专利名称：前原条和中内胚层细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学和细胞生物学领域。具体地，本发明涉及包含前原条和/或中内胚层细胞的组合物，以及制备、分离和使用这些细胞的方法。
背景技术：
人多能性干细胞(pluripotent stem cell)，如胚胎干细胞(ES)和胚胎生殖细胞(EG)，于1994年首先从无成纤维细胞饲养层的培养物中分离(Bongso et al.，1994)，1997年从含成纤维细胞饲养层的培养物中分离(Hogan，1997)。随后Thomson、Reubinoff和Shamblott建立了采用有丝分裂失活的小鼠饲养层连续培养人ES和EG细胞的方法(Reubinoffet al.，2000；Shamblott et al.，1998；Thomson et al.，1998)。
人ES和EG细胞(hESC)为研究人类早期发育和为治疗性干预一些疾病状态(如糖尿病和帕金森氏症)提供了极难得的机会。例如，在采用细胞疗法治疗糖尿病的过程中，使用衍生自hSEC的产生胰岛素的β细胞会比目前利用来自供者胰腺的细胞治疗糖尿病有很大进步。但目前还不知道如何从hSEC得到产生胰岛素的β细胞。因此，目前利用来自供者胰腺的胰岛细胞治疗糖尿病的细胞疗法受限于缺乏移植所需的高质量胰岛细胞。对单一I型糖尿病人的细胞治疗需要移植大约8×108胰岛细胞(Shapiro et al.，2000；Shapiro et al.，2001a；Shapiro et al.，2001b)。一次成功移植所需的胰岛细胞至少需要两个健康供者的器官提供。而人胚胎干细胞为开发用于人类细胞治疗的大量的高质量分化细胞提供了起始材料的来源。
多能性和能够维持hSEC细胞较长时间培养这两个性质使其特别适合用于细胞治疗。多能性是指hESC能够分化为所有3种主要胚层(内胚层，中胚层和外胚层)的衍生物，进而在除胚胎外组织(如胎盘)和生殖细胞外还形成成熟器官的所有体细胞类型的能力。尽管多能性赋予了hSEC特殊的用途，但这个性质也给这些细胞及其衍生物的研究和控制带来挑战。由于在分化hSEC培养基中会产生大量细胞类型，所以大部分细胞类型产生效率很低。而且，成功评价任一指定细胞类型的产生关键取决于定义合适的标志物。高效、定向的分化对hESC的治疗应用非常重要。
由此，除完成hESC的高效定向分化外，鉴定可以用于鉴定和/或分离特定细胞的标志物是有利的，该特定细胞处于其从hESC分化出来的最早期阶段。此外，还有利的是鉴定促进这些源自hESC的早期前体细胞向可用于细胞治疗的细胞类型分化的因子。
发明内容
本发明的实施方案涉及包含人细胞的细胞培养物。这些细胞培养物中，至少约5％的人细胞是前原条细胞(preprimitive streak)，其中该前原条细胞是可以分化为中内胚层细胞的多潜能细胞(multipotentcell)。其它实施方案中，培养物中至少约10％到至少约90％的人细胞是前原条细胞。本文所述的某些实施方案中，人饲养细胞也存在于细胞培养物中。这些实施方案中，除饲养细胞外，至少约5％到至少约75％的人细胞是前原条细胞。一些实施方案中，该前原条细胞表达标志物，例如FGF8和/或核定位的β-连接素(β-catenin)。某些实施方案中，这些标志物中的一种或两种的表达高于brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和/或SOX1的表达。本文所述的其它实施方案中，该细胞培养物基本上不含有内脏内胚层细胞、体壁内胚层细胞、原始内胚层细胞、定形内胚层细胞(definitive endodermal cell)、外胚层细胞和/或中胚层细胞。
关于本发明的某些实施方案，前原条细胞培养物包含多能性人细胞，如人胚胎干细胞(hESC)。这些实施方案中，细胞培养物中对应每1个hESC存在至少约2个到至少约10个前原条细胞。一些实施方案中，该hESC源自桑椹胚、胚胎内细胞团(ICM)和胚胎生殖嵴。一些实施方案中，含有人前原条细胞的细胞培养物包含的培养基含有少于约2％(v/v)到少于约0.2％(v/v)的血清。优选实施方案中，该细胞培养物包含不含血清或血清替代物的培养基。其它实施方案中，含有人前原条细胞的细胞培养物包含TGFβ超家族的Nodal/活化素(Activin)亚组的生长因子。优选实施方案中，该生长因子是活化素A。
本文所述的其它实施方案涉及包含中内胚层细胞的细胞培养物，其中该中内胚层细胞是可以分化为中胚层或定形内胚层细胞的多潜能细胞。这些实施方案中，该细胞培养物包含人细胞，其中至少约5％的人细胞是中内胚层细胞。其它实施方案中，培养物中至少约10％到至少约90％的人细胞是中内胚层细胞。本文所述的某些实施方案中，人饲养细胞也存在于细胞培养物中。这些实施方案中，至少约5％到至少约75％的除饲养细胞外的人细胞是中内胚层细胞。一些实施方案中，中内胚层细胞表达标志物，如brachyury、FGF4、和/或SNAI1。某些实施方案中，这些标志物中一种或多种的表达高于OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和/或SOX1的表达。本文所述的其它实施方案中，该细胞培养物基本上不含有内脏内胚层细胞、体壁内胚层细胞、原始内胚层细胞、定形内胚层细胞、外胚层细胞和/或中胚层细胞。
关于本发明的某些实施方案，中内胚层细胞培养物包含多能性人细胞，如人胚胎干细胞(hESC)。这些实施方案中，细胞培养物中对应每1个hESC存在至少约2个到至少约10个中内胚层细胞。一些实施方案中，该hESC源自桑椹胚、胚胎内细胞团(ICM)和胚胎生殖嵴。一些实施方案中，含有人中内胚层细胞的细胞培养物包含的培养基含有少于约2％(v/v)到少于约0.2％(v/v)的血清。优选实施方案中，该细胞培养物包含不含血清或血清替代物的培养基。其它实施方案中，含有人中内胚层细胞的细胞培养物包含TGFβ超家族的Nodal/活化素亚组的生长因子。优选实施方案中，该生长因子是活化素A。
本文所述其它实施方案涉及包含特定细胞的细胞群，该特定细胞中至少约90％是人前原条细胞。这些实施方案中，该前原条细胞是可以分化为中内胚层细胞的多潜能细胞。其它实施方案中，该细胞群中至少约95％到至少约98％的人细胞是前原条细胞。一些实施方案中，前原条细胞表达标志物，如FGF8和/或核定位的β-连接素。某些实施方案中，这两个标志物中一种或两种的表达高于brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和/或SOX1的表达。本文所述的其它实施方案中，该细胞群基本上不含有内脏内胚层细胞、体壁内胚层细胞、原始内胚层细胞、定形内胚层细胞、外胚层细胞和/或中胚层细胞。
本文所述其它实施方案涉及包含特定细胞的细胞群，该特定细胞中至少约90％是人中内胚层细胞。这些实施方案中，该中内胚层细胞是可以分化为中胚层细胞和/或定形内胚层细胞的多潜能细胞。其它实施方案中，该细胞群中至少约95％到至少约98％的人细胞是中内胚层细胞。一些实施方案中，中内胚层细胞表达标志物，如brachyury、FGF4、和/或SNAI1。某些实施方案中，这些标志物中一种或多种的表达高于OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和/或SOX1的表达。本文所述的其它实施方案中，该细胞培养物基本上不含有内脏内胚层细胞、体壁内胚层细胞、原始内胚层细胞、定形内胚层细胞、外胚层细胞和/或中胚层细胞。
本文所述其它实施方案涉及生产前原条细胞的方法。这些方法中，获得包含诸如hESC的多能性人细胞的细胞群。该细胞群中的多能性人细胞在包含少于约2％血清和至少一种TGFβ超家族的生长因子的培养基中分化，其中培养基中存在的生长因子的量足以促进至少一部分所述多能性细胞向前原条细胞分化，该前原条细胞是多潜能的并且可以分化为中内胚层细胞。一些实施方案包括其它步骤，其包含给予足够的时间使前原条细胞形成，其中通过检测所述细胞群中前原条细胞的存在来确定所述足够使前原条细胞形成的时长。一些实施方案中，该足够时长是至少约6小时。其它实施方案中，检测细胞群中前原条细胞的存在包括检测细胞群的细胞中至少一种选自FGF8和核定位的β-连接素的标志物和至少一种选自brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和SOX1的标志物的表达，其中所述前原条细胞中，选自FGF8和核定位的-β连接素中的标志物的表达高于选自brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和SOX1中的标志物的表达。这些实施方案中，标志物检测可以通过定量聚合酶链式反应(Q-PCR)、免疫细胞化学或其它类似方法。
关于本文所述的某些方法，培养物中至少约5％到至少约90％的人细胞分化为前原条细胞。本文所述方法的一些实施方案中，培养基中存在的生长因子是TGFβ超家族的Nodal/活化素亚组的生长因子。优选实施方案中，该生长因子是活化素A。其它优选的实施方案中，该生长因子在培养基中存在的浓度范围为从至少约10ng/ml到至少约1000ng/ml。某些实施方案中，约6小时、12小时或18小时后撤除该生长因子。其它实施方案中，培养基包含少于约1％(v/v)到少于约0.2％(v/v)的血清。其它实施方案中，培养基是低血清RPMI。其它实施方案中，细胞群在缺乏血清或缺乏血清替代物下分化。
本文所述其它方法是生产中内胚层细胞的方法。这些方法中，获得包含诸如hESC的多能性人细胞的细胞群。该细胞群中的多能性人细胞在包含少于约2％血清和至少一个TGFβ超家族的生长因子的培养基中分化，其中培养基中存在的生长因子的量足以促进至少一部分所述多能性细胞向中内胚层细胞分化，该中内胚层细胞是多潜能的并且可以分化为中胚层细胞和/或定形内胚层细胞。一些实施方案包括其它步骤，其包含给予足够的时间使中内胚层细胞形成，其中通过检测所述细胞群中中内胚层细胞的存在来确定所述使中内胚层细胞形成的足够时长。一些实施方案中，该足够时长是至少约24小时。其它实施方案中，检测细胞群中中内胚层细胞的存在包含检测细胞群的细胞中至少一种选自brachyury、FGF4和/或SNAI1的标志物和至少一种选自OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和/或SOX1的标志物的表达，其中所述中内胚层细胞中，选自brachyury、FGF4和/或SNAI1中的标志物的表达高于选自OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和/或SOX1中的标志物的表达。这些实施方案中，标志物检测可以通过定量聚合酶链式反应(Q-PCR)、免疫细胞化学或其它类似方法。
关于本文所述的某些方法，培养物中至少约5％到至少约90％的人细胞分化为中内胚层细胞。本文所述方法的一些实施方案中，培养基中存在的生长因子是TGFβ超家族的Nodal/活化素亚组的生长因子。优选实施方案中，该生长因子是活化素A。其它优选的实施方案中，该生长因子在培养基中存在的浓度范围为从至少约10ng/ml到至少约1000ng/ml。某些实施方案中，约24小时、36小时或48小时后撤除该生长因子。其它实施方案中，培养基包含少于约1％(v/v)到少于约0.2％(v/v)的血清。其它实施方案中，培养基是低血清RPMI。其它实施方案中，细胞群在缺乏血清或血清替代物下分化。
本文所述的其它实施方案涉及产生富集前原条细胞的细胞群的方法。这些方法包括步骤(a)获得诸如hESC的多能性细胞群，其中该多能细胞群中至少一个细胞包含置于FGF8启动子控制下的编码绿色荧光蛋白(GFP)的核酸序列或其生物活性片段的拷贝，(b)分化该多能性细胞以便生产前原条细胞，该前原条细胞为可以分化为中内胚层细胞的多潜能细胞，以及(c)从不表达GFP的细胞中分离前原条细胞。一些实施方案中，该细胞群包含至少约95％到至少约98％的前原条细胞。一些实施方案中，本文所述方法的分化步骤包含向多能细胞群提供至少一种TGFβ超家族的生长因子，如活化素A。活化素A的优选浓度范围从至少约50ng/ml到至少约500ng/ml。其它实施方案中，该细胞群在包含少于约1％(v/v)到少于约0.1％(v/v)的血清的培养基中分化。其它实施方案中，该培养基是低血清RPMI。其它实施方案中，该细胞群在缺乏血清或血清替代物下分化。
本文所述其它实施方案涉及生产富集中内胚层细胞的细胞群的方法。这些方法包括步骤(a)获得诸如hESC的多能性细胞群，其中该多能细胞群中至少一个细胞包含置于brachyury、FGF4和/或SNAI1启动子控制下的编码绿色荧光蛋白(GFP)的核酸序列的拷贝或生物活性片段，(b)分化该多能细胞以便生产中内胚层细胞，该中内胚层细胞为可以分化为中胚层细胞和/或定形内胚层细胞的多潜能细胞，以及(c)从不表达GFP的细胞中分离中内胚层细胞。一些实施方案中，该细胞群包含至少约95％到至少约98％的中内胚层细胞。一些实施方案中，本文所述方法的分化步骤包含向多能细胞群提供至少一个TGFβ超家族的生长因子，如活化素A。活化素A的优选浓度范围从至少约50ng/ml到至少约500ng/ml。其它实施方案中，该细胞群在包含少于约1％(v/v)到少于约0.1％(v/v)的血清的培养基中分化。其它实施方案中，该培养基是低血清RPMI。其它实施方案中，该细胞群在缺乏血清或血清替代物下分化。
本发明的一些实施方案是鉴定分化因子的筛选方法，该分化因子能够促进包含人细胞的细胞群中的前原条细胞的分化。这些方法包括步骤(a)获得包含人前原条细胞的细胞群，(b)向该细胞群提供候选分化因子，(c)确定细胞群中标志物在第一时间点的表达，确定该细胞群中相同标志物在第二时间点的表达，其中第二时间点在第一时间点之后，并且第二时间点在向该细胞群提供候选分化因子之后，(d)以及确定与该标志物在细胞群中第一时间点的表达相比，其在细胞群中第二时间点的表达是否增加或减少，其中标志物在细胞群中的表达的增加或减少表明该候选分化因子能够促进前原条细胞的分化。某些实施方案中，第一时间点在向细胞群提供候选分化因子之前或大致同时。其它实施方案中，第一时间点在向细胞群提供候选分化因子之后。本文所述筛选方法的一些实施方案中，该人前原条细胞响应候选分化因子分化为特定细胞，如中内胚层细胞、中胚层细胞和/或定形内胚层细胞。一些实施方案中，中内胚层由诸如brachyury、FGF4和/或SNAI1的标志物的表达表明。其它实施方案中，中胚层由诸如FOXF1、FLK1、BMP4、MOX1和SDF1的标志物的表达表明。其它实施方案中，定形内胚层由诸如CXCR4和/或SOX17的标志物的表达表明。
关于本文所述筛选方法，某些实施方案涉及提供候选分化因子，如至少一种TGFβ超家族的生长因子，如活化素A。其它实施方案中，该候选分化因子是小分子或多肽。其它实施方案中，该候选分化因子不是TGFβ超家族的因子。其它实施方案中，该候选分化因子是未知能造成前原条细胞分化的因子。
本文所述的其它实施方案是鉴定能够促进包含人细胞的细胞群中中内胚层细胞分化的分化因子的筛选方法。此类方法包含步骤(a)获得包含人中内胚层细胞的细胞群，(b)向该细胞群提供候选分化因子，(c)确定该细胞群中标志物在第一时间点的表达，确定该细胞群中相同标志物在第二时间点的表达，其中第二时间点在第一时间点之后，并且第二时间点在向该群提供候选分化因子之后，(d)以及确定与该标志物在细胞群中第一时间点的表达相比，其在细胞群中第二时间点的表达是否增加或减少，其中标志物在细胞群中的表达的增加或减少表明该候选分化因子能够促进中内胚层细胞的分化。某些实施方案中，第一时间点在向细胞群提供候选分化因子之前或大致同时。其它实施方案中，第一时间点在向细胞群提供候选分化因子之后。本文所述筛选方法的一些实施方案中，该人中内胚层细胞响应候选分化因子分化为特定细胞，如中胚层细胞和/或定形内胚层细胞。一些实施方案中，中胚层由诸如FOXF1、FLK1、BMP4、MOX1和SDF1的标志物的表达表明。其它实施方案中，定形内胚层由诸如CXCR4和/或SOX17的标志物的表达表明。
关于本文所述筛选方法，某些实施方案涉及提供候选分化因子，如至少一种TGFβ超家族的生长因子，如活化素A。其它实施方案中，该候选分化因子是小分子或多肽。其它实施方案中，该候选分化因子不是TGFβ超家族的因子。其它实施方案中，该候选分化因子是未知能造成中内胚层细胞分化的因子。
其它实施方案涉及在体外提高人胚胎干细胞(hESC)中FGF8基因产物的表达的方法。该方法包括在包含少于约2％(v/v)血清的培养基中获得hESC，并且使该hESC接触特定量的分化因子，该特定量足以增加FGF8基因产物的表达。一些实施方案中，该分化因子是至少一种TGFβ超家族的生长因子，如活化素A。一些实施方案中，该培养基不包含血清替代物。
其它实施方案涉及在体外提高人胚胎干细胞(hESC)中选自brachyury、FGF4和SNAI1的基因产物的表达的方法。所述方法包括在包含少于约2％(v/v)血清的培养基中获得hESC，并且使该hESC接触特定量的分化因子，该特定量足以增加选自brachyury、FGF4和SNAI1的基因产物的表达。一些实施方案中，该分化因子是至少一种TGFβ超家族的生长因子，如活化素A。一些实施方案中，该培养基不包含血清替代物。
本文所述的一些实施方案涉及包含人胚胎干细胞(hESC)和含有少于约2％(v/v)血清的培养基的细胞培养物，其中该hESC从特定参考时间点开始分化，与该hESC的基线FGF8mRNA表达相比，距所述参考时间点约6小时时FGF8mRNA的表达显著上调。一些实施方案中，距该参考时间点约17小时β-连接素多肽的表达开始向细胞核定位。其它实施方案中，距该参考时间点约24小时brachyury、FGF4和/或SNAI1mRNA的表达显著上调。其它实施方案中，距该参考时间点约12小时时E-钙粘着素(E-cadherin)mRNA的表达开始下调。此外，一些实施方案中，距该参考时间点约48小时时SOX17mRNA的表达显著上调和/或距该参考时间点约96小时时FOXA2mRNA的表达显著上调。本文所述细胞培养物的某些实施方案中，该培养基包含少于约1％(v/v)到少于约0.2％(v/v)的血清。其它实施方案中，该培养基包含约0％(v/v)的血清。其它实施方案中，该培养基不包含血清替代物。
本文所述的其它实施方案涉及包含人胚胎干细胞、TGFβ超家族的分化因子和含有少于约2％(v/v)血清的培养基的细胞培养物，其中第一套标志物基因在第二套和/或第三套标志物基因的上调或峰值表达之前或大致同时上调或下调。
其它实施方案涉及分化细胞培养物中细胞的方法，通过使包含人胚胎干细胞的细胞培养物与包含少于约2％血清的培养基接触、向该hESC提供TGFβ超家族的分化因子、以及允许hESC分化的发生。一些实施方案中，该方法产生特定细胞，该细胞中第一套标志物基因在第二套和/或第三套标志物基因的上调或峰值表达之前或大约同时上调或下调。一些实施方案中，该培养基不包含血清或血清替代物。
一些权限中，术语“包含”可能不具有任何通常所接受的定义。此处使用的术语“包含”是开放式的，可以包括任何其他元素。考虑到这一点，本发明的其他实施方案参考以下编号的段落进行描述1.包含人细胞的细胞培养物，其中至少约5％的所述人细胞是前原条细胞，所述前原条细胞是能分化为中内胚层细胞的多潜能细胞。
2.段落1的细胞培养物，其中至少约10％的所述人细胞是前原条细胞。
3.段落1的细胞培养物，其中至少约20％的所述人细胞是前原条细胞。
4.段落1的细胞培养物，其中至少约30％的所述人细胞是前原条细胞。
5.段落1的细胞培养物，其中至少约40％的所述人细胞是前原条细胞。
6.段落1的细胞培养物，其中至少约50％的所述人细胞是前原条细胞。
7.段落1的细胞培养物，其中至少约60％的所述人细胞是前原条细胞。
8.段落1的细胞培养物，其中至少约70％的所述人细胞是前原条细胞。
9.段落1的细胞培养物，其中至少约80％的所述人细胞是前原条细胞。
10.段落1的细胞培养物，其中至少约90％的所述人细胞是前原条细胞。
11.段落1的细胞培养物，其中所述培养物中存在人饲养细胞，并且其中至少约5％的除所述人饲养细胞外的人细胞是前原条细胞。
12.段落1的细胞培养物，其中所述培养物中存在人饲养细胞，并且其中至少约25％的除所述人饲养细胞外的人细胞是前原条细胞。
13.段落1的细胞培养物，其中所述培养物中存在人饲养细胞，并且其中至少约50％的除所述人饲养细胞外的人细胞是前原条细胞。
14.段落1的细胞培养物，其中所述培养物中存在人饲养细胞，并且其中至少约75％的除所述人饲养细胞外的人细胞是前原条细胞。
15.段落1的细胞培养物，其中所述前原条细胞表达选自FGF8和核定位的β-连接素的标志物。
16.段落15的细胞培养物，其中所述前原条细胞中选自FGF8和核定位的β-连接素的标志物的表达高于选自brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和SOX1的标志物的表达。
17.段落15的细胞培养物，其中所述前原条细胞不显著表达选自brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和SOX1的标志物。
18.段落1的细胞培养物，其中所述前原条细胞表达FGF8和核定位的β-连接素。
19.段落18的细胞培养物，其中所述前原条细胞中FGF8和细胞核定位的β连接素的表达高于brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和SOX1的表达。
20.段落18的细胞培养物，其中所述前原条细胞不显著表达brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和SOX1。
21.段落1的细胞培养物，其中所述细胞培养物基本上不含有选自内脏内胚层细胞、体壁内胚层细胞、原始内胚层细胞、定形内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞的细胞。
22.段落1的细胞培养物，还包含人胚胎干细胞(hESC)。
23.段落22的细胞培养物，其中所述细胞培养物中对应约每一个hESC存在至少约2个前原条细胞。
24.段落22的细胞培养物，其中所述细胞培养物中对应约每一个hESC存在至少约10个前原条细胞。
25.段落22的细胞培养物，其中所述hESC源自选自桑椹胚、胚胎内细胞团(ICM)和胚胎生殖嵴的组织。
26.段落1的细胞培养物，还包含含有少于约2％(v/v)血清的培养基。
27.段落1的细胞培养物，还包含含有少于约1％(v/v)血清的培养基。
28.段落1的细胞培养物，还包含含有少于约0.5％(v/v)血清的培养基。
29.段落1的细胞培养物，还包含含有少于约0.2％(v/v)血清的培养基。
30.段落1的细胞培养物，还包含不含血清或血清替代物的培养基。
31.段落1的细胞培养物，还包含TGFβ超家族的Nodal/活化素亚组的生长因子。
32.段落31的细胞培养物，其中所述TGFβ超家族的Nodal/活化素亚组的生长因子包括活化素A。
33.包含人细胞的细胞培养物，其中至少约5％的所述人细胞是中内胚层细胞，所述中内胚层细胞是能分化为中胚层细胞或定形内胚层细胞的多潜能细胞。
34.段落33的细胞培养物，其中至少约10％的所述人细胞是中内胚层细胞。
35.段落33的细胞培养物，其中至少约20％的所述人细胞是中内胚层细胞。
36.段落33的细胞培养物，其中至少约30％的所述人细胞是中内胚层细胞。
37.段落33的细胞培养物，其中至少约40％的所述人细胞是前原条细胞。
38.段落33的细胞培养物，其中至少约50％的所述人细胞是中内胚层细胞。
39.段落33的细胞培养物，其中至少约60％的所述人细胞是中内胚层细胞。
40.段落33的细胞培养物，其中至少约70％的所述人细胞是中内胚层细胞。
41.段落33的细胞培养物，其中至少约80％的所述人细胞是中内胚层细胞。
42.段落33的细胞培养物，其中至少约90％的所述人细胞是中内胚层细胞。
43.段落33的细胞培养物，其中所述培养物中存在人饲养细胞，并且其中至少约5％的除所述人饲养细胞外的人细胞是中内胚层细胞。
44.段落33的细胞培养物，其中所述培养物中存在人饲养细胞，并且其中至少约25％的除所述人饲养细胞外的人细胞是中内胚层细胞。
45.段落33的细胞培养物，其中所述培养物中存在人饲养细胞，并且其中至少约50％的除所述人饲养细胞外的人细胞是中内胚层细胞。
46.段落33的细胞培养物，其中所述培养物中存在人饲养细胞，并且其中至少约75％的除所述人饲养细胞外的人细胞是中内胚层细胞。
47.段落33的细胞培养物，其中所述中内胚层细胞表达选自brachyury、FGF4和SNAI1的标志物。
48.段落47的细胞培养物，其中所述中内胚层细胞中选自brachyury、FGF4和SNAI1的标志物的表达高于选自OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和SOX1的标志物的表达。
49.段落47的细胞培养物，其中所述中内胚层细胞不显著表达选自OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和SOX1的标志物。
50.段落33的细胞培养物，其中所述中内胚层细胞表达brachyury、FGF4和SNAI1。
51.段落51的细胞培养物，其中所述中内胚层细胞中brachyury、FGF4和SNAI1的表达高于OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和SOX1的表达。
52.段落51的细胞培养物，其中所述中内胚层细胞不显著表达OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和SOX1。
53.段落33的细胞培养物，其中所述细胞培养物基本上不含选自内脏内胚层细胞、体壁内胚层细胞、原始内胚层细胞、定形内胚层细胞、外胚层细胞和中胚层细胞的细胞。
54.段落33的细胞培养物，还包含人胚胎干细胞(hESC)。
55.段落54的细胞培养物，其中所述细胞培养物中对应约每一个hESC存在至少约2个中内胚层细胞。
56.段落54的细胞培养物，其中所述细胞培养物中对应约每一个hESC存在至少约10个中内胚层细胞。
57.段落54的细胞培养物，其中所述hESC源自选自桑椹胚、胚胎内细胞团(ICM)和胚胎生殖嵴的组织。
58.段落33的细胞培养物，还包含含有少于约2％(v/v)血清的培养基。
59.段落33的细胞培养物，还包含含有少于约1％(v/v)血清的培养基。
60.段落33的细胞培养物，还包含含有少于约0.5％(v/v)血清的培养基。
61.段落33的细胞培养物，还包含含有少于约0.2％(v/v)血清的培养基。
62.段落33的细胞培养物，还包含不含血清或血清替代物的培养基。
63.段落33的细胞培养物，还包含TGFβ超家族的Nodal/活化素亚组的生长因子。
64.段落63的细胞培养物，其中所述TGFβ超家族的Nodal/活化素亚组的生长因子包含活化素A。
65.包含细胞的细胞群，其中至少约90％的所述细胞是人前原条细胞，所述前原条细胞是能分化为中内胚层细胞的多潜能细胞。
66.段落65的细胞群，其中至少约95％的所述细胞是人前原条细胞。
67.段落65的细胞群，其中至少约98％的所述细胞是人前原条细胞。
68.段落65的细胞群，其中所述人前原条细胞表达选自FGF8和核定位的β-连接素的标志物。
69.段落68的细胞群，其中所述人前原条细胞中选自FGF8和核定位的β-连接素的标志物的表达高于选自brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和SOX1的标志物的表达。
70.段落68的细胞群，其中所述人前原条细胞不显著表达选自brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和SOX1的标志物。
71.段落65的细胞群，其中所述人前原条细胞表达FGF8和核定位的β-连接素。
72.段落71的细胞群，其中所述人前原条细胞中FGF8和核定位的β-连接素的表达高于brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和SOX1的表达。
73.段落71的细胞群，其中所述人前原条细胞不显著表达brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和SOX1。
74.包含细胞的细胞群，其中至少约90％的所述细胞是人中内胚层细胞，所述中内胚层细胞是能分化为中胚层细胞或定形内胚层细胞的多潜能细胞。
75.段落74的细胞群，其中至少约95％的所述细胞是人中内胚层细胞。
76.段落74的细胞群，其中至少约98％的所述细胞是人中内胚层细胞。
77.段落74的细胞群，其中所述人中内胚层细胞表达选自brachyury、FGF4和SNAI1的标志物。
78.段落77的细胞群，其中所述人中内胚层细胞中选自brachyury、FGF4和SNAI1的标志物的表达高于选自OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和SOX1的标志物的表达。
79.段落77的细胞群，其中所述人中内胚层细胞不显著表达选自OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和SOX1的标志物。
80.段落74的细胞群，其中所述人中内胚层细胞表达brachyury、FGF4和SNAI1。
81.段落77的细胞群，其中所述人中内胚层细胞中brachyury、FGF4和SNAI1的表达高于OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和SOX1的表达。
82.段落77的细胞群，其中所述人中内胚层细胞不显著表达OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和SOX1。
83.产生前原条细胞的方法，所述方法包括获得含有多能性人细胞的细胞群和在含有少于约2％的血清和至少一种TGFβ超家族的生长因子的培养基中分化所述多能性人细胞的步骤，其中所述生长因子以足以促进至少一部分所述多能性细胞分化为前原条细胞的量存在于所述培养基中，所述前原条细胞是能分化为中内胚层细胞的多潜能细胞。
84.段落83的方法，还包括给予足够时间让前原条细胞形成，其中所述让前原条细胞形成的足够时间通过检测前原条细胞在所述细胞群中的存在来确定。
85.段落84的方法，其中足够时间为最少约6小时。
86.段落84的方法，其中检测前原条细胞在所述细胞群中的存在包括检测所述细胞群细胞中至少一种选自FGF8和核定位的β-连接素的标志物和至少一种选自brachyury、FGF4、SNAI1、FOXA2、SOX7和SOX1的标志物的表达，其中所述前原条细胞中选自FGF8和核定位的β-连接素的标志物的表达高于选自brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和SOX1的标志物的表达。
87.段落86的方法，其中通过定量聚合酶链式反应(Q-PCR)确定至少一种所述标志物的表达。
88.段落86的方法，其中通过免疫细胞化学确定至少一种所述标志物的表达。
89.段落83的方法，其中至少约5％的所述多能性人细胞分化为前原条细胞。
90.段落83的方法，其中至少约10％的所述多能性人细胞分化为前原条细胞。
91.段落83的方法，其中至少约20％的所述多能性人细胞分化为前原条细胞。
92.段落83的方法，其中至少约30％的所述多能性人细胞分化为前原条细胞。
93.段落83的方法，其中至少约40％的所述多能性人细胞分化为前原条细胞。
94.段落83的方法，其中至少约50％的所述多能性人细胞分化为前原条细胞。
95.段落83的方法，其中至少约60％的所述多能性人细胞分化为前原条细胞。
96.段落83的方法，其中至少约70％的所述多能性人细胞分化为前原条细胞。
97.段落83的方法，其中至少约80％的所述多能性人细胞分化为前原条细胞。
98.段落83的方法，其中至少约90％的所述多能性人细胞分化为前原条细胞。
99.段落83的方法，其中所述至少一种生长因子属于TGFβ超家族的NodaI/活化素亚组。
100.段落99的方法，其中所述至少一种属于TGFβ超家族的Nodal/活化素亚组的生长因子包含活化素A。
101.段落83的方法，其中所述至少一种生长因子以至少约10ng/ml的浓度提供。
102.段落83的方法，其中所述至少一种生长因子以至少约100ng/ml的浓度提供。
103.段落83的方法，其中所述至少一种生长因子以至少约500ng/ml的浓度提供。
104.段落83的方法，其中所述至少一种生长因子以至少约1000ng/ml的浓度提供。
105.段落83的方法，其中在约6小时后撤除所述至少一种生长因子。
106.段落83的方法，其中在约12小时后撤除所述至少一种生长因子。
107.段落83的方法，其中在约18小时后撤除所述至少一种生长因子。
108.段落83的方法，其中所述细胞群在含有少于约1％(v/v)血清的培养基中分化。
109.段落83的方法，其中所述细胞群在含有少于约0.5％(v/v)血清的培养基中分化。
110.段落83的方法，其中所述细胞群在含有少于约0.2％(v/v)血清的培养基中分化。
111.段落83的方法，其中所述细胞群在含有少于约0.1％(v/v)血清的培养基中分化。
112.段落83的方法，其中所述细胞群在不存在血清或不存在血清替代物下分化。
113.段落83的方法，其中所述细胞群在特定血清含量的培养基中分化，所述培养基在加入所述至少一种生长因子后的约第一天含有约0％(v/v)血清，在加入所述至少一种生长因子后的约第二天含有约0.2％(v/v)或更少血清，并且在加入所述至少一种生长因子后的约第三天含有约2％(v/v)或更少血清。
114.段落83的方法，其中所述细胞群在低血清RPMI培养基中分化。
115.段落83的方法，其中所述多能性人细胞包含人胚胎干细胞(hESC)。
116.段落115的方法，其中所述人胚胎干细胞源自选自桑椹胚、胚胎内细胞团(ICM)和胚胎生殖嵴的组织。
117.通过段落83的方法制备的前原条细胞。
118.制备中内胚层细胞的方法，所述方法包括获得含有多能性人细胞的细胞群和在含有少于约2％的血清和至少一种TGFβ超家族的生长因子的培养基中分化所述多能性人细胞的步骤，其中所述生长因子以足以促进至少一部分所述多能性细胞分化为中内胚层细胞的量存在于所述培养基中，所述中内胚层细胞是能分化为中内胚层细胞的多潜能细胞。
119.段落118的方法，还包括给予足够时间让中内胚层细胞形成的步骤，其中所述让中内胚层细胞形成的足够时间通过检测中内胚层细胞在所述细胞群中的存在来确定。
120.段落119的方法，其中足够时间为最少约24小时。
121.段落118的方法，其中检测中内胚层细胞在所述细胞群中的存在包括检测所述细胞群中至少一种选自brachyury、FGF4和SNAI1的标志物和至少一种选自OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和SOX1的标志物的表达，其中在所述中内胚层细胞中选自brachyury、FGF4和SNAI1的标志物的表达高于选自OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和SOX1的标志物的表达。
122.段落121的方法，其中通过定量聚合酶链式反应(Q-PCR)确定至少一种所述标志物的表达。
123.段落121的方法，其中通过免疫细胞化学确定至少一种所述标志物的表达。
124.段落118的方法，其中至少约5％的所述多能性人细胞分化为中内胚层细胞。
125.段落118的方法，其中至少约10％的所述多能性人细胞分化为中内胚层细胞。
126.段落118的方法，其中至少约20％的所述多能性人细胞分化为中内胚层细胞。
127.段落118的方法，其中至少约30％的所述多能性人细胞分化为中内胚层细胞。
128.段落118的方法，其中至少约40％的所述多能性人细胞分化为中内胚层细胞。
129.段落118的方法，其中至少约50％的所述多能性人细胞分化为中内胚层细胞。
130.段落118的方法，其中至少约60％的所述多能性人细胞分化为中内胚层细胞。
131.段落118的方法，其中至少约70％的所述多能性人细胞分化为中内胚层细胞。
132.段落118的方法，其中至少约80％的所述多能性人细胞分化为中内胚层细胞。
133.段落118的方法，其中至少约90％的所述多能性人细胞分化为中内胚层细胞。
134.段落118的方法，其中所述至少一种生长因子属于TGFβ超家族的Nodal/活化素亚组。
135.段落134的方法，其中所述至少一种属于TGFβ超家族的Nodal/活化素亚组的生长因子包含活化素A。
136.段落118的方法，其中所述至少一种生长因子以至少约10ng/ml的浓度提供。
137.段落118的方法，其中所述至少一种生长因子以至少约100ng/ml的浓度提供。
138.段落118的方法，其中所述至少一种生长因子以至少约500ng/ml的浓度提供。
139.段落118的方法，其中所述至少一种生长因子以至少约1000ng/ml的浓度提供。
140.段落118的方法，其中在约24小时后撤除所述至少一种生长因子。
141.段落118的方法，其中在约36小时后撤除所述至少一种生长因子。
142.段落118的方法，其中在约48小时后撤除所述至少一种生长因子。
143.段落118的方法，其中所述细胞群在含有少于约1％(v/v)血清的培养基中分化。
144.段落118的方法，其中所述细胞群在含有少于约0.5％(v/v)血清的培养基中分化。
145.段落118的方法，其中所述细胞群在含有少于约0.2％(v/v)血清的培养基中分化。
146.段落118的方法，其中所述细胞群在含有少于约0.1％(v/v)血清的培养基中分化。
147.段落118的方法，其中所述细胞群在不存在血清或不存在血清替代物下分化。
148.段落118的方法，其中所述细胞群在特定血清含量的培养基中分化，所述培养基在加入所述至少一种生长因子后的约第一天含有约0％(v/v)血清，在加入所述至少一种生长因子后的约第二天含有约0.2％(v/v)或更少血清，并且在加入所述至少一种生长因子后的约第三天含有约2％(v/v)或更少血清。
149.段落118的方法，其中所述细胞群在低血清RPMI培养基中分化。
150.段落118的方法，其中所述细胞群包含人胚胎干细胞(hESC)。
151.段落150的方法，其中所述人胚胎干细胞源自选自桑椹胚、胚胎内细胞团(ICM)和胚胎生殖嵴的组织。
152.通过段落118方法制备的中内胚层细胞。
153.产生富集前原条细胞的细胞群方法，所述方法包括以下步骤获得多能性细胞的群，其中所述多能性细胞群的至少一个细胞含有至少一个拷贝的受FGF8启动子控制的核酸，所述核酸含有编码绿色荧光蛋白(GFP)或其生物活性片段的序列；分化所述多能性细胞以制备前原条细胞，所述前原条细胞是能分化为中内胚层细胞的多潜能细胞；以及从不表达GFP的细胞中分离所述前原条细胞。
154.段落153的方法，其中所述富集细胞群包含至少约95％的前原条细胞。
155.段落153的方法，其中所述富集细胞群包含至少约98％的前原条细胞。
156.段落153的方法，其中所述分化步骤包括以特定量向所述多能性细胞群提供至少一种来自TGFβ超家族的生长因子，该特定量足以促进所述多能性细胞向前原条细胞分化。
157.段落156的方法，其中所述至少一种TGFβ超家族的生长因子是活化素A。
158.段落157的方法，其中所述活化素A以至少约50ng/ml的浓度提供。
159.段落157的方法，其中所述活化素A以至少约100ng/ml的浓度提供。
160.段落157的方法，其中所述活化素A以至少约500ng/ml的浓度提供。
161.段落153的方法，其中所述细胞群在含有少于约1％(v/v)血清的培养基中分化。
162.段落153的方法，其中所述细胞群在含有少于约0.5％(v/v)血清的培养基中分化。
163.段落153的方法，其中所述细胞群在含有少于约0.2％(v/v)血清的培养基中分化。
164.段落153的方法，其中所述细胞群在含有少于约0.1％(v/v)血清的培养基中分化。
165.段落153的方法，其中所述细胞群在不存在血清或不存在血清替代物下分化。
166.段落153的方法，其中所述细胞群在特定血清含量的培养基中分化，所述培养基在加入所述至少一种生长因子后的约第一天含有约0％(v/v)血清，在加入所述至少一种生长因子后的约第二天含有约0.2％(v/v)或更少血清，并且在加入所述至少一种生长因子后的约第三天含有约2％(v/v)或更少血清。
167.段落153的方法，其中所述细胞群在低血清RPMI培养基中分化。
168.通过段落153的方法产生的前原条细胞的富集群。
169.产生富集中内胚层细胞的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤获得多能性细胞群，其中所述多能性细胞群的至少一个细胞含有至少一个拷贝的受选自brachyury启动子、FGF4启动子和SNAI1启动子的启动子控制的核酸，所述核酸含有编码绿色荧光蛋白(GFP)或其生物活性片段的序列；分化所述多能性细胞以产生中内胚层细胞，所述中内胚层细胞是能分化为中胚层细胞或定形内胚层细胞的多潜能细胞；以及从不表达GFP的细胞中分离所述中内胚层细胞。
170.段落169的方法，其中所述富集细胞群包含至少约95％的中内胚层细胞。
171.段落169的方法，其中所述富集细胞群包含至少约98％的中内胚层细胞。
172.段落169的方法，其中所述分化步骤包括以特定量向所述多能性细胞群提供至少一种来自TGFβ超家族的生长因子，该特定量足以促进所述多能性细胞向中内胚层细胞分化。
173.段落172的方法，其中所述至少一种TGFβ超家族的生长因子是活化素A。
174.段落173的方法，其中所述活化素A以至少约50ng/ml的浓度提供。
175.段落173的方法，其中所述活化素A以至少约100ng/ml的浓度提供。
176.段落173的方法，其中所述活化素A以至少约500ng/ml的浓度提供。
177.段落169的方法，其中所述细胞群在含有少于约1％(v/v)血清的培养基中分化。
178.段落169的方法，其中所述细胞群在含有少于约0.5％(v/v)血清的培养基中分化。
179.段落169的方法，其中所述细胞群在含有少于约0.2％(v/v)血清的培养基中分化。
180.段落169的方法，其中所述细胞群在含有少于约0.1％(v/v)血清的培养基中分化。
181.段落169的方法，其中所述细胞群在不存在血清或不存在血清替代物下分化。
182.段落169的方法，其中所述细胞群在特定血清含量的培养基中分化，所述培养基在加入所述至少一种生长因子后的约第一天含有约0％(v/v)血清，在加入所述至少一种生长因子后的约第二天含有约0.2％(v/v)或更少血清，并且在加入所述至少一种生长因子后的约第三天含有约2％(v/v)或更少血清。
183.段落169的方法，其中所述细胞群在低血清RPMI培养基中分化。
184.通过段落169的方法产生的中内胚层细胞的富集群。
185.鉴定能够促进包含人细胞的细胞群中前原条细胞的分化的分化因子的方法，所述方法包含以下步骤获得包含人前原条细胞的细胞群，向所述细胞群提供候选分化因子，确定所述细胞群中标志物在第一时间点的表达、确定所述细胞群中相同标志物在第二时间点的表达，其中所述第二时间点在所述第一时间点之后，并且其中所述第二时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之后，以及确定所述细胞群中该标志物在所述第二时间点的表达与所述细胞群中该标志物在所述第一时间点的表达相比是否增加或减少，其中所述细胞群中所述标志物表达的增加或减少表明所述候选分化因子能够促进所述前原条细胞的分化。
186.段落185的方法，其中在所述细胞群中所述人前原条细胞占所述人细胞的至少约10％。
187.段落185的方法，其中所述细胞群中存在人饲养细胞，并且其中至少约10％的除所述饲养细胞外的人细胞是前原条细胞。
188.段落185的方法，其中在所述细胞群中所述人前原条细胞占所述人细胞的至少约50％。
189.段落185的方法，其中所述细胞群中存在人饲养细胞，并且其中至少约50％的除所述饲养细胞外的人细胞是前原条细胞。
190.段落185的方法，其中所述人前原条细胞响应所述候选分化因子分化为选自中内胚层、中胚层和定形内胚层的细胞。
191.段落185的方法，其中所述人前原条细胞响应所述候选分化因子分化为中内胚层细胞。
192.段落191的方法，其中所述标志物选自brachyury、FGF4和SNAI1。
193.段落185的方法，其中所述人前原条细胞响应所述候选分化因子分化为中胚层细胞。
194.段落193的方法，其中所述标志物选自FOXF1、FLK1、BMP4、MOX1和SDF1。
195.段落185的方法，其中所述人前原条细胞响应所述候选分化因子分化为定形内胚层细胞。
196.段落195的方法，其中所述标志物选自CXCR4和SOX17。
197.段落185的方法，其中所述第一时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之前。
198.段落185的方法，其中所述第一时间点与向所述细胞群提供所述候选分化因子大致同时。
199.段落185的方法，其中所述第一时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之后。
200.段落185的方法，其中所述标志物的表达增加。
201.段落185的方法，其中所述标志物的表达减少。
202.段落185的方法，其中所述标志物的表达通过定量聚合酶链式反应(Q-PCR)确定。
203.段落185的方法，其中所述标志物的表达通过免疫细胞化学确定。
204.段落185的方法，其中所述候选分化因子包括至少一种TGFβ超家族的生长因子。
205.段落204的方法，其中所述至少一种TGFβ超家族的生长因子是活化素A。
206.段落185的方法，其中所述候选分化因子包括小分子。
207.段落185的方法，其中所述候选分化因子包括多肽。
208.段落185的方法，其中所述候选分化因子不是TGFβ超家族的生长因子。
209.段落185的方法，其中以约0.1ng/ml至约10mg/ml的浓度向所述细胞群提供所述候选分化因子。
210.段落185的方法，其中以约1ng/ml至约1mg/ml的浓度向所述细胞群提供所述候选分化因子。
211.段落185的方法，其中以约10ng/ml至约100μg/ml的浓度向所述细胞群提供所述候选分化因子。
212.段落185的方法，其中以约100ng/ml至约10μg/ml的浓度向所述细胞群提供所述候选分化因子。
213.段落185的方法，其中以约1μg/ml的浓度向所述细胞群提供所述候选分化因子。
214.鉴定能够促进包含人细胞的细胞群中中内胚层细胞的分化的分化因子的方法，所述方法包括以下步骤获得包含人中内胚层细胞的细胞群，向所述细胞群提供候选分化因子，确定所述细胞群中标志物在第一时间点的表达，确定所述细胞群中相同标志物在第二时间点的表达，其中所述第二时间点在所述第一时间点之后，并且其中所述第二时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之后，以及确定所述细胞群中该标志物在所述第二时间点的表达与所述细胞群中该标志物在所述第一时间点的表达相比是否增加或减少，其中所述细胞群中所述标志物表达的增加或减少表明所述候选分化因子能够促进所述中内胚层细胞的分化。
215.段落214的方法，其中所述细胞群中所述人中内胚层细胞占所述人细胞的至少约10％。
216.段落214的方法，其中所述细胞群中存在人饲养细胞，并且其中至少约10％的除所述饲养细胞外的所述人细胞是中内胚层细胞。
217.段落214的方法，其中所述细胞群中所述人中内胚层细胞占所述人细胞的至少约50％。
218.段落214的方法，其中所述细胞群中存在人饲养细胞，并且其中至少约50％的除所述饲养细胞外的所述人细胞是中内胚层细胞。
219.段落214的方法，其中所述人中内胚层细胞响应所述候选分化因子分化为选自中胚层细胞和定形内胚层的细胞。
220.段落214的方法，其中所述人中内胚层细胞响应所述候选分化因子分化为中胚层细胞。
221.段落220的方法，其中所述标志物选自FOXF1、FLK1、BMP4、MOX1和SDF1。
222.段落214的方法，其中所述人中内胚层细胞响应所述候选分化因子分化为定形内胚层细胞。
223.段落222的方法，其中所述标志物选自CXCR4和SOX17。
224.段落214的方法，其中所述第一时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之前。
225.段落214的方法，其中所述第一时间点与向所述细胞群提供所述候选分化因子大致同时。
226.段落214的方法，其中所述第一时间点在向所述细胞群提供所述候选分化因子之后。
227.段落214的方法，其中所述标志物的表达增加。
228.段落214的方法，其中所述标志物的表达减少。
229.段落214的方法，其中所述标志物的表达通过定量聚合酶链式反应(Q-PCR)确定。
230.段落214的方法，其中所述标志物的表达通过免疫细胞化学确定。
231.段落214的方法，其中所述候选分化因子包括至少一种TGFβ超家族的生长因子。
232.段落231的方法，其中所述至少一种TGFβ超家族的生长因子是活化素A。
233.段落214的方法，其中所述候选分化因子包括小分子。
234.段落214的方法，其中所述候选分化因子包括多肽。
235.段落214的方法，其中所述候选分化因子不是TGFβ超家族的生长因子。
236.段落214的方法，其中以约0.1ng/ml至约10mg/ml的浓度向所述细胞群提供所述候选分化因子。
237.段落214的方法，其中以约1ng/ml至约1mg/ml的浓度向所述细胞群提供所述候选分化因子。
238.段落214的方法，其中以约10ng/ml至约100μg/ml的浓度向所述细胞群提供所述候选分化因子。
239.段落214的方法，其中以约100ng/ml至约10μg/ml的浓度向所述细胞群提供所述候选分化因子。
240.段落214的方法，其中以约1μg/ml的浓度向所述细胞群提供所述候选分化因子。
241.在体外提高人胚胎干细胞(hESC)中FGF8基因产物的表达的方法，所述方法包括在含有少于约2％(v/v)血清的培养基中获得所述hESC，并且使所述hESC接触足以增加FGF8基因产物的表达的量的分化因子。
242.段落241的方法，其中所述分化因子包括至少一种TGFβ超家族的生长因子。
243.段落242的方法，其中所述分化因子包括活化素A。
244.段落241的方法，其中所述培养基缺乏血清或缺乏血清替代物。
245.在体外提高人胚胎干细胞(hESC)或前原条细胞中选自brachyury、FGF4和SNAI1的基因产物的表达的方法，所述方法包括在包含少于约2％(v/v)血清的培养基中获得所述hESC或前原条细胞，并且使所述hESC或所述前原条细胞接触足以增加选自brachyury、FGF4和SNAI1的基因产物的表达的量的细胞因子。
246.段落245的方法，其中所述分化因子包括至少一种TGFβ超家族的生长因子。
247.段落246的方法，其中所述分化因子包括活化素A。
248.段落245的方法，其中所述培养基缺乏血清或缺乏血清替代物。
249.包含人胚胎干细胞(hESC)和含有少于约2％(v/v)血清的培养基的细胞培养物，其中所述hESC在参考时间点开始分化，以至于与所述hESC中基线FGF8mRNA表达相比，距所述参考时间点约6小时时FGF8mRNA的表达显著上调。
250.段落249的细胞培养物，其中距所述参考时间点约24小时时FGF8mRNA的表达显著下调。
251.段落250的细胞培养物，其中在距所述参考时间点约6小时至约24小时之间FGF8mRNA的表达达到峰值。
252.段落249的细胞培养物，其中距所述参考时间点约17小时时β-连接素多肽开始向细胞核定位。
253.段落249的细胞培养物，其中距所述参考时间点约24小时时brachyury mRNA的表达显著上调。
254.段落253的细胞培养物，其中距所述参考时间点约48小时时brachyury mRNA的表达显著下调。
255.段落254的细胞培养物，其中在距所述参考时间点约12小时至约48小时之间brachyury mRNA的表达达到峰值。
256.段落255的细胞培养物，其中距所述参考时间点约72小时时brachyury mRNA不显著表达。
257.段落249的细胞培养物，其中距所述参考时间点约24小时时FGF4 mRNA的表达显著上调。
258.段落257的细胞培养物，其中距所述参考时间点约48小时时FGF4mRNA的表达显著下调。
259.段落258的细胞培养物，其中在距所述参考时间点约12小时至约48小时之间FGF4mRNA的表达达到峰值。
260.段落259的细胞培养物，其中距所述参考时间点约72小时时FGF4mRNA不显著表达。
261.段落249的细胞培养物，其中距所述参考时间点约24小时时brachyury和FGF4mRNA的表达显著上调。
262.段落261的细胞培养物，其中距所述参考时间点约48小时时brachyury和FGF4mRNA的表达显著下调。
263.段落262的细胞培养物，其中在距所述参考时间点约12小时至约48小时之间brachyury和FGF4mRNA的表达达到峰值。
264.段落263的细胞培养物，其中距所述参考时间点约72小时时brachyury和FGF4mRNA不显著表达。
265.段落249的细胞培养物，其中距所述参考时间点约24小时时SNAI1mRNA的表达显著上调。
266.段落265的细胞培养物，其中距所述参考时间点约48小时时SNAI1mRNA的表达显著下调。
267.段落266的细胞培养物，其中在距所述参考时间点约12小时至约48小时之间SNAI1mRNA的表达达到峰值。
268.段落249的细胞培养物，其中距所述参考时间点约12小时时E-钙粘着素mRNA的表达开始下调。
269.段落249的细胞培养物，其中距所述参考时间点约48小时时E-钙粘着素mRNA的表达显著下调。
270.段落249的细胞培养物，其中距所述参考时间点约48小时时SOX17mRNA的表达显著上调。
271.段落249的细胞培养物，其中距所述参考时间点约96小时时FOXA2mRNA的表达显著上调。
272.段落249的细胞培养物，其中所述培养基包含少于约1％(v/v)的血清。
273.段落249的细胞培养物，其中所述培养基包含少于约0.2％(v/v)的血清。
274.段落249的细胞培养物，其中所述培养基包含约0％(v/v)的血清。
275.段落249的细胞培养物，其中所述培养基缺乏血清或缺乏血清替代物。
276.段落249的细胞培养物，还包含TGFβ超家族的分化因子。
277.段落276的细胞培养物，其中所述分化因子包括活化素A。
278.段落277的细胞培养物，其中所述活化素A以约100ng/ml的浓度存在。
279.包含人胚胎干细胞(hESC)、TGFβ超家族的分化因子和含有少于约2％(v/v)血清的培养基的细胞培养物。
280.段落279的细胞培养物，其中所述细胞培养物的细胞中，选自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的表达上调之前上调。
281.段落280的细胞培养物，其中所述细胞培养物的细胞中，选自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的峰值表达之前上调。
282.段落281的细胞培养物，其中所述细胞培养物的细胞中，选自HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的峰值表达之前或大约同时下调。
283.段落279的细胞培养物，其中所述细胞培养物的细胞中，选自FGF8、Noda1、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自SOX17、FOXA2、CXCR4和MIXL1的标志物基因的表达上调之前上调。
284.段落283的细胞培养物，其中所述细胞培养物的细胞中，选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的表达在选自SOX17、FOXA2、CXCR4和MIXL1的标志物基因的表达上调之前或大致同时上调。
285.段落284的细胞培养物，其中所述细胞培养物的细胞中，选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因在选自SOX17、FOXA2、CXCR4和MIXL1的标志物基因的表达上调之前或大致同时达到其峰值表达。
286.段落283的细胞培养物，其中所述细胞培养物的细胞中，选自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的表达上调之前上调。
287.段落279的细胞培养物，其中所述培养基包含少于约1％(v/v)的血清。
288.段落279的细胞培养物，其中所述培养基包含少于约0.2％(v/v)的血清。
289.段落279的细胞培养物，其中所述培养基包含约0％(v/v)的血清。
290.段落279的细胞培养物，其中所述培养基缺乏血清或缺乏血清替代物。
291.段落279的细胞培养物，其中所述TGFβ超家族的分化因子包括活化素A。
292.段落291的细胞培养物，其中所述活化素A以约100ng/ml的浓度存在于培养基中。
293.在细胞培养物中分化细胞的方法，所述方法包括(a)使包含人胚胎干细胞(hESC)的细胞培养物与含有少于约2％血清的培养基接触，(b)向所述hESC提供TGFβ超家族的分化因子，以及(c)允许所述hESC的分化发生。
294.段落283的方法，其中所述细胞培养物的细胞中，选自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的表达上调之前上调。
295.段落294的方法，其中所述细胞培养物的细胞中，选自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的峰值表达之前上调。
296.段落295的方法，其中所述细胞培养物的细胞中，选自HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的峰值表达之前或大致同时下调。
297.段落293的方法，其中所述细胞培养物的细胞中，选自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自SOX17、FOXA2、CXCR4和MIXL1的标志物基因的表达上调之前上调。
298.段落297的方法，其中所述细胞培养物的细胞中，选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的表达在选自SOX17、FOXA2、CXCR4和MIXL1的标志物基因的表达上调之前或大致同时上调。
299.段落298的方法，其中所述细胞培养物的细胞中，选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因在选自SOX17、FOXA2、CXCR4和MIXL1的标志物基因的表达上调之前或大致同时达到其峰值表达。
300.段落297的方法，其中所述细胞培养物的细胞中，选自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的表达上调之前上调。
301.段落293的方法，其中所述培养基包含少于约1％(v/v)的血清。
302.段落293的方法，其中所述培养基包含少于约0.2％(v/v)的血清。
303.段落293的方法，其中所述培养基包含约0％(v/v)的血清。
304.段落293的方法，其中所述培养基缺乏血清或缺乏血清替代物。
305.段落293的方法，其中所述TGFβ超家族的分化因子包括活化素A。
306.段落305的方法，其中所述活化素A以约100ng/ml的浓度存在于所述培养基中。
307.包含人胚胎干细胞(hESC)和含有少于约2％(v/v)血清的培养基的细胞培养物，其中所述hESC在参考时间点开始分化，以至于距所述参考时间点约2小时时所述hESC中选自FZD10、FGF5和OCT4的mRNA的表达与选自FZD10、FGF5和OCT4的相应mRNA的基线表达相比显著上调。
308.段落307的细胞培养物，其中所述培养基包含少于约1％(v/v)的血清。
309.段落307的细胞培养物，其中所述培养基包含少于约0.2％(v/v)的血清。
310.段落307的细胞培养物，其中所述培养基包含约0％(v/v)的血清。
311.段落307的细胞培养物，其中所述培养基缺乏血清或缺乏血清替代物。
312.段落307的细胞培养物，还包含TGFβ超家族的分化因子。
313.段落312的细胞培养物，其中所述分化因子包括活化素A。
314.段落313的细胞培养物，其中所述活化素A以约100ng/ml的浓度存在。
315.包含人胚胎干细胞(hESC)和含有少于约2％(v/v)血清的培养基的细胞培养物，其中所述hESC在参考时间点开始分化，以至于距所述参考时间点约2小时时所述hESC中选自GBX2、ZFP42和SOX2的mRNA的表达与选自GBX2、ZFP42和SOX2的相应mRNA的基线表达相比显著下调。
316.段落315的细胞培养物，其中所述培养基包含少于约1％(v/v)的血清。
317.段落315的细胞培养物，其中所述培养基包含少于约0.2％(v/v)的血清。
318.段落315的细胞培养物，其中所述培养基包含约0％(v/v)的血清。
319.段落315的细胞培养物，其中所述培养基缺乏血清或缺乏血清替代物。
320.段落315的细胞培养物，还包含TGFβ超家族的分化因子。
321.段落320的细胞培养物，其中所述TGFβ超家族的分化因子包括活化素A。
322.段落321的细胞培养物，其中所述活化素A以约100ng/ml的浓度存在。
323.包含人胚胎干细胞(hESC)、TGFβ超家族的分化因子和含有少于约2％(v/v)血清的培养基的细胞培养物，其中所述细胞培养物的细胞中，在选自FGF8、Noda1、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达上调之前选自FZD10、FGF5、Nanog和OCT4的标志物基因的表达上调，或者选自GBX2、ZFP42和SOX2的标志物基因的表达下调。
324.段落323的细胞培养物，其中在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的表达上调之前选自FZD10、FGF5、Nanog和OCT4的标志物基因的表达上调，或者选自GBX2、ZFP42和SOX2的标志物基因的表达下调。
325.段落323的细胞培养物，其中所述培养基包含少于约1％(v/v)的血清。
326.段落323的细胞培养物，其中所述培养基包含少于约0.2％(v/v)的血清。
327.段落323的细胞培养物，其中所述培养基包含约0％(v/v)的血清。
328.段落323的细胞培养物，其中所述培养基缺乏血清或缺乏血清替代物。
329.段落323的细胞培养物，还包含TGFβ超家族的分化因子。
330.段落329的细胞培养物，其中所述TGFβ超家族的分化因子包括活化素A。
331.段落330的细胞培养物，其中所述活化素A以约100ng/ml的浓度存在。
332.分化细胞培养物中细胞的方法，所述方法包括(a)使包含人胚胎干细胞(hESC)的细胞培养物与包含少于约2％血清的培养基接触，(b)向所述hESC提供TGFβ超家族的分化因子，以及(c)允许所述hESC分化的发生，其中所述细胞培养物的细胞中，在选自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达上调之前选自FZD10、FGF5、Nanog和OCT4的标志物基因的表达上调，或者选自GBX2、ZFP42和SOX2的标志物基因的表达下调。
333.段落332所述的方法，其中在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的表达上调之前选自FZD10、FGF5、Nanog和OCT4的标志物基因的表达上调，或者选自GBX2、ZFP42和SOX2的标志物基因的表达下调。
334.段落332的方法，其中所述培养基包含少于约1％(v/v)的血清。
335.段落332的方法，其中所述培养基包含少于约0.2％(v/v)的血清。
336.段落332的方法，其中所述培养基包含约0％(v/v)的血清。
337.段落332的方法，其中所述培养基缺乏血清或缺乏血清替代物。
338.段落332的方法，还包含TGFβ超家族的分化因子。
339.段落338的方法，其中所述分化因子包括活化素A。
340.段落339的方法，其中所述活化素A以约100ng/ml的浓度存在。
应理解上述方法和组合物涉及体外培养的细胞。但是，上述的体外分化的细胞组合物可用于体内应用。
本发明的其他实施方案也可参见以下专利申请于2003年12月23 日提交的题为DEFINITIVE ENDODERM(定形内胚层)的第60/532,004号美国临时专利申请；于2004年4月27日提交的题为PDX1EXPRESSING ENDODERM(表达PDX1的内胚层)的第60/566,293号美国临时专利申请；于2004年7月9日提交的题为CHEMOKINE CELLSURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVEENDODERM(用于分离定形内胚层的趋化因子细胞表面受体)的第60/586,566号美国临时专利申请；于2004年7月14日提交的题为CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OFDEFINITIVE ENDODERM(用于分离定形内胚层的趋化因子细胞表面受体)的第60/587,942号美国临时专利申请；于2004年12月23日提交的题为DEFINITIVE ENDODERM(定形内胚层)的第11/021,618号美国专利申请；于2005年4月26日提交的题为PDX1 EXPRESSINGENDODERM(表达PDX1的定形内胚层)的第11/115,868号美国专利申请；于2005年6月23日提交的题为METHODS FOR IDENTIFYINGFACTORS FOR DEFFERENTIATING DEFINITIVE ENDODERM(鉴定用于分化定形内胚层的因子的方法)的第11/165,305号美国专利申请和于2005年6月23日提交的题为PREPRIMITIVE STREAK CELLSAND MESENDODERM CELLS(前原条细胞和中内胚层细胞)的第60/693,364号美国临时专利申请，其公开在此整体并入以供参考。
附图简要说明
图1是描述在活化素存在下、在BMP4和SU5402组合存在下、和不存在任何分化因子时胚胎干细胞(ESC)的分化的示意图。还列出了一些对鉴定和/或检测每种细胞类型有用的标志物基因。
图2A-M是显示可用于鉴定定形内胚层细胞的标志物基因的表达模式的条形图。图G-L依次显示了定形内胚层标志物FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的表达分析。图A-F依次显示了前述细胞系标志基因SOX17、SOX7、SOX17/SOX7、TM、ZIC1和MOX1的表达分析。图M显示了CXCR4的表达分析。对于图A-M的每一图，标注hESC的列表示来自纯化的人胚胎干细胞的基因表达；2NF表示细胞经过2％FBS处理，不添加活化素；0.1A100表示细胞经0.1％FBS和100ng/ml活化素A处理；1A100表示细胞经过1％FBS和100ng/ml活化素A处理；2A100表示细胞经过2％FBS和100ng/ml活化素A处理。
图3是显示了某些标志物基因在(A)前原条细胞，(B-D)原条(中内胚层)细胞，(E-F)中内胚层和定形内胚层细胞，(G)定形内胚层细胞，和(H-L)滋养外胚层和原始内胚层细胞中表达的条形图。分化过程中，在向细胞培养物中加入100ng/ml活化素A(用“A”表明)或100ng/mlBMP4和2.5μM SU5402的组合(用“B/SU”表明)后的0、6、12、24、48、72和96小时时，通过Q-PCR确定标志物的表达。所有细胞都生长在在第一天(最初24小时)含有0％(v/v)FBS、在第二天(24-48小时)含有0.2％(v/v)FBS和在第三和第四天(48-96小时)含有2％(v/v)FBS的RPMI培养基中。表1提供了每种标志物基因的全称。
图4A-C是显示在100ng/ml活化素A和0.1％(v/v)FBS存在下，在hESC(用“ESC”表明)分化的最初48小时中(A)中内胚层的Brachyury标志物(BRACH)，(B)hESC的E-钙粘着素标志物，和(C)中内胚层的SNAI1标志物的mRNA表达模式的条形图。
图5A和B是依次显示了100ng/ml活化素A和0.1％(v/v)FBS(用“ESC”表明)存在下，在hESC分化的最初48小时中，中内胚层的Brachyury标志物(BRACH)和定形内胚层的性别决定区Y-Box17(SOX17)标志物的mRNA表达模式的条形图。
图6A-D是显微图片，显示了在100ng/ml活化素A和0.1％(v/v)FBS存在下，从hESC分化48小时后的细胞。图A显示了用DAPI染色的细胞区域。图B-D显示了用抗Brachyury(B)、抗SOX17(C)或抗Brachyury和SOX17二者(D)的抗体染色的相同细胞区域。
图7是描述了低血清条件下，存在100ng/ml活化素A(A100)或不存在活化素A(NF)时胚胎干细胞(ESC)的分化的示意图。PS表示原条细胞(中内胚层细胞)；DE表示定形内胚层细胞；并且M表示中胚层细胞。
图8A-F是描述特定条件下细胞培养物中中胚层标志物基因(A)BRACH，(B)FOXF1，(C)FLK1，(D)BMP4，(E)MOX1和(F)SDF1表达的条形图，该特定条件为在100ng/ml活化素A连续存在下孵育4天后(A100)，或孵育4天后但在第一天后撤除活化素A(NF)。通过Q-PCR确定标志物基因的表达。
图9A-C是描述特定条件下细胞培养物中定形内胚层标志物基因(A)GSC，(B)SOX17和(C)FOXA2表达的条形图，该特定条件为在100ng/ml活化素A连续存在下孵育4天后(A100)，或孵育4天后但在第一天后撤除活化素A(NF)。通过Q-PCR确定标志物基因的表达。
图10A-I是描述可用于鉴定和/或检测定形内胚层细胞的某些标志物基因表达的条形图。在含有0.5％、2％或10％小牛血清(FBS)和100ng/ml活化素A(A100)或没有活化素A(NF)的五天的细胞培养物中，通过Q-PCR确定标志物基因的表达。
图11A和B是描述了在100ng/ml活化素A存在下分化了4天的细胞培养物中定形内胚层标志物(A)SOX17和(B)FOXA2表达的条形图。通过Q-PCR确定分化过程中，加入活化素A后0、6、24、30、48和96小时时标志物基因的表达。
图12A-D显示了移植到免疫妥协小鼠的肾包膜下的定形内胚层细胞的体内分化。各图A-苏木精-伊红染色显示肠管样结构；B-抗肝细胞特异性抗原(肝)的抗体免疫反应性；C-抗绒毛蛋白(肠)的抗体免疫反应性；和D-抗CDX2(肠)的抗体免疫反应性。
详细描述称为原肠胚形成的早期人发育中的重要阶段发生于受精后2-3周。原肠胚形成非常重要，因为在这个阶段三种主要胚层第一次特异化和组织化(Lu et al.，2001；Schoenwolf和Smith，2000)。外胚层负责身体外表和整个神经系统的最终形成，而中胚层衍生出心、血、骨、骨骼肌和其他结缔组织。定形内胚层被定义为负责整个肠管(包括食道、胃、小肠和大肠)以及肠管衍生的器官(如肺、肝、胸腺、甲状旁腺、甲状腺、胆囊和胰腺)形成的胚层(Grapin-Botton和Melton，2000；Kimelman和Griffin，2000；Tremblay et al.，2000；Wells和Melton，1999；Wells和Melton，2000))。定形内胚层细胞与称为原始内胚层的完全分离细胞系有重要区别。原始内胚层主要负责胚外组织的形成，主要是胎盘卵黄囊的腔壁和内脏内胚层部分和Reichert’s膜的胞外基质物质。
在原肠胚形成期，定形内胚层形成过程起始于细胞迁移，其中中内胚层细胞(有形成中胚层或内胚层能力的细胞)迁移穿过称为原条的结构。当中内胚层进入原条，它们经历表皮间质转化(EMT)，成为中胚层或定形内胚层。定形内胚层源自迁移穿过原条前部及节(在原条最前部区域的特化结构)的细胞。当迁移发生时，定形内胚层首先集中于最前部肠管，随后以肠管后端的形成而终止。
原条前体细胞(前原条细胞)和原条细胞(中内胚层细胞)是产生中胚层和定形内胚层的早期阶段前体细胞。事实上，前原条细胞和中内胚层细胞可能是从多能性向由中胚层和定形内胚层细胞系形成的终分化的细胞、组织和/或器官的发育过程中最早的前体。直到目前，尚未获得富集人前原条细胞的细胞群或富集人中内胚层细胞的细胞群。而且，该细胞群的细胞之前未在体外被表征过。
考虑以上所述，本发明的一些实施方案涉及包含人前原条细胞的细胞培养物和/或富集细胞群，以及包含人中内胚层细胞的细胞培养物和/或富集细胞群。这些实施方案中，前原条细胞和中内胚层细胞能够进一步分化为中胚层细胞和/或定形内胚层细胞以及源自这些细胞系的细胞、组织和/或器官。
本发明的其它实施方案涉及制备包含人前原条细胞的细胞培养物和/或富集细胞群，以及制备包含人中内胚层细胞的细胞培养物和/或富集细胞群的方法。
本文所述其它实施方案涉及鉴定可用于使包含前原条细胞或中内胚层细胞的细胞群中细胞分化的一种或多种分化因子的筛选方法。这些因子可用于促进这些细胞类型向中胚层和/或定形内胚层细胞以及源自这些细胞系的细胞、组织和/或器官的分化。
本发明的某些其它方面涉及提高某些早期阶段细胞标志物表达的方法。其它方面涉及包含在分化过程中表达某些标志物的细胞的细胞组合物。
定义贯穿本申请的某些术语和短语具有以下所描述的意义此处使用的“胚胎的”指有机体的一系列发育阶段，开始于单一受精卵，结束于多细胞结构，这种多细胞结构除了发育的配子生殖细胞外不再包含多能性或全能细胞。除了来自配子融合的胚胎，术语“胚胎的”也指来自体细胞核转移的胚胎。
本文使用的“多潜能的(multipotent)”或“多潜能细胞(multipotent cell)”指能产生有限数量的其它具体细胞类型的细胞类型。
本文使用的“表达”指材料或物质的产生以及材料或物质产生的水平或数量。因此，检测特定标志物的表达指测定表达标志物的相对或绝对量，或仅仅检测标志物的存在或缺失。
此处使用的“标志物”指能够被观察或检测到的任何分子。例如，标志物可包括但不局限于核酸，如特异基因的转录本、基因的多肽产物、非基因多肽产物、糖蛋白、糖、糖脂、脂质、脂蛋白或小分子(例如，分子量小于10,000amu的分子)。
当涉及细胞培养物和/或细胞群时，术语“部分”表示细胞培养物或细胞群任意不为零的数量，范围从单个细胞到整个细胞培养物或细胞群。
关于细胞培养物或细胞群中的细胞，术语“基本上不含”表示细胞培养物或细胞群不含的特异细胞类型在细胞培养物或细胞群的所有细胞中占有的比例少于5％。
关于细胞培养的培养基，此处使用的“低血清RPMI”指含有低血清的培养基，其中血清浓度在限定的时间段内逐渐增强。例如，在一个实施方案中，低血清RPMI在细胞生长的第一天包含浓度为约0.2％的小牛血清(FBS)，在细胞生长的第二天包含浓度为约0.5％的小牛血清(FBS)，在细胞生长的第三天到第五天包含浓度为约2％的小牛血清(FBS)。另一实施方案中，低血清RPMI在第一天包含浓度为约0％的，在第二天包含浓度为约0.2％的，以及在第三天及以后包含约2％的。
本文使用的“血清替代物”指包含IGF或胰岛素的血清替代物。
hESC向定形内胚层细胞分化中早期事件的模型图1显示了总结在体外人胚胎干细胞(hESC)早期转变的模型。可以通过在低血清添加情况下使用高剂量的活化素A组织hESC通过接近重演原肠胚形成的过程的分化。约24小时(前原条细胞)之前FGF8和核定位的β-连接素的表达(其为原条形成之前发生在最接近的上胚层的事件)明显。原条表达基因(brachyury和FGF4)的高水平表达发生在约24小时。如果保持在高剂量活化素A中，该原条细胞(中内胚层细胞)有效地转化为定形内胚层。相反，缺乏活化素时，这些中内胚层前体成为中胚层。用BMP4和SU5402处理hESC诱导与原始内胚层和滋养外胚层相关的基因表达。
前原条细胞和中内胚层细胞及其相关过程本发明的实施方案涉及在培养物中生成前原条细胞和/或中内胚层细胞的新的确定方法，其通过将诸如干细胞的多能性细胞分化为前原条细胞和/或中内胚层细胞来实现。如上所述，前原条细胞能够分化中内胚层细胞以及源于它们的细胞、组织和/或器官。中内胚层细胞能够分化中胚层细胞和/或定形内胚层细胞以及源于这些细胞系中任一种的细胞、组织和/或器官。一些实施方案中，前原条细胞经过中内胚层中间体转化为中胚层或定形内胚层细胞系的终末分化的细胞。如以下将要进一步详细描述的，这些方法可以提供有效生成多种人内胚层和中胚层衍生组织的基础。例如，这些方法可以提供有效生成人内胚层衍生的组织，如胰、肝、肺、胃、肠、甲状腺、胸腺、咽、胆囊和膀胱的基础。重要地，前原条细胞和/或中内胚层细胞的产生是干细胞向功能性的产生胰岛素的β细胞分化的早期步骤。作为另一例子，前原条细胞和/或中内胚层细胞可以提供有效生成人中胚层衍生的组织，如血细胞、心血管组织、骨组织和其它结构和结缔组织的基础。为了获得有用量的任何上述的细胞或组织类型，在达到终末分化的细胞命运之前，期望发生的每个分化步骤都是高效的。因为干细胞分化为前原条细胞和/或中内胚层细胞代表着生成功能性中胚层和定形内胚层细胞系的终末分化细胞的最初步骤(如图1所示)，特别需要此步分化高效。
鉴于分化多能性细胞至前原条细胞和/或中内胚层细胞的需要，本发明一些方面涉及体外方法学，将约5-90％的多能性细胞转变为前原条细胞和/或中内胚层细胞。典型地，这些方法包括以已确定及暂时指定的方式使用培养物及生长因子。通过基于差异荧光标志物表达拣选细胞，从细胞群中将前原条细胞和/或中内胚层细胞与其它细胞分离和/或纯化，可获得前原条细胞和/或中内胚层细胞细胞群的更大富集。这样，本文所述一些实施方案涉及前原条细胞及制备和分离和/或纯化这些细胞的方法。其它实施方案涉及中内胚层细胞及制备和分离和/或纯化这些细胞的方法。
为了确定细胞培养物或细胞群内前原条细胞细胞的数量，需要从培养物或细胞群中区分这类细胞与其它细胞的方法。因此，本发明实施方案涉及细胞标志物，其存在、缺失和/或相对表达水平对前原条细胞是特异的，以及检测确定这些标志物表达的方法。
本发明的一些实施方案中，标志物表达的存在与否和/或其水平由定量PCR(Q-PCR)确定。例如，一些遗传标志物产生的转录本量，例如OCT4、ECAD、FGF8、β-连接素、brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、CXCR4、GSC、MIXL1、FOXA2、SOX7、FOXF1、FLK1、BML4、MOX1、SDF1及本文所述的其它标志物，由定量Q-PCR确定。其它实施方案中，免疫组化技术用于检测上述基因表达的蛋白。其它实施方案中，免疫组化技术/免疫细胞化学用于检测例如核定位的β-连接素的某些多肽标志物的细胞区室定位。其它实施方案中，Q-PCR及免疫组化技术用于识别及确定这些标志物的量或相对比例。
通过使用如上述的确定一种或多种合适的标志物表达的方法，在细胞培养物或细胞群内识别前原条细胞和/或中内胚层细胞以及确定前原条细胞和/或中内胚层细胞的比例是可能的。例如，本发明的一些实施方案中，产生的前原条细胞或细胞群表达FGF8标志物和/或核定位的β-连接素的水平比非前原条细胞类型或细胞群高约2个数量级。在其它实施方案中，产生的前原条细胞或细胞群表达FGF8标志物和/或核定位的β-连接素的水平比非前原条细胞细胞类型或细胞群高2个数量级以上。在本发明的其它实施方案中，产生的中内胚层细胞或细胞群表达brachyury、FGF4和/或SNAI1标志物的水平比非中内胚层细胞类型或细胞群高约2个数量级。其它实施方案中，产生的中内胚层细胞或细胞群表达brachyury、FGF4和/或SNAI1标志物的水平比非中内胚层细胞类型或细胞群高2个数量级以上。
本文所述实施方案还涉及前原条细胞和/或中内胚层细胞组合物。例如，一些实施方案涉及包括前原条细胞和/或中内胚层细胞的细胞培养物，然而其它的涉及富集了前原条细胞和/或中内胚层细胞的细胞群。一些优选的实施方案涉及包括前原条细胞和/或中内胚层细胞的细胞培养物，其中所述培养物中至少约5-90％的细胞为前原条细胞和/或中内胚层细胞。特别优选的实施方案涉及包括人细胞的细胞培养物，其中培养物中至少约5-90％的人细胞为前原条细胞和/或中内胚层细胞。由于分化方法的效果可以通过改变一些参数进行调节，这些参数包括但不限于细胞生长条件、生长因子浓度及培养步骤的时间安排，本发明所述的分化方法可使约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或大于95％的多能性细胞转化为前原条细胞和/或中内胚层细胞。在其它优选的实施方案中，考虑将诸如干细胞群体的多能性细胞群转化为基本纯的前原条细胞和/或中内胚层细胞群。
本发明所述的组合物及方法具有几个有用的特征。例如，包括前原条细胞和/或中内胚层细胞的细胞培养物及细胞群，以及制备这些细胞培养物及细胞群的方法可用于模建人发育的早期阶段。此外，本发明所述的组合物及方法也可用于诸如糖尿病的疾病的治疗性干预。例如，由于前原条细胞和/或中内胚层细胞仅为有限数量的组织的来源，因而其可用于发育纯的组织或细胞类型。
从多能性细胞产生前原条细胞产生前原条细胞的一些方法中，作为起始材料的多能性细胞是干细胞。某些方法中，从胚胎干细胞产生包含前原条细胞的细胞培养物和富集的细胞群。优选的衍生前原条细胞的方法利用人胚胎干细胞作为制备前原条细胞的起始材料。这些多能性细胞可以是衍生于桑椹胚、胚胎内细胞团或从胚胎生殖嵴获得的细胞。使用现有技术已知的方法，人胚胎干细胞可在培养基中保持多能性状态而基本不分化。所述的方法在诸如第5,453,357、5,670,372、5,690,926、5,843,780、6,200,806及6,251,671号美国专利中有所描述，其公开在此整体并入以供参考。
在产生前原条细胞的一些方法中，hESC维持在滋养层。在这些方法中，任何能够使hESC保持在多能性状态的滋养层都可使用。一种常用的培养人胚胎干细胞的滋养层为一层小鼠成纤维细胞。最近，人成纤维细胞滋养层也已开发出来用于培养hESC(参见第2002/0072117号美国专利申请中公开的方法，其公开在此整体并入以供参考)。产生前原条细胞的其它方法允许不使用滋养层而保持多能性hESC。在没有滋养层条件下保持多能hESC的方法已在第2003/0175956号美国专利申请中有描述，其公开在此整体并入以供参考。
本发明所述的人胚胎干细胞可以保持在具有或不具有血清的培养基中。在一些胚胎干细胞保持方法中，使用血清替代品。在其它方法中，使用无血清培养技术，如美国专利申请号2003/0190748所述，其公开在此全部引入，以供参考。
在培养基中保持多能性状态的干细胞按照常规传代，直到分化为前原条细胞。在一些实施方案中，分化至前原条细胞的完成是通过向干细胞培养基中加入分化因子，如TGFβ超家族的生长因子，其加入的量足以促进至前原条细胞的分化。用于制备前原条细胞的TGFβ超家族生长因子选自Nodal/活化素亚群。一些优选的分化方法中，生长因子选自Nodal、活化素A和活化素B。在某些分化方法中，使用生长因子活化素A。
关于从多能性干细胞向前原条细胞分化的一些方法，向细胞中加入的上述生长因子，使其在培养基中的浓度足以促进至少一部分干细胞分化至前原条细胞。一些方法中，培养基中上述生长因子的浓度至少约5ng/ml、至少约10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约200ng/ml、至少约300ng/ml、至少约400ng/ml、至少约500ng/ml、至少约1000ng/ml、至少约2000ng/ml、至少约3000ng/ml、至少约4000ng/ml、至少约5000ng/ml或大于5000ng/ml。
在使多能干细胞向前原条细胞分化的某些方法中，上述生长因子加入培养基后需要被从细胞培养物中除去。例如，生长因子的除去时间约1小时之内、约2小时之内、约3小时之内、约4小时之内、约5小时之内、约6小时之内、约7小时之内、约8小时之内、约9小时之内、约10小时之内、约11小时之内、约12小时之内、约13小时之内、约14小时之内、约15小时之内、约16小时之内、约17小时之内、约18小时之内、约19小时之内、约20小时之内、约21小时之内、约22小时之内、约23小时之内、约24小时之内或约多于24小时之内。
前原条细胞的培养物可生长在包含少量血清或无血清的培养基中。在某些培养条件下，血清的浓度范围为约0％(v/v)至约10％(v/v)。例如，在一些分化方法中，培养基中血清的浓度可以低于约0.05％(v/v)、低于约0.1％(v/v)、低于约0.2％(v/v)、低于约0.3％(v/v)、低于约0.4％(v/v)、低于约0.5％(v/v)、低于约0.6％(v/v)、低于约0.7％(v/v)、低于约0.8％(v/v)、低于约0.9％(v/v)、低于约1％(v/v)、低于约2％(v/v)、低于约3％(v/v)、低于约4％(v/v)、低于约5％(v/v)、低于约6％(v/v)、低于约7％(v/v)、低于约8％(v/v)、低于约9％(v/v)或低于约10％(v/v)。在一些方法中，前原条细胞在无血清或无血清替代物下生长。在其它方法中，前原条细胞在B27存在下生长。在这些方法中，B27添加物的浓度范围为约0.1％(v/v)至约20％(v/v)。
监测多能性细胞向前原条细胞的分化hESC培养物至前原条细胞的进程可以通过确定前原条细胞特征性标志物的时间性表达来监测。在一些方法中，一些标志物的表达可通过标志物的存在或缺失来确定。或者，某些标志物的表达可通过测定标志物在细胞培养物或细胞群的细胞中，在加入分化因子之后的一个或多个时间点的水平来确定。在这些方法中，可以定性或定量测定标志物的表达。定量标志物基因产生的标志物表达的一种方法可以使用定量聚合酶链式反应(Q-PCR)。进行Q-PCR的方法为现有技术。现有技术已知的其它方法也可用于定量标志物基因的表达。例如，标志物基因产物的表达可以通过使用针对感兴趣的特异标志物基因产物的抗体来检测。某些方法中，测定前原条细胞的特征性标志物基因的表达，以及缺乏hESC及其它细胞类型的特征标志物基因的显著表达。其它方法中，确定前原条细胞的特征性标志物基因在加入分化因子后的一个或多个时间点的表达的时间性和量。
如以下实施例的进一步所述，前原条细胞的标志物为FGF8和β-连接素。这样，本发明所述方法制备的前原条细胞表达FGF8和β-连接素标志物基因，由此产生FGF8和β连接素标志物基因产物。在一些实施方案中，FGF8mRNA在前原条细胞但不在hESC中大量表达。FGF8mRNA的显著上调，直至接近峰值水平，可以在hESC接触诸如活化素A的合适的分化因子后6小时时在分化中的hESC培养物中观察到。此时，指示诸如中内胚层、原始内胚层、定形内胚层、中胚层和外胚层的其它细胞类型的标志物(参见表1)的表达依然相对较低。一些实施方案中，指示中内胚层、原始内胚层、定形内胚层、中胚层和外胚层的标志物在hESC接触分化因子后6小时时不显著表达。FGF8mRNA的表达在hESC接触分化因子后至少约24小时维持高水平，但是其后开始下降。此外，hESC接触诸如活化素A的合适的分化因子后17小时，通过免疫细胞化学观察到β-连接素多肽的细胞核定位(细胞核定位的β-连接素的表达)。hESC中，该β-连接素多肽存在于细胞外周但不在细胞核中。
应当理解，根据分化条件，在前原条细胞内诱导不同水平范围的FGF8和细胞核定位的β连接素的表达。这样，在本发明一些实施方案中，在hESC分化的最初6至18小时内，FGF8标志物和/或核定位的β-连接素标志物在前原条细胞或细胞群的表达比这些标志物在非前原条细胞或细胞群中的表达至少高约2倍至至少高约10,000倍。其它实施方案中，在hESC分化的最初6至18小时内，FGF8标志物和/或核定位的β-连接素标志物在前原条细胞或细胞群的表达比FGF8标志物和/或核定位的β-连接素标志物在非前原条细胞或细胞群中的表达高至少约4倍、至少约6倍、至少约8倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约40倍、至少约80倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约500倍、至少约750倍、至少约1000倍、至少约2500倍、至少约5000倍、至少约7500倍或至少约10,000倍。一些实施方案中，在hESC分化的最初6至18小时内，FGF8标志物和/或核定位的β-连接素标志物在前原条细胞或细胞群的表达无限地高于FGF8标志物和/或细胞核定位的β连接素标志物在非前原条细胞或细胞群中的表达。
还应当理解，在前原条细胞内，FGF8标志物的表达水平与brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和/或SOX1标志物的表达水平存在差异范围。类似地，在前原条细胞内，核定位的β-连接素标志物的表达水平与brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和/或SOX1标志物的表达水平存在差异范围。类似地，在本发明一些实施方案中，FGF8标志物和/或核定位的β-连接素标志物的表达比brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和/或SOX1标志物的表达高至少约2倍至至少约10,000倍。其它实施方案中，FGF8标志物和/或核定位的β-连接素标志物的表达比brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和/或SOX1标志物的表达高至少约4倍、至少约6倍、至少约8倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约40倍、至少约80倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约500倍、至少约750倍、至少约1000倍、至少约2500倍、至少约5000倍、至少约7500倍或至少约10,000倍。一些实施方案中，brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和/或SOX1标志物在前原条细胞内不显著表达。
前原条细胞的富集、分离和/或纯化关于本发明方法的其它方面，前原条细胞可被富集、分离和/或纯化。一些实施方案中，通过从细胞培养物中分离此类细胞制备富集前原条细胞的细胞群。
本文所述方法的一些实施方案中，前原条细胞被荧光标记，然后通过荧光活化细胞分选器(FACS)将其从未标记细胞中分离。这些实施方案中，编码绿色荧光蛋白(GFP)的核酸或编码可表达荧光标志物的其它核酸被用于标记前原条细胞。例如，一些实施方案中，至少一个拷贝的编码GFP或其生物活性片段的核酸被引入多能性细胞中，优选为人胚胎干细胞，该核酸位于FGF8启动子下游，使得GFP基因产物或其生物活性片段的表达处于FGF8启动子的控制之下。一些实施方案中，编码FGF8的核酸的全部编码区被编码GFP或其生物活性片段的核酸替换。其它实施方案中，编码GFP或其生物活性片段的核酸与至少部分FGF8的核酸同框融合，因而提供融合蛋白。这些实施方案中，该融合蛋白保持与GFP类似的荧光活性。
荧光标记的细胞，如上述的多能性细胞，分化为如之前所述的前原条细胞。因为前原条细胞表达荧光标志物基因，而非前原条细胞不表达，因此这两种细胞类型可被分开。一些实施方案中，包含荧光标记的前原条细胞和未标记的非前原条细胞的悬浮培养物用FACS分选。前原条细胞被从非前原条细胞分离收集，因而造成所述细胞类型的分离。如果需要的话，分离的细胞组合物可通过更多轮的分选被进一步纯化，该分选使用特异针对前原条细胞的相同或不同标志物。
除所述方法之外，可通过其它细胞分离技术分离前原条细胞。此外，可通过在特定生长条件下连续次培养(subculture)的方法富集或分离前原条细胞，该特定生长条件促进前原条细胞的选择性存活或选择性生长。
应该理解，上述的富集、分离和纯化方法可用于任何分化阶段的培养物。
使用本文所述方法，前原条细胞和/或组织的富集的、分离的和/或纯化的群可体外自hESC培养物或细胞群制备，该hESC培养物或细胞群经历约1小时至约24小时的分化。一些实施方案中，所述细胞进行随机分化。但在优选实施方案中，所述细胞被定向主要分化为前原条细胞。一些优选的富集、分离和/或纯化方法涉及在体外产生始于人胚胎干细胞的前原条细胞。
使用本文所述方法，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，细胞群或细胞培养物中前原条细胞的含量可被富集至少约2倍至约1000倍。在一些实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，前原条细胞可被富集至少约5倍至约500倍。在其它实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，前原条细胞可被富集至少约10倍至约200倍。在其它实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，前原条细胞可被富集至少约20倍至约100倍。在其它实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，前原条细胞可被富集至少约40倍至约80倍。在某些实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，前原条细胞可被富集至少约2倍至约20倍。
包含前原条细胞的组合物上述方法产生的细胞组合物包括包含前原条细胞的细胞培养物和富集前原条细胞的细胞群。例如，能够产生包含前原条细胞的细胞培养物，其中培养物中至少约5-90％的细胞是前原条细胞。因为可通过调整某些参数(这些参数包括但不限于，细胞生长条件、生长因子浓度和培养步骤的时间安排)来调整分化方法的效率，本文所述的分化方法可导致约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或超过约95％的多能性细胞向前原条细胞的转化。在使用分离前原条细胞的方法中，可回收基本上纯的前原条细胞群。
本发明的一些实施方案涉及包含诸如干细胞的多能性细胞和前原条细胞的组合物，例如细胞群和细胞培养物。例如，用本发明的方法可以产生包含hESC和前原条细胞的混合物的组合物。一些实施方案中，产生包含约每95个多能性细胞对应至少约5个前原条细胞的组合物。其它实施方案中，产生包含约每5个多能性细胞对应至少约95个前原条细胞的组合物。此外，预期可以得到包含前原条细胞和多能性细胞其他比例的组合物。例如，预期可以得到包含至少约1个前原条细胞对应约每1,000,000个多能性细胞、至少约1个前原条细胞对应约每100,000个多能性细胞、至少约1个前原条细胞对应约每10,000个多能性细胞、至少约1个前原条细胞对应约每1000个多能性细胞、至少约1个前原条细胞对应约每500个多能性细胞、至少约1个前原条细胞对应约每100个多能性细胞、至少约1个前原条细胞对应约每10个多能性细胞、至少约1个前原条细胞对应约每5个多能性细胞、至少约1个前原条细胞对应约每2个多能性细胞、至少约2个前原条细胞对应约每1个多能性细胞、至少约5个前原条细胞对应约每1个多能性细胞、至少约10个前原条细胞对应约每1个多能性细胞、至少约20个前原条细胞对应约每1个多能性细胞、至少约50个前原条细胞对应约每1个多能性细胞、至少约100个前原条细胞对应约每1个多能性细胞、至少约1000个前原条细胞对应约每1个多能性细胞、至少约10,000个前原条细胞对应约每1个多能性细胞、至少约100,000个前原条细胞对应约每一个多能性细胞、以及至少约1,000,000个前原条细胞对应约每1个多能性细胞的组合物。一些实施方案中，该多能性细胞是人多能干细胞。某些实施方案中，该干细胞衍生自桑椹胚、胚胎内细胞团或胚胎生殖嵴。某些其他实施方案中，该多能性细胞衍生自发育已经越过胚胎期的多细胞结构的性腺组织或生殖组织。
本发明的一些实施方案涉及包含从至少约5％前原条细胞到至少约99％前原条细胞的细胞培养物或细胞群。一些实施方案中，该细胞培养物或细胞群包含哺乳动物细胞。优选实施方案中，该细胞培养物或细胞群包含人细胞。例如，某些特定实施方案涉及含有人细胞的细胞培养物，其中从至少约5％到至少约99％的人类细胞是前原条细胞。其它实施方案涉及含有人细胞的细胞培养物，其中至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或多于99％的人细胞是前原条细胞。一些实施方案中，细胞培养物或细胞群包含人饲养细胞，计算上述百分比时不考虑细胞培养物或细胞群中的人饲养细胞。
本发明的其它实施方案涉及包含诸如人前原条细胞的人细胞的组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中至少约5％的人细胞中FGF8标志物和/或核定位的β-连接素标志物的表达高于brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和/或SOX1标志物的表达。其他实施方案中，至少约10％的人细胞中、至少约15％的人细胞中、至少约20％的人细胞中、至少约25％的人细胞中、至少约30％的人细胞中、至少约35％的人细胞中、至少约40％的人细胞中、至少约45％的人细胞中、至少约50％的人细胞中、至少约55％的人细胞中、至少约60％的人细胞中、至少约65％的人细胞中、至少约70％的人细胞中、至少约75％的人细胞中、至少约80％的人细胞中、至少约85％的人细胞中、至少约90％的人细胞中、至少95％的人细胞中、至少98％的人细胞中、至少99％的人细胞中或多于99％的人细胞中，FGF8或核定位的β-连接素标志物的表达高于brachry FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和/或SOX1标志物的表达。一些实施方案中，细胞培养物或细胞群包含人饲养细胞，计算上述百分比时不考虑细胞培养物或细胞群中的人饲养细胞。
本发明的其它实施方案涉及包含人hESC和人前原条细胞的组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中在细胞培养物或细胞群的细胞中，FGF8mRNA表达的显著上调发生在使培养物中的hESC与诸如活化素A的适当分化因子接触后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、--约23小时、约24小时或晚于约24小时。这些实施方案中，FGF8mRNA表达的显著上调发生在至少约5％的人细胞中、至少约10％的人细胞中、至少约15％的人细胞中、至少约20％的人细胞中、至少约25％的人细胞中、至少约30％的人细胞中、至少约35％的人细胞中、至少约40％的人细胞中、至少约45％的人细胞中、至少约50％的人细胞中、至少约55％的人细胞中、至少约60％的人细胞中、至少约65％的人细胞中、至少约70％的人细胞中、至少约75％的人细胞中、至少约80％的人细胞中、至少约85％的人细胞中、至少约90％的人细胞中、至少95％的人细胞中、至少98％的人细胞中、至少99％的人细胞中或多于99％的人细胞中。一些实施方案中，细胞培养物或细胞群包含人饲养细胞，计算上述百分比时不考虑细胞培养物或细胞群中的人饲养细胞。
本发明的其它实施方案涉及包含人hESC和人前原条细胞的组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中在细胞培养物或细胞群的细胞中，β-连接素多肽的显著细胞核定位(核定位的β-连接素标志物的表达)发生在使培养物中的hESC与诸如活化素A的适当分化因子接触后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约1 2小时约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时或晚于约24小时。这些实施方案中，核定位的β-连接素的表达发生在至少约5％的人细胞中、至少约10％的人细胞中、至少约15％的人细胞中、至少约20％的人细胞中、至少约25％的人细胞中、至少约30％的人细胞中、至少约35％的人细胞中、至少约40％的人细胞中、至少约45％的人细胞中、至少约50％的人细胞中、至少约55％的人细胞中、至少约60％的人细胞中、至少约65％的人细胞中、至少约70％的人细胞中、至少约75％的人细胞中、至少约80％的人细胞中、至少约85％的人细胞中、至少约90％的人细胞中、至少95％的人细胞中、至少98％的人细胞中、至少99％的人细胞中或多于99％的人细胞中。一些实施方案中，细胞培养物或细胞群包含人饲养细胞，计算上述百分比时不考虑细胞培养物或细胞群中的人饲养细胞。
使用本发明的方法可以产生包含基本上不含其它细胞类型的前原条细胞的组合物。本发明的一些实施方案中，通过本发明方法制备的前原条细胞群或细胞培养物基本上不含显著表达brachyury、FGF4、SNAI1、SOX17、FOXA2、SOX7和/或SOX1标志物基因的细胞。
一个实施方案中，基于标志物基因表达的前原条细胞的描述是FGF8高、核定位的β-连接素高、brachyury低、FGF4低、SNAI1低、SOX17低、FOXA2低、SOX7低和SOX1低。
从多能细胞产生中内胚层细胞一些产生中内胚层细胞的方法中，作为起始材料的多能性细胞是干细胞。某些方法中，从胚胎干细胞产生包含中内胚层细胞的细胞培养物和富集的细胞群。优选的衍生中内胚层细胞的方法利用人胚胎干细胞作为产生中内胚层细胞的起始材料。这些多能性细胞可以是起源于桑椹胚、胚胎内细胞团或从胚胎生殖嵴获得的细胞。使用现有技术中已知的方法，人胚胎干细胞可在培养基中保持多能性状态而基本不分化。所述的方法在诸如美国专利第5,453,357、5,670,372、5,690,926、5,843,780、6,200,806及6,251,671号中有所描述，其公开在此整体引入，以供参考。
在产生中内胚层细胞的一些方法中，将hESC维持在滋养层上。在这些方法中，可以使用任何能够使hESC保持在多能性状态的滋养层。一种常用的培养人胚胎干细胞的滋养层为一层小鼠成纤维细胞。最近，人成纤维细胞滋养层也已开发出来用于培养hESC(参见第2002/0072117号美国专利申请，其公开在此整体引入，以供参考)。制备中内胚层细胞的其它方法允许不使用滋养层保持多能hESC。在没有滋养层的条件下保持多能性hESC的方法已在第2003/0175956号美国专利申请中有描述，其公开在此整体引入，以供参考。
本发明使用的人胚胎干细胞可以保持在含有或不含有血清的培养基中。在一些胚胎干细胞保持方法中，使用血清替代品。其它方法中，使用无血清培养技术，例如美国专利申请第2003/0190748号所述的方法，其公开在此整体引入，以供参考。
在培养物中保持多能性状态的干细胞按照常规传代，直到分化为中内胚层细胞。在一些实施方案中，通过向干细胞培养物中加入诸如TGFβ超家族生长因子的分化因子完成向中内胚层细胞的分化，其加入的量足以促进向中内胚层细胞的分化。用于制备中内胚层细胞的TGFβ超家族生长因子选自Nodal/活化素亚组。在一些优选的分化方法中，生长因子选自Nodal、活化素A和活化素B。某些分化方法中，使用生长因子活化素A。
关于从多能性干细胞向中内胚层细胞分化的一些方法，向细胞提供上述生长因子，使其在培养基中的浓度足以促进至少一部分干细胞分化为中内胚层细胞。在一些方法中，上述生长因子在细胞培养物中存在的浓度为至少约5ng/ml、至少约10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约200ng/ml、至少约300ng/ml、至少约400ng/ml、至少约500ng/ml、至少约1000ng/ml、至少约2000ng/ml、至少约3000ng/ml、至少约4000ng/ml、至少约5000ng/ml或大于5000ng/ml。
在使多能性干细胞向中内胚层细胞分化的某些方法中，上述生长因子加入细胞培养物后从细胞培养物中除去。例如，可以在约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约25小时、约26小时、约27小时、约28小时、约29小时、约30小时、约31小时、约32小时、约33小时、约34小时、约35小时、约36小时、约37小时、约38小时、约39小时、约40小时、约41小时、约42小时、约43小时、约44小时、约45小时、约46小时、约47小时、约48小时或约多于48小时之内除去生长因子。
可在含有减量血清或不含血清的培养基中培养中内胚层细胞的培养物。在某些培养条件下，血清的浓度范围为约0％(v/v)至约10％(v/v)。例如，在一些分化方法中，培养基中血清的浓度可以低于约0.05％(v/v)、低于约0.1％(v/v)、低于约0.2％(v/v)、低于约0.3％(v/v)、低于约0.4％(v/v)、低于约0.5％(v/v)、低于约0.6％(v/v)、低于约0.7％(v/v)、低于约0.8％(v/v)、低于约0.9％(v/v)、低于约1％(v/v)、低于约2％(v/v)、低于约3％(v/v)、低于约4％(v/v)、低于约5％(v/v)、低于约6％(v/v)、低于约7％(v/v)、低于约8％(v/v)、低于约9％(v/v)或低于约10％(v/v)。一些方法中，中内胚层细胞在无血清或无血清替代物下生长。在其它方法中，中内胚层细胞在B27存在下生长。在这些方法中，B27添加物的浓度范围为约0.1％(v/v)至约20％(v/v)。
监测多能性细胞向中内胚层细胞的分化可以通过确定中内胚层细胞特征性标志物的时间性表达来监测hESC培养物向中内胚层细胞的进行。一些方法中，某些标志物的表达可通过检测是否存在该标志物来确定。或者，某些标志物的表达可通过测量该标志物在加入分化因子后的一个或多个时间点在细胞培养物或细胞群细胞中存在的水平来确定。在这些方法中，可以定性或定量测定标志物的表达。定量标志物基因产生的标志物表达的一种方法是通过使用Q-PCR。也可以使用本领域已知的其它方法定量标志物基因的表达。例如，可以通过使用对所关注的标志物基因产物特异的抗体来检测标志物基因产物的表达。某些方法中，确定中内胚层细胞的特征性标志物基因的表达以及hESC和其它细胞类型的特征性标志物基因的显著表达的缺乏。其它方法中，测定加入分化因子后的一个或多个时间点时，中内胚层细胞的特征性标志物基因表达的时间性和数量。
如以下实施例进一步所述，中内胚层细胞的标志物为brachyury、FGF4和SNAI1。同样地，用本发明所述方法制备的中内胚层细胞表达brachyury、FGF4和SNAI1标志物基因，因此产生brachyury、FGF4和SNAI1标志物基因产物。一些实施方案中，brachyury、FGF4和SNAI1mRNA在中内胚层细胞中但不在hESC中显著表达。在使hESC与诸如活化素A的适当分化因子接触后24小时，可在分化中的hESC培养物中观察到brachyury、FGF4和SNAI1mRNA的显著上调，直至接近峰值。这时，指示诸如原始内胚层、定形内胚层、中胚层和外胚层的其它细胞类型(参见表1)的某些标志物的表达依然相对较低。一些实施方案中，指示原始内胚层、定形内胚层、中胚层和外胚层的某些标志物在使hESC与分化因子接触后24小时不显著表达。一些实施方案中，brachyury、FGF4和/或SNAI1mRNA的表达在使hESC与分化因子接触后24小时之后开始下降。一些实施方案中，brachyury、FGF4和/或SNAI1mRNA的表达在使hESC与分化因子接触后约30小时、约36小时、约42小时、约48小时或晚于约48小时之后开始下降。
应当理解，可根据分化条件诱导不同水平的brachyury、FGF4和/或SNAI1在中内胚层细胞中的表达。由此，本发明的一些实施方案中，在从hESC开始分化约24小时之后，brachyury、FGF4和/或SNAI1标志物在中内胚层细胞或细胞群中的表达比这些标志物在非中内胚层细胞或细胞群中的表达高至少约2倍至至少约10,000倍。其它实施方案中，在从hESC开始分化约24小时之后，brachyury、FGF4和/或SNAI1标志物在中内胚层细胞或细胞群中的表达比这些标志物在非中内胚层细胞或细胞群中的表达高至少约4倍、高至少约6倍、高至少约8倍、高至少约10倍、高至少约15倍、高至少约20倍、高至少约40倍、高至少约80倍、高至少约100倍、高至少约150倍、高至少约200倍、高至少约500倍、高至少约750倍、高至少约1000倍、高至少约2500倍、高至少约5000倍、高至少约7500倍或高至少约10,000倍。一些实施方案中，在从hESC开始分化约24小时之后，brachyury、FGF4和/或SNAI1标志物在中内胚层细胞或细胞群中的表达无限地高于brachyury、FGF4和/或SNAI1标志物在非中内胚层细胞或细胞群中的表达。
另外，应当-理解，在中内胚层细胞内，brachyury、FGF4和/或SNAI1标志物的表达水平与OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和/或SOX1标志物的表达水平存在差异范围。类似地，在本发明一些实施方案中，brachyury、FGF4和/或SNAI1标志物的表达比OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和/或SOX1标志物的表达高至少约2倍至至少约10,000倍。其它实施方案中，brachyury、FGF4和/或SNAI1标志物的表达比OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和/或SOX1标志物的表达高至少约4倍、至少约6倍、至少约8倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约40倍、至少约80倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约500倍、至少约750倍、至少约1000倍、至少约2500倍、至少约5000倍、至少约7500倍或至少约10,000倍。在一些实施方案中，OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和/或SOX1标志物在中内胚层细胞中不显著表达。
中内胚层细胞的富集、分离和/或纯化关于本发明方法的其它方面，可以富集、分离和/或纯化中内胚层细胞。在一些实施方案中，通过从细胞培养物中分离中内胚层细胞产生富集中内胚层细胞的细胞群。
本发明方法的一些实施方案中，荧光标记中内胚层细胞，然后使用FACS从未标记的细胞中将其分离。这些实施方案中，使用编码绿色荧光蛋白(GFP)的核酸或编码可表达的荧光标志物基因的另一核酸标记中内胚层细胞。例如，在一些实施方案中，向优选为人胚胎干细胞的多能性细胞中引入编码GFP或其生物活性片段的至少一个拷贝的核酸，该编码GFP或其生物活性片段的至少一个拷贝的核酸位于brachyury、FGF4和SNAI1启动子的下游，使得其处于brachyury、FGF4和SNAI1启动子的控制之下。在一些实施方案中，编码brachyury、FGF4或SNAI1的核酸的全部编码区被编码GFP或其生物活性片段的核酸替代。在其它实施方案中，编码GFP或其生物活性片段的核酸与至少部分编码brachyury、FGF4或SNAI1的核酸同框融合，从而产生融合蛋白。这些实施方案中，该融合蛋白保留了与GFP相似的荧光活性。
例如上述多能性细胞的荧光标记的细胞如前所述地分化为中内胚层细胞。因为中内胚层细胞表达荧光标志物基因而非中内胚层细胞不表达，这两类细胞可被分开。在一些实施方案中，使用FACS分选包含荧光标记的中内胚层细胞和未标记的非中内胚层细胞混合物的细胞悬浮培养物。中内胚层细胞被从非中内胚层细胞中分离收集，从而导致这些细胞类型的分离。如果需要的话，分离的细胞组合物可通过更多轮的分选被进一步纯化，该分选使用特异针对中内胚层细胞的相同或不同标志物。
除上述的方法之外，还可以通过细胞分离的其它技术分离中内胚层细胞。另外，还可以通过特定生长条件下连续次培养的方法富集或分离中内胚层细胞，该特定生长条件促进中内胚层细胞的选择性存活或选择性生长。
应该理解，上述的富集、分离和纯化方法可用于任何分化阶段的培养物。
使用本文所述方法，富集的、分离的和/或纯化的中内胚层细胞群和/或组织可体外自hESC培养物或细胞群制备，该hESC培养物或细胞群经历约18小时至约48小时的分化。一些实施方案中，所述细胞进行随机分化。但在优选的实施方案中，所述细胞被定向为主要分化为中内胚层细胞。一些优选的富集、分离和/或纯化方法涉及在体外产生始于人胚胎干细胞的中内胚层细胞。
使用本文所述方法，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，细胞群或细胞培养物中中内胚层细胞的含量可被富集至少约2倍至约1000倍。在一些实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，中内胚层细胞可被富集至少约5倍至约500倍。在其它实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，中内胚层细胞可被富集至少约10倍至约200倍。在其它实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，中内胚层细胞可被富集至少约20倍至约100倍。在其它实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，中内胚层细胞可被富集至少约40倍至约80倍。在某些实施方案中，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，中内胚层细胞可被富集至少约2倍至约20倍。
包含中内胚层细胞的组合物上述方法产生的细胞组合物包括包含中内胚层细胞的细胞培养物和富集中内胚层细胞的细胞群。例如，能够产生包含中内胚层细胞的细胞培养物，其中培养物中至少约5-90％的细胞是中内胚层细胞。因为可通过调整某些参数(这些参数包括但不限于，细胞生长条件、生长因子浓度和培养步骤的时间安排)来调整分化方法的效率，本文所述的分化方法可导致约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约6％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或超过约95％的多能性细胞向中内胚层细胞的转化。在使用分离中内胚层细胞的方法中，可回收基本上纯的中内胚层细胞群。
本发明的一些实施方案涉及包含诸如干细胞的多能性细胞和中内胚层细胞的组合物，例如细胞群和细胞培养物。例如，用本发明的方法可以制备包含hESC和中内胚层细胞的混合物的组合物。一些实施方案中，产生包含至少约5个中内胚层细胞对应约每95个多能性细胞的组合物。其它实施方案中，产生包含至少约95个中内胚层细胞对应约每5个多能性细胞的组合物。此外，预期可以得到包含中内胚层细胞和多能细胞其他比例的组合物。例如，预期可以得到包含至少约1个中内胚层细胞对应约每1,000,000个多能性细胞、至少约1个中内胚层细胞对应约每100,000个多能性细胞、至少约1个中内胚层细胞对应约每10,000个多能性细胞、至少约1个中内胚层细胞对应约每1000个多能性细胞、至少约1个中内胚层细胞对应约每500个多能细胞、至少约1个中内胚层细胞对应约每100个多能细胞、至少约1个中内胚层细胞对应约每10个多能细胞、至少约1个中内胚层细胞对应约每5个多能细胞、至少约1个中内胚层细胞对应约每2个多能细胞、至少约2个中内胚层细胞对应约每1个多能细胞、至少约5个中内胚层细胞对应约每1个多能细胞、至少约10个中内胚层细胞对应约每1个多能细胞、至少约20个中内胚层细胞对应约每1个多能细胞、至少约50个中内胚层细胞对应约每1个多能细胞、至少约100个中内胚层细胞对应约每1个多能细胞、至少约1000个中内胚层细胞对应约每1个多能细胞、至少约10,000个中内胚层细胞对应约每1个多能细胞、至少约100,000个中内胚层细胞对应约每1个多能细胞、以及至少约1,000,000个中内胚层细胞对应约每1个多能细胞的组合物。一些实施方案中，该多能性细胞是人多能性干细胞。某些实施方案中，该干细胞衍生自桑椹胚、胚胎内细胞团或胚胎生殖嵴。某些其他实施方案中，该多能性细胞衍生自发育已经越过胚胎期的多细胞结构的性腺组织或生殖组织。
本发明的一些实施方案涉及包含从至少约5％的中内胚层细胞到至少约99％的中内胚层细胞的细胞培养物或细胞群。一些实施方案中，该细胞培养物或细胞群包含哺乳动物细胞。优选实施方案中，该细胞培养物或细胞群包含人细胞。例如，某些特定实施方案涉及含有人细胞的细胞培养物，其中从至少约5％到至少约99％的人细胞是中内胚层细胞。其它实施方案涉及含有人细胞的细胞培养物，其中至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或多于99％的人类细胞是中内胚层细胞。一些实施方案中，细胞培养物或细胞群包含人饲养细胞，计算上述百分比时不考虑细胞培养物或细胞群中的人饲养细胞。
本发明的其它实施方案涉及包含诸如人中内胚层细胞的人细胞的组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中至少约5％的人细胞中brachyury、FGF4和/或SNAI1标志物的表达高于OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和/或SOX1标志物的表达。其他实施方案中，至少约10％的人细胞中、至少约15％的人细胞中、至少约20％的人细胞中、至少约25％的人细胞中、至少约30％的人细胞中、至少约35％的人细胞中、至少约40％的人细胞中、至少约45％的人细胞中、至少约50％的人细胞中、至少约55％的人细胞中、至少约60％的人细胞中、至少约65％的人细胞中、至少约70％的人细胞中、至少约75％的人细胞中、至少约80％的人细胞中、至少约85％的人细胞中、至少约90％的人细胞中、至少95％的人细胞中、至少98％的人细胞中、至少99％的人细胞中或多于99％的人细胞中，brachyury、FGF4和/或SNAI1标志物的表达高于OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和/或SOX1标志物的表达。一些实施方案中，细胞培养物或细胞群包含人饲养细胞，计算上述百分比时不考虑细胞培养物或细胞群中的人饲养细胞。
本发明的其它实施方案涉及包含人hESC和人中内胚层细胞的组合物，例如细胞培养物或细胞群，其中在细胞培养物或细胞群的细胞中，brachyury、FGF4和/或SNAI1mRNA表达的显著上调发生在使培养物中的hESC与诸如活化素A的适当分化因子接触后约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约25小时、约26小时、约27小时、约28小时、约29小时、约30小时、约31小时、约32小时、约33小时、约34小时、约35小时、约36小时、约37小时、约38小时、约39小时、约40小时、约41小时、约42小时、约43小时、约44小时、约45小时、约46小时、约47小时、约48小时或晚于约48小时。这些实施方案中，brachyury、FGF4和/或SNAI1mRNA表达的显著上调发生在至少约5％的人细胞中、至少约10％的人细胞中、至少约15％的人细胞中、至少约20％的人细胞中、至少约25％的人细胞中、至少约30％的人细胞中、至少约35％的人细胞中、至少约40％的人细胞中、至少约45％的人细胞中、至少约50％的人细胞中、至少约55％的人细胞中、至少约60％的人细胞中、至少约65％的人细胞中、至少约70％的人细胞中、至少约75％的人细胞中、至少约80％的人细胞中、至少约85％的人细胞中、至少约90％的人细胞中、至少95％的人细胞中、至少98％的人细胞中、至少99％的人细胞中或多于99％的人细胞中。一些实施方案中，细胞培养物或细胞群包含人饲养细胞，计算上述百分比时不考虑细胞培养物或细胞群中的人饲养细胞。
使用本发明的方法，可以制备包含基本上不含其它细胞类型的中内胚层细胞的组合物。本发明的一些实施方案中，通过本发明方法制备的中内胚层细胞群或细胞培养物基本上不含显著表达OCT4、SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX7和/或SOX1标志物基因的细胞。
一个实施方案中，基于标志物基因表达的中内胚层细胞的描述是brachyury高、FGF4高、SNAI1高、SOX17低、CXCR4低、FOXA2低、SOX7低和SOX1低。
定形内胚层细胞的产生下文简述分化多能性细胞产生包含定形内胚层的细胞培养物和富集的细胞群的方法，在于2004年12月23日提交的题为DEFINITIVEENDODERM(定形内胚层)的第11/021,618号美国专利中详细描述了该方法，其公开内容在此整体并入以供参考。一些制备定形内胚层细胞的方法中，作为起始材料的多能性细胞是干细胞。某些方法中，从胚胎干细胞产生包含定形内胚层细胞的细胞培养物和富集的细胞群。优选的衍生定形内胚层细胞的方法利用人胚胎干细胞作为产生定形内胚层的起始材料。这些多能性细胞可以是起源于桑椹胚、胚胎内细胞团或从胚胎生殖嵴获得的细胞。使用现有技术中已知的方法，人胚胎干细胞可在培养基中保持多能性状态而基本不分化。所述的方法在诸如美国专利第5,453,357、5,670,372、5,690,926、5,843,780、6,200,806及6,251,671号中有所描述，其公开在此整体引入，以供参考。
在产生定形内胚层细胞的一些方法中，将hESC保持在滋养层上。在这些方法中，可以使用任何能够使hESC保持在多能性状态的滋养层。一种常用的培养人胚胎干细胞的滋养层为一层小鼠成纤维细胞。最近，人成纤维细胞滋养层也已开发出来用于培养hESC(参见第2002/0072117号美国专利申请，其公开在此整体引入，以供参考)。制备定形内胚层细胞的其它方法允许不使用滋养层保持多能性hESC。在没有滋养层的条件下保持多能性hESC的方法已在第2003/0175956号美国专利申请中有描述，其公开在此整体引入，以供参考。
本发明使用的人胚胎干细胞可以保持在含有或不含有血清的培养基中。在一些胚胎干细胞保持方法中，使用血清替代品。其它方法中，使用无血清培养技术，例如美国专利申请第2003/0190748号所述的方法，其公开在此整体引入，以供参考。
在培养物中保持多能性状态的干细胞按照常规传代，直到分化为定形内胚层。在一些方法中，通过向干细胞培养物中加入诸如TGFβ超家族生长因子的分化因子完成向定形内胚层的分化，其加入的量足以促进向定形内胚层细胞的分化。可用于制备定形内胚层的TGFβ超家族生长因子选自Nodal/活化素亚组。在一些优选的分化方法中，生长因子选自Nodal、活化素A和活化素B。某些分化方法中，可以使用任何上述生长因子的组合。
关于从多能性干细胞向定形内胚层细胞分化的一些方法，向细胞提供上述生长因子，使其在培养基中的浓度足以促进至少一部分干细胞分化为定形内胚层细胞。在一些方法中，上述生长因子在细胞培养物中存在的浓度为至少约5ng/ml、至少约10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约200ng/ml、至少约300ng/ml、至少约400ng/ml、至少约500ng/ml、至少约1000ng/ml、至少约2000ng/ml、至少约3000ng/ml、至少约4000ng/ml、至少约5000ng/ml或大于约5000ng/ml。
在使多能性干细胞向定形内胚层细胞分化的某些方法中，上述生长因子加入细胞培养物后从细胞培养物中除去。例如，可以在加入后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天除去生长因子。在优选的方法中，在加入后约4天除去生长因子。
可在含有减量血清或不含血清的培养基中培养定形内胚层细胞的培养物。在某些培养条件下，血清的浓度范围为约0.05％(v/v)至约20％(v/v)。例如，在一些分化方法中，培养基中血清的浓度可以低于约0.05％(v/v)、低于约0.1％(v/v)、低于约0.2％(v/v)、低于约0.3％(v/v)、低于约0.4％(v/v)、低于约0.5％(v/v)、低于约0.6％(v/v)、低于约0.7％(v/v)、低于约0.8％(v/v)、低于约0.9％(v/v)、低于约1％(v/v)、低于约2％(v/v)、低于约3％(v/v)、低于约4％(v/v)、低于约5％(v/v)、低于约6％(v/v)、低于约7％(v/v)、低于约8％(v/v)、低于约9％(v/v)、低于约10％(v/v)、低于约15％(v/v)或低于约20％(v/v)。一些方法中，定形内胚层细胞在无血清或无血清替代物下生长。一些实施方案中，定形内胚层细胞在有血清替代物下生长。在其它方法中，定形内胚层细胞在B27存在下生长。在这些方法中，B27添加物的浓度范围为约0.1％(v/v)至约20％(v/v)。
监测多能性细胞向定形内胚层细胞的分化可以通过测定定形内胚层特征性标志物的表达来监测hESC培养物向定形内胚层的进行。一些方法中，某些标志物的表达可通过检测是否存在该标志物来确定。或者，某些标志物的表达可通过测量该标志物在细胞培养物或细胞群细胞中存在的水平来确定。在这些方法中，可以定性或定量测定标志物的表达。定量标志物基因产生的标志物表达的一种方法是通过使用Q-PCR。也可以使用本领域已知的其它方法定量标志物基因的表达。例如，可以通过使用对所关注的标志物基因产物特异的抗体来检测标志物基因产物的表达。某些方法中，确定定形内胚层的特征性标志物基因的表达以及hESC和其它细胞类型的特征性标志物基因的显著表达的缺乏。
如以下实施例进一步所述，定形内胚层的可靠标志物为SOX17基因。这样，用本发明所述方法产生的定形内胚层细胞表达SOX17标志物基因，因此产生SOX17基因产物。定形内胚层的其它标志物为MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1。因为定形内胚层细胞表达SOX17标志物基因的水平高于表达SOX7标志物基因的水平，所以在一些方法中，既监测SOX17又监测SOX7的表达，SOX7是原始内胚层和内脏内胚层的特征性标志物基因。其它方法中，既监测SOX17标志物基因又监测OCT4标志物基因的表达，OCT4是hESC的特征性标志物基因。另外，因为定形内胚层细胞表达SOX17标志物基因的水平高于表达AFP、SPARC或血栓调节蛋白(TM)标志物基因的水平，所以还可以监测这些基因的表达。
定形内胚层的另一标志物是CXCR4基因。CXCR4基因编码配体为趋化吸引剂SDF-1的细胞表面趋化因子受体。成体中具有CXCR4受体的细胞的主要作用被认为有造血细胞向骨髓的迁移、淋巴细胞传输以及各种B细胞和巨噬细胞血细胞谱系的分化[Kim，C.，and Broxmeyer，H.J.Leukocyte Biol.65，6-15(1999)]。CXCR4受体还作为HIV-1进入T细胞的共同受体[Feng，Y.，et al.Science，272，872-877(1996)]。在[McGrath，K.E.et al.Dev.Biology 213，442-456(1999)]进行的一系列广泛研究中，描述了小鼠中趋化因子受体CXCR4及其独特的配体SDF-1[Kim，C.，andBroxmeyer，H.J.Leukocyte Biol.65，6-15(1999)]在早期发育和成体生活期间的表达。当证实转基因小鼠中，CXCR4和SDF-1的任意一个被破坏[Nagasawa et al.Nature，382，635-638(1996)；Ma，Q.，et al Immunity，10，463-471(1999)]都导致晚期胚胎死亡时，发育中CXCR4/SDF-1的相互作用变得明显。McGrath等人使用RNase保护和原位杂交方法证实CXCR4是在早期原肠胚(E7.5)期间检测到的最大量的趋化因子受体信使RNA。在原肠胚中，CXCR4/SDF-1信号看来主要涉及诱导原条胚层细胞的迁移，并且其在此时存在的定形内胚层、中胚层和胚外中胚层表达。在E7.2-7.8小鼠胚胎中，CXCR4和甲胎蛋白互相排斥，表明其在内脏内胚层缺乏表达[McGrath，K.E.et al.Dev.Biology213，442-456(1999)]。
因为通过分化多能性细胞制备的定形内胚层细胞表达CXCR4标志物基因，所以为了追踪定形内胚层细胞的产生可以监测CXCR4的表达。另外，用本发明方法制备的定形内胚层细胞表达定形内胚层的其它标志物，包括但不限于SOX17、MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1。因为定形内胚层细胞表达CXCR4标志物基因的水平高于表达SOX7标志物基因的水平，所以可以既监测CXCR4又监测SOX7的表达。其它方法中，监测CXCR4标志物基因和OCT4标志物基因的表达。另外，因为定形内胚层细胞表达CXCR4标志物基因的水平高于表达AFP、SPARC或血栓调节蛋白(TM)标志物基因的水平，所以还可以监测这些基因的表达。
应当理解，CXCR4在内胚层细胞中的表达不排除SOX17的表达。由此，用本发明方法产生的定形内胚层细胞将显著表达SOX17和CXCR4，但不会显著表达AFP、TM、SPARC或PDX1。
定形内胚层细胞的富集、分离和/或纯化可以使用对该细胞特异的亲和标签富集、分离和/或纯化通过任何上述方法制备的定形内胚层细胞。对定形内胚层细胞特异的亲和标签的实例是对诸如多肽的标志物分子特异的抗体、配体或其它结合剂，该标志物分子存在于定形内胚层细胞的细胞表面，但不在可在通过本发明方法产生的细胞培养物中找到的其它细胞类型上显著存在。在一些方法中，结合CXCR4的抗体被用做富集、分离和/或纯化定形内胚层细胞的亲和标签。在其它方法中，趋化因子SDF-1或基于SDF-1的其它分子也可以被用做亲和标签。这样的分子包括但不限于SDF-1片段、SDF-1融和物或SDF-1模拟物。
本领域已知制备抗体以及使用它们分离细胞的方法，这些方法可用于本文所述的抗体和定形内胚层细胞。一种方法中，结合CXCR4的抗体被连接到磁珠上，然后使其在细胞培养物中与定形内胚层细胞结合，该细胞培养物已经过酶处理以减少细胞间及与基质间的粘附。然后将该细胞/抗体/珠子复合体暴露于用于从未结合细胞中分离珠子结合的定形内胚层细胞的活动磁场中。一旦定形内胚层细胞与培养物的其它细胞物理分离，就破坏所述抗体结合，并且将定形内胚层细胞再次接种在适当的组织培养培养基中。
也可以使用其它方法获得富集的、分离的或纯化的定形内胚层细胞培养物或群。例如，在一些实施方案中，CXCR4抗体与含有定形内胚层的细胞培养物一起孵育，该细胞培养物已经过酶处理以减少细胞间及与基质间的粘附。然后清洗、离心并且再次悬浮这些细胞。然后该细胞悬浮物与诸如能够结合所述初级抗体的FITC-偶联抗体等二级抗体一起孵育。然后清洗、离心并且在缓冲液中再次悬浮这些细胞。然后使用荧光激活细胞分选仪(FACS)分析和分选该细胞悬浮物。CXCR4-阳性细胞被从CXCR4-阴性细胞中分离收集，因此产生该细胞类型的分离。如果需要的话，分离的细胞组合物可通过更多轮的分选被进一步纯化，该分选通过其它基于亲和的方法或者使用特异针对定形内胚层细胞的相同或不同标志物。
在其它方法中，可以使用配体或与CXCR4结合的其它分子富集、分离和/或纯化定形内胚层细胞。在一些实施方案中，该分子是SDF-1或其片段、融合物或模拟物。
优选的方法中，在诱导干细胞培养物向定形内胚层谱系分化后，从其它非定形内胚层细胞富集、分离和/或纯化定形内胚层细胞。应当理解，上述富集、分离和纯化方法可用于处于分化任何阶段的培养物。
除了刚描述过的方法外，也可以使用其它细胞分离技术分离定形内胚层细胞。另外，还可以通过特定生长条件下连续次培养的方法富集或分离定形内胚层细胞，该特定生长条件促进定形内胚层细胞的选择性存活或选择性生长。
使用本发明的方法，富集的、分离的和/或纯化的定形内胚层细胞群和/或组织可在体外自多能性细胞培养物或细胞群产生，例如已经经历至少一些分化的干细胞培养物或细胞群。在一些方法中，所述细胞进行随机分化。但在优选的方法中，所述细胞被定向主要分化为定形内胚层细胞。一些优选的富集、分离和/或纯化方法涉及在体外产生始于人胚胎干细胞的定形内胚层细胞。使用本发明的方法，与未处理的细胞群或细胞培养物相比，细胞群或细胞培养物中定形内胚层细胞的含量可被富集至少约2倍至约1000倍。
包含定形内胚层细胞的组合物上述方法产生的细胞组合物包括包含定形内胚层细胞的细胞培养物和富集定形内胚层细胞的细胞群。例如，可以产生包含定形内胚层细胞的细胞培养物，其中该细胞培养物或细胞群中至少约50-90％的细胞是定形内胚层细胞。因为可通过调整某些参数(这些参数包括但不限于，细胞生长条件、生长因子浓度和培养步骤的时间安排)来调整分化方法的效率，本文所述的分化方法可导致约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或超过约99％的多能性细胞向定形内胚层细胞转化。在使用分离定形内胚层细胞的方法中，例如通过使用与CXCR4受体结合的亲和试剂，可回收基本上纯的定形内胚层细胞群。一些实施方案中，细胞培养物或细胞群包含人饲养细胞，计算上述百分比时不考虑细胞培养物或细胞群中的人饲养细胞。
鉴定能够促进前原条和/或中内胚层分化的因子本发明的某些筛选方法涉及鉴定能够促进前原条和/或中内胚层细胞分化的至少一种分化因子的方法。这些方法的一些实施方案中，获得包含诸如人前原条和/或中内胚层细胞的前原条和/或中内胚层细胞的细胞群。然后向该细胞群提供候选分化因子。在第一时间点，其在提供候选分化因子之前或大约同时，确定标志物的表达。或者，可以在提供候选因子之后确定该标志物的表达。在第二时间点，其在第一时间点之后并且在向所述细胞群提供候选分化因子之后，再次确定相同标志物的表达。通过比较所述标志物在第一时间点的表达和所述标志物在第二时间点的表达，确定所述候选分化因子是否能够促进定形内胚层细胞的分化。如果所述标志物在第二时间点的表达比所述标志物在第一时间点的表达增加或减少，则所述候选分化因子能够促进定形内胚层细胞的分化。
本发明筛选方法的一些实施方案使用包含人前原条和/或中内胚层细胞的细胞群或细胞培养物。例如，该细胞群可以是基本上纯的人前原条和/或中内胚层细胞群。或者，该细胞群可以是富集的人前原条和/或中内胚层细胞群，其中该细胞群中至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或多于至少约99％的人细胞是人前原条和/或中内胚层细胞。本发明的其它实施方案中，所述细胞群包含人细胞，其中至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或多于至少约85％的人细胞是人前原条和/或中内胚层细胞。其它实施方案中，所述细胞群包含非人细胞，例如非人饲养细胞。其它实施方案中，所述细胞群包含人饲养细胞。这些实施方案中，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或多于至少约95％的除所述饲养细胞外的人细胞是人前原条和/或中内胚层细胞。
本发明筛选方法的一些实施方案中，使所述细胞群接触候选(测试)分化因子，或者以其它方式向所述细胞群提供候选(测试)分化因子。该候选分化因子可以包括有可能促进人前原条和/或中内胚层细胞分化的任何分子。本发明的一些实施方案中，所述候选分化因子包括已知是一种或多种细胞类型的分化因子的分子。其它实施方案中，所述候选分化因子包括未知能够促进细胞分化的分子。在优选实施方案中，所述候选分化因子包括未知能够促进人前原条和/或中内胚层细胞分化的分子。
本发明筛选方法的一些实施方案中，所述候选分化因子包括小分子。在优选实施方案中，小分子是分子量约10,000amu或更小的分子。在一些实施方案中，小分子是类视黄醇，例如视黄酸。
本发明的其它实施方案中，候选分化因子包括多肽。该多肽可以是包括但不限于糖蛋白、脂蛋白、细胞外基质蛋白、细胞因子、趋化因子、肽类激素、白介素或生长因子的任何多肽。优选的多肽包括生长因子。一些优选实施方案中，候选分化因子包括一种或多种选自FGF10、FGF4、FGF2和Wnt3B的生长因子。
本文所述筛选方法的一些实施方案中，候选分化因子包括一种或多种选自双调蛋白(amphiregulin)、B-淋巴细胞刺激因子、IL-16、胸腺生成素、TRAIL/Apo-2、前B细胞集落增强因子、内皮分化相关因子1(EDF1)、内皮单核细胞活化多肽II、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、自然杀伤细胞增强因子(NKEFA)、骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白8(成骨蛋白2)、骨形态发生蛋白6、骨形态发生蛋白7、结缔组织生长因子(CTGF)、CGI-149蛋白(神经内分泌分化因子)、细胞因子A3(巨噬细胞炎性蛋白1-α)、神经胶母细胞分化相关蛋白(GBDR1)、肝癌衍生生长因子、神经调节肽U-25前体、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、T细胞特异RANTES前体、胸腺树突状细胞衍生因子1、运铁蛋白、白介素-1(IL1)、白介素-2(IL2)、白介素-3(IL3)、白介素-4(IL4)、白介素-5(IL5)、白介素-6(IL6)、白介素-7(IL7)、白介素-8(IL8)、白介素-9(IL9)、白介素-10(IL10)、白介素-11(IL11)、白介素-12(IL12)、白介素-13(IL13)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、红细胞生成素、血小板生成素、维生素D3、表皮生长因子(EGF)、脑衍生神经营养因子、白血病抑制因子、甲状腺激素、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、aFGF、FGF-4、FGF-6、角质形成细胞生长因子(KGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板衍生生长因子BB、β神经生长因子、活化素A、转化生长因子β1(TGF-β1)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、爆裂刺激活性物(BPA)、红细胞系刺激活性物(EPA)、PGE2、胰岛素生长因子(IGF-1)、IGF-II、神经营养蛋白生长因子(NGF)、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白4/5、睫状神经营养因子、胶质源性连接蛋白(Glial-derived nexin)、地塞米松(Dexamethasone)、β-巯基乙醇、视黄酸、叔丁对甲氧酚、5-氮杂胞苷、两性霉素B、抗坏血酸、抗坏血酸盐、异丁基黄嘌呤、吲哚美辛、β-甘油磷酸盐、烟酰胺、DMSO、噻唑烷二酮、TWS119、氧化毒素(oxytoxin)、血管升压素、促黑素细胞激素、促皮质激素、促脂解素、促甲状腺素、生长激素、促乳素、黄体生成素、人绒毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促肾上腺皮质激素释放因子、促性腺激素释放因子、促乳素释放因子、促乳素抑制因子、生长激素释放因子、促生长素抑制素、促甲状腺素释放因子、降钙素基因相关肽、甲状旁腺激素、胰高血糖素样肽1、葡萄糖依赖性促胰岛多肽、胃泌素、肠促胰液素、缩胆囊素、促胃动素、血管活性肠肽、P物质、胰多肽、酪酪肽、酪神经肽、胰岛素、胰高血糖素、胎盘促乳素、松弛素、血管紧张素II、钙三醇、心房钠尿肽、褪黑激素、甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、降钙素、雌二醇、雌酮、孕酮、睾酮、皮质醇、皮质酮、醛固酮、肾上腺素、去甲肾上腺素、雄甾烯(androstiene)、钙三醇、胶原蛋白、地塞米松、β-巯基乙醇、视黄酸、叔丁对甲氧酚、5-氮杂胞苷、两性霉素B、抗坏血酸、抗坏血酸盐、异丁基黄嘌呤、吲哚美辛、β-甘油磷酸盐、烟酰胺、DMSO、噻唑烷二酮和TWS119的生长因子。
本发明筛选方法的一些实施方案中，以一种或多种浓度向细胞群提供候选分化因子。一些实施方案中，向细胞群提供候选分化因子使围绕细胞的培养基中候选分化因子的浓度范围为从约0.1ng/ml到约10mg/ml。一些实施方案中，围绕细胞的培养基中候选分化因子的浓度范围为从约1ng/ml到约1mg/ml。其它实施方案中，围绕细胞的培养基中候选分化因子的浓度范围为从约10ng/ml到约100μg/ml。其它实施方案中，围绕细胞的培养基中候选分化因子的浓度范围为从约100ng/ml到约10μg/ml。优选实施方案中，围绕细胞的培养基中候选分化因子的浓度为约5ng/ml、约25ng/ml、约50ng/ml、约75ng/ml、约100ng/ml、约125ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约225ng/ml、约250ng/ml、约275ng/ml、约300ng/ml、约325ng/ml、约350ng/ml、约375ng/ml、约400ng/ml、约425ng/ml、约450ng/ml、约475ng/ml、约500ng/ml、约525ng/ml、约550ng/ml、约575ng/ml、约600ng/ml、约625ng/ml、约650ng/ml、约675ng/ml、约700ng/ml、约725ng/ml、约750ng/ml、约775ng/ml、约800ng/ml、约825ng/ml、约850ng/ml、约875ng/ml、约900ng/ml、约925ng/ml、约950ng/ml、约975ng/ml、约1μg/ml、约2μg/ml、约3μg/ml、约4μg/ml、约5μg/ml、约6μg/ml、约7μg/ml、约8μg/ml、约9μg/ml、约10μg/ml、约11μg/ml、约12μg/ml、约13μg/ml、约14μg/ml、约15μg/ml、约16μg/ml、约17μg/ml、约18μg/ml、约19μg/ml、约20μg/ml、约25μg/ml、约50μg/ml、约75μg/ml、约100μg/ml、约125μg/ml、约150μg/ml、约175μg/ml、约200μg/ml、约250μg/ml、约300μg/ml、约350μg/ml、约400μg/ml、约450μg/ml、约500μg/ml、约550μg/ml、约600μg/ml、约650μg/ml、约700μg/ml、约750μg/ml、约800μg/ml、约850μg/ml、约900μg/ml、约950μg/ml、约1000μg/ml或大于1000μg/ml。
本发明筛选方法的某些实施方案中，向细胞群提供除前肠分化因子之外的包括任何分子的候选分化因子。例如，一些实施方案中，向细胞群提供除类视黄醇、生长因子TGFβ超家族的成员、FGF10和FGF4之外的包括任何分子的候选分化因子。一些实施方案中，向细胞群提供除视黄酸之外的包括任何分子的候选分化因子。
一些实施方案中，本文所述筛选方法的步骤包括确定至少一种标志物在第一时间点和第二时间点的表达。一些实施方案中，该第一时间点可以在向细胞群提供候选分化因子之前或与之大致同时。或者，一些实施方案中，该第一时间点在向细胞群提供候选分化因子之后。一些实施方案中，确定多种标志物在第一时间点的表达。
除确定至少一种标志物在第一时间点的表达之外，本文所述筛选方法的一些实施方案考虑确定至少一种标志物在第二时间点的表达，该第二时间点在第一时间点之后，也在向细胞群提供候选分化因子之后。这些实施方案中，确定相同标志物在第一时间点和第二时间点的表达。一些实施方案中，确定多种标志物在第一时间点和第二时间点的表达。这些实施方案中，确定相同的多种标志物在第一时间点和第二时间点的表达。一些实施方案中，在多个时间点确定标志物的表达，其中每一个都在第一时间点之后，并且每一个都在向细胞群提供候选分化因子之后。某些实施方案中，用Q-PCR确定标志物的表达。其它实施方案中，用免疫细胞化学确定标志物的表达。
本文所述筛选方法的某些实施方案中，在第一时间点和第二时间点确定其表达的标志物是与人前原条细胞和/或中内胚层细胞分化为特定细胞相关的标志物，该特定细胞为组成衍生自肠管的组织和/或器官的细胞的前体。一些实施方案中，衍生自肠管的组织和/或器官包含终末分化的细胞。一些实施方案中，标志物指示胰细胞或胰前体细胞。优选实施方案中，标志物是胰-十二指肠同源框因子-1(PDX1)。其它实施方案中，标志物是同源框A13(HOXA13)或同源框C6(HOXC6)。另外，其它实施方案中，标志物指示肝细胞或肝前体细胞。某些优选实施方案中，标志物是白蛋白、肝细胞特异性抗原(HSA)或普洛斯彼罗(prospero)-相关同源框1(PROX1)。其它实施方案中，标志物指示肺或肺前体细胞。一些优选实施方案中，标志物是甲状腺转录因子1(TITF1)。其它实施方案中，标志物指示肠或肠前体细胞。其它优选实施方案中，标志物是绒毛蛋白(villin)或尾型同源框转录因子2(CDX2)。其它实施方案中，标志物指示胃或胃前体细胞。其它优选实施方案中，标志物是VACM1、VMF或CXCR4。其它实施方案中，标志物指示甲状腺或甲状腺前体细胞。这些实施方案中，标志物是TITF1。其它实施方案中，标志物指示胸腺或胸腺前体细胞。
本发明筛选方法的一些实施方案中，使向细胞群提供候选趋化因子和确定标记物在第二时间点的表达之间经过足够长的时间。该向细胞群提供候选趋化因子和确定标记物在第二时间点的表达之间的足够的时间间隔可以从最短约1小时到最长约10天。一些实施方案中，向细胞群提供候选趋化因子后多次确定至少一种标志物的表达。一些实施方案中，该足够的时间间隔是最短约1小时、最短约6小时、最短约12小时、最短约18小时、最短约24小时、最短约30小时、最短约36小时、最短约42小时、最短约48小时、最短约54小时、最短约60小时、最短约66小时、最短约72小时、最短约78小时、最短约84小时、最短约90小时、最短约96小时、最短约102小时、最短约108小时、最短约114小时、最短约120小时、最短约126小时、最短约132小时、最短约138小时、最短约144小时、最短约150小时、最短约156小时、最短约162小时、最短约168小时、最短约174小时、最短约180小时、最短约186小时、最短约192小时、最短约198小时、最短约204小时、最短约210小时、最短约216小时、最短约222小时、最短约228小时、最短约234小时或最短约240小时。
本文所述方法的一些实施方案中，进一步确定标志物在第二时间点的表达与该标志物在第一时间点的表达相比是否增加或减少。所述至少一种标志物表达的增加或减少表明候选分化因子能够促进定形内胚层细胞的分化。类似地，如果确定了多种标志物表达，进一步确定该多种标志物在第二时间点的表达与该多种标志物在第一时间点的表达相比是否增加或减少。可以通过测量或评估细胞群中标志物在第一和第二时间点的数量、水平或活性来确定标志物表达的增加或减少。这种确定可以是与其它标志物(如看家基因的表达)相比较的，或绝对的。某些实施方案中，其中标志物在第二时间点的表达比其在第一时间点的表达增加了，增加的量为至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍或多于至少约100倍。一些实施方案中，增加的量为少于2倍。标志物在第二时间点的表达比其在第一时间点的表达减少的实施方案中，减少的量为至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍或多于至少约100倍。一些实施方案中，减少的量为少于2倍。
本文所述筛选方法的一些实施方案中，向细胞群提供候选趋化因子之后，人前原条和/或中内胚层细胞分化为一种或多种定形内胚层谱系的细胞类型。一些实施方案中，向细胞群提供候选趋化因子之后，人前原条和/或中内胚层细胞分化为衍生自肠管的细胞。这些细胞包括但不限于，胰腺、肝、肺、胃、肠、甲状腺、胸腺、咽、胆囊和膀胱的细胞和这些细胞的前体。此外，这些细胞可以进一步发育为更高级的结构如组织和/或器官。
本发明的筛选方法的其它实施方案中，向所述细胞群提供候选分化因子之后，所述人前原条和/或中内胚层细胞分化为中胚层谱系的一种或多种细胞类型。一些实施方案中，向所述细胞群提供候选分化因子之后，所述人前原条和/或中内胚层细胞分化为包括但不限于血细胞、心血管系统的细胞、骨骼组织及其它结构和结缔组织以及每一前述细胞类型的前体的细胞。或者，这些细胞可以进一步发育为诸如组织和/或器官的更高级结构。
增加FGF8基因产物表达的方法本发明方法的一些实施方案涉及在体外增加FGF8基因产物在人胚胎干细胞中的表达的方法。此类方法包括在含有少于约2％(v/v)血清的培养基中获得所述hESC的步骤。例如，该培养基可以含有浓度为约0％(v/v)、约0.05％(v/v)、约0.1％(v/v)、约0.2％(v/v)、约0.3％(v/v)、约0.4％(v/v)、约0.5％(v/v)、约0.6％(v/v)、约0.7％(v/v)、约0.8％(v/v)、约0.9％(v/v)、约1％(v/v)、约1.1％(v/v)、约1.2％(v/v)、约1.3％(v/v)、约1.4％(v/v)、约1.5％(v/v)、约1.6％(v/v)、约1.7％(v/v)、约1.8％(v/v)、约1.9％(v/v)的血清。一些实施方案中，所述培养基不包含血清替代物。让hESC与足以增加FGF8基因产物的表达的量的分化因子接触。一些实施方案中，所述分化因子是至少一种TGFβ超家族的生长因子。在优选实施方案中，所述TGFβ超家族的生长因子是活化素A。用于接触hESC的分化因子的浓度范围从约1ng/ml至约1mg/ml。例如，分化因子可以以1ng/ml、约5ng/ml、约25ng/ml、约50ng/ml、约75ng/ml、约100ng/ml、约125ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约225ng/ml、约250ng/ml、约275ng/ml、约300ng/ml、约325ng/ml、约350ng/ml、约375ng/ml、约400ng/ml、约425ng/ml、约450ng/ml、约475ng/ml、约500ng/ml、约525ng/ml、约550ng/ml、约575ng/ml、约600ng/ml、约625ng/ml、约650ng/ml、约675ng/ml、约700ng/ml、约725ng/ml、约750ng/ml、约775ng/ml、约800ng/ml、约825ng/ml、约850ng/ml、约875ng/ml、约900ng/ml、约925ng/ml、约950ng/ml、约975ng/ml、约1μg/ml、约2μg/ml、约3μg/ml、约4μg/ml、约5μg/ml、约6μg/ml、约7μg/ml、约8μg/ml、约9μg/ml、约10μg/ml、约11μg/ml、约12μg/ml、约13μg/ml、约14μg/ml、约15μg/ml、约16μg/ml、约17μg/ml、约18μg/ml、约19μg/ml、约20μg/ml、约25μg/ml、约50μg/ml、约75μg/ml、约100μg/ml、约125μg/ml、约150μg/ml、约175μg/ml、约200μg/ml、约250μg/ml、约300μg/ml、约350μg/ml、约400μg/ml、约450μg/ml、约500μg/ml、约550μg/ml、约600μg/ml、约650μg/ml、约700μg/ml、约750μg/ml、约800μg/ml、约850μg/ml、约900μg/ml、约950μg/ml、约1000μg/ml的浓度接触hESC。
增加Brachyury、FGF4和/或SNAI1基因产物表达的方法本发明的其它实施方案涉及在体外增加brachyury、FGF4和/或SNAI1基因产物在人胚胎干细胞中的表达的方法。此类方法包括在含有少于约2％(v/v)血清的培养基中获得所述hESC的步骤。例如，该培养基可以含有浓度为约0％(v/v)、约0.05％(v/v)、约0.1％(v/v)、约0.2％(v/v)、约0.3％(v/v)、约0.4％(v/v)、约0.5％(v/v)、约0.6％(v/v)、约0.7％(v/v)、约0.8％(v/v)、约0.9％(v/v)、约1％(v/v)、约1.1％(v/v)、约1.2％(v/v)、约1.3％(v/v)、约1.4％(v/v)、约1.5％(v/v)、约1.6％(v/v)、约1.7％(v/v)、约1.8％(v/v)、约1.9％(v/v)的血清。一些实施方案中，所述培养基不包含血清替代物。让hESC与足以增加brachyury、FGF4和/或SNAI1基因产物的表达的量的分化因子接触。一些实施方案中，所述分化因子是至少一种TGFβ超家族的生长因子。在优选实施方案中，所述TGFβ超家族的生长因子是活化素A。用于接触hESC的分化因子的浓度范围从约1ng/ml至约1mg/ml。例如，分化因子可以以1ng/ml、约5ng/ml、约25ng/ml、约50ng/ml、约75ng/ml、约100ng/ml、约125ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约225ng/ml、约250ng/ml、约275ng/ml、约300ng/ml、约325ng/ml、约350ng/ml、约375ng/ml、约400ng/ml、约425ng/ml、约450ng/ml、约475ng/ml、约500ng/ml、约525ng/ml、约550ng/ml、约575ng/ml、约600ng/ml、约625ng/ml、约650ng/ml、约675ng/ml、约700ng/ml、约725ng/ml、约750ng/ml、约775ng/ml、约800ng/ml、约825ng/ml、约850ng/ml、约875ng/ml、约900ng/ml、约925ng/ml、约950ng/ml、约975ng/ml、约1μg/ml、约2μg/ml、约3μg/ml、约4μg/ml、约5μg/ml、约6μg/ml、约7μg/ml、约8μg/ml、约9μg/ml、约10μg/ml、约11μg/ml、约12μg/ml、约13μg/ml、约14μg/ml、约15μg/ml、约16μg/ml、约17μg/ml、约18μg/ml、约19μg/ml、约20μg/ml、约25μg/ml、约50μg/ml、约75μg/ml、约100μg/ml、约125μg/ml、约150μg/ml、约175μg/ml、约200μg/ml、约250μg/ml、约300μg/ml、约350μg/ml、约400μg/ml、约450μg/ml、约500μg/ml、约550μg/ml、约600μg/ml、约650μg/ml、约700μg/ml、约750μg/ml、约800μg/ml、约850μg/ml、约900μg/ml、约950μg/ml、约1000μg/ml的浓度接触hESC。
基因产物在细胞培养物中的时间性表达本发明的其它实施方案涉及具有特定时间模式的基因表达的细胞培养物。一些实施方案中，该细胞培养物包含人胚胎干细胞(hESC)和含有少于约2％(v/v)血清的培养基。例如，该培养基可以含有浓度为约0％(v/v)、约0.05％(v/v)、约0.1％(v/v)、约0.2％(v/v)、约0.3％(v/v)、约0.4％(v/v)、约0.5％(v/v)、约0.6％(v/v)、约0.7％(v/v)、约0.8％(v/v)、约0.9％(v/v)、约1％(v/v)、约1.1％(v/v)、约1.2％(v/v)、约1.3％(v/v)、约1.4％(v/v)、约1.5％(v/v)、约1.6％(v/v)、约1.7％(v/v)、约1.8％(v/v)、约1.9％(v/v)的血清。一些实施方案中，所述培养基不包含血清替代物。一些实施方案中，所述培养基是低血清RPMI。
本发明的一些实施方案中，培养物中的hESC在参考时间点开始分化。该参考时间点是向所述细胞提供分化因子的点。一些实施方案中，所述分化因子是至少一种TGFβ超家族的生长因子。在优选实施方案中，所述TGFβ超家族的生长因子是活化素A。向hESC提供的分化因子的浓度范围从约1ng/ml至约1mg/ml。例如，分化因子可以以1ng/ml、约5ng/ml、约25ng/ml、约50ng/ml、约75ng/ml、约100ng/ml、约125ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约225ng/ml、约250ng/ml、约275ng/ml、约300ng/ml、约325ng/ml、约350ng/ml、约375ng/ml、约400ng/ml、约425ng/ml、约450ng/ml、约475ng/ml、约500ng/ml、约525ng/ml、约550ng/ml、约575ng/ml、约600ng/ml、约625ng/ml、约650ng/ml、约675ng/ml、约700ng/ml、约725ng/ml、约750ng/ml、约775ng/ml、约800ng/ml、约825ng/ml、约850ng/ml、约875ng/ml、约900ng/ml、约925ng/ml、约950ng/ml、约975ng/ml、约1μg/ml、约2μg/ml、约3μg/ml、约4μg/ml、约5μg/ml、约6μg/ml、约7μg/ml、约8μg/ml、约9μg/ml、约10μg/ml、约11μg/ml、约12μg/ml、约13μg/ml、约14μg/ml、约15μg/ml、约16μg/ml、约17μg/ml、约18μg/ml、约19μg/ml、约20μg/ml、约25μg/ml、约50μg/ml、约75μg/ml、约100μg/ml、约125μg/ml、约150μg/ml、约175μg/ml、约200μg/ml、约250μg/ml、约300μg/ml、约350μg/ml、约400μg/ml、约450μg/ml、约500μg/ml、约550μg/ml、约600μg/ml、约650μg/ml、约700μg/ml、约750μg/ml、约800μg/ml、约850μg/ml、约900μg/ml、约950μg/ml、约1000μg/ml的浓度接触hESC。
向hESC提供分化因子后，与hESC中的基线FGF8mRNA表达相比，FGF8mRNA的表达显著上调。hESC中的基线FGF8表达是诸如mRNA等的FGF8基因产物的表达，该FGF8基因产物存在于维持在未分化状态的hESC细胞培养物中。一些实施方案中，距参考时间点约6小时时，FGF8mRNA的表达显著上调。本发明的其它实施方案中，距参考时间点约24小时后，FGF8mRNA的表达下调。其它实施方案中，FGF8mRNA的表达在距参考时间点约6小时至约24小时之间达到峰值。其它实施方案中，FGF8的峰值表达在距参考时间点少于约6小时时达到。
本发明的其它实施方案涉及细胞培养物，其展现β-连接素多肽的增加的细胞核定位。在这些实施方案中，距所述参考时间点约17小时时β-连接素多肽开始向细胞核定位。一些实施方案中，距所述参考时间点短于约17小时时β-连接素多肽开始向细胞核定位。其它实施方案中，距所述参考时间点约17小时时β-连接素多肽显著地向细胞核定位。
本发明的细胞培养物的其它实施方案涉及具有增加的brachyurymRNA表达的细胞培养物。在该细胞培养物中，距所述参考时间点约24小时时brachyury mRNA的表达显著上调。一些实施方案中，距所述参考时间点约24小时之前brachyury mRNA的表达显著上调。一些实施方案中，距所述参考时间点约48小时时brachyury mRNA的表达显著下调。某些实施方案中，brachyury mRNA的表达在距参考时间点约12小时至约48小时之间达到峰值。在优选实施方案中，距所述参考时间点约72小时时brachyury mRNA不显著表达。在其它优选实施方案中，距所述参考时间点约24小时时brachyury mRNA的表达显著上调，而在距所述参考时间点约72小时时brachyury mRNA不显著表达。
本发明的细胞培养物的其它实施方案涉及具有增加的FGF4mRNA表达的细胞培养物。在该细胞培养物中，距所述参考时间点约24小时时FGF4mRNA的表达显著上调。一些实施方案中，距所述参考时间点约24小时之前FGF4mRNA的表达显著上调。一些实施方案中，距所述参考时间点约48小时时FGF4mRNA的表达显著下调。某些实施方案中，FGF4mRNA的表达在距参考时间点约12小时至约48小时之间达到峰值。在优选实施方案中，距所述参考时间点约72小时时FGF4mRNA不显著表达。在其它优选实施方案中，距所述参考时间点约24小时时FGF4mRNA的表达显著上调，而在距所述参考时间点约72小时时FGF4mRNA不显著表达。
本发明的细胞培养物的优选实施方案涉及具有增加的brachyury和FGF4mRNA表达的细胞培养物。在该细胞培养物中，距所述参考时间点约24小时时brachyury和FGF4mRNA的表达显著上调。一些实施方案中，距所述参考时间点约24小时之前brachyury和FGF4mRNA的表达显著上调。一些实施方案中，距所述参考时间点约48小时时brachyury和FGF4mRNA的表达显著下调。某些实施方案中，brachyury和FGF4mRNA的表达在距参考时间点约12小时至约48小时之间达到峰值。在优选实施方案中，距所述参考时间点约72小时时brachyury和FGF4mRNA不显著表达。在其它优选实施方案中，距所述参考时间点约24小时时brachyury和FGF4mRNA的表达显著上调，而在距所述参考时间点约72小时时brachyury和FGF4mRNA不显著表达。
本发明的细胞培养物的其它实施方案涉及具有增加的SNAI1mRNA表达的细胞培养物。在该细胞培养物中，距所述参考时间点约24小时时SNAI1mRNA的表达显著上调。一些实施方案中，距所述参考时间点约24小时之前SNAI1mRNA的表达显著上调。一些实施方案中，距所述参考时间点约48小时时SNAI1mRNA的表达下调。某些实施方案中，SNAI1mRNA的表达在距参考时间点约12小时至约48小时之间达到峰值。
本发明的细胞培养物的实施方案还涉及具有E-钙粘着素(ECAD)基因产物的特异时间表达的细胞培养物。该实施方案中，距所述参考时间点约12小时时E-钙粘着素mRNA的表达下调。其它实施方案中，距所述参考时间点短于12小时时E-钙粘着素mRNA的表达可以下调。在优选实施方案中，距所述参考时间点约48小时时E-钙粘着素mRNA的表达显著下调。
本发明的其它实施方案涉及表达SOX17和/或FOXA2标志物的细胞培养物。一些实施方案中，距所述参考时间点约48小时时SOX17mRNA的表达显著上调。其它实施方案中，距所述参考时间点约96小时时FOXA2mRNA的表达显著上调。
本发明的一些实施方案涉及包括具有某些特定模式的基因表达的细胞的细胞培养物。这些实施方案中，所述细胞培养物包含hESC、例如TGFβ超家族的分化因子等的分化因子和包含少于约2％(v/v)血清的培养基。其它实施方案中，所述培养基包含多于2％(v/v)的血清。一些实施方案中，所述培养物缺乏血清替代物。
一些实施方案中，在向所述细胞培养物提供所述分化因子时，所述细胞培养物全部是或主要全部是hESC。在分化期间，至少部分hESC分化为其它细胞类型，如通过某些标志物基因产物(mRNA和/或多肽)的表达所表明的。
本发明的细胞培养物的一些实施方案中，第一套标志物基因的表达在第二和/或第三套标志物基因的表达上调之前上调。一些实施方案中，每一套标志物基因都可以包括一种或多种标志物基因。基因表达上调的范围可以是从轻微到显著。例如，与未分化hESC中相同标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以上调至少约10％。其它实施方案中，与未分化hESC中相同标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以上调至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或多于至少约90％。其它实施方案中，与未分化hESC中相同标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以上调至少2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍或多于至少约100倍。
本发明的细胞培养物的其它实施方案中，第一套标志物基因的表达在第二和/或第三套标志物基因的表达上调之前下调。这些实施方案中，每一套标志物基因都可以包括一种或多种标志物基因。如同基因表达的上调，下调的范围可以是从轻微到显著。例如，与未分化hESC中相同标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以下调至少约10％。其它实施方案中，与未分化hESC中相同标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以下调至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或多于至少约90％。其它实施方案中，与未分化hESC中相同标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以下调至少2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍或多于至少约100倍。
本发明的细胞培养物的其它实施方案中，第一套标志物基因的表达在第二和/或第三套标志物基因的峰值表达之前或大致同时上调。这些实施方案中，每一套标志物基因都可以包括一种或多种标志物基因。其它实施方案中，第一套标志物基因的表达在第二和/或第三套标志物基因的峰值表达之前或大致同时下调。如上所述，在这些实施方案中，每一套标志物基因都可以包括一种或多种标志物基因。而且，在上述实施方案中，基因表达的上调和下调的范围都可以是从轻微到显著。例如，与未分化hESC中相同标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以上调或下调至少约10％。其它实施方案中，与未分化hESC中相同标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以上调或下调至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或多于至少约90％。其它实施方案中，与未分化hESC中相同标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以上调或下调至少2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍或多于至少约100倍。
本发明的一些实施方案中，在所述细胞培养物的至少一些细胞中，选自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的表达上调之前上调。其它实施方案中，在所述细胞培养物的至少一些细胞中，选自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的峰值表达之前上调。其它实施方案中，在所述细胞培养物的至少一些细胞中，选自HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的峰值表达之前或大致同时下调。其它实施方案中，在所述细胞培养物的至少一些细胞中，选自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自SOX17、FOXA2、CXCR4和MIXL1的标志物基因的表达上调之前上调。其它实施方案中，在所述细胞培养物的至少一些细胞中，选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的表达在选自SOX17、FOXA2、CXCR4和MIXL1的标志物基因的表达上调之前或大致同时上调。其它实施方案中，在所述细胞培养物的至少一些细胞中，选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因在选自SOX17、FOXA2、CXCR4和MIXL1的标志物基因的表达上调之前或大致同时达到峰值表达。其它实施方案中，在所述细胞培养物的至少一些细胞中，选自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的表达上调之前上调。
具有一种或多种上述时间性基因表达模式的细胞培养物中的一些包括包含少于约2％(v/v)血清的培养基。在一些实施方案中，培养基不含血清。在其它实施方案中，培养基不含血清替代物。用于本发明细胞培养物的一些培养基包括浓度少于约1.9％(v/v)、少于约1.8％(v/v)、少于约1.7％(v/v)、少于约1.6％(v/v)、少于约1.5％(v/v)、少于约1.4％(v/v)、少于约1.3％(v/v)、少于约1.2％(v/v)、少于约1.1％(v/v)、少于约1％(v/v)、少于约0.9％(v/v)、少于约0.8％(v/v)、少于约0.7％(v/v)、少于约0.6％(v/v)、少于约0.5％(v/v)、少于约0.4％(v/v)、少于约0.3％(v/v)、少于约0.2％(v/v)、少于约0.1％(v/v)或少于约0.05％(v/v)的血清。
具有一种或多种上述时间性基因表达模式的细胞培养物中的一些包含至少一种TGFβ超家族的分化因子。一些实施方案中，该生长因子是nodal、活化素A和/或活化素B。在优选实施方案中，所述分化因子是活化素A。在更优选的实施方案中，活化素A在培养基中存在的浓度为约100ng/ml。
然而，应该理解，可以以约1ng/ml至约1mg/ml的浓度范围向细胞培养物提供所述TGFβ超家族的分化因子。一些实施方案中，以约5ng/ml、约25ng/ml、约50ng/ml、约75ng/ml、约100ng/ml、约125ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约225ng/ml、约250ng/ml、约275ng/ml、约300ng/ml、约325ng/ml、约350ng/ml、约375ng/ml、约400ng/ml、约425ng/ml、约450ng/ml、约475ng/ml、约500ng/ml、约525ng/ml、约550ng/ml、约575ng/ml、约600ng/ml、约625ng/ml、约650ng/ml、约675ng/ml、约700ng/ml、约725ng/ml、约750ng/ml、约775ng/ml、约800ng/ml、约825ng/ml、约850ng/ml、约875ng/ml、约900ng/ml、约925ng/ml、约950ng/ml、约975ng/ml、约1μg/ml、约2μg/ml、约3μg/ml、约4μg/ml、约5μg/ml、约6μg/ml、约7μg/ml、约8μg/ml、约9μg/ml、约10μg/ml、约11μg/ml、约12μg/ml、约13μg/ml、约14μg/ml、约15μg/ml、约16μg/ml、约17μg/ml、约18μg/ml、约19μg/ml、约20μg/ml、约25μg/ml、约50μg/ml、约75μg/ml、约100μg/ml、约125μg/ml、约150μg/ml、约175μg/ml、约200μg/ml、约250μg/ml、约300μg/ml、约350μg/ml、约400μg/ml、约450μg/ml、约500μg/ml、约550μg/ml、约600μg/ml、约650μg/ml、约700μg/ml、约750μg/ml、约800μg/ml、约850μg/ml、约900μg/ml、约950μg/ml、约1000μg/ml或高于约1000μg/ml向细胞培养物提供所述TGFβ超家族的分化因子。
本发明还预期分化hESC以产生具有特定时间性标志物基因表达模式的细胞的方法。例如，一些实施方案涉及分化人胚胎干细胞(hESC)的方法，其通过使hESC接触包含少于约2％(v/v)血清的培养基，向该hESC提供TGFβ超家族的分化因子，然后容许hESC的分化发生来实现。
在上述分化hESC的方法的一些实施方案中，第一套标志物基因的表达在第二和/或第三套标志物基因的表达上调之前上调。一些实施方案中，每一套标志物基因都可以包括一种或多种标志物基因。基因表达上调的范围可以是从轻微到显著。例如，与未分化hESC中相同标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以上调至少约10％。其它实施方案中，与未分化hESC中相同标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以上调至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或多于至少约90％。其它实施方案中，与未分化hESC中相同标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以上调至少2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍或多于至少约100倍。
本发明的分化hESC的方法的其它实施方案中，第一套标志物基因的表达在第二和/或第三套标志物基因的表达上调之前下调。这些实施方案中，每一套标志物基因都可以包括一个或多个标志物基因。如同基因表达的上调，下调的范围可以是从轻微到显著。例如，与未分化hESC中同一标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以下调至少约10％。其它实施方案中，与未分化hESC中同一标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以下调至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或多于至少约90％。其它实施方案中，与未分化hESC中同一标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以下调至少2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍或多于至少约100倍。
本发明的分化hESC的方法的其它实施方案中，第一套标志物基因的表达在第二和/或第三套标志物基因的峰值表达之前或大致同时上调。这些实施方案中，每一套标志物基因都可以包括一种或多种标志物基因。其它实施方案中，第一套标志物基因的表达在第二和/或第三套标志物基因的峰值表达之前或大约同时下调。如上所述，在这些实施方案中，每一套标志物基因都可以包括一种或多种标志物基因。而且，在上述实施方案中，基因表达的上调和下调的范围都可以是从轻微到显著。例如，与未分化hESC中相同标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以上调或下调至少约10％。其它实施方案中，与未分化hESC中相同标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以上调或下调至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或多于至少约90％。其它实施方案中，与未分化hESC中相同标志物基因的表达相比，该标志物基因的表达可以上调或下调至少2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍或多于至少约100倍。
本发明的一些实施方案中，在所述细胞培养物的至少一些细胞中，选自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的表达上调之前上调。其它实施方案中，在所述细胞培养物的至少一些细胞中，选自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的峰值表达之前上调。其它实施方案中，在所述细胞培养物的至少一些细胞中，选自HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的峰值表达之前或大致同时下调。其它实施方案中，在所述细胞培养物的至少一些细胞中，选自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自SOX17、FOXA2、CXCR4和MIXL1的标志物基因的表达上调之前上调。其它实施方案中，在所述细胞培养物的至少一些细胞中，选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的表达在选自SOX17、FOXA2、CXCR4和MIXL1的标志物基因的表达上调之前或大致同时上调。其它实施方案中，在所述细胞培养物的至少一些细胞中，选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因在选自SOX17、FOXA2、CXCR4和MIXL1的标志物基因的表达上调之前或大致同时达到峰值表达。其它实施方案中，在所述细胞培养物的至少一些细胞中，选自FGF8、Nodal、HEG、HEY1、GATA2、BIK和ID1的标志物基因的表达在选自brachyury、FGF4、SNAI1、Wnt3、MIXL1、DKK4、NETO1、T、DACT1、FLJ22662、SLIT2、GAD1和GRM4的标志物基因的表达上调之前上调。
在本发明分化方法的一些实施方案中，使细胞培养物接触或者以其它方式向其提供包含少于约2％(v/v)血清的培养基。在一些实施方案中，培养基不含血清。在其它实施方案中，培养基不含血清替代物。用于本发明方法的一些培养基包括浓度少于约1.9％(v/v)、少于约1.8％(v/v)、少于约1.7％(v/v)、少于约1.6％(v/v)、少于约1.5％(v/v)、少于约1.4％(v/v)、少于约1.3％(v/v)、少于约1.2％(v/v)、少于约1.1％(v/v)、少于约1％(v/v)、少于约0.9％(v/v)、少于约0.8％(v/v)、少于约0.7％(v/v)、少于约0.6％(v/v)、少于约0.5％(v/v)、少于约0.4％(v/v)、少于约0.3％(v/v)、少于约0.2％(v/v)、少于约0.1％(v/v)或少于约0.05％(v/v)的血清。
分化hESC以产生上述基因表达的时间模式的一些方法包括向例如hESC的培养物中的细胞提供至少一种TGFβ超家族的分化因子。一些实施方案中，该生长因子是nodal、活化素A和/或活化素B。在优选实施方案中，所述分化因子是活化素A。在更优选的实施方案中，活化素A在培养基中存在的浓度为约100ng/ml。
然而，应该理解，可以以约1ng/ml至约1mg/ml的浓度范围向细胞培养物提供所述TGFβ超家族的分化因子。一些实施方案中，以约5ng/ml、约25ng/ml、约50ng/ml、约75ng/ml、约100ng/ml、约125ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约225ng/ml、约250ng/ml、约275ng/ml、约300ng/ml、约325ng/ml、约350ng/ml、约375ng/ml、约400ng/ml、约425ng/ml、约450ng/ml、约475ng/ml、约500ng/ml、约525ng/ml、约550ng/ml、约575ng/ml、约600ng/ml、约625ng/ml、约650ng/ml、约675ng/ml、约700ng/ml、约725ng/ml、约750ng/ml、约775ng/ml、约800ng/ml、约825ng/ml、约850ng/ml、约875ng/ml、约900ng/ml、约925ng/ml、约950ng/ml、约975ng/ml、约1μg/ml、约2μg/ml、约3μg/ml、约4μg/ml、约5μg/ml、约6μg/ml、约7μg/ml、约8μg/ml、约9μg/ml、约10μg/ml、约11μg/ml、约12μg/ml、约13μg/ml、约14μg/ml、约15μg/ml、约16μg/ml、约17μg/ml、约18μg/ml、约19μg/ml、约20μg/ml、约25μg/ml、约50μg/ml、约75μg/ml、约100μg/ml、约125μg/ml、约150μg/ml、约175μg/ml、约200μg/ml、约250μg/ml、约300μg/ml、约350μg/ml、约400μg/ml、约450μg/ml、约500μg/ml、约550μg/ml、约600μg/ml、约650μg/ml、约700μg/ml、约750μg/ml、约800μg/ml、约850μg/ml、约900μg/ml、约950μg/ml、约1000μg/ml或高于约1000μg/ml向细胞培养物提供所述TGFβ超家族的分化因子。
以上概括描述了本发明，可通过参照本文提供的某些具体实施例进一步理解本发明，这些实施例仅是为了说明而不是限制本发明。
实施例以下很多实施例描述了人多能性细胞的使用。产生人多能性细胞的方法在现有技术中是公知的，在许多科学出版物中都有描述，包括第5,453,357、5,670,372、5,690,926、6,090,622、6,200,806和6,251,671号美国专利及
发明者凯文·艾伦·达穆尔, 艾伦·D·阿古尼克, 苏珊·埃利泽, 依文特·克鲁恩, 伊曼纽尔·E·贝特格 申请人:赛瑟拉公司