使用微孔芯片的筛选方法及筛选装置的制作方法

专利名称：使用微孔芯片的筛选方法及筛选装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用微孔芯片，筛选具有酶活性的蛋白质或产生具有酶活性蛋白质的微生物的方法及用于此种微生物筛选的装置。本发明还涉及确认微生物在细胞膜表层表达具有酶活性的蛋白质或分泌表达具有酶活性的蛋白质的方法及装置。
背景技术：
以往，关于筛选具有有用功能的微生物(例如产生有用蛋白质的微生物)的技术，通常的方法是将微生物涂在琼脂培养皿上，加以某种选择压，以确认其是否增殖，或添加基质，例如确认是否形成晕圈等的方法。通过此种方法筛选目的微生物。但是，此种方法具有如下问题，需要大量的琼脂培养皿，制作琼脂培养皿、播种菌株需要很多劳力、时间和成本。
近来，用基因组学或蛋白组学分析大量基因、蛋白质的功能时，需要使用微量样品进行高速分析。为适应此需求，正在推进对微量且高速分析用的DNA芯片和蛋白芯片等的开发。由于微细加工技术的进步，制备极微小的孔(chamber)(well)已成为可能。并且利用CCD照相机及计算机处理，可进行定性、半定量的分析。
非专利文献1中报道了如下技术，实际使用此种微孔芯片技术，进行1细胞PCR、或进行无细胞系蛋白合成、或检测加入细胞的荧光发色细胞等。且此非专利文献1中也报道了，将改变了的基因全部导入大肠杆菌或酵母，可对表达了的蛋白的功能进行分析。
伴随此种技术的进步，可一次性筛选多数基因或蛋白质、可短时间间进行功能分析的高通量筛选法已为人瞩目。现在的高通量筛选法是将大量化合物使用96孔或384孔的板、使用自动化装置进行筛选的方法。非专利文献2中报道了使用无细胞蛋白质合成系统合成蛋白质的高通量筛选技术。
非专利文献1《特集组合生物工程》，生物产业，2001年，18卷，6月号，7～17页，56～72页(日语原名「特集コンビナトリアル バイオエンヅニアリング」、バイオインダストリ一、2001年、18卷、6月号、7～17頁、56～72頁)非专利文献2Nippon Nogeikagaku Kaishi，Vol.78，No.5，27～30(2004年5月1日发行)发明内容此96孔或384孔板中存在的各孔的容量，96孔板约为300μl，384孔板约为100μl。使用此种板进行筛选时，至少需要各孔容量的3分之1左右的溶剂，同时需要与其相应量的试剂等。筛选的次数增多时，仅此部分成本就会上升。
并且最近越来越需要从更大量的文库中微量、短时间且廉价地筛选具有脂肪酶活性等酶活性的蛋白质、微生物。如果使用上述琼脂培养皿进行筛选，必须花费巨大的劳力和成本，所以适应此种需要非常困难。实际中进行的是使用96孔或384孔板进行酶反应，进行抑制剂的高通量筛选，但在更大量处理时会产生包含成本在内的很多问题。
另外，例如只要是内径为100μm左右，深度为10μm左右的微孔，其容量即为约80pl，仅用上述96孔或384孔板上设置的孔的10万分之1的容量即可。如果是具有上述容量的微孔，1cm2面积的板上即可配置5000～100000个左右。因此，使用微孔配置成阵列状的板进行微生物、蛋白质的筛选，即可期待实现高速且低成本的功能分析。
虽然在微孔内可进行种种反应，但目前的现状是还未有过通过酶反应进行的高通量的筛选。
也就是说，至今为止使用96孔、384孔板的目的是医药用途的酶抑制剂的筛选。因酶抑制剂是低分子化合物，所以化学文库即使多也不过100万个左右，对微孔芯片的需要并不太高。但是，最近伴随对从更大量的文库中进行筛选的需求性，期望使用微孔芯片进行筛选。
因此，本发明提供使用上述微孔芯片、筛选具有有用功能的微生物、蛋白质的方法及装置。本发明还提供通过基因重组，可确认出在酵母等的微生物、细胞的细胞膜表层表达或分泌表达具有酶活性的蛋白质的方法及装置。
为解决上述课题，本发明所涉及的筛选方法，其特征在于，包括在具有配置成阵列状的多数微孔的基板上，添加通过分解可发生荧光的荧光底物的工序；和将含有蛋白质或微生物的样品滴在上述基板上的工序；和通过检测通过蛋白质或微生物与上述荧光底物的酶反应所发生的荧光，检测上述微孔内存在的具有酶活性的蛋白质或产生其蛋白质的微生物的工序。
本发明的蛋白质或微生物的筛选方法是使用具有配置成阵列状的多数微孔的基板，对具有某种酶活性的蛋白质或产生其蛋白质的微生物进行筛选的方法。
根据此筛选方法，可通过使用具有其容量为pl单位的非常小的微孔的基板，从包含大量文库的样品中短时间且廉价地筛选。因各微孔非常小，所以可从样品中微量取出含有目的蛋白质或微生物的溶液。其结果，为微生物的情况下可从中取出1个～多个，也可使其增殖。由此，可在筛选的下一阶段实施的、例如功能分析等中，以其本身的状态或使其增殖的状态使用。在此，文库是指样品中含有的全蛋白质或全微生物(也包括目的蛋白质或目的微生物以外的蛋白质或微生物)。
“包含蛋白质或微生物的样品”也包括可能含有具有某种特定酶活性的蛋白质或微生物的样品。也就是说，上述样品是指成为目的蛋白质或微生物的筛选对象的样品。上述样品的具体例子，可以是从土壤或海洋等自然环境中采集的样品，也可以是通过以往公知的基因工程技术根据转化法制备的包含突变蛋白质或微生物的突变体的样品等。
作为上述样品，使用从土壤或海洋等自然环境中采集的样品进行本发明的筛选时，可从自然界中筛选具有特定酶活性的有用的微生物。且上述样品使用包含突变蛋白质或微生物的突变体的样品，可从庞大的文库中容易地分离出所制备的突变蛋白质或突变体。
在本发明的筛选方法中，上述蛋白质是在微生物的细胞膜表层表达的蛋白质，上述的检测工序中，优选通过检测上述多数的微孔中发生荧光的微孔，检测在细胞膜表层表达具有酶活性的蛋白质的微生物。
也就是说，上述筛选方法中，成为筛选对象的蛋白质是在酵母等微生物的细胞膜表层表达的蛋白质。此时，筛选对象中也包括在细胞膜表层表达具有酶活性的蛋白质的微生物自身。
将含有在此细胞膜表层表达蛋白质的微生物的样品滴在基板上时，上述微生物在基板上所形成的多数微孔的一些中分散存在。根据通过上述筛选方法，通过检测哪些微孔内发生荧光，即可确认哪些微孔内含有目的蛋白质。
且在本发明的筛选方法中，如将底物导入细胞内进行酶反应，不仅可筛选在细胞外分泌表达或在细胞膜表层表达的蛋白质，也可筛选在细胞内表达的蛋白质。
本发明的筛选方法中，上述微孔的内径优选5～500μm。
如上所述，如微孔的内径在5～500μm的范围内，微孔的容量即可为pl单位的非常小的容量。
本发明的筛选方法中，优选进一步包括在上述的检测工序后取出含有上述蛋白质的微孔内的内容物的工序。
通过包括上述取出工序，可获得含有目的蛋白质或微生物的微量溶液。由于此溶液非常微量且确实含有目的蛋白质或微生物，所以可在筛选之后进行的功能分析等中直接增殖利用。
为解决上述课题，本发明所涉及的筛选装置是从样品中筛选具有酶活性的蛋白质或产生其蛋白质的微生物的装置，其特征在于，具有配置成阵列状的多数微孔的基板，和具备检测上述基板上发生的荧光的荧光检测器，上述荧光检测器通过检测通过具有酶活性的蛋白质与荧光底物的酶反应所发生的荧光，检测上述微孔内存在的具有酶活性的蛋白质或产生其蛋白质的微生物。
上述蛋白质或微生物的筛选装置使用具有配置成阵列状的多数微孔的基板(微孔芯片)，筛选具有某种酶活性的蛋白质或产生其蛋白质的微生物。
也就是说，本发明的筛选装置是在具有配置成阵列状的多数微孔的基板上，添加可能含有具有某种酶活性的蛋白质或产生该蛋白质的微生物的样品、及通过分解可发生荧光的荧光底物，使具有酶活性的蛋白质与荧光底物在微孔内进行酶反应。荧光检测器通过检测在基板上设置的微孔中是否发生了荧光，来判定微孔内有无酶反应，进而判定有无具有酶活性的蛋白质或产生该蛋白质的微生物。
根据此筛选装置，通过使用具有其容量为pl单位的非常小的微孔的基板，即可从大量文库中短时间且廉价地进行筛选。并且，因各微孔非常小，所以可从样品中微量取出含有目的蛋白质或微生物的溶液。其结果，为微生物时可取出1个～多个，也可使其增殖。由此，可在筛选的下一阶段实施的、例如功能分析等中以其本身的状态或其增殖的状态使用。在此，文库是指样品中含有的全蛋白质或全微生物(包含目的蛋白质或微生物以外的蛋白质或微生物)。
如此，上述样品是指成为筛选对象的样品，具体地说，可以是从土壤或海洋等自然环境中采集的样品，也可以是通过以往公知的基因工程技术通过转化法制备的含有突变蛋白质或微生物的突变体的样品等。
上述样品中，使用从土壤或海洋等自然环境中采集的样品进行本发明的筛选时，可从自然界筛选具有特定酶活性的有用的微生物。并且，上述样品使用含有突变蛋白质或微生物的突变体的样品进行筛选时，可容易地分离出所制备的突变蛋白质或突变体。
在本发明的筛选装置中，上述蛋白质是在微生物的细胞膜表层表达的蛋白质，上述的荧光检测器优选通过检测上述多数的微孔中可发生荧光的微孔，检测在细胞膜表层表达具有酶活性的蛋白质的微生物。
也就是说，上述筛选装置中，成为筛选对象的蛋白质是在酵母等微生物的细胞膜表层表达的蛋白质。此时，筛选对象也包括在细胞膜表层表达具有酶活性的蛋白质的微生物自身。
将含有在此细胞膜表层表达蛋白质的微生物的样品滴在基板上时，上述微生物在基板上所形成的多数微孔的一些中分散存在。因此，荧光检测器通过检测基板上设置的多数微孔中哪些微孔发生了荧光，即可确认哪些微孔内含有目的蛋白质。
本发明的筛选装置，优选进一步具备取出发生荧光的微孔内的内容物的显微操作器。
根据上述构成，可获得含有目的蛋白质或微生物的微量溶液。由于此溶液非常微量且确实含有目的蛋白质或微生物，所以可在筛选之后进行的功能分析等中直接利用。
本发明的筛选装置中，上述微孔的内径优选为5～500μm。
如上所述，只要上述微孔的内径在5～500μm的范围内，微孔的容量即可为pl单位的非常小的容量。由此，可将1个微孔内所包含的含有蛋白质或微生物的溶液直接用于之后进行的功能分析等中。
只要使用本发明的方法及装置，即可简便地确认在酵母等的微生物或细胞中具有酶活性的蛋白质在细胞膜表层表达或分泌表达。以往，为检验微生物或细胞中是否导入了表达目的蛋白的基因，使用在载体内导入抗生素抗性基因，确认在添加了抗生素的培养基中是否能生长发育的方法。此时，需使用多余的基因与载体结合，有时还需去除该基因。
另外，用本发明的方法确认时，可大量且同时地挑选少量样品中进行了导入的突变株，且不需将多余的基因导入载体。同时，通常的方法是将GFP等发光蛋白质的基因导入载体并确认其表达，但此时需使多余的基因结合于载体，所以载体也会变长。如载体变长，就会产生基因难于导入、即使导入也不表达的问题。
本发明的筛选方法及筛选装置，如上所述，通过使用具有其容量为pl单位的非常小的微孔的基板，可从含有大量文库的样品中短时间且廉价地进行筛选。并且，因各微孔非常小，所以可从样品中微量取出含有目的蛋白质或微生物的溶液。由此，可在筛选的下一阶段实施的、例如功能分析等中以其本身的状态使用。
因此，本发明所涉及的筛选方法及筛选装置可高速且低成本地实施，同时，能以容易利用于下～阶段的状态获得目的蛋白质或微生物，所以可以说是具有很大方便性的方法及装置。根据本发明的方法及装置，可确认微生物在细胞膜表层表达具有酶活性的蛋白质或分泌表达具有酶活性的蛋白质。


图1是一例表示构成本发明筛选装置的模式图。
图2(a)是一例表示具有微孔的基板的模式图。(b)、(c)是表示(a)所示基板上配置的微孔模式的模式图。
图3(a)是表示实施例1结果的模式图，(b)是表示实施例2结果的模式图，(c)是表示实施例3结果的模式图。
符号说明1 具有微孔的基板2 电动平台3 CCD照相机4 电脑10 筛选装置具体实施方式
以下，更具体地说明本发明，但本发明不限于此记载。
本发明中的蛋白质或微生物的筛选，使用内径为20～500μm的微孔配列成阵列状的载玻片(基板)，还使用如下方法，通过在其微孔内加入含有酵母或微生物等的样品及荧光底物并进行酶反应后，用荧光显微镜观察所发生的荧光、或用安装在显微镜上的CCD照相机摄影，以检测进行了酶反应的微孔。
以下，就本发明的筛选方法及本发明的筛选装置分别进行说明。
(1)本发明的筛选方法本发明的筛选方法包括在具有配置成阵列状的多数微孔的基板上添加荧光底物的工序；和将含有蛋白质或微生物的样品滴在上述基板上的工序；和通过检测通过蛋白质或微生物与上述荧光底物的酶反应所发生的荧光，检测上述微孔内存在的具有酶活性的蛋白质或产生其蛋白质的微生物的工序。
此筛选方法使用具有配置成阵列状的多数微孔的基板。此基板被称作微孔芯片，容量为1～2000pl左右(例如，微孔内径为500μm时容量为2μl，内径为100μm时容量为80pl)的非常小的凹型形状的孔在载玻片上配列成阵列状。此基板与本发明的筛选装置中具备的具有多数微孔的基板是相同物体，所以将在筛选装置的说明中详细叙述。
在上述基板的微孔内，添加荧光底物的同时滴入含有蛋白质或微生物的样品。此添加荧光底物的工序和滴入含有蛋白质或微生物的样品的工序的顺序可不同，先进行哪相工序均可。且“含有蛋白质或微生物的样品”是指成为筛选对象的样品，同时，本发明的筛选方法是指筛选具有其酶活性的蛋白质或产生该蛋白质的微生物的方法。
在“添加荧光底物的工序”及“滴入含有蛋白质或微生物的样品的工序”之后，进行“检测微孔内存在的具有酶活性的蛋白质或产生其蛋白质的微生物的工序”。在此检测工序中，检测配置成阵列状的多数的微孔中哪些微孔发生了酶反应。因此，可判定进行了酶反应的微孔中含有目的蛋白质或微生物，未进行酶反应的微孔中不含目的蛋白质或微生物。
本发明的筛选方法中，使用荧光底物作为确认有无酶反应的酶反应底物。因此，在上述检测工序中，通过检测每个微孔是否发生荧光，可容易地确认是否引起了酶反应。所以也可容易地判定微孔内是否含有目的蛋白质或微生物。
根据本发明的筛选方法，通过使用具有其容量为pl单位的非常小的微孔的基板，可从含有大量文库的样品中短时间且廉价地筛选。并且由于各微孔非常小，所以可从样品中微量取出含有目的蛋白质、微生物的溶液。其结果，为微生物时可取出1个～多个，也可使其增殖。由此可在进行筛选的下一阶段、例如功能分析等中，以其本身的状态或使其增殖的状态使用。
且本发明的筛选方法，可在上述检测工序后，进一步进行取出含有目的蛋白质的微孔内的内容物的工序。此取出工序可利用显微操作器等进行。通过包括此种取出工序，可获得含有目的蛋白质或微生物的微量溶液。由于此溶液非常微量且确实含有目的蛋白质或微生物，所以可直接利用于筛选之后进行的功能分析等。
(2)本发明的筛选装置本发明的筛选装置是从样品中筛选具有酶活性的蛋白质或产生其蛋白质的微生物的装置。此筛选装置具备具有配置成阵列状的多数微孔的基板，和检测在上述基板上发生的荧光的荧光检测器，上述荧光检测器通过检测通过具有酶活性的蛋白质与荧光底物的酶反应所发生的荧光，检测上述微孔内存在的具有酶活性的蛋白质或产生其蛋白质的微生物。
图1是本发明的筛选装置的构成例。图1中所示的筛选装置10由具有微孔的基板1、和载置上述基板1且使其移动的电动平台2、和用于检测基板1上发生的荧光的荧光检测器构成。基板1上内径为5～500μm左右的微孔配列成阵列状。且图1A表示配置在基板1上的孔阵列。荧光检测器由CCD照相机3和用于放映CCD照相机所拍摄的图像的PC4构成。以下，就构成筛选装置的各部分进行说明。
首先，对上述筛选装置上设置的具有多数微孔的基板进行说明。
基板的材质可使用玻璃或聚碳酸酯等。其可通过在此基板上直接加工形成微孔，也可在此基板上粘贴开孔(洞)状态的聚二甲基硅氧烷、聚酰亚胺等的膜。粘贴此种膜时，开在膜上的孔即为微孔。或者也可以在玻璃制的基板上涂膜后对膜面进行加工形成微孔。
因此筛选装置用荧光检测目的蛋白质和底物的酶反应，所以优选尽量不带荧光的基板及膜。此种微孔芯片也包括现在市售的可获得的微孔芯片。
基板上所形成的微孔，为使孔内的容量适当，优选其内径为5～500μm，更优选为10～100μm。微孔的深度优选为5～50μm，更优选为7～20μm。如上所述，只要微孔的内径为5～500μm的范围内，其容量即可为1～2000pl左右。筛选后进行的蛋白质的功能分析，也使用此程度的微量溶液。因此，如能使微孔的容量在上述范围内，即可将1个微孔内所包含的含有蛋白质或微生物的溶液直接用于以下的功能分析等。
且上述微孔配列在其长度、宽度为5～20mm、优选为5～10mm范围的基板上。1个基板上所形成的微孔的数量优选为1000～100000，更优选为5000～100000。
微孔的形状只要是凹型无特别限定，例如，可以是如非专利文献1所示的四棱锥或四棱柱、圆柱、半球形、圆锥等。微孔的形状是四棱锥或四棱柱时，上述“内径”是指基板表面上微孔一边的长度。微孔的形状是圆柱、半球形或圆锥时，上述“内径”是指基板表面上微孔的直径。
图2(a)是一例具有多数微孔的基板的模式图。图2(a)上部的图表示上述基板的全部，下部的图是配置于基板上的微孔的放大图。此图中所示的基板上，在其基本中央的位置上阵列状配置有80×80个80μm间隔的微孔。而且此微孔的大小为内径50μm、深度10μm，其形状是半球形。
图2(b)、(c)是一例表示上述基板上配置的微孔的阵列模式的模式图。图2(b)中所示的模式1是80×80个微孔在一边为10.32mm的范围内等间隔配置。图2(c)中所示的模式2是40×40个微孔的部分配列、在一边为11.24mm的范围内配置，每边2个、共4个。
其次，就上述筛选装置上设置的荧光检测器进行说明。
上述荧光检测器可使用能检测出由检测对象物所发生的荧光的以往公知的所有仪器。其具体例子可例举为荧光显微镜、带光源及CCD照相机的图像显示装置等。图1中所示的筛选装置中的荧光检测器由CCD照相机3和PC4构成。
本发明的筛选装置至少具备具有上述微孔的基板及荧光检测器即可，除此2个构成部件以外，还可进一步具备用于取出发生荧光的微孔内的内容物的显微操作器。
如设置显微操作器，即可获得含有目的蛋白质或微生物的微量溶液，且可直接将此微量溶液用于之后进行的蛋白质的功能分析等。
其次，说明使用本发明的筛选装置，筛选目的蛋白质或微生物的步骤。
使用上述的筛选装置进行筛选时，首先在形成有上述微孔的基板上滴入可能含有成为筛选对象的蛋白质或微生物的样品。
滴样时，在1个微孔内散布1～100个微生物，优选1～10个左右。因此，最好将由酵母的突变株或微生物组成的文库悬浮于水或缓冲液中，制备浊度为0.01～1.0的样品。而且，在孔内放入1个～多个微生物时0.5左右的浊度较为适合，加入更多微生物时则为更高的浊度。放入孔内的微生物的数量与样品中含有的微生物的浓度有关，遵从泊松分布式。
然后，在此基板上添加含有荧光底物的溶液。
荧光底物，例如检测脂肪酶活性时，可以是伞形酮的脂肪酸酯，荧光素的脂肪酸酯等。这些底物通过酯水解后发生荧光。检测葡萄糖苷酶活性时，可列举为伞形酮的葡萄糖苷衍生物、荧光素的葡萄糖苷衍生物、试卤灵(resorufine)的葡萄糖苷衍生物等。半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸苷酶等也可使用同样的半乳糖苷衍生物、葡萄糖苷酸衍生物检测。
使用包括肽酶在内的蛋白酶等可在上述底物的带有氨基酸序列的寡肽的C末端、以酰胺键与具有氨基色满(amino chroman)衍生物等氨基的荧光探针结合的底物进行检测。例如，半胱天冬酶(caspase酶)可使用C末端具有天冬酰胺酰色满(asparagyl chroman)的寡肽，识别胰蛋白酶等碱性氨基酸的蛋白酶可使用C末端具有赖氨酸色满(Lys chroman)、精氨酰色满(arginyl chroman)的寡肽，识别糜蛋白酶等脂溶性氨基酸的蛋白酶可使用C末端具有苯丙氨酰色满(phenyl alanyl chroman)、亮氨酰色满(leucyl chroman)等的寡肽。
这些荧光底物具有了通过各个酶的催化作用分解时可发生荧光的性质。荧光检测器通过检测此荧光，可判别上述样品中是否含有具有酶活性(例如脂肪酶活性、葡萄糖苷酶活性、蛋白酶活性等)的蛋白质或产生其蛋白质的微生物，同时可判别配置成阵列状的哪些微孔中含有上述蛋白质或上述微生物。
且含有此荧光底物的溶液中该底物浓度优选为10μm～1mmol/dm3(10μmM～1mM)。只要是此程度的浓度，即可充分检测出样品中含有的蛋白质的酶活性。
如上所述，在基板上添加样品及含有荧光底物的溶液时，样品中所含有的具有酶活性的蛋白质就会与荧光底物进行酶反应，分解荧光底物。而且为检测基板上发生的荧光而配备的荧光显微镜(荧光检测器)，可通过观察荧光底物分解后生成的物质的荧光，检测出哪些微孔具有酶活性。由此，可检测出哪些微孔中含有目的蛋白质或微生物。荧光检测器是带光源及CCD照相机的电脑时，用光源的激发波长照射基板，将该基板上发生的荧光用CCD照相机传入电脑，并在电脑上设置的图像显示装置中显示发生荧光的基板。因此，使用者可通过用图像显示装置观察，识别发生荧光的微孔。
使用上述装置进行筛选时，先进行样品的滴入和荧光底物的添加的哪一项均可。也就是说，不是如上所述的先滴入样品，先添加荧光底物溶液后再滴入样品也可检测出酶活性。
在上述筛选装置上配备显微操作器时，通过从发生荧光的微孔内取出内容物，可微量获得具有目的酶活性的微生物、蛋白质。其结果，为微生物时可取出1个～多个，也可使其增殖。此目的微生物可直接用于功能分析等。
本发明不只限于上述实施方式，可在权利要求所述范围内作种种变更。即在权利要求所示范围内，组合适当变更的技术方式后所获得的实施方式也包含于本发明的技术范围内。
实施例以下通过实施例进一步具体说明本发明。但是，本发明不只限于下述实施例。
针对脂肪酶分泌表达酵母使用微孔芯片中荧光底物的水解反应的检测。
本实施例中，首先按以下步骤制备脂肪酶分泌表达酵母。
(1)脂肪酶分泌表达酵母的制备使用白地霉脂肪酶lip1(Geotrichum candidum lipase lip1)基因的5’端EcoRI、3’端SalI的位点可用的引物，进行聚合酶链反应(polymerase chainreaction(PCR))。通过将所得到的PCR产物用EcoRI、SalI酶切后与同样用EcoRI、SalI处理的酵母用的分泌用载体pYE22m连接，构建白地霉脂肪酶分泌表达质粒pYEGCL1。构建的pYEGCL1的白地霉脂肪酶基因部分的碱基序列用脱氧终止法确认其有无错误。用pYEGCL1转化啤酒酵母菌EH1315(Saccharomycescerevisiae EH1315)株，制备脂肪酶分泌表达酵母。质粒导入的确认是以从转化株提取的基因为模板，使用白地霉脂肪酶基因两端的引物进行PCR，用白地霉脂肪酶基因大小1.6kb左右的扩增带的扩增确认。
(2)使用微孔芯片中的荧光底物的水解反应的检测将用上述步骤制备的白地霉脂肪酶分泌表达酵母在10mL合成培养基中30℃振荡培养2日后，用3000rpm、4℃、10分钟离心分离培养液并集菌。所得到的菌体用PBS 10mL悬浮后，在同条件下用离心分离集菌。再次进行菌体的洗涤，洗涤菌体悬浮于PBS 1mL中，用OD600测定浊度。在4℃保存状态的微孔芯片(内径20μm)上，散布悬浮酵母40μl(相当于OD600＝0.6)，4℃放置10分钟。然后，在其液面添加底物(0.1mmol/l(0.1mM)MU-C18/1％DMF/50mmol(50mM)磷酸缓冲液(pH7.0))360μl，4℃放置10分钟。滑动覆盖盖波片，挤压水分后，使板在湿度100％的培养箱(室温)内反应1小时，之后用荧光显微镜观察(激发波长320nm、检测波长450nm)。
其结果如图3(a)所示。此图是倍率400倍的显微镜照片。如此图所示，观察到了基板上的各微孔内的荧光，可确认在各微孔内存在有白地霉脂肪酶分泌表达酵母。
针对脂肪酶表层表达酵母使用微孔芯片中荧光底物的水解反应的检测。
本实施例中，首先按以下步骤制备脂肪酶表层表达酵母。
(1)脂肪酶表层表达酵母的制备使用白地霉脂肪酶lip1(Geotrichum candidum lipase lip1)基因的5’端EcoRI、3’端Xhol的位点可用的引物，进行聚合酶链反应(polymerase chainreaction(PCR))。通过将所得到的PCR产物用EcoRI、Xhol酶切后与同样用EcoRI、Xhol处理的酵母用的分泌用载体pCASS25连接，构建白地霉脂肪酶表层表达质粒pCASS25GCL1。构建的pCASS25GCL1的白地霉脂肪酶基因部分的碱基序列用脱氧终止法确认其有无错误。用pCASS25GCL1转化啤酒酵母菌EH1315(Saccharomyces cerevisiae EH1315)株，制备脂肪酶表层表达酵母。质粒导入的确认是以从转化株中提取的基因为模板，使用白地霉脂肪酶基因两端的引物进行PCR，用白地霉脂肪酶基因大小1.6kb左右的扩增带的扩增确认。
(2)使用微孔芯片中的荧光底物的水解反应的检测将用上述步骤制备的白地霉脂肪酶表层表达酵母在10mL合成培养基中30℃振荡培养2日后，用3000rpm、4℃、10分钟离心分离培养液并集菌。所得到的菌体用PBS 10mL悬浮后，在同条件下用离心分离集菌。再次进行菌体的洗涤，洗涤菌体悬浮于PBS 1mL，用OD600测定浊度。在4℃保存状态的微孔芯片(内径20μm)上，散布悬浮酵母40μl(相当于OD600＝0.6)，4℃放置10分钟。然后，在其液面添加底物(0.1mM MU-C18/1％DMF/50mM磷酸缓冲液(pH7.0))360μl，4℃放置10分钟。滑动覆盖盖波片，挤压水分，之后使板在湿度100％的培养箱(室温)内反应1小时后，用荧光显微镜观察(激发波长320nm、检测波长450nm)。
其结果如图3(a)所示。此图是倍率400倍的显微镜照片。如此图所示，观察到了基板上的各微孔内的荧光，可确认在各微孔内存在有白地霉脂肪酶表层表达酵母。
针对海洋性微生物使用微孔芯片中的荧光底物的水解反应的检测将从海底采集的地杆菌(Terrabacter)属的海洋微生物(与文献微生物学杂志(J.Bacteriol).179，53-62，1997中所述的地杆菌属细菌的16 SrRNA有100％同源性的菌)用市售的海鲜肉汤(marine broth)(Difco，cat no.279110)10mL、25℃振荡培养5日后，将培养液用8000rpm、4℃、5分钟离心分离并集菌。所得到的菌体用PBS 10mL悬浮后，在同条件下离心分离集菌。再一次进行菌体的洗涤，洗涤菌体悬浮于PBS 1mL。用OD600测定浊度。在4℃保存状态的微孔芯片(内径100μm)上散布悬浮酵母40μl(相当于OD600＝0.6)，4℃放置10分钟。然后，在其液面添加底物(0.1mM Fluorescein-diC18/1％DMF/50mM磷酸缓冲液(pH7.0))360μl，4℃下放置10分钟。滑动覆盖盖波片，挤压水分后，使板在湿度100％的培养箱(室温)内反应1小时，之后用市售的微阵列扫描仪(CRBIOTMIIe-FIPC)检测(激发波长473nm，检测波长532nm)。
其结果如图3(c)所示。如此图所示，观察到了基板上的各微孔内的荧光，可确认在各微孔内存在有产生具有脂肪酶活性的海洋微生物。
根据本发明，可用微量的单位进行短时间、不耗费成本的筛选。因此，可有效地用于基因组学、蛋白质组学中大量的基因、蛋白质的功能分析。
权利要求
1.蛋白质或微生物的筛选方法，其特征在于，包括在具有配置成阵列状的多数微孔的基板上添加通过分解可发生荧光的荧光底物的工序，和将含有蛋白质或微生物的样品滴在上述基板上的工序，和通过检测通过蛋白质或微生物与上述荧光底物的酶反应所发生的荧光，检测上述微孔内存在的具有酶活性的蛋白质或产生其蛋白质的微生物的工序。
2.权利要求1中所述的筛选方法，其特征在于，上述蛋白质是在微生物的细胞膜表层表达的蛋白质，上述检测工序通过检测上述多数微孔中发生荧光的微孔，检测在细胞膜表层表达具有酶活性的蛋白质的微生物。
3.权利要求1或2中所述的筛选方法，其特征在于，上述微孔的内径为5～500μm。
4.权利要求1～3中任一项所述的筛选方法，其特征在于，进一步包括在上述检测工序之后取出含有上述蛋白质的微孔内的内容物的工序。
5.蛋白质或微生物的筛选装置，其是从样品中筛选具有酶活性的蛋白质或产生其蛋白质的微生物的装置，其特征在于，具备配置成阵列状的多数微孔的基板，和具备检测在上述基板上发生荧光的荧光检测器，上述荧光检测器是通过检测通过具有酶活性的蛋白质与荧光底物的酶反应所发生的荧光，检测上述微孔内存在的具有酶活性的蛋白质或产生其蛋白质的微生物。
6.权利要求5中所述的筛选装置，其特征在于，上述蛋白质是在微生物的细胞膜表层表达的蛋白质，上述荧光检测器通过检测上述多数微孔中发生荧光的微孔，检测在细胞膜表层表达具有酶活性的蛋白质的微生物。
7.权利要求5或6中所述的筛选装置，其特征在于，还进一步具备取出发生荧光的微孔内的内容物的显微操作器。
8.权利要求5～7中任一项所述的筛选装置，其特征在于，上述微孔的内径为5～500μm。
全文摘要
本发明涉及利用微孔芯片筛选具有有用功能的微生物、蛋白质的方法及装置。更具体地说，使用具有配置成阵列状的多数微孔的基板，从成为筛选对象的样品中筛选具有目的酶活性的蛋白质或产生该蛋白质的微生物。此方法及装置，通过检测通过具有酶活性的蛋白质与荧光底物的酶反应所发生的荧光，检测微孔内存在的具有酶活性的蛋白质或产生其蛋白质的微生物。
文档编号C12Q1/34GK101014718SQ20058002829
公开日2007年8月8日 申请日期2005年8月24日 优先权日2004年8月24日
发明者植田充美, 中尾正宏, 朝见麻希, 落合美佐, 深见治一 申请人:三得利株式会社