agg aac ctg gcc agg aag gag agc aag gag528
Arg Arg Glu Asn Ala Asn Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu
165 170 175
gcg ggt gct ggc tct cga aga cgc aag ggg cag caa cag cag cag cag576
Ala Gly Ala Gly Ser Arg Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln
180 185 190
caa ggg aca gtg ggg cca ctc aca tct gca ggg cct gcc615
Gln Gly Thr Val Gly Pro Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala
195 200 205
<210>99
<211>205
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>99
Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val
1 5 10 15
Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp
20 25 30
Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe
35 40 45
Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys
50 55 60
Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly
65 70 75 80
Thr Met Glu Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser
85 90 95
Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg
100 105 110
Gly Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu His Ala Pro Val Gly Asp
115 120 125
His Ala Ala Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg
130 135 140
Arg Val Pro Cys Pro Glu Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly
145 150 155 160
Arg Arg Glu Asn Ala Asn Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu
165 170 175
Ala Gly Ala Gly Ser Arg Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln
180 185 190
Gln Gly Thr Val Gly Pro Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala
195 200 205
<210>100
<211>432
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(432)
<400>100
ctg cac aag ggc cgc tgc tat cca gct tgt ccc gag ggc tcc tca gct 48
Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala
1 5 10 15
gcc aat ggc acc atg gag tgc agt agt cct gcg caa tgt gaa atg agc 96
Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser
20 25 30
gag tgg tct ccg tgg ggg ccc tgc tcc aag aag cag cag ctc tgt ggt144
Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly
35 40 45
ttc cgg agg ggc tcc gag gag cgg aca cgc agg gtg cta cat gcc cct192
Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu His Ala Pro
50 55 60
gtg ggg gac cat gct gcc tgc tct gac acc aag gag acc cgg agg tgc240
Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys
65 70 75 80
aca gtg agg aga gtg ccg tgt cct gag ggg cag aag agg agg aag gga288
Thr Val Arg Arg Val Pro Cys Pro Glu Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly
85 90 95
ggc cag ggc cgg cgg gag aat gcc aac agg aac ctg gcc agg aag gag336
Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu
100 105 110
agc aag gag gcg ggt gct ggc tct cga aga cgc aag ggg cag caa cag384
Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser Arg Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln
115 120 125
cag cag cag caa ggg aca gtg ggg cca ctc aca tct gca ggg cct gcc432
Gln Gln Gln Gln Gly Thr Val Gly Pro Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala
130 135 140
<210>101
<211>144
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>101
Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala
1 5 10 15
Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser
20 25 30
Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly
35 40 45
Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu His Ala Pro
50 55 60
Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys
65 70 75 80
Thr Val Arg Arg Val Pro Cys Pro Glu Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly
85 90 95
Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu
100 105 110
Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser Arg Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln
115 120 125
Gln Gln Gln Gln Gly Thr Val Gly Pro Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala
130 135 140
<210>102
<211>366
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(366)
<400>102
tgc agt agt cct gcg caa tgt gaa atg agc gag tgg tct ccg tgg ggg 48
Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly
1 5 10 15
ccc tgc tcc aag aag cag cag ctc tgt ggt ttc cgg agg ggc tcc gag 96
Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu
20 25 30
gag cgg aca cgc agg gtg cta cat gcc cct gtg ggg gac cat gct gcc144
Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala
35 40 45
tgc tct gac acc aag gag acc cgg agg tgc aca gtg agg aga gtg ccg192
Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val Pro
50 55 60
tgt cct gag ggg cag aag agg agg aag gga ggc cag ggc cgg cgg gag240
Cys Pro Glu Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu
65 70 75 80
aat gcc aac agg aac ctg gcc agg aag gag agc aag gag gcg ggt gct288
Asn Ala Asn Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala
85 90 95
ggc tct cga aga cgc aag ggg cag caa cag cag cag cag caa ggg aca336
Gly Ser Arg Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Thr
100 105 110
gtg ggg cca ctc aca tct gca ggg cct gcc366
Val Gly Pro Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala
115 120
<210>103
<211>122
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>103
Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly
1 5 10 15
Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu
20 25 30
Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala
35 40 45
Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val Pro
50 55 60
Cys Pro Glu Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu
65 70 75 80
Asn Ala Asn Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala
85 90 95
Gly Ser Arg Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Thr
100 105 110
Val Gly Pro Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala
115 120
<210>104
<211>228
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(228)
<400>104
cgc cag gtg ggc gtc tgc ttg ccg tcc tgc cca cct gga tac ttc gac 48
Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe Asp
1 5 10 15
gcc cgc aac ccc gac atg aac aag tgc atc aaa tgc aag atc gag cac 96
Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu His
20 25 30
tgt gag gcc tgc ttc agc cat aac ttc tgc acc aag tgt aag gag ggc144
Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu Gly
35 40 45
ttg tac ctg cac aag ggc cgc tgc tat cca gct tgt ccc gag ggc tcc192
Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly Ser
50 55 60
tca gct gcc aat ggc acc atg gag tgc agt agt cct228
Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser Pro
65 70 75
<210>105
<211>76
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>105
Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe Asp
1 5 10 15
Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu His
20 25 30
Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu Gly
35 40 45
Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly Ser
50 55 60
Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser Pro
65 70 75
<210>106
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>106
caccgctagc agccggggga tcaagg 26
<210>107
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>107
cacgcggccg ctcttgaggc agccgttg 28
<210>108
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>108
cacgcggccg cttgggcagg acggcaagc 29
<210>109
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>109
cacgcggccg ctgaagttat ggctgaagca g 31
<210>110
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>110
cacgcggccg ctcatggtgc cattggcagc 30
<210>111
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>111
cacgcggccg ctcctccgga aaccacagag 30
<210>112
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>112
cacgcggccg cttgtgcacc tccgggtctc 30
<210>113
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>113
cacgcggccg ctcttcctgg ccaggttcc 29
<210>114
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>114
caccgctagc aagctgttca tcctgctgg 29
<210>115
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>115
cacgcggccg ctggcaggcc ctgcagatg 29
<210>116
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>116
caccgctagc ctgcacaagg gccgctg27
<210>117
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>117
caccgctagc tgcagtagtc ctgcgca27
<210>118
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>118
caccgctagc cgccaggtgg gcgtctg27
<210>119
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>119
cacgcggccg ctaggactac tgcactcca 29
<210>120
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>120
gatcagcagc tggaacaaac acag 24
<210>121
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>121
tgcacaatca gtcaatcaac agagc 25
<210>122
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>122
ggcggatccc tgagttggag gccagtttgg 30
<210>123
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸123
<400>123
gctctagacc atggtggacg agcctagagg agaaggcat 39
<210>124
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>124
ccgctcgagg catgcggctt gggctgtgtg tggtggccct g41
<210>125
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>125
gctctagaag atctctaggc aggccctgca gatgtgagtg gccc 44
<210>126
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>126
aattcggatc cggcgcgcc 19
<210>127
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>127
gatcggcgcg ccggatccg 19
<210>128
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>128
ggccgtttaa acataacttc gtataatgta tgctatacga agttatc 47
<210>129
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>129
tcgagataac ttcgtatagc atacattata cgaagttatg tttaaac 47
<210>130
<211>41
<212>DNA
<213>正向引物
<220>
<223>寡核苷酸
<400>130
cgggatccgt ttaaacctgt gccttctagt tgccagccat c41
<210>131
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>131
cggatatccc atagagccca ccgcatcccc agc 33
<210>132
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>132
taaccgcgat cgcggccgg 19
<210>133
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>133
ccgcgatcgc ccttaat 17
<210>134
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>134
ctaacgttac tggccgaagc20
<210>135
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>135
attatcatcg tgtttttcaa aggaa 25
<210>136
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>136
gctctgacac caaggagacc20
<210>137
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>137
ccctaggaat gctcgtcaag20
<210>138
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>138
caggagcctc acccttcg 18
<210>139
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>139
acgccgaggt gcttgccc 18
<210>140
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>140
caccatggag aaggccgggg cccac 25
<210>141
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>141
atcatacttg gcaggtttct ccagg 25
<210>142
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>142
cgggatcccc atggctcctc tcggatacct cttagtgct 39
<210>143
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>143
gctctagagt ttaaacctac ttgcaggtgt gcacgtcata g41
<210>144
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>144
tcgagtcgcg acaccggcgg gcgcgccc 28
<210>145
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>145
tcgagggcgc gcccgccggt gtcgcgac 28
<210>146
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>146
ggccgcttaa ttaaggccgg ccgtcgacg 29
<210>147
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>147
aattcgtcga cggccggcct taattaagc 29
<210>148
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>148
ttggcgcgcc ctccctagga ctgcagttga gctcagattt ga42
<210>149
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>149
ccgctcgagt cttactgtct cagcaacaat aatataaaca gggg 44
<210>150
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>150
ataagaatgc ggccgcaaag ctggtgggtt aagactatct cgtgaagtg 49
<210>151
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>151
acgcgtcgac tcacaggttg gtccctctct gtgtgtggtt gctgt 45
<210>152
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>152
tcttactaga gttctcacta gctct 25
<210>153
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>153
ggaaccaaag aatgaggaag ctgtt 25
<210>154
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>154
ggccaggcgc gccttgc 17
<210>155
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>olignucleotide
<400>155
ggccgcaagg cgcgcct 17
<210>156
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>156
taagggctag ctagggccgg20
<210>157
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>157
ccctagctag cccttaat 18
<210>158
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>158
tcgagttaac 10
<210>159
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>159
agctgttaac 10
<210>160
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>160
agctgtcgac ttaattaagg ccggccg27
<210>161
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>161
ctagcggccg gccttaatta agtcgac27
<210>162
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>162
tcgacttaat taaggccggc cctagctagc a 31
<210>163
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>163
agcttgctag ctagggccgg ccttaattaa g 31
<210>164
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>164
ccttaattaa agttatgtgt cctagagggc tgcaaactca agatc45
<210>165
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>165
ttggccggcc ttggcgccag tggaacctgg aatgataaac acaaagatta ttg 53
<210>166
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>166
aagcgtcgac caccatgcgg cttgggctgt gtg 33
<210>167
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>167
atggccggcc ctacatggtg ccattggcag 30
<210>168
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>168
agccggggga tcaaggggaa aaggcagagg 30
<210>169
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>169
atggccggcc ctacatggtg ccattggcag 30
<210>170
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>170
acgcgtcgac caccatgata ttccgagtca gtgc34
<210>171
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>171
ggccggccct aggcaggccc tgcagatgtg agtgg 35
<210>172
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>172
atgatattcc gagtcagtgc cgaggggagc cag 33
<210>173
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>173
ggccggccct aggcaggccc tgcagatgtg agtgg 35
<210>174
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>174
atcaagggga aaaggcagag20
<210>175
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>175
cgcttgtggg gaagcctcca agacc 25
<210>176
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>176
ataacttctg caccaagtgt aagga 25
<210>177
<211>2333
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(219)..(926)
<400>177
aggcgagccg ggcgcccagg acagtcccgc agcgggcggg tgagcgggcc gcgccctcgc 60
ccctcccggg cctgcccccg tcgcgactgg cagcacgaag ctgagattgt ggtttcctgg120
tgattcaggt gggagtgggc cagaagatca ccgctggcaa ggactgggtt ggtttttgga180
gtagtccctg ctgacgtgac aaaaagatct ctcatatg ata ttc cga gtc agt gcc236
Ile Phe Arg Val Ser Ala
1 5
gag ggg agc cag gcc tgt gcc aaa ggc tgt gag ctc tgc tct gaa gtc 284
Glu Gly Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser Glu Val
10 15 20
aac ggc tgc ctc aag tgc tca ccc aag ctg ttc atc ctg ctg gag agg 332
Asn Gly Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu Glu Arg
25 30 35
aac gac atc cgc cag gtg ggc gtc tgc ttg ccg tcc tgc cca cct gga 380
Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro Pro Gly
40 45 50
tac ttc gac gcc cgc aac ccc gac atg aac aag tgc atc aaa tgc aag 428
Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys Cys Lys
55 60 65 70
atc gag cac tgt gag gcc tgc ttc agc cat aac ttc tgc acc aag tgt 476
Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr Lys Cys
75 80 85
aag gag ggc ttg tac ctg cac aag ggc cgc tgc tat cca gct tgt ccc 524
Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala Cys Pro
90 95 100
gag ggc tcc tca gct gcc aat ggc acc atg gag tgc agt agt cct gcg 572
Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser Pro Ala
105 110 115
caa tgt gaa gtg agc gag tgg tct ccg tgg ggg ccc tgc tcc aag aag 620
Gln Cys Glu Val Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser Lys Lys
120 125 130
cag cag ctc tgt ggt ttc cgg agg ggc tcc gag gag cgg aca cgc agg 668
Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr Arg Arg
135 140 145 150
gtg cta cat gcc cct gtg ggg gac cat gct gcc tgc tct gac acc aag 716
Val Leu His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp Thr Lys
155 160 165
gag acc cgg agg tgc aca gtg agg aga gtg ccg tgt cct gag ggg cag 764
Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val Pro Cys Pro Glu Gly Gln
170 175 180
aag agg agg aag gga ggc cag ggc cgg cgg gag aat gcc aac agg aac 812
Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn Arg Asn
185 190 195
ctg gcc agg aag gag agc aag gag gcg ggt gct ggc tct cga aga cgc 860
Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser Arg Arg Arg
200 205 210
aag ggg cag caa cag cag cag cag caa ggg aca gtg ggg cca ctc aca 908
Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Thr Val Gly Pro Leu Thr
215 220 225 230
tct gca ggg cct gcc tag ggacactgtc cagcctccag gcccatgcag 956
Ser Ala Gly Pro Ala
235
aaagagttca gtgctactct gcgtgattca agctttcctg aactggaacg tcgggggcaa1016
agcatacaca cacactccaa tccatccatg catacacaga cacaagacac acacgctcaa1076
acccctgtcc acatatacaa ccatacatac ttgcacatgt gtgttcatgt acacacgcag1136
acacagacac cacacacaca catacacaca cacacacaca cacacacctg aggccaccag1196
aagacacttc catccctcgg gcccagcagt acacacttgg tttccagagc tcccagtgga1256
catgtcagag acaacacttc ccagcatctg agaccaaact gcagagggga gccttctgga1316
gaagctgctg ggatcggacc agccactgtg gcagatggga gccaagcttg aggactgctg1376
gtgacctggg aagaaacctt cttcccatcc tgttcagcac tcccagctgt gtgactttat1436
cgttggagag tattgttacc cttccaggat acatatcagg gttaacctga ctttgaaaac1496
tgcttaaagg tttatttcaa attaaaacaa aaaaatcaac gacagcagta gacacaggca1556
ccacattcct ttgcagggtg tgagggtttg gcgaggtatg cgtaggagca agaagggaca1616
gggaatttca agagacccca aatagcctgc tcagtagagg gtcatgcaga caaggaagaa1676
aacttagggg ctgctctgac ggtggtaaac aggctgtcta tatccttgtt actcagagca1736
tggcccggca gcagtgttgt cacagggcag cttgttagga atgagaatct caggtctcat1796
tccagacctg gtgagccaga gtctaaattt taagattcct gatgattggc atgttaccca1856
aatttgagaa gtgctgctgt aattcccctt aaaggacggg agaaagggcc ccggccatct1916
tgcagcagga gggattctgg tcagctataa aggaggactt tccatctggg agaggcagaa1976
tctatatact gaagggctag tggcactgcc aggggaaggg agtgcgtagg cttccagtga2036
tggttgggga caatcctgcc caaaggcagg gcagtggatg gaataactcc ttgtggcatt2096
ctgaagtgtg tgccaggctc tggactaggt gctaggtttc cagggaggag ccaaacacgg2156
gccttgctct tgtggagctt agaggttggt ggggaagaaa ataggcatgc accaaggaat2216
cgtacaaaca catatataac tacaaaagga tggtgccaag ggcaggtgac cactggcatc2276
tatgcttagc tatgaaagtg aataaagcag aataaaaata aaatactttc tctcagg 2333
<210>178
<211>235
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>178
Ile Phe Arg Val Ser Ala Glu Gly Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys
1 5 10 15
Glu Leu Cys Ser Glu Val Asn Gly Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu
20 25 30
Phe Ile Leu Leu Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu
35 40 45
Pro Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn
50 55 60
Lys Cys Ile Lys Cys Lys Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His
65 70 75 80
Asn Phe Cys Thr Lys Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg
85 90 95
Cys Tyr Pro Ala Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met
100 105 110
Glu Cys Ser Ser Pro Ala Gln Cys Glu Val Ser Glu Trp Ser Pro Trp
115 120 125
Gly Pro Cys Ser Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser
130 135 140
Glu Glu Arg Thr Arg Arg Val Leu His Ala Pro Val Gly Asp His Ala
145 150 155 160
Ala Cys Ser Asp Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val
165 170 175
Pro Cys Pro Glu Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg
180 185 190
Glu Asn Ala Asn Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala Gly
195 200 205
Ala Gly Ser Arg Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly
210 215 220
Thr Val Gly Pro Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala
225 230 23权利要求
1.一种组合物，其包括治疗有效量的GIPF多肽，其片段，或其类似物，和可药用的载体。
2.一种药用组合物，其包括含有GIPF生物活性片段的多肽和可药用的载体。
3.权利要求2的药用组合物，其中GIPF是人GIPF。
4.权利要求2的药用组合物，其中多肽包括SEQ ID NO4多肽的生物活性片段。
5.一种药用组合物，其包括含有SEQ ID NO4的多肽片段的多肽，其中多肽片段包括选自下列的氨基酸序列SEQ ID NO10，12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105和178。
6.权利要求1至5任何一个的药用组合物，其中多肽是糖基化的。
7.权利要求1至5任何一个的药用组合物，其中多肽是未糖基化的。
8.权利要求1至6任何一个的药用组合物，其中多肽刺激上皮细胞增殖。
9.权利要求1的药用组合物，其包括含有与SEQ ID NO4氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列的多肽。
10.在受试者上刺激上皮细胞增殖的方法，其包括给予受试者含有GIPF多肽，其片段或其类似物和载体的组合物。
11.一种治疗方法，其包括按其需要给予哺乳动物受试者治疗有效量的含有GIPF多肽和可药用的载体的组合物。
12.治疗黏膜炎，炎症性肠疾病，或短肠综合征的方法，其包括按其需要给予哺乳动物受试者治疗有效量的含有GIPF多肽和可药用的载体的组合物。
13.刺激患者胃肠道中上皮细胞增殖的方法，其中方法包括给予治疗有效量的含有GIPF多肽和可药用的载体的组合物。
14.权利要求13的方法，其中刺激食管中上皮细胞增殖。
15.权利要求13的方法，其中刺激小肠中上皮细胞增殖。
16.权利要求13的方法，其中刺激大肠中上皮细胞增殖。
17.权利要求13的方法，其中刺激胃中上皮细胞增殖。
18.用于治疗有衬于至少部分胃肠道的上皮细胞破坏风险的患者的方法，其中该方法包括给予治疗有效量的含有GIPF多肽和可药用的载体的组合物。
19.权利要求18的方法，其中患者进行或要进行放射治疗。
20.权利要求18的方法，其中患者进行或要进行化学治疗。
21.治疗已经历过放射治疗或化学治疗的患者的方法，其包括给予治疗有效量的含有GIPF多肽和可药用的载体的组合物。
22.权利要求10-13，18和21任何一个的方法，其中哺乳动物受试者是人类。
23.一种腺病毒载体，其包括可操作性地与表达控制序列相连的编码GIPF的基因。
24.药用组合物，其包括权利要求23的腺病毒载体。
25.在受试者上刺激上皮细胞增殖的方法，其包括给予该受试者权利要求24的药用组合物。
26.转基因构建物，其包括编码GIPF蛋白的核酸，其中该核酸被可操作性地连接于指导其在B-细胞中表达的转录调节序列。
27.权利要求26的转基因构建物，其包括B-细胞特异的启动子。
28.转基因鼠，其在B-细胞中产生可检测到水平的天然人GIPF蛋白，其中该转基因鼠将编码GIPF蛋白的核酸稳定整合到其基因组中，可操作性地连接于指导其在B-细胞中表达的转录调节序列。
29.权利要求28的转基因鼠，其中该转录调节序列包括B-细胞启动子。
30.鉴定候选药物的方法，其中该药物治疗黏膜炎，炎症性肠疾病或短肠综合征，该方法包括
(a)向转基因鼠给予受试化合物，其中与不表达重组GIPF多肽肠上皮细胞增殖的相同小鼠相比，该转基因鼠B-细胞中表达重组GIPF多肽并表现增加的肠上皮细胞增殖；和
(b)评价该受试化合物对肠上皮细胞增殖的影响，其中将增加肠细胞增殖的受试化合物鉴定为用于治疗黏膜炎，炎症性肠疾病或短肠综合征的候选药物。
31.权利要求30的方法，其中肠上皮细胞是隐窝细胞。
32.分离的多核苷酸其包括选自SEQ ID NO9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102和104的核苷酸。
33.编码有生物活性多肽的分离的多核苷酸，该多核苷酸具有与权利要求32的多核苷酸大约95％以上的序列同一性。
34.分离的多肽，其包括选自SEQ ID NO12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103和105的氨基酸序列。
35.分离的多肽，其包括与选自SEQ ID NO12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103和105的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
36.表达载体，其包括可操作性地连接于选自SEQ ID NO5，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102和104多核苷酸序列的表达调控元件。
37.用SEQ ID NO5，9，11，13，15，17，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104或177的多核苷酸转化或转染的宿主细胞。
38.权利要求37的转化或转染的宿主细胞，其中该细胞是原核的或真核的。
39.生产包括SEQ ID NO12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103或105的氨基酸序列的多肽的方法，该方法包括
(a)在适于表达多肽的条件下在培养基中培养分离的细胞，其中该细胞包括编码SEQ ID NO12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103或105多肽的核酸分子；和
(b)从细胞或培养基中纯化所述多肽。
40.生产药用组合物的方法，其中药用组合物包括含有SEQ ID NO12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105或178氨基酸序列的多肽，该方法包括
(a)在适于表达多肽的条件下在培养基中培养分离的细胞，其中该细胞包括编码SEQ ID NO12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105或178的多肽的核酸分子；
(b)从所述细胞或培养基中纯化所述多肽；和
(c)将纯化的多肽与可药用的载体联合。
41.生产药用组合物的方法，其中药用组合物包括含有SEQ ID NO12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105或178氨基酸序列的多肽，该方法包括
(a)合成包括含有SEQ ID NO12，14，16，18，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105或178的氨基酸序列的多肽；
(b)纯化所述多肽；和
(c)将纯化的多肽与可药用的载体联合。
42.包括编码GIPF蛋白的核酸的表达载体构建物，其中将核酸可操作性地连接于指导GIPF蛋白在肠上皮细胞内表达的转录调控序列。
43.转基因鼠，其在肠上皮细胞中产生可检测水平的GIPF蛋白，其中该转基因鼠将编码GIPF蛋白的核酸稳定整合到其基因组中，其中编码GIPF蛋白的核酸序列被可操作性地连接于指导GIPF蛋白在肠上皮细胞中表达的转录调节序列。
44.包括编码GIPF蛋白和Wnt3a蛋白的核酸的表达载体构建物，其中所述核酸可操作性地连接于指导其在肠上皮细胞内表达的转录调控序列。
45.转基因鼠，其在肠上皮细胞中产生可检测水平的天然GIPF和Wnt3a蛋白，其中该转基因鼠已将编码GIPF蛋白的核酸稳定整合到其基因组中，并可操作性地连接于指导GIPF蛋白在肠上皮细胞中表达的转录调节序列。
46.权利要求43或45的转基因鼠，其中所述鼠表现肠扩张。
47.用于治疗黏膜炎的权利要求1的药用组合物。
48.用于治疗炎症性肠疾病的权利要求1的药用组合物。
49.用于治疗短肠综合征的权利要求1的药用组合物。
50.用于治疗由化学治疗或放射治疗引起的胃肠道损害的权利要求1的药用组合物。
51.权利要求13的方法，其中刺激口腔中上皮细胞的增生。
52.包括SEQ ID NO4的变体的多肽，其中用异亮氨酸取代在第50位氨基酸的缬氨酸。
全文摘要
本发明涉及包括胃肠增生因子(GIPF)多核苷酸和多肽的药用组合物。本发明进一步涉及GIPF预防或治疗与粘膜上皮退变相关的情况或疾病的治疗性应用。
文档编号C07K14/435GK101060855SQ20058000994
公开日2007年10月24日 申请日期2005年1月27日 优先权日2004年1月27日
发明者布赖恩·J·博伊尔, 沃尔特·芬克, 柿谷诚, 大岛毅, 朴云具, 汤姆·Y·唐, 八木干夫, 富塚一磨 申请人:纽维洛股份有限公司, 麒麟麦酒株式会社