释放甘露糖蛋白的酵母菌株和生产甘露糖蛋白的方法

专利名称：释放甘露糖蛋白的酵母菌株和生产甘露糖蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及酵母菌株以及通过使用该菌株生产甘露糖蛋白，尤其是含α-甘露聚糖的甘露糖蛋白的方法，该酵母菌株将酵母细胞壁组分，尤其是甘露糖蛋白，特别是含阿尔法(α)-甘露聚糖的甘露糖蛋白释放到培养基中。本发明还涉及生产甘露聚糖，特别是α-甘露聚糖的方法。
背景技术：
由于其高安全性，对酵母的使用已经有很长的历史，已经将其用于各种用途，例如提取物或酵母细胞壁，以及面包的生产或包括啤酒的酒精的发酵。该细胞壁主要由不溶性葡聚糖组成，主要用作食用纤维。还已知葡聚糖具有例如免疫刺激的功能，并且在最近的健康食品趋势下是一种值得注意的食物材料。另一方面，主要由甘露糖蛋白组成的水溶性多糖也存在于细胞壁。甘露糖蛋白是其中甘露聚糖链与位于细胞壁的蛋白以所谓的N-糖苷键或O-糖苷键的方式相连接的物质的总称。来自于酵母细胞的水溶性多糖的功能已被广泛研究，并有关于抗癌(经审查日本申请公开(JP-Kokoku)58-57153)、抗肿瘤(未审申请公开(JP-Kokai)58-109423、JP-Kokoku64-3479)、抗感染(JP Kokai58-109423)、抗高血压(JP Kokai63-10327)、抗植物病毒(JP Kokoku59-40126)功能等的报道。对于集中于甘露聚糖部分的研究，也有许多关于甘露聚糖部分的功能的报道，包括干扰素诱导活性(Acta Virology，1970；141-7)、巨噬细胞迁移抑制活性(Jpn.J.of Microbiol.1975；19355-362)、增加TNFα产生(Microbiol.Immunol.，2002；46(7)503-12)。
提取甘露聚糖的已报道的方法可以粗略地分为三类(1)热水(含稀碱)提取(JP Kokoku64-6479，JP Kokai58-109423)；(2)自溶(JP Kokoku58-57153)；(3)用细胞壁消化酶分解(JP Kokoku59-40126)。用这些方法获得的粗提物用于通过下列方式来回收功能组分形成甘露聚糖-铜复合物，通过盐酸、乙醇沉淀、离子层析、凝胶过滤层析、蛋白酶处理及这些方法的组合来去除蛋白。在这些方法中，纯化步骤繁重，产率约为100mg每1L培养基。
也有关于使用与甘露聚糖生物合成有关的不同酵母菌株来修饰甘露聚糖结构的技术的报道(JP Kokai2-419，JP Kokai6-277086，JP Kokai6-296482，JP Kokai9-135689，JPKokai9-266792)。至于甘露聚糖结构的差异，线性甘露聚糖的抗肿瘤活性(JP Kokai54-97692)、含磷酸盐的甘露聚糖对腹水瘤的抗肿瘤活性(JP Kokai58-121216)也已报道。
甚至为了有效地利用这些经验，已期望开发生产甘露糖蛋白的有效方法。
作为细胞外分泌甘露聚糖的酵母，已知RhodotorulamucilaginosaYR-2(Nihon Eiyou Shokuryou Gakkai-shi，Vol.55，33-99(2002)，JP Kokai2002-095492)。由该酵母生产的甘露聚糖是由β1，3-或β1，4-键重复构成的所谓的β-甘露聚糖，它不同于甘露糖蛋白中含有的细胞壁成分α-甘露聚糖。

发明内容
本发明的目的是提供释放处于与在酵母中的固有形态尽可能接近的形态的甘露糖蛋白(尤其是含有α-甘露聚糖的甘露糖蛋白)的酵母菌株，以及有效制造此类甘露糖蛋白(尤其是含有α-甘露聚糖的甘露糖蛋白)的方法。
本发明的另一个目的是提供甘露糖蛋白，尤其是含有接近天然形态的α-甘露聚糖的甘露糖蛋白，该甘露糖蛋白是使用该酵母菌株和/或本发明的方法生产的。这里的“阿尔法(α)-甘露聚糖”是指由阿尔法(α)-1，6-、阿尔法(α)-1，2-或阿尔法(α)-1，3键组成的D-甘露糖的聚合物。
本发明的另一目的提供有效制造甘露聚糖，尤其是α-甘露聚糖的方法。
本发明的又一目的是提供用本发明的方法生产的，接近天然形态的甘露聚糖，尤其是α-甘露聚糖。
在本发明中，除非另有说明，“甘露糖蛋白”和“甘露聚糖”分别是来自于酵母的甘露糖蛋白(酵母甘露糖蛋白)和来自于酵母的甘露聚糖(酵母甘露聚糖)。
本发明是将酵母细胞壁组分，尤其是甘露糖蛋白，特别是含α-甘露聚糖的甘露糖蛋白释放到培养基中的酵母菌株。更具体地，本发明是由于糖链合成基因的突变而将含有α-甘露聚糖的甘露糖蛋白释放到培养基中的酵母菌株。更具体地，本发明是将甘露糖蛋白释放到培养基中的酵母菌株，其在编码与甘露糖蛋白在细胞壁中的保留有关的蛋白的基因中具有突变。
特别地，本发明是将含有α-甘露聚糖的甘露糖蛋白释放到培养基中的酵母菌株，其在编码α1，2-甘露糖转移酶的基因中具有突变。更具体地，本发明是前述释放含有α-甘露聚糖的甘露糖蛋白的酵母菌株，其在编码α1，2-甘露糖转移酶的基因中具有突变，其中α1，2-甘露糖转移酶是由在严苛条件下可以与具有在SEQ ID NO17中所示序列的234至2081核苷酸序列(编码GPI10蛋白(Gpi10p)的区域)的核酸进行杂交的核酸编码的。
特别地，本发明的酵母是由保藏编号FERM BP-10390或FERM BP-10391规定的酵母。
本发明也是生产甘露糖蛋白，尤其是含有α-甘露聚糖的甘露糖蛋白的方法，其包括在液体培养基中培养将细胞壁成分释放到培养基中的酵母，尤其是将甘露糖蛋白，特别是含有α-甘露聚糖的甘露糖蛋白释放到培养基中的酵母；回收释放在培养基中的甘露糖蛋白，尤其是含有α-甘露聚糖的甘露糖蛋白。
本发明也是分离的甘露糖蛋白，尤其是分离的含有α-甘露聚糖的甘露糖蛋白，其用前述方法以与天然存在于细胞壁中的甘露糖蛋白接近的形态(以接近天然形态的形态)生产。
此外，本发明也是以与天然存在于细胞壁中的甘露糖蛋白中含有的甘露聚糖的形态接近的形态(以接近天然形态的形态)生产甘露聚糖，尤其是α-甘露聚糖的方法，其包括从本发明和/或由本发明获得的甘露糖蛋白，尤其是从由本方法获得的含有α-甘露聚糖的甘露糖蛋白以及甘露聚糖，尤其是α-甘露聚糖中去除蛋白部分的步骤。


图1是质粒YCp50-Chr.VII的示意图。
图2显示为确定与甘露糖蛋白释放有关的突变区域的用于质粒改组的染色体区域，和甘露聚糖释放拯救的结果。
图3示出Gpi10p中疏水区域的分布。
图4示出来源于MTY9菌株的各种甘露糖蛋白释放酵母菌株的系谱。
具体实施例方式
将细胞壁成分，尤其是甘露糖蛋白释放到培养基中的酵母是根据本发明生产的，并用于本发明。该酵母可以通过诱变酵母，然后筛选已失去在细胞壁中保留甘露糖蛋白能力的酵母菌株的方法获得。要诱变的酵母并不专门限定，但优选Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Saccharomyces paradoxus、Saccharomyces mikatae、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces kudriavzevii、Kluyveromyces lactis、Candida utilis或Candida albicans，最优选Saccharomyces cerevisiae。诱变可以通过传统方法如EMS或其它诱变处理、UV照射或射线照射而实现。通过这些方法在酵母诱变的方案为本领域熟练技术人员所熟知(Ishikawa et al.，Biseibutsu Idengaku Jikkenho，KyoritsuShuppan；Kaiser，C.et al.，1994，Methods in YeastGenetics，Cold Spring Harbor Laboratory)。
例如，用EMS诱变时，将几乎不释放甘露糖蛋白的酵母菌株如野生酵母菌株在YPD培养基中培养，并收获。将收获的细胞悬浮于4ml适当缓冲液如含有2％葡萄糖的0.2M磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，将甲磺酸乙酯(EMS)加入至最终浓度为1％至5％，或优选约3％。然后，将该悬浮液在30℃下搅拌30至90分钟以诱导突变。可以适当改变EMS的浓度和处理时间以达到存活率15％至60％或优选20％至30％。诱变后，用6％的硫代硫酸钠溶液中和EMS，将细胞涂布在适当的培养基如YPD培养基上。
本发明的酵母优选编码用于在细胞壁中保留甘露糖蛋白的必需位点的合成酶的基因例如，编码与糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚钩的生物合成有关的α1，2-甘露糖转移酶的基因(例如GPI10)中具有突变的菌株，这些菌株已失去在细胞壁中保留甘露糖蛋白的能力。由GPI10编码的GPI蛋白(GPi10p)是由616个氨基酸构成的膜蛋白，其包含多个跨膜结构域。在此基因中的缺陷通常是致命的，因此它明显具有存活所必需的功能。在本发明的一个实施方案中，本发明的酵母是在GPI10中具有突变且在细胞壁中不能保留甘露糖蛋白，但保留存活所必需功能的活酵母，因此，本发明中的酵母可以通过任意的诱变，或定向于编码α1，2-甘露糖转移酶的基因(GPI10)的位点定向诱变获得。这种分子生物学的技术为本领域熟练技术人员所熟知。在本发明特别优选的实施方案中，本发明的酵母是在GPI10基因中具有突变，以致SEQ ID NO18的氨基酸序列中的位置498处的脯氨酸残基用亮氨酸残基所取代的酵母。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的酵母是在具有α1，2-甘露糖转移酶活性的蛋白中和编码该蛋白的基因中存在突变的酵母，该蛋白由在严苛条件下能与具有SEQ ID NO17序列中的234-2081核苷酸序列(编码Gpi10p的区域)的核酸进行杂交的核酸编码。如在本说明书中使用的，严苛条件是指这样的条件，在该条件下所谓的特异性杂交可以形成，而非特异性杂交不能有效地形成。例如，严苛的条件是那种高度同源的DNA(例如，具有至少70％或优选至少80％同源的DNA)优先互相杂交，而具有更低同源性的DNA明显地不能互相杂交的条件，或温度和盐浓度对应为50℃，2×SSC、0.1％SDS，或优选1×SSC、0.1％SDS，或更优选0.1×SSC、0.1％SDS的杂交条件。与这些相当的条件也可以容易为该领域熟练技术人员所理解(参见例如Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，2nd Ed.(1989)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，andAusubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994))。
就氨基酸序列而言，在本发明中，具有与SEQ ID NO18中的氨基酸序列显示至少40％同源性序列的多肽可被认为是α1，2-甘露糖转移酶候选者，而可以将编码这种多肽的基因当作编码1，2-甘露糖转移酶的基因。核酸或氨基酸的同源性可以使用BLASTN、BLASTP、FASTA等计算，其在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankOverview.html)中或DDBJ(http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html)中给出。
例如，通过使用这些程序，已不仅在Saccharomycescerevisiae中，而且在Saccharomyces paradoxus、Saccharomyces mikatae、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces kudriavzevii和Kluyveromyces lactis中发现高度同源基因。与Gpi10p具有同源性的蛋白的其它实例包括Neurospora crassancu00193.1、Schizosaccharomycespombe_972hSPCC16Λ11.06c和Candida albicansca4431。另外，作为与Gpi10p具有同源性的蛋白，在Saccharomycescerevisiae中发现SMP3和ALG9。
例如，Saccharomyces paradoxus gbAABY01000142.1与SEQ ID NO18的氨基酸序列具有88％的同源性，与SEQ IDNO18的氨基酸序列相比，Saccharomyces mikataegbΛΛBZ01000054.1具有86％同源性，Saccharomycesbayanus gbAACG01000485.1具有85％同源性，Saccharomyces kudriavzevii gbAAC101000185.1具有84％同源性，Kluyveromyces lactis gi49643748具有68％同源性，Neurospora crass ref-NW_04710.1具有50％同源性，Schizosaccharomyces pombe ref-NC_00342 1.1具有41％同源性，以及Candida albicans gbAACQ01000012.1具有49％同源性。SMP3和ALG9与SEQ ID NO18的氨基酸序列的同源性分别为40％和43％。
对于由在严苛条件下与具有SEQ ID NO17序列中的234-2081核苷酸序列(编码Gpi10p的区域)的核酸杂交的核酸编码的蛋白，及与SEQ ID NO18序列显示40％以上序列同源性的蛋白，可以通过以下方式确认它们具有α1，2-甘露糖转移酶活性将具有适当的启动子和表达所必需的其它序列的核酸引入到通常可获得的α1，2-甘露糖转移酶-缺失的酵母菌株(例如Euroscarf Y24509)中，确认将缺失菌株的α1，2-甘露糖转移酶互补(尤其对致死是互补)。
如在本说明书中使用的，具有α1，2-甘露糖转移酶活性的蛋白总称为α1，2-甘露糖转移酶。
在本发明的另一个优选的实施方案中，本发明的酵母是具有在α1，2-甘露糖转移酶基因中以亮氨酸残基取代了脯氨酸残基的突变的酵母，该α1，2-甘露糖转移酶基因具有能够在严苛条件下与具有SEQ ID NO17序列中的234-2081核苷酸序列(编码Gpi10p的区域)的核酸杂交的核酸的核苷酸序列，其中脯氨酸残基对应于在SEQ ID NO18中示出的序列中的脯氨酸498。对应于在SEQ ID NO18中示出的序列中的脯氨酸498的脯氨酸残基可以通过比对氨基酸序列来测定。
这种候选酵母菌株的甘露聚糖释放性质可以通过下述方法分析例如在适当的培养基如合成培养基(Difco的无氨基酸无硫酸氨酵母氮源(Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino acidand Ammonium sulfate)0.17％、葡萄糖2％、氨基酸0.13％)中，于约30℃下培养候选酵母2-4天，通过加入2到3倍体积的乙醇沉淀悬浮物(乙醇沉淀)，接着进行SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)和PAS染色等。培养基和培养温度可以是不抑制酵母增殖并优选适于酵母增殖的那些。可以选择被确认为比亲本(野生型)菌株释放更多甘露糖蛋白于培养基中的菌株，并用作本发明的酵母。
可通过将本发明的酵母与突变或野生型酵母菌株进行回交或杂交(mating)来增加或从本发明的酵母中去除其它特性。例如，通过使用本发明中的酵母菌株之一作为亲本进行杂交，可以制备释放更多甘露糖蛋白、生长更快、或具有改进的营养缺陷型的甘露糖蛋白释放酵母，或具有增加或改进其它性质的甘露糖蛋白释放酵母，或其它二倍体菌株。用于杂交酵母的方法和条件为本领域熟练技术人员所熟知(Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994))。
发明人事实上使用MTY9作为起始材料来制备释放甘露糖蛋白，尤其是α-甘露糖蛋白(图4)的各种衍生菌株。
可用于本发明并释放甘露糖蛋白，尤其是包括α-甘露聚糖的甘露糖蛋白的酵母的典型实例包括由下面保藏编号规定的酵母。
S.cerevisiae MTY9[MATa gpi10 ura3 trp1]保藏编号FERMBP-10391和S.cerevisiae AB9(同源二倍体菌株)[MATa/a gpi10/gpi10 ura3/URA3l eu2/LEU2]保藏编号FERMBP-10390该AB9菌株尤其理想，因为它释放大量的甘露糖蛋白，尤其是含有α-甘露聚糖的甘露糖蛋白，生长良好，且不是营养缺陷型。MTY9和AB9都可以用作制备释放甘露糖蛋白，尤其是含有α-甘露聚糖的甘露糖蛋白的酵母的起始材料。
得到的酵母可以在有氧条件下，在液体培养基如合成培养基(Difco的无氨基酸和无硫酸铵酵母氮源0.17％、葡萄糖2％、氨基酸0.13％)中，于30℃下生长优选至少24小时，或更优选24-96小时，或进一步更优选24到72小时，此后，可除去酵母细胞，通过离心和/或过滤收集培养物上清液，用超滤膜过滤后作为残余物或从乙醇/水溶液如2∶1乙醇/水溶液(乙醇浓度为66.7％(V/V))中作为沉淀物回收甘露糖蛋白。进行超滤的分子质量阈值约为10000，或优选约50000。培养基和培养温度可以是不抑制酵母增殖，优选适合酵母增殖的那些。
由此通过超滤回收的甘露糖蛋白可以在用适量的水稀释后干燥。乙醇沉淀物可以溶解在水中，并用例如冷冻干燥法干燥。通过乙醇沉淀获得的干燥的甘露糖蛋白的形态是白色的、含约10％的蛋白的高度水溶性粉末。用本发明的酵母和本发明的方法，当使用典型的合成培养基时，通过培养24到72小时，可以在培养基中获得至少150mg/l至900mg/l，优选200mg/l至880mg/l(换算为甘露糖的量)的甘露糖蛋白。更具体地，根据培养条件，通过24小时培养，可以获得至少150mg/l至300mg/l(换算为甘露糖的量)甘露糖蛋白，通过72小时培养，可以获得至少150mg/l至900mg/l或优选200mg/l到880mg/l(换算为甘露糖的量)甘露糖蛋白。
由于通过其本性，本发明的酵母随其增殖向培养基中释放甘露糖蛋白，即，随着细胞壁合成的进展，在培养物上清液中的甘露糖蛋白的浓度和总量可通过调节培养条件进一步增加。
用此方法获得的甘露糖蛋白没有经过任何化学和/或物理处理，并且是与存在于细胞壁中的天然甘露糖蛋白的形态接近的形态，其可以用于食品工业中的食品和饮料中。
另外，处于接近天然形态的形态的已分离的甘露聚糖可以通过本发明或通过从由本发明的酵母释放的甘露糖蛋白，尤其是含有α-甘露聚糖的甘露糖蛋白中去除蛋白部分来获得。可选择地，可以通过从具有各种结构的甘露糖蛋白中去除蛋白部分来获得甚至更有用的已分离的甘露聚糖。
可以通过本领域熟练技术人员所熟知的任何方法从甘露糖蛋白中去除蛋白部分，但是尤其理想的是采用不会明显改变甘露聚糖部分的结构的方法。从甘露糖蛋白中去除蛋白部分可以通过用糖链切除酶如内切糖苷酶的部分水解，或通过酸或碱处理来实现。
实施例实施例1释放甘露糖蛋白的酵母的生产1)诱变将野生型酵母菌株YNN27在YPD培养基中培养并收获，然后悬浮于4ml含有2％葡萄糖的0.2M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)中，并悬浮于甲磺酸乙酯中至浓度为3％。通过在30℃下振摇70分钟诱导诱变。诱变后，用6％的硫代硫酸钠溶液中和EMS，将细胞涂布在YPD培养基上。长出的129个酵母菌株用作候选菌。
2)筛选分离候选酵母菌株，通过在10ml合成培养基(无氨基酸酵母氮源0.67％、葡萄糖2％、氨基酸0.13％)中，于30℃下振摇三夜来培养每个菌株。将培养液在6000rpm下离心5分钟，将上清液通过0.45μm圆盘过滤器过滤，以彻底除去酵母。向滤出的上清液中加入20ml乙醇，使其在-30℃放置过夜。第二日，于7000rpm下离心15分钟后，弃去上清液。沉淀用66.7％的乙醇洗一次，悬浮于100μl水中。将该悬浮物用作来自培养物的乙醇沉淀样品(此后称为“样品A”)。
将这样获得的每一个样品与等体积的2×SDS-PAGE样品缓冲液(15％甘油、0.125mM Tris/Cl pH6.8、5mM Na2EDTA、2％SDS、0.1％BPB、1％2-巯基乙醇)混合，在用于测试前在100℃水浴中煮沸3分钟。
将这样获得的样品根据附于Glycoprotein Detection Kit(SIGMA，Cat#GLYCO-PRO)的方案分析。
与样品缓冲液混合的10μl样品A以18mA每凝胶(per gel)在Pre-cast SDS-PAGE 4-12％梯度凝胶(Cat.No.01 032，TEFCO)上进行电泳约2小时。电泳完成后，将丙烯酰胺凝胶从组件中取下，通过在50％甲醇中振摇1小时来固定。将甲醇-水弃去，加入新鲜的水，然后振摇20分钟。重复该步骤，然后用氧化溶液置换水，振摇1小时。重复用水洗两次，每次20分钟，再用显色溶液置换水，振摇1小时显色。目测评价结果。
由此，在所测试的129个酵母菌株中，获得了三个明显释放甘露糖蛋白的菌株。也观察到野生型菌株同样向培养基中稍微释放甘露糖蛋白。将所获得的甘露糖蛋白释放酵母菌株之一(菌株MTY9)，用于进一步生产各种衍生菌株。
3)甘露聚糖的定量甘露糖蛋白中甘露聚糖的定量用如下所述的DIONEX离子层析进行。
制备如2)中所述的来自培养物溶液的乙醇沉淀样品(样品A)。同样分析通过过滤培养物获得的上清液(样品B)。
向50-60μl样品A中加入2ml 2N三氟乙酸(Riedel-de-Haen61030)，将样品冷冻，减压，在水解试管中于100℃下水解16小时。向2ml样品B中加入400μl TFA，将样品冷冻，减压，在水解试管中于100℃下水解16小时。
水解完成后，使样品冷却至室温，转移到一次性15ml-离心管中，在离心蒸发器中干燥。干燥后，将样品溶解在5ml水中，施加于Sep-pak C18柱上(WAT020515用5ml甲醇和5ml水平衡)，通过45mm样品过滤器过滤，并用作离子层析的样品。
将20、40和60ppm的葡萄糖和甘露糖的单糖标准溶液分别用作定量的标准，当样品不在标准曲线的范围内时，可进行必要地稀释。
所使用的设备为GP50，Dionex的离子层析装置，将电流分析检测器ED-40用作检测器。对于流动相，将Milli Q水用作溶液A，200mM氢氧化钠溶液用作溶液D，A∶D的比例从开始至30分钟为95∶5，30分钟至45分钟之间为0∶100，45分钟至70分钟之间为95∶5。从用标准溶液制作的标准曲线来测定定量值，以计算在每一样品中的含量。
葡萄糖和甘露糖的峰分别在18分钟和20分钟出现，在该浓度范围的线性非常良好，由约0.999的相关系数所显示。
分析来自于甘露糖蛋白释放酵母菌株MTY9的样品A。其主要构成单糖为甘露糖，甘露糖与葡萄糖的比例为约90∶10。对来自于同一菌株的样品B进行类似的分析。甘露糖与葡萄糖的比例为35∶65。
培养基中的甘露糖浓度为13.4mg/l，其是野生型的培养物上清液中的浓度的约4倍。
4)各种衍生菌株的生产将通过诱变处理直接获得的MTY9菌株，与野生型菌株AH22杂交以提高甘露糖蛋白的释放性质，并去除引起释放甘露糖蛋白之外的其它突变。将根据传统方法杂交得到的二倍体菌株进行减数分裂，在显微镜下用显微操作器分离囊孢子。测定源自每一个囊孢子的酵母菌株的甘露糖蛋白释放性质。
将YNN27或AH22与这样获得的MT26-14C杂交，最终获得MT39-6A和MT41-10D。这些菌株是单倍体，且为营养缺陷型，而它们的生长和甘露糖蛋白释放性质是良好的。通过进一步杂交这些菌株，获得二倍体菌株AB9，它不是营养缺陷型。AB9菌株不具有营养缺陷型，生长良好，并稳定地释放甘露糖蛋白，其尤其适于工业应用。
这些菌株的繁殖在图4中示意性地示出。在这些菌株中，MTY9和同源二倍体菌株AB9保藏在独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託セン夕一(日本国茨城県つくば市東1-1-1中央第6、郵便番号305-8566)(International Patent OrganismDepositary，National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology(Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan))，保藏编号如下。
S.cerevisiae MTY9(gpi10)[MATαgPi10 ura trpl]保藏编号FERMBP-10391，和S.cerevisiae AB9[MATa/αgPi/gPi10 ura3/URA3 leu2/LEU2]保藏编号FERMBP-10390。
AB9最初于2004年7月13日保藏在独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託它ン夕一，指定的保藏编号为FERMP-20116，又于2005年8月3日变更为国际保藏，保藏编号变更为FERM BP-10390。MTY9最初于2004年7月13日保藏在独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託セン夕一，指定的保藏编号为FERMP-20116，于2005年8月3日变更为国际保藏，保藏编号为FERM BP-10391。
实施例2突变基因和位点的鉴定1)突变基因的鉴定将源自YCp50、ATCC37415的酵母染色体库引入甘露聚糖释放酵母MTY9，以筛选失去甘露聚糖释放性质的菌株。将酵母染色体库引入酵母根据传统的方法(Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994))进行。
使用RPM Yeast Plasmid Isolation Kit(2069-400)(Q-BIOgene)，以依赖于含有酵母染色体片段的质粒的方式，从失去甘露聚糖释放性质的菌株中回收质粒，鉴定包含插入片段区域的DNA序列。用Prism3100Avant (AppliedBiosystems)和Big Dye Terminator Kit ver.3.0(4390242)(Applied Biosystems)分析核酸序列。
所使用的引物序列为CCCAGTCCTGCTCGCTTCGCT(正向引物)(SEQ ID NO1)和GTCGGCGATATAGGCGCCAGC(反向引物)(SEQ ID NO2)。通过使用Blastn程序，对于核苷酸序列对Saccharomyces Genome Database(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)的同源性进行搜索，其表明插入的片段是7号染色体的DNA片段。质粒YCp50-Chr.VII的结构示于图1，其是以质粒依赖的方式从失去甘露聚糖释放性质的菌株中回收的。
包含在此片段中的蛋白编码区域(ORF)只有YGL141和YGL142两种。这些区域的片段用限制性酶产生，以确定哪个ORF能够与突变互补，这表明显示互补的ORF是YGL142，即GPI10基因(图2)。
GPI10与GPI的合成有关，一般认为，在MYT9和它的衍生菌株中，由于GPI锚钩生物合成不充分，甘露糖蛋白不能锚钉在细胞壁上，并释放到培养基中。
2)突变位点的鉴定分别从甘露糖蛋白释放菌株MT37-2B(通过回交MTY9产生的菌株)中和从野生型菌株中回收GPI10基因，以鉴别突变位点。
使用AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)，通过PCR进行基因回收。在第一轮PCR中，来自已诱变酵母菌株和野生型菌株的染色体DNA分别用作模板，扩增含有GPI10 ORF上游1000个碱基和下游300个碱基的片段(3141bp)，用引物组F1和R1，全长核苷酸序列用F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7确定，它们以500bp的间隔设计。
每个引物的序列如下F1GGAGCAATATGATTGTTGAAGTTTGG(SEQ IDNO3)F2AATAGATTAATTTGCCCC(SEQ ID NO4)F3ATGGCTCACGAGGTTCAT(SEQ ID NO5)F4ACTTGATAAGAGAAACGA(SEQ ID NO6)F5TTTCTTTCAAAGCTTACC(SEQ ID NO7)F6CATTTACTTGGAGACCCA(SEQ ID NO8)F7TCTGTACTAGGCTGAGTA(SEQ ID NO9)R1TTGTTCTGCTCTACGAACTTTTCA(SEQ IDNO10)R2GGCTGTATGTTTTACCTG(SEQ ID NO11)R3ACAGATTCAACAAGATAG(SEQ ID NO12)R4TCAAAAGAGTTGATGAAC(SEQ ID NO13)R5CAATGTGCCGGCTCCAAT(SEQ ID NO14)R6AGATAAGCTCAAAGAAGA(SEQ ID NO15)R7TACTTGCCGAAAGAAACC(SEQ ID NO16)
在亲本YNN27中，序列100％对应于数据库中GPI10中的核苷酸序列(SEQ ID NO17的234至2081核苷酸，Gpi10p通过此序列编码)，仅在已诱变酵母菌株中发现在核苷酸序列中的两个不同的位置。一个是在ORF上游78个碱基处的单碱基取代，另一个是在ORF中的突变。
为了确定哪个突变决定甘露糖蛋白释放性质，将回收的基因进行亚克隆，并用于质粒改组。通过使用TOYOBO KOD+根据所附的方案进行基因的回收。确定核苷酸序列以证实它不包含其它突变，进行亚克隆以产生用于改组的质粒。将这些质粒再次引入本发明的酵母菌株(MT37-2B)中，用PAS染色来检验甘露聚糖释放性质。虽然用仅在ORF上游区域具有突变的质粒将甘露糖蛋白释放性质抑制到野生型的水平，但是使用在ORF中具有突变的质粒才释放甘露糖蛋白，这表明ORF中的突变决定甘露聚糖的释放。
根据Gpi10p的氨基酸序列，认为它是一种多次穿越膜的膜蛋白。MTY9菌株中的突变显示为位于C-末端区域的脯氨酸被亮氨酸所取代(图3)。对此，野生型Gpi10p的氨基酸在SEQ IDNO18中示出。SEQ ID NO18的氨基酸序列是由SEQ IDNO17中示出的234至2081核苷酸编码的序列。
实施例3从本发明的酵母菌株中回收甘露糖蛋白I甘露糖蛋白释放菌株AB9在Erlenmeyer烧瓶中的1L合成培养基(无氨基酸无硫酸铵酵母氮源0.17％、葡萄糖2％、氨基酸0.13％)中，于30℃下旋转培养10天，间隔取样。甘露糖蛋白的释放通过如实施例1中所述的SDS-PAGE测定。开始培养后约40小时，细胞生长从对数期转移到稳定期，甘露糖蛋白的量的增加与细胞的生长有关。细胞培养完成后，发现每1L培养物上清液中回收约150mg(换算为甘露糖)甘露糖蛋白，根据实施例1中所述的方法定量。
实施例4从本发明的酵母菌株中回收甘露糖蛋白II甘露糖蛋白释放菌株AB9在发酵罐中在2L合成培养基(无氨基酸无硫酸铵酵母氮源0.17％、葡萄糖2％、氨基酸0.13％)培养(30℃、pH5.5、通气体积1vvm、以200rpm搅拌、72小时)，培养基中的甘露糖蛋白如实施例3所述类似地定量。从而显示每1L培养物上清液中回收约230mg(换算为甘露糖)甘露糖蛋白。
实施例5从本发明的酵母菌株中回收甘露糖蛋白III甘露糖蛋白释放菌株AB9在发酵罐中使用2L合成培养基(无氨基酸无硫酸铵酵母氮源0.51％、葡萄糖6％、氨基酸0.4％)培养(30℃、pH5.5、通气体积1vvm、以200rpm搅拌、72小时)，培养基中的甘露糖蛋白如实施例3所述类似地定量。从而显示每1L培养物上清液中回收约880mg(换算为甘露糖)甘露糖蛋白。
实施例6释放的甘露糖蛋白的分析为了评价使用切除酶从回收的甘露糖蛋白中切割甘露聚糖的可能性，将回收的甘露糖蛋白用内切糖苷酶H(EndoH)处理，并电泳，随后通过PAS染色。
通过实施例1中所述的方法，从MTY9的培养基中制备乙醇沉淀样品。根据制造商推荐的方案，用EndoH(P0702S，NewEngland Biolabs)酶处理乙醇沉淀的样品。即，向36μl溶液A中加入4μl10×变性缓冲液(5％SDS、10％β-ME)，接着于100℃煮沸10分钟。向样品中加入5μl10×G5缓冲液(0.5M柠檬酸钠，pH5.5)，然后将样品进行涡旋，分为25μl和20μl的部分。将25μl的样品于37℃下放置1小时作为阴性对照。向剩余的20μl部分中加入5μl EndoH并在37℃下培育1小时。培育后，向每一样品中加入等体积的2×SDS-PAGE样品缓冲液，根据如实施例1中所述的类似方法进行电泳和PAS染色。
结果确定能在PAS染色中被染色的甘露糖蛋白的迁移率通过EndoH处理而显著变化，这表示蛋白的质量通过甘露聚糖的切离而降低。
2)蛋白含量和甘露糖蛋白的氨基酸组成通过在6L合成培养基(无氨基酸无硫酸铵酵母氮源0.17％、葡萄糖2％、氨基酸0.13％)中培养甘露聚糖释放酵母菌株MT36-4D(MAta ura3，见图4)获得的培养物上清液中回收甘露糖蛋白。将甘露糖蛋白水溶液在冷冻干燥器中干燥以制备样品(1.05g)。
向样品中加入0.5ml12 N的盐酸，样品于110℃下水解22小时，用氨基酸分析仪(JLC-500/V，JEOL DATUM LTD.)分析氨基酸组成。结果示于表1。通过乙醇沉淀回收的甘露糖蛋白中蛋白的含量为约10％。丝氨酸和苏氨酸作为氨基酸组成相对丰富。
表1氨基酸组成


实施例7甘露糖蛋白回收条件的优化1)超滤中的截断分子量将甘露聚糖释放菌株MT36-4D(MAta ura3，见图4)在Erlenmeyer烧瓶中在6升合成培养基(无氨基酸无硫酸铵酵母氮源0.17％、葡萄糖2％、氨基酸0.13％)中按实施例3所述培养。通过过滤从培养物中除去酵母细胞，以获得培养物上清液，将其用作样品。将二(2)ml样品加载于超滤柱Centricon(YM50、YM10、YM-3)上。通过在建议条件(YM-505000×g、15分钟；YM-105000×g、1小时；YM-37500×g、2小时)下离心进行超滤。分别收集滤液和残余物溶液，调节至2ml，加入400μl 12N的TFA后冷冻并减压，在水解试管中于100℃下水解16小时。水解后将样品在离心蒸发器中干燥以制备由离子层析分析的分析样品。结果示于表2。百分之九十(90％)以上的甘露糖存在于分子量为10000以上的部分中，葡萄糖广泛存在于分子量更宽的范围中。尽管大多数甘露糖蛋白是从具有分子量为50000以上的部分中回收的，但显示为了有效地回收甘露糖蛋白，超滤优选在使分子量为10000以上的部分能够被分离的条件下进行。
表2甘露糖部分的分子量分布

2)乙醇沉淀中的乙醇浓度将甘露聚糖释放菌株MT36-4D(MAta ura3，见图4)在Erlenmeyer烧瓶中在6升合成培养基(无氨基酸无硫酸铵酵母氮源0.17％、葡萄糖2％、氨基酸0.13％)中按实施例3所述培养。通过过滤从培养物中除去酵母细胞，以获得培养物上清液。向10ml上清液中加入100％乙醇(Wako Pure Chemicals)使最终浓度分别为33％、50％、60％、66.7％和80％(v/v)，使其于-30℃下放置过夜。第二日，将其在7000rpm下离心15分钟，将上清液弃去。将沉淀用66.7％乙醇洗一次，在进行SDS-PAGE和PAS染色前悬浮于100μl水中。
结果表明甘露糖的回收在大于60％的乙醇浓度下是有利的，尤其是在乙醇浓度为66.7％或80％时有效回收甘露糖。
本发明提供向培养基中释放甘露糖蛋白，尤其是含有α-甘露聚糖的甘露糖蛋白的酵母，和生产甘露糖蛋白以及分离具有与天然形态接近形态的甘露糖蛋白的方法。即，本发明提供1)向培养基中释放甘露糖蛋白，尤其是含有α-甘露聚糖的甘露糖蛋白的酵母；和2)有效生产甘露糖蛋白的方法，该方法包括从已培养前述酵母的培养基中回收甘露糖蛋白，这与以前闩物理或化学处理回收甘露糖蛋白的方法形成对比。
特别地，由于本发明的酵母能够不断培养，所以能够根据本发明不断获得甘露糖蛋白，尤其是含有α-甘露聚糖的甘露糖蛋白。可使用向培养基释放甘露糖蛋白的本发明的酵母以用于繁殖有用的酵母菌株。例如，通过回交本发明的酵母，或将其与突变酵母或与野生型菌株或其类似物进行杂交，本发明的酵母可用作亲本菌株，以产生引入或去除其它特性的新的酵母菌株。
另外，可以通过将蛋白部分从具有与天然形式接近形式的甘露糖蛋白中去除，来提供具有与天然形式接近形式的已分离的甘露聚糖，其可以通过培养根据本发明的酵母来获得。
参考1.JP-特开昭2002-095492。
2.Nihon Eiyou Shokuryou Gakkai-shi，Vol.55，33-99(2002)。
序列表<110>朝日啤酒株式会社(Asahi Breweries，LTD.)独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of AdvanceIndustrial Science and Technology)<120>释放甘露糖蛋白的酵母菌株和生产甘露糖蛋白的方法<130>Y1M0644<150>JP 2004-250129<151>2004-08-30<160>18<170>PatentIn version3.2<210>1<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>1cccagtcctg ctcgcttcgc t 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>PCR引物<400>5atggctcacg aggttcat 18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
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<221>CDS<222>(234)..(2081)<400>17tttaagtcag aatcctttga aatgctgctt gagataaatt ataacgcttt gccactcgaa 60tgaagttata ggcgagtcat ccttaaaagt ttaagtgaga tcgttatagt gcggaaaagg120cgaactttta aggtaaaaga aattcaagcc attcacacca tgaggaacgg aaaaagataa180aaggcattaa gatagtgtag gattgtgtaa tccaacataa tatctaactt tca atg 236Met
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<212>PRT<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>18Met Ala His Glu Val His Arg Ile Lys Pro Lys Leu Gly Arg Thr Gln1 5 10 15Ile Phe Trp Val Phe Leu Ala Phe Arg Val Leu Asn Ala Val Leu Thr20 25 30Arg Thr Phe Phe Gln Ala Asp Glu Phe Trp Gln Ala Leu Glu Pro Ala35 40 45His Trp Lys Ala Phe Lys Tyr Gly Glu Leu Thr Trp Glu Trp Lys Phe50 55 60Gly Val Arg Ser Tyr Leu Phe Pro Met Ile Phe Glu Leu Thr Tyr Arg65 70 75 80Leu Val Ser Leu Ser Ser Ile Leu Leu His Tyr Ala Leu Leu Leu Leu85 90 95Ser Thr Ile Gly Ser Asp Leu Leu Ile Leu Leu Leu Pro Lys Tyr Glu100 105 110Leu Ser Trp Gln ValAla Glu Asp Leu Lys Arg Leu Pro Phe Asp Val115120 125Thr Arg Ser Phe Glu Tyr Tyr Gly Val Ile Tyr Ala Pro Lys Ile Val130 135 140Met Ala Val Leu Ala Ser Ile Gly Glu Tyr Tyr Ile Val Arg Phe Val145 150 155 160Gln Lys Leu Tyr Leu Leu Thr Leu Asp Lys Arg Asn Glu Lys Glu Glu165 170 175Glu Glu Arg Arg Ser Gly Leu Ser Glu Ile Thr Lys Phe Ala Leu Leu180 185 190Leu Ser Leu Thr Asn Phe Phe Asn Cys Phe Phe Ile Thr Arg Thr Phe195 200 205
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1.一种酵母，其向培养基中释放含α-甘露聚糖的甘露糖蛋白，其在糖链合成基因中具有突变。
2.根据权利要求1所述的酵母，其中，该糖链合成系统基因是编码α1，2-甘露糖转移酶的基因，所述α1，2-甘露糖转移酶是由在严苛条件下与具有在SEQ ID NO17中所示序列的No.234至2081核苷酸序列的核酸杂交的核酸编码的。
3.根据权利要求2所述的酵母，其中，该α1，2-甘露糖转移酶具有在SEQ ID NO18中所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求2所述的酵母，其中，α1，2-甘露糖转移酶具有在SEQ ID NO18中所示的氨基酸序列，且该突变是将该序列中498脯氨酸替换为亮氨酸残基。
5.根据权利要求1至4任一项所述的酵母，其是选自由Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Saccharomyces paradoxus、Saccharomyces mikatae、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces kudriavzevii、Kluiveromyces lactis、Candida utilis、Candida albicans组成的组中。
6.根据权利要求5所述的酵母，其为Saccharomycescerevisiae。
7.根据权利要求6所述的酵母，其保藏编号为FERMBP-10390或FERM BP-10391。
8.一种生产甘露糖蛋白的方法，其包括培养根据权利要求1至7任一项所述的酵母，回收释放到培养基中的甘露糖蛋白。
9.一种生产α-甘露聚糖的方法，其包括培养根据权利要求1至7任一项所述的酵母，回收释放到培养基中的甘露糖蛋白，将甘露糖蛋白中的甘露聚糖从蛋白部分切割并回收甘露聚糖。
10.根据权利要求9所述的生产α-甘露聚糖的方法，其中，将甘露糖蛋白中的甘露聚糖从蛋白部分中切割是通过将糖链切除酶作用于甘露糖蛋白，或用酸或碱处理甘露糖蛋白实现的。
全文摘要
本发明意在提供能够释放大量处于与酵母中的固有形态尽可能接近的形态的甘露糖蛋白(尤其是含有α－甘露聚糖的甘露糖蛋白)的酵母菌株，及有效制造这种甘露糖蛋白，尤其是含有α－甘露聚糖的甘露糖蛋白的方法。更具体地，由于在糖链合成相关基因中的突变而能够向培养基中释放含有α－甘露聚糖的甘露糖蛋白的酵母，和有效生产该甘露糖蛋白的方法。
文档编号C12P19/00GK101018852SQ20058002929
公开日2007年8月15日 申请日期2005年8月29日 优先权日2004年8月30日
发明者田中美和, 小谷哲司, 结城敏文, 大竹康之, 新间阳一, 横尾岳彦, 千叶靖典, 地神芳文 申请人:朝日啤酒株式会社, 独立行政法人产业技术综合研究所