含β－葡聚糖的组合物、其制造方法以及含该组合物的饮食品或皮肤用保湿剂的制作方法

专利名称：含β－葡聚糖的组合物、其制造方法以及含该组合物的饮食品或皮肤用保湿剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有属于短梗霉属(Aureobasidiumsp.)的微生物的培养物的含β-葡聚糖的组合物及其制造方法，还涉及使用该组合物的饮食品或皮肤用保湿剂。
背景技术：
β-葡聚糖为以D-葡萄糖作为构成糖而构成的多糖类，例如β-1，3葡聚糖为β-吡喃糖型环状D-葡萄糖相互在葡萄糖1位碳上结合的羟基部位与葡萄糖3位碳上结合的羟基部位之间以β-1，3糖苷键缩合、环状β-吡喃糖型D-葡萄糖聚合而构成的多糖类。在自然界的生物中作为能量源糖的贮藏分子或细胞壁等的结构分子发现了各种各样的像β-葡聚糖那样的多糖类，已知作为菌类的姬松茸、灵芝、滑子菇、香菇等中所含的β-葡聚糖具有用于保持和增进健康的各种生理活性，被大量尝试用作以免疫增强作用、抗肿瘤活性、癌细胞增殖抑制作用、抗过敏作用、抗炎症作用、胆固醇降低作用、抗血栓作用、食物纤维作用、降血压作用、降血糖作用、肝功能亢进等为目的的功能性原料或药品等。此外，作为可期待用于利用难消耗性的用于预防和改善便秘的肠胃药或利用其保湿性的化妆品等广泛应用的多糖类的功能性原料备受期待。
作为具有有益活性的β-葡聚糖，已知有除了由β-1，3葡糖苷构成的主链之外还具有来自葡萄糖6位碳的D-葡萄糖支链的β-1，3-1，6-葡聚糖，分支结构被认为是活性所必需的，其作用机理还并不清楚。此外，β-葡聚糖为从天然物得到的高分子聚合物，分支的程度、主链的长度、支链的长度等结构以及基于氨基化、磷酸化、甲基化、乙酰基化等的D-葡萄糖羟基的修饰的有无和程度都不均一，关于其结构和化学修饰对活性的影响的原理还未得到揭示。因此，只是经验上优选使用来源于菌类的β-葡聚糖，较少尝试使用来源于其它物种的β-葡聚糖。
最近，发现通过在自然界广泛存在的作为不完全菌的属于短梗霉属的菌(俗称黑酵母)产生的β-1，3-1，6-葡聚糖也可以获得与来源于菌类的β-葡聚糖同等或更好的作用。
例如，下述专利文献1中记载了由属于短梗霉属的微生物产生的细胞外纯多糖为β-1，3-1，6-葡聚糖。
此外，下述专利文献2中记载了以β-1，3-1，6-葡聚糖为主要成分的短梗霉培养液可以用作口服对各种疾病具有高抗肿瘤活性和免疫活化活性的药品的技术内容。
专利文献1日本专利特开平10-276740号公报专利文献2日本专利特开2002-204687号公报发明的揭示通常的菌类培养需要栽培，但作为不完全菌的属于短梗霉属的菌可以在液体营养培养基中进行振荡培养，可以高效地量产化。此外，由于β-葡聚糖被释放到菌体外，在其培养液中高浓度积聚，所以可以无需从菌体提取而作为高浓度的β-葡聚糖组合物使用。另外，通过采用含菌体的培养物，也可以作为期待同时含有菌体所含的其它有用成分的复合效果的功能性原料。
然而，一般被称为黑酵母的属于短梗霉属的微生物的培养液由于积聚黑色素样物质而呈暗绿色，作为直接使用培养物或培养液的饮食品或化妆品等，存在外观差而不受欢迎的问题。此外，虽然也可以经过精制过程除去黑色素，但一般这需要复杂的过程，难以直接提取来源于天然物的β-葡聚糖。
因此，本发明的目的在于提供色素积聚性低且β-葡聚糖生产性高的来源于天然酵母的含β-葡聚糖的组合物及其制造方法。
为了实现上述目的，本发明者认真研究后，通过由属于短梗霉属的微生物培育出色素积聚性低的变异株，完成了本发明。
即，本发明的含β-葡聚糖的组合物的特征在于，由将变异株在液体培养基中进行培养而得到的培养物构成，β-葡聚糖含量在0.3质量％以上，所述变异株以属于短梗霉属的微生物为亲株，通过采用紫外线照射处理或变异原性物质处理的突变制造方法培育得到，色素积聚性比亲株低。
如果采用本发明的含β-葡聚糖的组合物，则可以提供以高浓度含有属于短梗霉属的微生物在增殖中向菌体外产出的β-葡聚糖且着色程度低的含β-葡聚糖的组合物。
本发明的含β-葡聚糖的组合物中，前述培养物的着色度以明度L*值计较好是在10以上。如果采用这样的形态，则可以提供以高浓度含有上述β-葡聚糖且不会因其外观而对制品的商品性造成影响的含β-葡聚糖的组合物。
此外，本发明的含β-葡聚糖的组合物中，前述亲株较好是属于出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)的微生物。如果采用这样的形态，则可以将菌类学性质已知的微生物作为原材料。
另外，本发明的含β-葡聚糖的组合物中，前述变异株较好是出芽短梗霉M-2(AureobasidiumpullulansM-2)(FERM BP-10014)。如果采用这样的形态，则可以将容易获得的菌类学性质已知的安全性高的微生物作为原材料。
本发明的含β-葡聚糖的组合物的制造方法的特征在于，将变异株在液体培养基中进行培养，使其在该培养物中生成0.3质量％以上的β-葡聚糖，所述变异株以属于短梗霉属的微生物为亲株，通过采用紫外线照射处理或变异原性物质处理的突变制造方法培育得到，色素积聚性比亲株低。
如果采用本发明的含β-葡聚糖的组合物的制造方法，则通过将前述变异株在液体培养基中进行培养，可以高效地制造以高浓度含有属于短梗霉属的微生物在增殖中向菌体外产出的β-葡聚糖且着色程度低的含β-葡聚糖的组合物。
本发明的含β-葡聚糖的组合物的制造方法中，前述培养物的着色度以明度L*值计较好是在10以上。如果采用这样的形态，则可以高效地制造以高浓度含有上述β-葡聚糖且不会因其外观而对制品的商品性造成影响的含β-葡聚糖的组合物。
此外，本发明的含β-葡聚糖的组合物的制造方法中，前述亲株较好是属于出芽短梗霉的微生物。如果采用这样的形态，则可以将菌类学性质已知的微生物作为原材料。
另外，本发明的含β-葡聚糖的组合物的制造方法中，前述变异株较好是出芽短梗霉M-2(FERM BP-10014)。如果采用这样的形态，则可以将容易获得的菌类学性质已知的安全性高的微生物作为原材料。
本发明的含β-葡聚糖的组合物的制造方法的优选形态中，较好是在前述液体培养基的pH为4.5～6.0的状态进行培养。
由此，生产β-葡聚糖的培养中的培养液pH在4.5～6.0的范围内，特别是培养后半段pH不到5.0，则不仅不易因杂菌污染而产生品质劣化，而且培养结束后必需的加热杀菌容易。
另外，本发明的含β-葡聚糖的组合物的制造方法的另一形态中，可以包括在得到的培养物中添加维生素C和/或有机酸，调整至pH不到4.5，然后进行加热杀菌的工序。
由此，可容易地以适合于饮食品卫生法的制造标准所规定的pH不到4.5的组合物的温和的加热条件进行杀菌，可以提供具有上述发明的含β-葡聚糖的组合物的特性而且口感、着色、味道、气味等作为饮食品添加物等的特性因加热而产生的变化被抑制到最低限度的含β-葡聚糖的组合物。此外，可以使该组合物成为含有具有抗氧化性及其它各种生理活性机能的维生素C和/或有机酸且具有清爽的呈味性的组合物。
另一方面，本发明的饮食品的特征在于，含有由上述发明的形态得到的含β-葡聚糖的组合物。若采用本发明的饮食品，则可以提供用于简便且安全地摄取着色程度低的作为来源于短梗霉的多糖类的β-葡聚糖的饮食品。
另外，本发明的皮肤用保湿剂的特征在于，含有由上述发明的形态得到的含β-葡聚糖的组合物。若采用该形态，则可以提供利用作为来源于短梗霉的多糖类的β-葡聚糖的皮肤用保湿剂，使制品的商品性不受其外观的影响。
本发明的属于短梗霉属的微生物的变异株是以属于短梗霉属的微生物为亲株，通过采用紫外线照射处理或变异原性物质处理的突变制造方法培育得到的变异株，其特征在于，色素积聚性比该亲株低，β-葡聚糖积聚性比该亲株高。
若采用本发明的属于短梗霉属的微生物的变异株，则可以提供以高浓度含有属于短梗霉属的微生物在增殖中向菌体外产出的β-葡聚糖且着色程度低的含β-葡聚糖的组合物，还可以提供制品的商品性不会受其外观的影响的含β-葡聚糖的饮食品、皮肤用保湿剂等。
此外，作为本发明的属于短梗霉属的微生物的变异株的优选形态，前述属于短梗霉属的微生物的变异株较好是出芽短梗霉M-2(FERM BP-10014)。若采用该形态，则可以将除色素积聚性和β-葡聚糖积聚性外保持与亲株同等的菌类学性质的变异株作为前述含β-葡聚糖的组合物、饮食品、皮肤用保湿剂等的原材料。
若采用本发明，则易于获得着色程度低且以高浓度含有β-葡聚糖的含β-葡聚糖的组合物。
此外，本发明的含β-葡聚糖的组合物的制造方法中，在前述液体培养基的pH为4.5～6.0的状态下进行培养时，特别是培养后期pH越低，越不易发生制造工序中的杂菌污染引起的品质劣化，可以在更温和的条件下进行饮食品卫生上所需的加热杀菌处理。
附图的简单说明

图1为基于核糖体RNA基因区域(1)ITS-5.8S区域的碱基序列通过邻近结合法制成的分子系统树。
图2为基于核糖体RNA基因区域(2)28SrRNA-D1/D2区域的碱基序列通过邻近结合法制成的分子系统树。
图3为表示被释放到培养液中并积聚的以β-葡聚糖为主要成分的多糖的积蓄量的经时变化的图。
图4为表示营养培养基中的蔗糖浓度对被释放到培养液中并积聚的以β-葡聚糖为主要成分的多糖的生成量的影响的图。
图5为表示接种时初始pH不同的培养液中的培养时间内的pH的经时变化的图。
实施发明的最佳方式本发明中作为亲株使用的微生物只要是属于短梗霉属的具有β-葡聚糖生成能力的菌即可，例如可以使用出芽短梗霉M-1(AureobasidiumpullulansM-1，独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏编号FERM BP-08615)。
本发明中的突变诱发方法为通常用于获得微生物的突变株的紫外线照射处理或变异原性物质处理等即可。作为变异原性物质，可以使用甲磺酸乙酯、亚硝基胍、溴化乙啶等常用的变异原性物质。此外，紫外线照射可以使用UV灯等。
通过在平板琼脂培养基上培养而从经上述突变诱发方法处理的属于短梗霉属的微生物的菌体群落中分离不呈深绿色的菌落，可以良好的再现性培育出本发明的色素积聚性比亲株低的变异株，较好是除色素积聚性和β-葡聚糖积聚性外保持与亲株同等的菌类学性质，例如可以使用以上述出芽短梗霉M-1为亲株的出芽短梗霉M-2(AureobasidiumpullulansM-2，独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏编号FERM BP-10014)。
本发明中，作为亲株使用的微生物及其变异株(以下将它们成为短梗霉菌)可以用通常的营养培养基进行培养，对营养培养基没有特别限定，例如可以使用含1％蔗糖、0.2％抗坏血酸、0.2％米糠的液体培养基(pH5.2～5.4)。通过在20～30℃的温度下进行通气培养、较好是通气搅拌培养，可以保持短梗霉菌稳定地增殖。此外，可以在平板琼脂培养基上进行培养，使其形成菌落。
通过上述液体培养的优选形态在规定量的液体培养基中增殖短梗霉菌时，在短梗霉菌消耗用于增殖的液体培养基中的营养成分达到增殖稳定期的阶段，该培养液中通常含有0.6～1.8质量％的固体成分，该固体成分中含有5～90质量％的β-葡聚糖。在这里，培养液是指通过以离心分离和过滤从培养后的培养物中除去增殖了的菌体部分而得到的溶液部分，培养液中所含的固体成分是指溶液的除水分以外的成分。此外，在被释放到菌体外的物质的溶液中，未扩散的释放成分中也会包含含有β-葡聚糖的成分。另外，如上所述，短梗霉菌产生的主要的高分子多糖的特征为它是具有从葡萄糖β-1，3键的主链上葡萄糖以β-1，6键分支的结构的β-1，3-1，6-葡聚糖，本发明中短梗霉菌生成释放的β-葡聚糖也在其结构上的构成和分支度上没有太大差异。
本发明中培育出的变异株较好是具有β-葡聚糖积聚性的变异株，即在通过离心分离和过滤等从如上所述在规定量的液体培养基中使前述变异株增殖而得到的培养物中除去菌体部分而得的溶液中，释放出亲株的1.5倍以上、更好是3倍以上的β-葡聚糖。通过使用这样的变异株，易于获得培养后的培养物的总重量中β-葡聚糖含量在0.3质量％以上的本发明的含β-葡聚糖的组合物。
本发明中，短梗霉菌的色素积聚性和培养液的着色程度可以通过采用光谱色度计或色彩色差计等对其色成分进行定性分析来实施测定，例如可以使用市售的“光谱色度计JS555”(商品名，カラ一テクノシステム株式会社制)进行分析。这种情况下，作为将色彩信息数值化的色彩模型之一的由CIE(国际照明委员会)标准化的Lab色度系统中，可以将通过从黑到白的范围的明度要素(L)把明暗的程度数值化得到的明度L*值作为指标。
通常，短梗霉菌具有生成黑色素样物质的性质，通过上述液体培养的优选形态达到增殖稳定状态的阶段中，黑色素样物质积聚的培养物整体呈暗绿色，该培养物的明度L*值不到10。
本发明中培育出的变异株较好是具有与亲株表现出的前述培养物的着色度相比明度L*值的差在5以上、更好是在10以上的色素积聚性。此外，特别好是在20以上。通过使用这样的的变异株，可以使达到前述增殖稳定状态的阶段中黑色素样物质积聚的培养物的着色度以明度L*值计在10以上。
本发明的含β-葡聚糖的组合物可以是通过如上所述在规定量的液体培养基中使上述变异株增殖而得到的培养物本身，或者可以是前述培养物的一部分，即通过离心分离和过滤等从培养物中将菌体部分分离除去而得到的溶液部分。即，含β-葡聚糖的组合物由培养物本身构成的情况下，形成含有短梗霉菌菌体的组合物，同时也含有没有扩散到释放至菌体内和菌体外的物质的溶液中而留存在菌体表面的β-葡聚糖。此外，含β-葡聚糖的组合物由培养物的溶液部分构成的情况下，形成不含短梗霉菌菌体的组合物，可以分别根据用途使用。
本发明的含β-葡聚糖的组合物也可以将上述培养物的溶液部分再通过乙醇沉淀处理等将β-葡聚糖分离浓缩至沉淀部，通过乙醇沉淀处理等将不被分离浓缩至该沉淀部的低分子物质除去而得到。
本发明的含β-葡聚糖的组合物中，含β-葡聚糖的组合物除水分以外的固体成分中所含的上述短梗霉菌生成的β-葡聚糖的配比较好是以β-葡聚糖换算为5～90质量％，更好是20～90质量％。
本发明的含β-葡聚糖的组合物可以不进行杀菌处理，但通常较好是将上述培养物杀菌得到的组合物，或者通过离心分离和过滤等从培养物中将菌体部分分离除去而得到的溶液部分加热或加压加热杀菌后得到的组合物。这种情况下，通过用维生素C、有机酸等pH调整剂将pH调至不到4.5、较好是不到4.0，以饮食品卫生法的制造标准所规定的温和的加热条件进行杀菌，可以将口感、着色、味道、气味等作为饮食品特性的变化抑制到最低限度。另外，如果添加维生素C和/或有机酸，则不仅可以赋予抗氧化性及其它各种生理机能，而且使本发明的含β-葡聚糖的组合物伴有清爽的呈味性。
除了上述β-1，3-1，6葡聚糖等短梗霉菌生成的多糖类和其它成分之外，本发明的含β-葡聚糖的组合物中还可以适当掺入维生素、矿物质、低聚糖、食物纤维、多酚等。
本发明的含β-葡聚糖的组合物可以通过常用的制剂法配制成各种制剂，从溶解性的角度来看，较好是通过冷冻干燥、喷雾造粒等粉体·造粒加工制成粉末或颗粒。此外，可以由它们配制成胶囊剂或片剂等。
本发明的含β-葡聚糖的组合物可以掺入到例如清凉饮料、牛奶、酸乳、乳酸菌饮料、冻胶饮料、果汁饮料、蔬菜汁、汤、酱汤等各种饮食品中。
通过口服摄取本发明的含β-葡聚糖的组合物时，对其1天的摄取量没有特别限定，较好是以β-葡聚糖换算为0.5mg～10mg/Kg/天。
含有本发明的含β-葡聚糖的组合物的皮肤用保湿剂可以直接将上述含β-葡聚糖的组合物用作化妆水或化妆液，也可以适当掺入各种皮肤用化妆品(例如乳液、乳膏、面膜等)。本发明的含β-葡聚糖的组合物对前述皮肤用保湿剂的配比以含β-葡聚糖的组合物计较好是0.5～50质量％，更好是5～20质量％。
实施例以下，例举实施例，对本发明进行具体说明，但本发明的范围并不限于这些实施例。
<实施例1>
(出芽短梗霉M-2的培育)将作为亲株的出芽短梗霉M-1(AureobasidiumpullulansM-1，独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏编号FERM BP-08615)用PDA(马铃薯葡萄糖琼脂，Potato Dextrose AgarDifco公司制)琼脂斜面培养7天，将得到的菌体悬浊于10ml PBS中，制成1000CFU/ml左右的溶液。将0.2ml该菌体悬浊液涂布于PDA琼脂平板上，然后对平板上的菌体分别以0、5、10分钟的照射时间进行UV照射处理。在25℃静置培养4天，确认形成菌落，再将平板在4℃培养3天，使菌体厚壁孢子化。从这些平板上选择白色菌落，分离多个变异株。白色菌落的出现频率为1/1200左右。
将一个得到的变异株命名为出芽短梗霉M-2，保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。(保藏编号FERM BP-10014)为了将出芽短梗霉M-2的菌类学性质与作为亲株的出芽短梗霉M-1进行比较，对在琼脂平板培养基上培养1周后得到的菌落，就其直径·色调、表面性状、可溶性色素是否产生等进行宏观的观察，并在显微镜下对其营养菌丝的性状和分生孢子形成方式等微观形态进行观察。其结果是，除色调外没有发现差异。关于色调，对于出芽短梗霉M-1，菌落观察时和显微镜下的观察时，观察到出芽短梗霉所具有的特征性的深绿色，而对于出芽短梗霉M-2，没有发现这样的色素积聚性。
因此，由上述的观察可知，除了色素积聚性，没有发现与亲株显著不同的菌类学性质。
另外，为了鉴定菌种，进行了出芽短梗霉M-1和出芽短梗霉M-2的基因序列分析。具体来说，对包含短梗霉菌的基因组DNA上邻近配置的核糖体RNA基因区域(1)ITS-5.8S区域和核糖体RNA基因区域(2)28SrRNA-D1/D2区域的DNA区域，使用序列表的序列编号1和8的碱基序列分别所表示的引物ITS5和引物NL4作为引物对，进行PCR扩增，通过将该DNA片断作为模板的热循环测序确定碱基序列。表1表示前述DNA扩增中所用的DNA引物和热循环测序中所用的DNA引物。


为了进行上述DNA区域的核糖体RNA基因区域(1)ITS-5.8S区域部分的热循环测序，使用上述引物ITS5或序列表的序列编号2、3和4的碱基序列分别所表示的引物ITS2、引物ITS3和引物ITS4作为测序引物，通过“ABI PRISM 3100 DNA测序仪”(商品名，アプライドバイオシステムズ公司制)对全长605的碱基部分确定碱基序列。此外，为了进行上述DNA区域的核糖体RNA基因区域(2)28SrRNA-D1/D2区域部分的热循环测序，使用上述引物NL4或序列表的序列编号5、6和7的碱基序列分别所表示的引物NL1、引物NL2和引物NL3作为测序引物，同样地对全长614的碱基部分确定碱基序列。
其结果是，确认来自出芽短梗霉M-2的基因组DNA的核糖体RNA基因区域(1)和(2)具有序列表的序列编号9、10分别所表示的碱基序列，来自出芽短梗霉M-1的基因组DNA的核糖体RNA基因区域(1)和(2)具有序列表的序列编号11、12分别所表示的碱基序列，分别都100％相同。
此外，使用得到的核糖体RNA基因区域的碱基序列，对于从国际DNA数据库检索得到的类似序列中的前20位通过邻近结合法制成分子系统树，图1中表示使用核糖体RNA基因区域(1)ITS-5.8S区域的碱基序列制成的分子系统树，图2表示使用核糖体RNA基因区域(2)28SrRNA-D1/D2区域的碱基序列制成的分子系统树。
由上述的基因序列分析的结果可知，作为通过上述UV照射培育的变异株的出芽短梗霉M-2为与作为亲株的出芽短梗霉M-1相同的属于不完全菌黑色菌科出芽短梗霉的菌。
<实施例2>
(含β-葡聚糖的组合物的制造)将出芽短梗霉M-2接种于含2.0％蔗糖、0.2％米糠、0.1％抗坏血酸钠的2升液体营养培养基(pH5.2～5.4)中，在3升发酵罐中以0.5v/v/m的通气搅拌条件于25℃的环境温度中培养至增殖稳定期(从接种起120小时)。得到的培养物呈淡乳白色，不具有出芽短梗霉通常所具有的深绿色的色调。
此外，为了测定前述培养物中的β-葡聚糖含量，用70％乙醇使高分子物质从将100g培养物以10000rpm离心得到的上清部分沉淀，进行离心分离。将该70％乙醇沉淀部用α淀粉酶、蛋白酶、淀粉转糖苷酶进行酶处理，将除β-葡聚糖以外的高分子物质低分子化后，加入4倍容积的95％乙醇，将β-葡聚糖分离至该沉淀部。将得到的95％乙醇沉淀部干燥一晚后，在105℃风干3小时，测定其重量，作为β-葡聚糖量。
该培养物每100g总重含有0.7g(0.7质量％)的β-葡聚糖。
<比较例1>
(色素积聚性)为了将出芽短梗霉M-2的色素积聚性与作为亲株的出芽短梗霉M-1的色素积聚性进行比较，将两者以实施例2的培养条件通气搅拌培养至增殖稳定期，该培养期间，从接种起72小时后和264小时后分别采集培养物的一部分。为了对采集的培养物的色成分进行定性分析，使用“光谱色度计JS555”(商品名，カラ一テクノシステム株式会社制)进行了分析。表2中表示将该分析结果通过CIE(国际照明委员会)Lab色度系统数值化得到的测定值。
(色差测定)

Lab色度系统为将色彩信息数值化的色彩模型之一，是由CIE(国际照明委员会)标准化的色度系统。该色度系统已知由作为从黑到白的范围的明度要素(L)与从绿到红的范围(a)和从蓝到黄的范围(b)这2个色彩要素构成，可以确定接近人的视觉的色度空间。
由表2可知，达到增殖稳定期的出芽短梗霉M-2的培养物与达到增殖稳定期的亲株的培养物相比，作为从黑到白的范围的明度要素(L)明显较高，深绿色色素积聚性低。
<比较例2>
(β-葡聚糖积聚性)将出芽短梗霉M-2的β-葡聚糖积聚性与作为亲株的出芽短梗霉M-1的β-葡聚糖积聚性进行了比较。为此，将两者以实施例2的培养条件通气搅拌培养至增殖稳定期，该培养期间，从接种起48小时后到264小时后的时间内，采集培养物，以上述实施例2中的方法测定100g培养物中的β-葡聚糖量。其结果示于图3。
由图3可知，作为亲株的出芽短梗霉M-1的培养中，从肉眼观察到黑色素样色素(深绿色色素)的积聚的培养时间起约72小时后，β-葡聚糖生成能力降低。另一方面，出芽短梗霉M-2的培养中，β-葡聚糖生成持续至培养液的粘度升高而搅拌效率显著降低，因此最终可以获得高浓度的培养液。此外，接种96小时后的β-葡聚糖的积聚量存在1.5～3.0倍的差。
<试验例1>
营养培养基中的糖被认为是β-葡聚糖生成时的原料，考察了该糖浓度的差对葡聚糖生成的影响。为此，将出芽短梗霉M-2在蔗糖浓度不同的营养培养基(蔗糖浓度1、2、3或4％)中以实施例2的培养条件振荡培养至增殖稳定期。采集部分接种192小时后的培养液，以与上述比较例2同样的方法测定100g培养物中的β-葡聚糖含量。其结果如图4所示，各营养培养基蔗糖浓度下都充分生成β-葡聚糖，特别是2～4％的营养培养基，其积聚量高。
<试验例2>
通常，食品加工工艺中通过将pH环境保持为酸性，使其不易发生杂菌污染引起的品质劣化，而且根据需要进行杀菌处理时可以使用温和的条件。因此，为了研究出芽短梗霉M-2的关于pH环境的培养条件，使用接种时初始pH不同的培养基，以实施例2的培养条件振荡培养至增殖稳定期，采集部分接种240小时后的培养液。以与上述比较例2同样的方法测定100g培养物中的β-葡聚糖含量，并且测定培养后的培养液的pH、粘度，其结果示于表3。此外，图5中表示出芽短梗霉M-2的培养中的培养液pH的经时测定结果。


肉眼观察中，由各接种时的初始pH得到的培养物的色调都为淡乳白色，没有发现显著差异。关于β-葡聚糖积聚量，虽然接种时的初始pH为4.5和8.5的培养中发现降低，但这时与作为亲株的出芽短梗霉M-1相比仍可以说是较高的浓度。此外，得到的培养液的粘度发现存在pH依存性，与亲株相比明显较高。另一方面，由图5可知，长时间培养后的培养液的pH表现出收敛于pH3.9～4.4的倾向，通过将前述培养液的接种时的初始pH设定在4.5～6.0的范围内，不需要人为的控制，也可以在pH4.5～6.0的范围的pH环境下进行培养。
由这些结果可知，出芽短梗霉M-2在pH4.5～6.0的范围的pH环境下其色素积聚性和β-葡聚糖积聚性不会受到影响，可以良好地进行培养。
<实施例3>
(掺入了含β-葡聚糖的组合物的高性能酸乳发酵引子)将实施例2中得到的出芽短梗霉M-2的培养物(1000g)在加压条件下于121℃杀菌15分钟后，将其中300g用搅拌机进行高速搅拌(1500rpm，20分钟)而低粘度化后，添加280g作为粉末化基剂的糊精(商品名“サンデツク”，三和淀粉工业公司制)和/或脱脂奶粉，用搅拌机均一混合。将其与其余的前述培养物(700g)混合后，进行冷冻干燥，粉末化，得到含β-葡聚糖的组合物。在其中加入155g糊精(商品名“サンデツク”，三和淀粉工业公司制)和/或脱脂奶粉、25g酸乳粉末(含酸乳发酵引子)、20g脱脂奶粉等，制成酸乳发酵引子。
该酸乳发酵引子为包含来源于短梗霉培养液β-葡聚糖的粘性和功能性的呈乳白色的酸乳发酵引子。
<实施例4>
(掺入了含β-葡聚糖的组合物的皮肤用保湿剂)通过离心分离从实施例2得到的出芽短梗霉M-2的培养物中除去菌体部分而制成溶液，在加压条件下于121℃杀菌15分钟。在30重量份该溶液中加入2重量份山梨糖醇、2重量份1，3-丁二醇、1重量份聚乙二醇、2重量份聚氧乙烯油烯基醚(ポリオキシエチレンイレイルエ一テル)、0.1重量份聚氧乙烯、10重量份乙醇、52.8重量份精制水，再适当添加pH调整剂、香料、防腐剂、防氧化剂，制成总体100重量份构成的增粘型柔软化妆水。
该化妆水为包含来源于β-葡聚糖的粘性和功能性的呈淡黄色的化妆水。
“序列表明细”序列编号1DNA正向引物ITS5。
序列编号2DNA反向引物ITS2。
序列编号3DNA正向引物ITS3。
序列编号4DNA反向引物ITS4。
序列编号5DNA正向引物NL1。
序列编号6DNA反向引物NL2。
序列编号7DNA正向引物NL3。
序列编号8DNA反向引物NL4。
序列编号9出芽短梗霉M-2的基因组DNA上编码的核糖体RNA基因区域(1)ITS-5.8区域部分的碱基序列。
序列编号10出芽短梗霉M-2的基因组DNA上编码的核糖体RNA基因区域(2)28SrRNA-D1/D2区域部分的碱基序列。
序列编号11出芽短梗霉M-1的基因组DNA上编码的核糖体RNA基因区域(1)ITS-5.8区域部分的碱基序列。
序列编号12出芽短梗霉M-1的基因组DNA上编码的核糖体RNA基因区域(2)28SrRNA-D1/D2区域部分的碱基序列。
产业上利用的可能性本发明的含β-葡聚糖的组合物具有保持增进健康和美容的功能性，可以用作饮食品、化妆品等。
PCT-AU-21/1PCT纸面的打印件(注意电子数据为原本)[该纸页不构成国际申请的一部分，不算入国际申请纸页的张数]
序列表<110>奥力有限公司(Aureo Co.Ltd.)<120>含β-葡聚糖的组合物、其制造方法以及含该组合物的饮食品或皮肤用保湿剂<130>MP-1909<160>12<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>DNA正向引物<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(22)<400>1ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22<210>2<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>DNA反向引物<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<400>2gctgcgttct tcatcgatgc20
<210>3<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>DNA正向引物<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<400>3gcatcgatga agaacgcagc20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>DNA反向引物<220>
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<223>DNA正向引物
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<400>5gcatatcaat aagcggagga aaag 24<210>6<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>DNA反向引物<220>
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<223>DNA正向引物<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(26)<400>7agatgaaaag aactttgaaa agagag 26<210>8
<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>DNA反向引物<220>
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1.含β-葡聚糖的组合物，其特征在于，由将变异株在液体培养基中进行培养而得到的培养物构成，β-葡聚糖含量在0.3质量％以上，所述变异株以属于短梗霉属(Aureobasidiumsp.)的微生物为亲株，通过采用紫外线照射处理或变异原性物质处理的突变制造方法培育得到，色素积聚性比亲株低。
2.如权利要求1所述的含β-葡聚糖的组合物，其特征在于，前述培养物的着色度以明度L*值计在10以上。
3.如权利要求1或2所述的含β-葡聚糖的组合物，其特征在于，前述亲株为属于出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)的微生物。
4.如权利要求1～3中任一项所述的含β-葡聚糖的组合物，其特征在于，前述变异株为出芽短梗霉M-2(AureobasidiumpullulansM-2)(FERM BP-10014)。
5.含β-葡聚糖的组合物的制造方法，其特征在于，将变异株在液体培养基中进行培养，使其在该培养物中生成0.3质量％以上的β-葡聚糖，所述变异株以属于短梗霉属(Aureobasidiumsp.)的微生物为亲株，通过采用紫外线照射处理或变异原性物质处理的突变制造方法培育得到，色素积聚性比亲株低。
6.如权利要求5所述的含β-葡聚糖的组合物的制造方法，其特征在于，前述培养物的着色度以明度L*值计在10以上。
7.如权利要求5或6所述的含β-葡聚糖的组合物的制造方法，其特征在于，前述亲株为属于出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)的微生物。
8.如权利要求5～7中任一项所述的含β-葡聚糖的组合物的制造方法，其特征在于，前述变异株为出芽短梗霉M-2(AureobasidiumpullulansM-2)(FERMBP-10014)。
9.如权利要求5～8中任一项所述的含β-葡聚糖的组合物的制造方法，其特征在于，在前述液体培养基的pH为4.5～6.0的状态进行培养。
10.如权利要求5～9中任一项所述的含β-葡聚糖的组合物的制造方法，其特征在于，包括在得到的培养物中添加维生素C和/或有机酸，pH调整至不到4.5，然后进行加热杀菌的工序。
11.饮食品，其特征在于，含有权利要求1～4中任一项所述的含β-葡聚糖的组合物。
12.皮肤用保湿剂，其特征在于，含有权利要求1～4中任一项所述的含β-葡聚糖的组合物。
13.属于短梗霉属(Aureobasidiumsp.)的微生物的变异株，它是以属于短梗霉属(Aureobasidiumsp.)的微生物为亲株、通过采用紫外线照射处理或变异原性物质处理的突变制造方法培育得到的变异株，其特征在于，色素积聚性比该亲株低，β-葡聚糖积聚性比该亲株高。
14.如权利要求13所述的微生物的变异株，其特征在于，前述属于短梗霉属(Aureobasidiumsp.)的微生物的变异株为出芽短梗霉M-2(AureobasidiumpullulansM-2)(FERM BP-10014)。
全文摘要
本发明利用属于短梗霉属的菌产生的β－葡聚糖。由属于短梗霉属的微生物，通过采用紫外线照射处理或变异原性物质处理的突变制造方法，培育出色素积聚性低的变异株。通过将该变异株在液体培养基中进行培养而得到的培养物不会呈现因黑色素样物质积聚而产生的强烈的暗绿色，而且形成β－葡聚糖含量高的组合物，可以作为具有含β－葡聚糖的组合物的生理活性功能的功能性食品直接摄取，也可以掺入饮食品、食品添加物、化妆品等中使用。
文档编号A23L1/30GK101068931SQ20058002976
公开日2007年11月7日 申请日期2005年8月3日 优先权日2004年9月9日
发明者守屋直幸, 守屋祐生子, 久保田浩二 申请人:奥力有限公司