专利名称：用于生产拴系蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及使用重组表达载体生产拴系的(tethered)跨膜蛋白细胞外或细胞内结构域的方法。
背景技术：
目前市场上治疗的主要部分瞄准了细胞膜成分。发明针对细胞膜目标的药物的主要挑战是保证分离的细胞膜样本及其成分如在体内一样发挥功能。从天然细胞环境移出时，细胞膜常常失去了其主要生理特征流动性。流动性是中心膜特性之一，其有助于在无数的生化过程中的受体和信号分子的引人注目的空间重排，从细胞间的联系到病毒感染。例如，多价配体诱导他们的靶受体的共同定位，从而编码被承认的不同于独立结合过程的集合特性。在许多情况中，靶受体能够移动和采纳互补构建的能力对于确定分子识别过程的整体亲和性极为重要。在G蛋白偶联受体(GPCR)和整合信号中，结合配体触发受体蛋白自身的构象改变，依次，改变其与其他膜信号分子的结合。在各种情况中，膜成分的组织和迁移率的改变发生在信号传送和识别过程中。
为了保留细胞膜的生理完整性，大多数药物开发过程被强制开发分析膜靶物质的“活细胞”分析。这些方法导致了显著的复杂性，且常常难以被工业化。而且，活细胞系统特定受体的机制研究高度问题化，原因是天然膜含有数百的独特的受体分子。
美国专利No6228326，在此引入作参考，描述了已知为MembraneChipTM的系统。此技术解决了许多上述问题，原因是其结合了体内环境的生理精确性和工业药物筛选所需的高产量。此技术包括被轻移到硅底物上的被支持的脂质双层，以及在不连续的列阵栏空间分离他们。MembraneChipTM能够展示出细胞膜及其分子成分在体内系统中的流动性及其功能特性。该技术的此特征不同于其他生物列阵技术，有助于准确代表种种生物功能，具有无先例的准确性。
磷脂瞄定区域的融合以及瞄定区域供体多肽的异种多肽已被描述了(美国专利No5,109,113)。而且，糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号区域与GPI信号区域的异种多肽的融合已经被描述(美国专利No5,374,548)用于瞄定细胞膜表面。这些融合蛋白质并不定位于细胞膜。但是，这些融合蛋白质的纯化存在问题。
因此，仍然需要一种新的生产拴系膜蛋白的方法，特别是使用以上所描述的设备。
发明内容
一方面，本发明包括一种生产拴系的跨膜蛋白的细胞内或细胞外结构域的方法。在一个实施方案中，该方法包括制备含有5’信号序列，纯化的抗原决定簇标记，编码膜蛋白细胞外结构域的序列，和3’瞄定序列的表达载体。然后用表达载体转染哺乳动物细胞，以生产融合至膜蛋白细胞外结构域的锚，从而瞄定细胞膜。在一个实施方案中，信号序列选自下组中的蛋白表皮生长因子，胰岛素，神经生长因子，血小板衍生的生长因子，胰高血糖素，ICAM-1，B7-1，TrkA，血小板衍生的生长因子受体，及CD58。在一个实施方案中，3’的瞄定序列是GPI瞄定序列。在另一个实施方案中，3’的瞄定序列是GPI序列的32个末端氨基酸。
在另一个实施方案中，该方法包括制备一种含有5’豆蔻酰化编码序列，编码膜蛋白细胞内结构域的序列，和3’纯化的抗原决定簇标记的表达载体。用表达载体转染哺乳动物细胞，以生产瞄定膜细胞内结构域的豆蔻酰化的拴系蛋白。在一个实施方案中，豆蔻酰化编码序列是来自c-Src。
在一个实施方案中，纯化标记是六-组氨酸抗原决定簇。哺乳动物细胞可以选自CHO或HEK-293细胞。
在另一方面，本发明包括用于生产含有5’信号序列；纯化抗原决定簇标记；编码膜蛋白细胞外结构域的序列；和3’瞄定序列的拴系细胞外结构域蛋白的表达载体。在一个可效仿的实施方案中，3’瞄定序列是GPI瞄定序列。
在另一方面，本发明包括用于生产含有豆蔻酰化5’信号序列；编码膜蛋白细胞内结构域的序列；和3’纯化抗原决定簇标记的拴系的细胞内结构域蛋白的表达载体。
在一个实施方案中，纯化抗原决定簇标记是六-组氨酸抗原决定簇标记。
图1A-1B分别表示表达载体pYBS101和pYBS201。
图2A-2C表示实施例3中描述的使用ICAM-1(图2A)和B7-1(图2B)的试验的FACS分析，以及ICAM-1和B7-1的SDS-PAGE和蛋白质印记分析(图2C)；图3A-3C是描述细胞黏附至MembraneChipTM显示蛋白的图；图4A-4B表示“免疫学的突触”的结果和T细胞激活试验，以进一步确定MembraneChipTM显示蛋白的功能。图4A表示在MembraneChipsTM显示的ICAM-1和PCC加载的IEk上PCC抗原特异的鼠科T细胞的不成熟和成熟的突触的荧光显微图片。图4B是图4A中图片的定量图。
具体实施例方式
I定义“表达载体”和“质粒”互换使用是指可以被用于携带特定基因到靶细胞的单链或双链DNA分子。一旦表达载体进入细胞，被基因编码的蛋白质可以通过宿主细胞的正常的转录和翻译过程被生产。应当理解DNA分子可以被可操纵的连接到控制序列如启动子上。可被进一步理解的是表达载体可以包含额外的调节序列以控制转录和/或翻译。
本文使用的“细胞外结构域”指的是膜蛋白的细胞外部分。这些片段通常为生理配体的结合位点，例如，神经传导因子和激素。如果蛋白的多肽链几次通过双层，细胞外结构域可以包含几个突出膜的“环”。
本文使用的“细胞内结构域”指的是膜蛋白的细胞内(或细胞质)区域。
本文使用的“纯化抗原决定簇标记”指的是用于从裂解的细胞中纯化表达蛋白的肽系列。可效仿的纯化肽是六-组氨酸。
本文使用的“信号序列”指的是指导翻译后蛋白运输的肽序列。
本文使用的“锚”和“拴系”指的是用磷脂或磷脂双层瞄定或连接膜蛋白结构域的序列。可效仿的锚序列编码GPI拴系或豆蔻酰化拴系。
除非特别指明，本发明的实践应用本领域技术中的分子生物学、化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学中的常规方法。这些技术在文献中有充分的解释。见，例如，Handbook of ExperimentalImmunology，Vols.I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell eds.，Blackwell Scientific Publications)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，current addition)；Sambrook，等人，Molecular Cloning；A Laboratory Manual(2ndEdition，1998)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplaneds.，Academic Press，Inc.)。
在详细描述本发明之前，应当理解本发明并没有局限于特定的配方或方法参数，其应该有不同。还应该理解用于本文的技术仅仅是为了描述本发明的特定实施方案，并没有限定本发明的意思。
尽管有许多类似或等同于本文描述的方法和物质可用于本发明，本文描述了优选的物质和方法。
II.拴系的蛋白膜蛋白构成了人基因组中总蛋白的重要的部分，表明其调节多种细胞过程，如生长和分化，细胞间黏附，神经突触产生，和免疫细胞活化。估计在约20,000已知的人蛋白中(NCBI Human ReferenceProtein Sequence，9/10/03)，通过TMHMM运算法则预计大约24.3％具有跨膜片段(Technical University of Denmark)。其中估计2,658个具有一个跨膜结构域，有531那么多蛋白具有仅通过膜一次的两个跨膜区域，信号肽的疏水特性使其常常在常规的数据库检索中作为跨膜片段显示。预计这些具有信号序列的蛋白的大约0.5％已经含有GPI锚，该GPI锚为一个天然发生的膜拴系。本质上，本发明确保使用和研究超过66％的膜蛋白，作为额外的膜蛋白种类，包括具有多个跨膜结构域，但是具有不连续的细胞外配体结合区域和细胞内信号结构域的蛋白，没有算在内。从而，本文描述的蛋白表达和显示的普通的方法有助于发现和研究大多数膜蛋白的与细胞内及细胞外有关的方面。
跨膜受体是完整的膜蛋白，典型的其位于并在细胞质膜中工作，但也存在于一些亚细胞结构和细胞器的膜上。在膜的一侧与一个信号传导分子或有时候与一对这样的分子结合，跨膜受体在另一侧启动反应。在这种方法中，他们在细胞通讯和信号传导中起到独特的和重要的作用。
膜蛋白通常具有三个不同的片段细胞外结构域，跨膜区域，和细胞内结构域。细胞外结构域是突出于细胞外或细胞内细胞器的腔表面上的膜的蛋白的一部分。如果蛋白的多肽链多次穿过双层，细胞外结构域可以包括几个突出于膜的“环”。此区域有助于配体的结合。跨膜区域贯穿膜。在结构明确的大多数蛋白中，跨膜的α螺旋组成了跨膜结构域的大部分。在某些蛋白中，如烟碱乙酰胆碱受体，跨膜结构域形成一个通过膜的蛋白线孔，或离子通道。通过结合适当的配体激活细胞外结构域，孔变得对离子可通透，离子随后通过该通道。在其他蛋白中，跨膜结构域被认为通过结合完成构向改变，其在细胞内发挥作用。在某些受体中，如7TM超家族(如GPCR)的成员，跨膜结构域可以含有配体结合袋(关于这类受体已知的这些和其他的一些证据是部分基于噬菌调理素以及通过结晶学确定的其详细结构的研究)。受体的细胞内(或细胞质)结构域与细胞或细胞器的内部相互作用，传递信号(www.wikipedia.com)。
许多跨膜受体与两个或更多蛋白亚单位组成，当受体结合、分离或他们的“激活”循环的其他步骤中，该亚单位可操纵的结合或分离。通常根据其分子结构分类，或者除了一部分，大多数受体的详细结构不清楚，根据其假定的(有时是试验证实的)膜拓扑结构分类。预计最简单的多肽链仅通过脂质双层一次，而其他通过七次之多(被称为G蛋白偶联)(www.wikipedia.com)。
膜蛋白在膜中具有多种拓扑结构，蛋白的最疏水部分包埋在膜中。蛋白可以具有一个跨膜成分，其N末端和C末端位于膜的相反两端，或N末端信号肽被切断在膜的细胞外部分产生一个新的N末端。在另一个实施方案中，膜蛋白可以具有多个跨膜部分。而且，许多膜蛋白没有包埋在膜中而是通过共价键连接的脂肪酸拴系于膜，该脂肪酸构成脂质双层的一部分(Creighton，ProteinsStructure and MolecularProperties，2ndEd.，W.H.Freeman and Company，New York，1984)。
II.生产拴系蛋白的方法在一个实施方案中，本发明提供了用于制备拴系的跨膜蛋白的细胞外或细胞内结构域的方法。这些拴系蛋白特别用于通过瞄定流动的双层膜展示跨膜蛋白的细胞外和细胞内结构域，如，但不局限于，美国专利No6,228,326中描述的MembraneChipTM中存在的那些，该专利在此引作参考。
特别地，膜蛋白拴系于锚上，例如，GPI抛锚点，脂质连接(如豆蔻酰化或棕榈化)，连接于生物素亚磷酰氨膜脂质的抗生物素蛋白/链霉素/神经抗生物素蛋白融合，通过Ni2+膜协调拴系的六-组氨酸标记蛋白，连接于与谷胱甘肽连接的膜脂质的谷胱甘肽-S-转染酶融合蛋白，以及连接于与麦芽糖结合的膜脂质的麦芽糖结合蛋白融合蛋白。
在一个优选的实施方案中，膜蛋白被基因工程操纵地含有如下所述的拴系连接。
A.细胞外结构域膜蛋白的可效仿的细胞外结构域包括人B7-1，ICAM-1，ErbB1，ErbB4，及鼠科的含有α和β多肽链的I-Ek二聚体。
细胞间信号传导是肿瘤重要的基础，因为为了其生长和维持，肿瘤常常需要细胞间的密切接触。信号通过的(促)红细胞生成素产生的肝细胞瘤(Eph)受体(EphRs)是受体酪氨酸激酶(RTKs)最大的家族，表明其在癌发生中很重要(Dodelet等人，Oncogene(2000)195614-5619)。而且，EphRs的配体，已知为Ephrins是一次通过或GPI-瞄定膜蛋白(Cutforth等人，Trends Neurosci.(2002)25332-334)，反应了通过此受体家族用于跨膜信号传导的细胞间接触的重要作用。EphRs/Ephrin信号传导在血管形成过程中起重要作用，通过该精细的过程，肿瘤形成了维持有氧状态的脉管系统。因此血管形成需要细胞间亲密的相互作用和信号传导，其也被认为是肿瘤治疗干扰的重要机理(Huang，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USE 1007785-7790)。使用本发明的方法，可以展示EphRs或Ephrin配体的细胞外结构域，并可以在被覆盖的完整的细胞上测定通过其同源受体的完整的信号传导路径。在肿瘤的一种情况中，合适的EphR/Ephrin配对介导的血管生成可被用于鉴别破坏信号系统的药物的目的研究。从而，这种展示一个跨膜蛋白的方法可以鉴别和确认新的肿瘤化疗药物。
除了组织再生和肿瘤外，免疫激活过程需要广泛的细胞间相互作用和信号传导。最终导致细胞因子释放和激活的T细胞增殖的连续的步骤需要与APCs的亲密接触。在T细胞/APC相互作用的情况中，细胞间接触非常紧密，以致被称为“突触”这一术语，其非常有助于精确地制定介导免疫反应的T细胞受体、MHC、黏附和共同刺激的分子的模式(Grakoui等人，Science(1999)285221-227)。而且，在MHC和特定抗原肽的上下文中的展示ICAM-1的被支持的脂质双层表明足以形成免疫突触和覆盖完整T细胞的骨侧(fide)激活(Grakoui等人，Science(1999)285221-227)。由于MHC分子、ICAM-1和大部分其他的黏附和共同刺激分子既是一次通过或GPI-瞄定的膜蛋白，展示此蛋白的本发明的方法提供了研究免疫系统活性的有力的机会。而且，过多的T细胞激活导致了许多严重的使衰弱的自体免疫疾病，包括多发硬化和Crohn氏病，此技术可以导致更好地治疗这些免疫性疾病。
B.细胞内结构域本发明还有助于通过膜蛋白细胞质区域的展示研究细胞内信号传导。RTKs是一个特别的受体的家族，其细胞内信号传导路径是抗肿瘤治疗的潜在的靶子。表皮生长因子受体，可能是最常见的RTK，在许多肿瘤中被上调了(Gill等人，Mol.Cell Endocrinol(1987)51169-186)，其是抗体治疗Erbitux和Herceptin的靶子。由于RTKs的细胞质激酶结构域已经被表明当从其细胞外和跨膜区域被分离时，具有组成活性，其有可能重建发源自拴系到流动双层的细胞内结构域的信号传导路径，如在MembraneChipTM上展示的。在一个实施方案中，RTK的细胞内结构域通过N末端膜锚瞄定到MembraneChipTM上，随后用信号路径的细胞提取液或纯化的成分孵育。在此方法中，体外重建RTK路径有助于鉴别用难以相信的特异性筛选的小分子药物。各种RTKs可以在一般的信号传导机制存在的情况下在MembraneChipTM上排列，其可以鉴别对指定RTK特异的抑制剂。靶RTKs与非靶RTKs平行排列，保证了鉴别影响酪氨酸激酶路径和可能的抗各种肿瘤活性的高特异的小分子药物。
在一个优选的实施方案中，RTK蛋白中的兴趣细胞内结构域是酪氨酸激酶结构域。进一步适合的细胞内结构域可以或可以不具酪氨酸激酶活性，这依赖其生物活性的模式，其选自粘合素和如肿瘤坏死因子受体、表皮生长因子受体和干扰素受体的受体。应该理解许多细胞内结构域是本领域已知的，适合用于本发明。
C表达载体在一个优选的实施方案中，拴系膜蛋白如以下描述使用表达载体被基因工程构建。将拴系序列，如GPI黏附信号与引起蛋白被细胞翻译后修饰的基因结合产生了拴系蛋白。例如，当使用GPI黏附信号时，GPI连接导致信号定位。
在一个实施方案中，膜蛋白包括膜蛋白的细胞外结构域。细胞外结构域作为配体的结合位点发挥作用。
在另一个实施方案中，膜蛋白包括膜蛋白的细胞内结构域。细胞内结构域作为细胞质蛋白(如，转换器、激酶、磷酸酶)的结合位点发挥作用，即，用于研究信号路径。
首先使用本领域已知的方法，通过PCR扩增膜蛋白。为了跨膜蛋白的细胞外结构域，编码感兴趣的细胞外结构域的cDNA而后被克隆至恰当的表达载体的灵活的多克隆位点，以产生pYBS101。恰当的表达载体是本领域已知的，是商业可售的(Invitrogen)。制备并将DNA插入表达载体的方法是本领域已知的(Sambrook，1989)。应该理解商售的表达载体可以包括调节序列以及限制性位点。应该理解表达载体可以进一步包括可选择的标记，如那些具有抗生素抗性的。在一个实施方案中，可选择的标记是新霉素抗性。
如图1A中所见，pYBS101载体包括5’信号序列，纯化抗原决定簇标记，以及3’拴系锚序列。信号序列将表达的蛋白定向于细胞表面。恰当的信号序列是本领域已知的。在一个实施方案中，信号序列是来自Igk链的信号序列，条件是其是被很好定性的。可效仿的信号序列几乎包括可用于本发明的每一个分泌蛋白，以及许多膜蛋白。含有信号序列的分泌蛋白和膜蛋白的例子包括表皮生长因子(分泌的)、胰岛素(分泌的)、神经生长因子(分泌的)、血小板衍生的生长因子(分泌的)、胰高血糖素(分泌的)、ICAM-1(膜蛋白)、B7-1(膜蛋白)、TrkA(膜蛋白)、血小板衍生的生长因子受体(膜蛋白)、以及CD58(膜蛋白)。应该理解，如本领域已知的，基因的密码子是简并的，超过一个密码子可以编码一个特定的蛋白。
在一个优选的实施方案中，纯化的抗原决定簇标记是六-组氨酸。可是，应该理解，六-组氨酸以外的其他抗原决定簇标记也可以被使用，如myc，Flag，HA，谷胱甘肽-S-转染酶，以及麦芽糖结合蛋白。
在一个优选的实施方案中，拴系序列是GPI拴系序列。应该理解，在另一个实施方案中，拴系由结合至生物素酰化的膜脂质的抗生物素蛋白/链霉素/神经抗生物素蛋白融合、通过Ni2+膜协同作用拴系的六-组氨酸标记蛋白、结合至与谷胱甘肽连接的膜脂质的谷胱甘肽-S-转染酶融合蛋白、以及结合至与麦芽糖连接的膜脂质的麦芽糖结合蛋白融合蛋白。
对于膜蛋白的细胞内结构域，将编码细胞内结构域的cDNA克隆至pYBS201灵活的多克隆位点。如图1B中所见，如上所述，pYBS201载体包括5’拴系序列和3’纯化抗原决定簇标记。编码膜蛋白的细胞内结构域的cDNA被亚克隆至侧面有两个修饰序列的多克隆位点。在一个实施方案中，拴系序列优选豆蔻酰化编码序列。在一个实施方案中，拴系序列来自c-Src蛋白，可是，也可以使用几乎任何一个N末端豆蔻酰化蛋白的相应的序列。此种蛋白的例子包括酪氨酸激酶的Src家族的其他成员、钙调蛋白磷酸酶B、蛋白的ADP-核糖基化因子家族的成员、一氧化氮合成酶、以及cAMP-依赖的蛋白激酶。
可选择的，可以使用在5’端(pYBS101)或3’端(pYBS201)的肠激酶剪切位点亚克隆cDNA，如果必要，其可以除去纯化的标记。除了肠激酶外，也可以使用其他蛋白酶和蛋白酶识别序列，包括但不局限于凝血酶和Xa因子。尽管已知pYBS101和pYBS201新霉素抗性基因，可用于选择稳定的转染细胞，应该理解可以很容易地修饰载体以确保用其他的药物选择，包括但不局限于，潮霉素和zeocin。此种增加的灵活性有助于选择共同表达不同蛋白的转染细胞，如复合型蛋白(multimeric complex)。
如实施例1和3中所描述的，构建质粒pYBS101以生产膜蛋白细胞外结构域的膜拴系型。在实施例3中，膜蛋白的细胞外结构域是人B7-1或ICAM-1。PYBS101质粒是通过修饰pcDNA3.1(+)的通用表达载体(图1A)，其含有5’信号序列、六-组氨酸纯化抗原决定簇标记、感兴趣膜蛋白的细胞外结构域和3’GPI瞄定序列。
如实施例2中所描述的，pYBS201是通过pcDNA3.1(+)修饰的通用质粒(图1B)，其含有5’豆蔻酰化编码序列(衍生自c-Src的N端瞄定氨基酸)和3’六-组氨酸抗原决定簇标记。
通过本领域已知的方法繁殖载体。可以用本领域已知的方法评估结构域的表达，例如，使用免疫组化染色、蛋白印迹杂交、和ELISA。而后根据本领域已知的方法用载体转染哺乳动物细胞。如实施例3所见，将得到的构建pYBS101转染到哺乳动物细胞，如中国仓鼠细胞(CHO)或HEK-293中，生成瞄定质膜的细胞外结构域和通过C末端GPI锚的拴系。应该理解，用pYBS201转染产生了瞄定质膜的细胞内结构域和通过N端的豆蔻酰化锚的拴系。还可以通过病毒载体完成在哺乳动物细胞中的表达，其依赖于用于任何指定蛋白的标准转染试剂的成功性。N末端的六-组氨酸序列的融合有助于快速、高效的在Ni2+树脂上纯化。使用本发明的方法观察到50-75％的转染效率。在一些实施方案中，使用本发明至少达到50％的转染效率。在其他实施方案中，使用本发明至少达到70-75％的转染效率。如图2A所见，在HEK293细胞中ICAM-1的表达是72％。图2A表明使用特异的抗人ICAM-1的PE-连接抗体的FASC分析结果。左面一组表明在对照的未转染细胞中基本上没有ICAM-1表达，而在用有人ICAM-1的pYBS101转染的细胞中观察到强表达(右组)。在图2B中的用FASC的分析中表明相似的人B7-1的表达结果。可以使用如图2C中的SDS-PAGE和蛋白印迹杂交证明拴系蛋白的表达。该图分别显示了对应于ICAM-1或B7-1蛋白(左)或免疫反应性(右)的条带。参考实施例3-11，尽管此处的实施例涉及使用pYBS101的膜蛋白细胞外结构域的产生和显示，应该理解，这些实施例等同于使用pYBS201的膜蛋白细胞内结构域的结合应用。
使用纯化抗原决定簇标记纯化翻译后的膜蛋白。在哺乳动物细胞中的表达分别产生了细胞外或细胞内结构域，其通过很容易被Ni2+树脂纯化的拴系拴系到膜上。如实施例4中所描述，根据已知的方法，抗原决定簇标记连接到小珠或树脂上。
IV列阵如上所述，通过此处描述的方法形成的拴系蛋白被用于产生和展示脂质双层列阵上的跨膜蛋白的细胞外和细胞内结构域。细胞外和细胞内结构域可被用作受体或配体结合区域，用于检测列阵中的分析物。特别优选地，使用本发明与美国专利No6,228,326中描述的流动的双层膜。此流动的双层膜，以下称MembraneChipTM，如那里所描述的，能够展示活的细胞膜的特性，这有助于使用他研究几乎调节细胞生理学每一方面的膜蛋白。
发现这些膜列阵可用于很多应用，包括简单质量确认/质量对照优化研究、医学诊断和涉及细胞间反应的药物发现。使用此方法展示的细胞内结构域可以使研究整体的完整的信号传导路径变得可能。本文描述的展示方法，能够处理含有不连续功能性细胞内或细胞外结构域的基因组中的大多数膜蛋白，从而使无数的工业和医学临床中的用于变为可能。
例如，受体酪氨酸激酶(RTKs)，其是细胞生长和分化重要的调节子，与多种肿瘤有关，使用本发明的技术其可被瞄定。RTKs的配体诱导的二聚化和自体磷酸化特性能够如实的被重建，用于指定MembraneChipTM环境的药物发现。除了研究膜蛋白调节的细胞自体状况外，此技术还可用于示范细胞间的相互作用，包括细胞间黏附和信号传导。细胞间信号传导对于调节细胞增殖和分化、胚胎发生的器官和组织发育、神经突触的建立、血管生成和免疫反应的激活非常重要。基本上，这些细胞间相互作用通过同源的跨膜结合的配体和受体的结合，在并列的细胞中启动信号级联中发生。不恰当的细胞间联系发生在一些疾病状态中，包括肿瘤和自体免疫性疾病，其相关的信号分子是发现药物的重要的靶子。在芯片栏中配体结合的膜，其上覆盖表达膜结合受体的完整的细胞，其优点是具有很好定义的、纯化成分，能够同时研究完整的信号传导路径。
在免疫系统中，例如，展示复合至流动的双层中的MHC和辅助黏附和共刺激分子的抗原肽可成功地再获得抗原提呈细胞的能力(APCs)。覆盖在芯片上展示的抗原肽特异的完整T细胞上，可使其快速激活，有助于T细胞激活路径中几乎每个检测点的瞄定(见，例如Grakoui等人Science(1999)285221-227，用于讨论其相互作用)。
MembraneChipTM的生理特性使其对于研究需要细胞间接触的过程非常有用。例如，在有支持的脂质双层中展示一次穿过膜蛋白的GPI连接的细胞外结构域可作为被覆盖的完整细胞中的黏附分子和用于识别受体的信号传导配体，使各种组织生长成为可能。许多研究表面干细胞可在体外通过与特定的组织共同培养分化成各种细胞类型(Prockop等人Proc.Natl.Sci.USA(2003)10011917-11923)。从而，本发明的膜列阵有助于在工业规模上生产器官和组织。因此，通过提供存在于膜蛋白细胞外结构域的特定组织中干细胞分化所需的最小信号，干细胞可在展示这些蛋白的细胞外结构域的MembraneChipTM的环境中培养。实际上，适合于移植或植入到有病器官的生长的人组织对公众健康是非常有利的，特别是考虑到全国大约73,000人正等待器官移植，每年10,000人死于尸体器官短缺。
此列阵还可以特别地用于临床诊断。感染性疾病变为医学中一个重要的分支，能够监控抗各种致病菌的疫苗接种的有效性变得非常有意义。通常，接种导致投药的特定抗原特异性的T细胞的产生。通过展示与致病抗原复合的MHC分子，有可能从病人的血清中分离抗原特异性的T细胞。在一个实施方案中，被免疫一组致病菌的病人提供简单的血清样本，其与在流动的双层列阵上的MHC上展示的相同组混合，有助于指示成功接种的反应T细胞的一次高信息内容的筛选。具有抗原的展示的MHCs也有助于诊断各种自体免疫性疾病。例如，多发硬化中的自体抗原可以在芯片上被展示以用于检测认为与疾病病理学相关的特定组群T细胞的存在与否。
如实施例10中所述的，JurkatT细胞选择的黏附于包括拴系蛋白的双层膜。如图3A中所见，至少比对照多4X的Jurkat T细胞黏附至展示人B7-1蛋白的MembraneChipTM上。对于展示人ICAM蛋白的MembraneChipTM，观察到至少多3X的黏附。而且，Jurkat T细胞的黏附可以分别被被预先与抗人B7-1和ICAM-1的细胞外结构域的单克隆抗体孵育的MembraneChipTM抑制(图3B)，表明展示蛋白的黏附特异性。图3B是用或不用抗体阻断的对照、具有拴系的ICAM-1蛋白的膜、具有拴系的B7-1蛋白的膜的Jurkat T细胞黏附的图。可以用每个领域的细胞数测定黏附。如图3B所见，使用抗体阻断比不使用抗体阻断至少少8X的Jurkat T细胞黏附。
图3表明抗原特异性T细胞在具有或不具有ICAM-1、I-Ek-PCC抗体阻断以及空膜对照中向MembraneChipTM的黏附。在另一个实施方案中，双层可以包括两个或多个拴系蛋白。如实施例10中所述，用ICAM-1或I-Ek-PCC拴系蛋白制备MembraneChipTM。在这种方式中，可以以同一个MembraneChipTM组合物检测超过一个分析物。两种蛋白均保留功能。如图3A所见，用抗I-Ek-抗体预处理后与没用单克隆抗体处理的MembraneChipTM相比大约一半的细胞黏附至ICAM-1/IEk-PCC。
本发明的方法为质量确定和对照应用提供了有效地设备。已被鉴别具有对抗使用本方法展示的任何膜蛋白的活性的药物(包括但不局限于小分子、抗体、和生物制剂)能够很容易的使用此技术鉴别和优化。此技术的列阵形式非常有助于特异性和敏感性的研究，其与许多不同的检测系统兼容，包括如美国专利公布No.20040053337中描述的无标记方法和表面等离子共振。在此方法中，可以快速获得活性药物的亲和性检测，有助于进一步优化和确认。从而，本发明的膜蛋白展示方法对于许多不同的领域非常有利。
表1免疫学的膜蛋白
膜蛋白被拴系到脂质上，而后被用于形成美国专利No6,228,326中描述的流动的双层。通过上述表达载体产生的膜蛋白被拴系至双层膜的脂质，与双层列阵一起使用。将纯化的蛋白加入到形成小囊的脂质混合物中，透析以形成囊悬着物。使用的脂质依赖于双层需要的特性。可效仿的脂质包括合成的和天然生产的脂质，包括磷脂如卵磷脂(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)等。然后将脂蛋白小囊沉积于底物而表面形成双层列阵。底物包括至少一个双层兼容的表面区域。典型的，底物表面与脂质蛋白小囊悬着物接触。允许悬着物在一个恰当的时间内与表面接触，该时间允许脂质与表面融合形成流动双层。所需时间典型为几分钟，如，大约5分钟。
如实施例5中所描述的，将纯化的蛋白加入到鸡蛋PC脂质混合物中形成小囊悬着物。将小囊悬着物沉积，并与MembraneChipTM或盖玻片孵育形成具有拴系膜蛋白的流动双层。通过免疫荧光确定蛋白与双层膜的结合。可以使用本领域已知的任何方法确认黏附至展示结构域的细胞，如实施例6-7中描述的。如实施例9所述，使用免疫荧光显微镜确认膜蛋白展示。
在实施例10中描述的，在图3A-3C中表明的T细胞黏附试验证实了使用本发明方法表达、纯化、展示的膜蛋白的活性，免疫突触形成的检测证实了在MembranChipTM的脂质双层中的这些蛋白的流动性和信号传导能力。信号传导路径通常需要细胞表面分子的低聚化和/或聚集，从而使传导信号穿过质膜，由生理膜的侧向流动性产生的必要的现象使其可能。如美国专利Nos6,228,326和6,503,452；美国专利公开Nos20020009807和20020160505和PCT公开No WO01/26800中所描述的，所有这些都引入本文作参考，MembranChipTM支持的脂质双层显示了流动性的生理水平。通过此处描述的方法生产的膜蛋白的迁移率在“免疫突触”的形成中检测，T细胞激活的动力学固定的过程，其中T细胞受体/MHC和LFA-1/ICAM-1对在细胞表面进行了令人吃惊的重组(Grakoui等，Science，(1999)285221-227)。
如实施例8中所述，在MembranChipTM上展示的结构域保留了结构域的功能。图4A表明当与PCC特异的T细胞接触时ICAM-1和I-E-PCC加载的MembranChipTM的成熟和不成熟的突触。当PCC-特异的鼠科T细胞首次遇到显示ICAM-1(用标记ICAM-1的箭头指定)和PCC加载的I-Ek(用标记IEk-PCC的箭头指定)的MembraneChipTM时，T细胞黏附并形成不成熟的“突触”，其特征为ICAM-1位于中间，I-Ek位于周围(图4A，左组)。可是，在与T细胞接触的下一个30分钟内，这个“突触”模式急剧改变，PCC-加载的I-Ek移到中间，ICAM-1移到更周围的位置(图4A，右组)。这种ICAM-1和I-Ek戏剧性的重排完全是抗原依赖的，因为它不发生在空的或加载突变的PCC*肽的I-Ek中(数据未显示)。而且，活T细胞加入后的这些蛋白的重定位强调了这些拴系蛋白显示的侧流动性的生理水平。除了免疫突触形成的定性分析，通过测量T细胞/APC突触中间的I-Ek聚集程度，很容易获得更多的定量信息。如在图4B中描述的，显示ICAM-1和PCC-加载的I-Ek的MembraneChipTM结合与展示空的I-Ek或复合至突变的PCC*肽的I-Ek膜相比，聚集的I-Ek分子大约增加了3-4倍。
此处引用的所有的文献、专利和专利申请，无论是在上还是在下，均在此引入作参考。
实施例下面的实施例仅仅提供了说明的目的，并不以任何方式限制本发明的范围。已经尽力保证所使用数字的准确性(如，含量，温度等)，但有些试验的失误和偏差应该是被允许的。
材料和方法细胞CHO、HEK-293和Jurkat T细胞来自加利福尼亚大学，旧金山细胞培养设施，分别在Ham’s F12，Dulbecco’s修饰的Eagle培养基和RPMI 1640培养基中，在37℃具有5％CO2的培养箱中，根据厂家推荐的方法培养。
实施例1生产GPI拴系细胞外结构域的表达载体的产生通过修饰pcDNA3.1(+)(Invitrogen)生成pYBS101。编码Igκ领导序列(SEQ ID NO1)的序列之后为编码六个串连组氨酸残基的序列(SEQ ID NO2)，将其作为寡核甘酸克隆至NheI-HindIII消化的pcDNA3.1(+)，仅生成HindIII位点。编码来自胎盘的碱性磷酸酶的GPI-瞄定序列(SEQ ID NO3)的32个末端氨基酸的序列被从pVac2-mcs(Invivogen)中作为Xhal-NheI片段被PCR扩增，并连接至上面提到的修饰pcDNA3.1(+)的XbaI位点，仅在序列的5’端重新产生XbaI位点，生成pYBS101。
实施例2生成豆蔻酰化拴系细胞内结构域的表达载体的产生通过修饰pcDNA3.1(+)(Invitrogen)生成pYBS201。将编码c-Src N末端的豆蔻酰化序列(SEQ ID NO4)作为寡核甘酸克隆至NheI-HindIII消化的pcDNA3.1(+)中。随后将编码六个串连的组氨酸残基的序列(SEQ ID NO2)作为寡核甘酸克隆至含有编码豆蔻酰化序列的XbaI-ApaI消化的载体中。得到pYBS201，即含有5’c-Src豆蔻酰化又含有3’六组氨酸编码序列。
实施例3在GPI瞄定的形式中表达膜蛋白编码人B7-1和ICAM-1的细胞外结构域的cDNA(不包括信号序列)从ESTs中扩增并作为HindIII-XbaI片段与在其N端的肠激酶编码切断位点(DDDDK，SEQ ID NO5)克隆至pYBS101中。使用磷酸钙转染法(Promega)或SuperFect(Qiagen)，根据厂家的推荐，用表达质粒转染CHO细胞。转染48小时后，将细胞以1∶5、1∶10和1∶20的比率接种到含有500μg/ml的G418(Invitrogen)的生长培养基中，以产生表达人B7-1和ICAM-1的稳定的细胞系。维持多克隆的稳定细胞系，并在含有G418的培养基中传代4周。ICAM-1和B7-1也在HEK-293细胞中瞬时表达。使用PE-连接的抗体通过FACS分析确定这些蛋白的表达(Beckton Dickinson)，结果分别表示在图2A和2B中。通过蛋白印记分析进一步确定ICAM-1和B7-1的表达，结果在图2C中显示。
实施例4膜蛋白的纯化制备表达B7-1或ICAM-1的pYBS101质粒，并如实施例3所述转染CHO细胞。用冷的PBS从6-8个10cm的平皿中洗涤融合的CHO细胞两次，将其刮入600μl(每个平皿)含有50mM Tris-Cl pH8.0，150mMNaCL，和1％ Triton X100和蛋白酶抑制混合物(Sigma)的裂解缓冲液中。将收集的细胞在冰上溶解30分钟，随后以最大速度通过微离心机离心15分钟。用裂解缓冲液洗涤Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)1次，并加入澄清的提取物，每600μl细胞提取液加50μl小珠。在4℃下将细胞提取液与小珠旋转孵育2小时。用含有50mM Tris PH8.0，150mMNaCl，10mM咪唑(Sigma)和1％的辛基-葡萄糖吡喃糖苷(Calbiochem)和蛋白酶抑制混合物的缓冲液中洗涤4次。用含有50mM Tris PH8.0，150mM NaCl，200mM咪唑和1％的辛基-葡萄糖吡喃糖苷和蛋白酶抑制混合物的600μl缓冲液在4℃旋转1小时洗提结合的蛋白。通过SDS-PAGE的检测，洗提的蛋白大约50％纯，根据Bradford分析(BioRad)，大约6.8μg B7-1/mg总蛋白，3.3μg ICAM-1/mg总蛋白。洗提后大约10-50％纯化的蛋白仍连接在小珠上。
实施例5膜蛋白的重建通过实施例4的方法制备的蛋白提取液的水性部分基本上加入到eggPC脂质混合物(1％ NBD-PG，99％eggPC)，在室温下在PBS中过夜透析，换3次缓冲液。在这种情况下，eggPC用于产生膜，这些蛋白可以很容易与多种脂质组合物在小囊中重建。为了形成支持的脂质膜，20μl未稀释(或1∶2稀释的)蛋白-脂质混合物在室温下被沉积到MembraneChipTM或盖玻片上3-5分钟，随后用缓冲液洗涤5次。使用各自蛋白的抗体通过免疫荧光确定融合到支持膜上的蛋白。在5％的FCS中用30μlPE结合的抗体(Becton Dickinson)染色30分钟，然后用PBS充分洗涤，用荧光显微镜分析。根据在7mm直径的芯片表面20μl滴中的脂质蛋白浓度为0.6μg/μl(50％纯度)的分析，蛋白密度大约为10,000-20,000个分子/μm2。假定仅仅有1％的滴含量保留在用于膜展示的芯片表面。
实施例6黏附至MembraneChipTM的Jurkat T细胞如Chan等(Chan等，J CellBiol(1991)115245-255)描述的并经过各种改进进行细胞黏附分析。简言之，通过实施例5的方法基本上由B7-1和ICAM-1形成的膜在室温下在PBS中用10％的胎牛血清(VWR)阻断1小时，随后在37℃下在含有10％的FBS的RPMI1640培养基中(Invitrogen)孵育10分钟。将1×105的Jurkat T细胞加入到孔中15分钟。通过在明场显微镜下的计数确定每一个膜栏上大概的细胞数(通常为150-200个细胞/栏)。随后将MembraneChipTM颠倒放置到含有10％FBS的PBS的平皿中，放置15-20分钟，以洗掉未结合的细胞。通过直接在显微镜下或照片后计数确定最后的细胞数。在使用抗人B7-1或ICAM-1(Santa Cruz)单克隆抗体阻断Jurkat T细胞黏附的试验中，预先将MembraneChipTM与抗体孵育，在与细胞孵育前用PBS洗涤3次。在Nikon Eclipse垂直显微镜中进行显像。
实施例7黏附至MembraneChipTM的抗原特异性T细胞为了进行抗原特异性T细胞的黏附，使用实施例3和4中描述的方法，鼠科II型MHC二聚分子I-Ek被表达、纯化，并在MembraneChipTM上展示。在各种试验中，I-Ek在存在或不存在ICAM-1的情况下被展示。用从鸽子细胞色素c(PCC)衍生的短肽加载I-Ek，该鸽子细胞色素c(PCC)为衍生自转基因小鼠株B10.Cg-Tg(TcrAND)53Hed/J和B6；SJL-Tg(TcrAND)53Hed/J细胞(Jackson实验室)(Kaye等人，Nature(1989)341746-749)的T细胞特异性识别的蛋白抗原。用磁性小珠选择(Dynal)从前述转基因小鼠得到的脾脏中分离PCC特异的鼠T细胞。基本上使用Tuekat T细胞试验(实施例6)中描述的进行这些鼠PCC特异的T细胞在单独或联合展示ICAM-1和PCC-加载的I-Ek的MembraneChipTM上的测量。使用直接抗人ICAM-1和鼠I-Ek(Santa Cruz)的单克隆抗体阻断试验。
实施例8在MembraneChipTM上抗原特异的免疫突触的形成基本上如实施例7中所描述的方法制备免疫突触试验使用的PCC抗原特异的鼠科T细胞和展示ICAM-1和PCC加载的I-EkMembraneChipTM(也见Grakoui等人，Science(1999)285221-227)。基本上使用实施例3-5中描述的方法表达、纯化和展示人ICAM-1(荧光标记的绿色)和鼠科I-Ek(荧光标记的红色)。图4A显示了PCC抗原特异的鼠科T细胞黏附至展示ICAM-1中央的和PCC加载I-Ek周边的MembraneChipTM不成熟突触(左组)。右组显示孵育30分钟后的成熟突触。
如在Adobe Photoshop中图像定量所确定的通过确定I-Ek聚集的中央的程度确定免疫突触形成的强度，结果在图4B中表示。没有肽制备的、突变PCC*制备的和野生型PCC制备的MembraneChipTM的I-Ek聚集的密度以相对的荧光单位测定。
实施例9膜蛋白展示的确认使用免疫突触的几种蛋白确定pYBS101表达系统，该免疫突触调节T细胞与抗原提呈细胞B7-1、ICAM-1和α和β链形成的二聚体I-Ek的相互作用。编码这些蛋白的人(ICAM-1、B7-1)或鼠科(I-Ek)的异构体的cDNA通过实施例3的方法被克隆至pYBS101中，稳定(在CHO细胞中)或瞬时(在HEK-293细胞中)表达。FACS分析(图2A和2B)证明这些蛋白高水平的表达(见ICAM-1和B7-1)，以及其正确的定位和拴系至质膜(未转染的在左，转染的在右)。如实施例4中描述的使用Ni2+树脂一步完成这些蛋白的纯化，SDS-PAGE和蛋白印迹杂交表面这些蛋白为预期的大小(图2C)。随后将纯化的蛋白重建到卵磷脂小囊中，如实施例5中所述列阵到MembraneChipTM的膜栏中。
免疫荧光显微镜显示了在支持双层中这些蛋白的存在(数据未显示)。在从芯片列阵中任意释放可溶蛋白的情况下，用磷脂酰肌醇磷脂酶C可以完成对GPI锚的酶切。
实施例10Jurkat T细胞黏附分析为了证实纯化的、MembraneChipTM展示蛋白是具有功能的，测试了调节Jurkat T细胞黏附的系统的能力(图3A)。与如实施例5中制备的具有或不具展示的人B7-1或ICAM-1的MembraneChipTM孵育大约1×105Jurkat T细胞，密度大约为10,000-20,000个分子/μm2。仅在展示这些蛋白的膜上观察到强的T细胞黏附，对于没有蛋白的膜，细胞几乎不黏附。作为细胞黏附特异性的进一步试验，分别用抗人B7-1和ICAM-1的细胞外结构域的单克隆抗体阻断CD28/B7-1和LFA-1/ICAM-1的相互作用。在图3B中的结果表明与抗B7-1或ICAM-1的抗体预孵育的膜使Jurkat T细胞向展示各种蛋白的MembraneChipTM膜的黏附消失了，在没有蛋白的膜中观察到的降低至背景水平的细胞黏附。而且，检测了PCC抗原特异的鼠科T细胞对MembraneChipTM单独或联合展示ICAM-1和PCC加载的I-Ek的黏附(图3C)。如在Jurkat T细胞试验的情况中，可以使用抗ICAM-1和I-Ek的单克隆抗体完成T细胞黏附的特异性阻断(图3C)。
因此，本发明描述了生成拴系的细胞内和细胞外结构域的新方法，特别是用于与流动的双层膜使用。本文所描述的试验证实了在生物分析中拴系蛋白的强活性。尽管本发明主旨的优选实施方案被详细的描述了，应该理解在不偏离本发明的主旨和范围的前提下可以进行各种改变。
序列表<110>西纳门公司V·山崎O·西连科J·T·格罗夫斯<120>用于生产拴系蛋白的方法<130>547958003WO0<140>Not Yet Assigned<141>Filed Herewith<150>US 60/543,324<151>2004-02-09<160>5<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgK引导序列<400>1Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp20<210>2<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>六-组氨酸标记<400>2His His His His His His1 5<210>3<211>32<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GPI序列<400>3Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Arg Ser Val Val Pro Ala Leu Leu1 5 10 15Pro Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu Glu Thr Ala Thr Ala Pro20 25 30
<210>4<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>c-Src豆蔻酰化序列<400>4Met Gly Ser Ser Lys Ser Lys Pro Lys Asp1 5 10<210>5<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肠激酶编码切断位点<400>5Asp Asp Asp Asp Lys1 权利要求
1.一种产生跨膜蛋白的拴系的细胞内和细胞外结构域的方法，其包括(a)制备含有5’信号序列，纯化的抗原决定簇标记，膜蛋白细胞外结构域的编码序列和3’锚序列的表达载体；以及用所述表达载体转染哺乳动物细胞，以产生瞄定质膜的细胞外结构域的锚拴系蛋白；或(b)制备含有5’豆蔻酰化编码序列，膜蛋白细胞内结构域的编码序列和3’纯化的抗原决定簇标记的表达载体；和用所述表达载体转染哺乳动物细胞以产生瞄定膜的细胞内结构域的豆蔻酰化的拴系蛋白。
2.根据权利要求1的方法，其中所述3’瞄定序列是GPI锚序列。
3.根据权利要求2的方法，其中所述GPI锚序列含有GPI锚定序列的32个末端氨基酸。
4.根据前述任何一项权利要求的方法，其中所述哺乳动物细胞选自CHO或HEK-293细胞。
5.根据前述任何一项权利要求的方法，其中所述信号序列选自由表皮生长因子、胰岛素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、胰高血糖素、ICAM-1、B7-1、TrkA、血小板衍生的生长因子受体或CD58组成的蛋白。
6.根据前述任何一项权利要求的方法，其中所述纯化的抗原决定簇标记是六-组氨酸抗原决定簇标记。
7.根据前述任何一项权利要求的方法，其中所述豆蔻酰化编码序列是c-Src豆蔻酰化编码序列。
8.一种用于产生拴系的细胞外结构域蛋白的表达载体，其包括
5’信号序列，纯化的抗原决定簇标记，膜蛋白细胞外结构域的编码序列，和
3’锚序列。
9.根据权利要求8的载体，其中所述锚序列是GPI序列。
10.根据权利要求8或9的载体，其中所述纯化抗原决定簇标记是六-组氨酸抗原决定簇标记。
11.一种用于产生拴系的细胞内结构域蛋白的表达载体，其包括豆蔻酰化的5’信号序列；膜蛋白的细胞内结构域的编码序列；和
3’纯化抗原决定簇标记。
12.根据权利要求11的载体，其中所述纯化抗原决定簇标记是六-组氨酸抗原决定簇标记。
全文摘要
本发明涉及一种新的使用表达载体生产拴系的(tethered)跨膜蛋白细胞外或细胞内结构域的方法。本发明还提供了用于此领域的表达载体。
文档编号C12N15/85GK1918299SQ200580004464
公开日2007年2月21日 申请日期2005年2月9日 优先权日2004年2月9日
发明者V·山崎, O·西连科, J·T·格罗夫斯 申请人:西纳门公司