具有改良生长特性的植物及其制备方法

专利名称：具有改良生长特性的植物及其制备方法
技术领域：
本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及改良植物生长特性的方法。更具体地，本发明涉及通过增加植物中YIPPEE样多肽或其同源物的活性来改良植物生长特性尤其是产率的方法。本发明还涉及具有增加活性的YIPPEE样多肽或其同源物的植物，这些植物相对于相应的野生型植物，具有改良的生长特性。本发明还提供在发明方法中有用的构建体。
背景技术：
世界人口的不断增长和用于农业的可耕种土地供给的减少，推动农业研究向着提高农业效率的方向发展。农作物和园艺改良的常规方法是利用选育技术来鉴定具有所希望特性的植物。然而，这种选育技术有几个缺点，即这些技术通常是劳动密集型的，并且产生通常含有异源遗传组分的植物，这些遗传组分并非总是产生从亲本植物传递的所希望的性状。分子生物学的进展已经允许人类改造动物和植物的种质(germplasm)。植物基因工程需要分离和操作遗传物质(通常以DNA或RNA的形式)及随后将此遗传物质导入植物。这种技术使能够递送具有多种改良的经济、农业或园艺性状的农作物或植物。具有特别经济利益的一个性状是产率。产率通常被定义为来自农作物经济价值的可测量产出。其可以根据数量和/或质量来定义。产率直接依赖于几种因素，例如器官的数量和大小，植物构造(例如分枝数)，种子产量及更多的因素。根的发育，营养吸收和胁迫耐受性也是决定产率的重要因素。可以通过优化上述因素之一来增加农作物的产率。
改良植物多种生长特性的能力将在诸如增强农作物、植物育种、观赏植物的生产、树木栽培(aboriculture)、园艺学和林业等领域具有许多应用。改良的生长特性，如产率，也可以用于在生物反应器中使用的藻类生产(用于诸如药物、抗体或疫苗物质的生物技术生产，或用于有机废物的生物转化)及其它这类领域。
现已发现，与相应野生型植物相比，增强植物中YIPPEE样多肽的活性使植物具有改良的生长特性。
YIPPEE基因在果蝇中首次发现，并揭示了在真核生物中高度保守的推定锌结合蛋白质的新家族(Roxstrom-Lindquist K.和Faye I.(2001)Insect Mol Biol.10(1)77-86)。对YIPPEE蛋白质进行了表征，并发现其含有一个推定的锌指样金属结合结构域。它是该保守基因家族蛋白质中第一个被表征的成员，所述保守基因家族蛋白质存在于从细胞状黏菌到人类的多种真核生物中。YIPPEE基因普遍表达于果蝇的不同发育阶段。YIPPEE样序列在广泛物种范围中的高度保守性表明YIPPEE蛋白质在真核生物中的普遍重要性。

发明内容
根据本发明，提供了改良植物生长特性的方法，其包括增加植物中YIPPEE样多肽或其同源物的活性。
有利地，执行本发明的方法使植物具有多种改良的生长特性，尤其是增加的产率，特别是种子产率。
本文所定义术语“增加的产率”意指相对于相应的野生型植物，在以下任一或多个方面的增加(i)植物的一个或多个部分，特别是地上(可收获)部分增加的生物量(重量)、增加的根生物量或者任何其它可收获部分增加的生物量；(ii)增加的种子产率，包括种子生物量(种子重量)的增加，并且可以是每株植物种子重量或以单个种子为基础的增加；(iii)增加的饱满种子数量；(iv)增加的种子大小，其也可能影响种子的组成；(v)增加的种子体积，其也可能影响种子的组成；(vi)增加的收获指数，其表示为可收获部分(如种子)的产率与总生物量的比值；和(vii)增加的千粒重(TKW)，其是从所计的饱满种子数和它们的总重量推断出的。增加的TKW可能源自增加的种子大小和/或种子重量。
以玉米为例，产率的增加可以表现为以下的一个或多个每公顷或每英亩植物数量的增加，每株植物穗数的增加，行数、行粒数、粒重量、千粒重、穗长度/直径的增加等等。以稻为例，产率的增加可以表现为以下的一个或多个每公顷或每英亩植物的数量，每株植物的圆锥花序数，每个圆锥花序的小穗数，每个圆锥花序的花数，种子饱满率的增加，千粒重的增加等等。产率的增加也可能产生改变的构造，或者可以作为改变的构造的结果发生。
根据优选的方面，执行本发明的方法产生具有增加的产率(特别是种子产率)的植物。因此，本发明提供了增加植物产率(特别是种子产率)的方法，该方法包括增加植物中YIPPEE样多肽或其同源物的活性。
由于本发明的转基因植物具有增加的产率，相对于相应野生型植物在它们生命周期相应阶段的生长速率而言，这些植物可能呈现增加的生长速率(在至少它们部分的生命周期中)。增加的生长速率可能是对植物的一个或多个部分(包括种子)特异性的，或者可能基本上遍及整个植物。具有增加生长速率的植物甚至可能呈现早期开花。生长速率的增加可能出现在植物生命周期的一个或多个阶段，或者出现在基本上整个植物生命周期的过程中。在植物生命周期的早期阶段，生长速率的增长可能表现为增强的活力。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，使植物能够比其它可能的情况更晚播种和/或更快收获。如果生长速率充分增加，可能允许播种同种植物物种更多的种子(例如播种和收获稻类植物，随后在一个常规的生长期播种和收获更多的稻类植物)。同样的，如果生长速率充分地增长，可能允许播种不同植物物种更多的种子(例如播种和收获稻类植物，随后，如播种和任选的收获大豆、马铃薯或任何其它适合的植物)。在一些植物的情况下也可能从同一根茎收获增加的次数。改变植物的收获周期可能会导致每英亩年生物量产量的增加(这是由于(比方说在一年中)任何特定植物可以生长和收获次数的增加)。与野生型对应物相比，生长速率的增加还可能使能够在更广阔的地域栽培转基因植物，因为种植农作物的地域限制通常由种植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定。如果缩短收获周期，可以避免这类不利条件。可以通过来自生长曲线的多种参数确定生长速率，这类参数可以是T-Mid(植物达到其最大大小的50％所需时间)和T-90(植物达到其最大大小90％所需时间)等等。
执行本发明的方法赋予植物增加的生长速率。因此，本发明提供了增加植物生长速率的方法，该方法包括增加植物中YIPPEE样多肽或其同源物的活性。
在植物处于无胁迫条件下，或植物相对于对照植物暴露于多种胁迫下发生产率和/或生长速率的增加。通常植物通过更加缓慢的生长来应答暴露于胁迫。在重度胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，中度胁迫在本文中定义为当植物暴露于此，其不导致植物完全停止生长丧失重新开始生长能力的任何胁迫。由于耕作方法(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的发展，栽培的农作物植物常常不会遇到重度胁迫。因此，由中度胁迫诱导的受损的生长成为农业中不期望的要素。中度胁迫是植物可能接触的典型胁迫。这些胁迫可以是植物被暴露于其的日常生物的和/或非生物的(环境的)胁迫。典型的非生物的或环境的胁迫包括由反常的热或冷/冰冻温度产生的温度胁迫；盐胁迫；水胁迫(干旱或过量的水)。非生物胁迫也可以由化学药品引起。生物的胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些胁迫。
可以在任何植物中有利地修饰上述生长特性。
本文所用术语“植物”包括整个植物、植物的祖先和后代以及植物的部分，包括种子、芽、茎、叶、根、花(包括块茎)以及组织和器官，其中上述的每种(优选在YIPPEE样基因座)包括目的基因/核酸和/或遗传修饰。术语“植物”还包括悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生区、配子体、孢子体、花粉、和小孢子，同样其中上述的每种(优选在YIPPEE样基因座)包括目的基因/核酸和/或遗传修饰。
在本发明的方法中特别有用的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括选自如下物种的饲料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木；金合欢属物种(Acaciaspp.)、槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、七叶树属物种(Aesculus spp.)、新西兰贝壳杉(Agathis australis)、Albiziaamara、Alsophila tricolor、须芒草属物种(Andropogon spp.)、落花生属物种(Arachis spp.)、槟榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、Astragaluscicer、Baikiaea plurijuga、桦木属(Betula spp.)、芸苔属(Brassica spp.)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫铆(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱缨花属物种(Calliandra spp.)、大叶茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、决明属物种(Cassia spp.)、距豌豆(Centroema pubescens)、木瓜属物种(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffeaarabica)、Colophospermum mopane、变异小冠花(Coronillia varia)、Cotoneaster serotina、山楂属物种(Crataegus spp.)、香瓜属物种(Cucumisspp.)、柏木属物种(Cupressus spp.)、Cyathea dealbata、榅桲(Cydoniaoblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅属物种(Cymbopogonspp.)、Cynthea dealbata、榅桲(Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、大叶骨碎补(Davallia divaricata)、山马蟥属物种(Desmodium spp.)、粗糙蚌贝蕨(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、镰扁豆属物种(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloapyramidalis、Ehrartia spp.、穇子(Eleusine coracana)、画眉草属物种(Eragrestis spp.)、刺桐属物种(Erythrina spp.)、桉属物种(Eucalyptusspp.)、Euclea schimperi、Eulalia villosa、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、费约果(Feijoa sellowiana)、草莓属物种(Fragaria spp.)、千斤拔属物种(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergi、银杏(Ginkgobiloba)、Glycine javanica、Gliricidia spp、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银桦属物种(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、岩黄芪属物种(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黄茅(Heteropogoncontortus)、大麦(Hordeum vulgare)、Hyparrhenia rufa、小连翘(Hypericumerectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭蓝(Indigo incarnata)、鸢尾属物种(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子属物种(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、Leucaena leucocephala、Loudetia simplex、罗顿豆(Lotonusbainesii)、百脉根属物种(Lotus spp.)、Macrotyloma axillare、苹果属物种(Malus spp.)、Manihot esculenta、紫苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、粉芭蕉(Musa sapientum)、烟草属物种(Nicotianum spp.)、驴食豆属物种(Onobrychis spp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草属物种(Pennisetumspp.)、Persea gratissima、碧冬茄属物种(Petunia spp.)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、槟榔竹(Phoenix canariensis)、Phormium cookianum、石楠属物种(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松属物种(Pinusspp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西兰罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobiumstellatum、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、Rhaphiolepsis umbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhusnatalensis、欧洲醋栗(Ribes grossularia)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、洋槐(Robinia pseudoacacia)、蔷薇属物种(Rosa spp.)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、柳属物种(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美红杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、葫芦茶属物种(Tadehagi spp.)、落羽松(Taxodiumdistichum)、阿拉伯黄背草(Themeda triandra)、车轴草属物种(Trifoliumspp.)、小麦属物种(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野豌豆属物种(Vicia spp.)、葡萄(Vitisvinfera)、锥穗沃森花(Watsonia pyramidata)、马蹄莲(Zantedeschiaaethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、苋属植物、洋蓟、芦笋、椰菜、孢子甘蓝、卷心菜、芸苔、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣绿甘蓝、亚麻、羽衣甘蓝、小扁豆、油料种子油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、茶树和藻类等等。根据本发明优选的实施方案，所述植物为农作物植物，如大豆、向日葵、芸苔、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯或烟草。进一步优选的植物是单子叶植物，如甘蔗。更优选的植物是谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高粱或燕麦。
可以通过提高植物中多肽的水平来增加YIPPEE样多肽的活性。备选地，当YIPPEE样多肽水平没有改变，或者甚至当YIPPEE样多肽水平降低的时候，其活性也可以增加。这种情况出现在多肽固有特性发生改变的时候，例如，通过制备比野生型多肽更具活性的突变体形式。
本文定义的术语“YIPPEE样多肽或其同源物”指这样的多肽，其包括(i)推定的锌结合基序2×CXXC，其中X是任意氨基酸残基；和(ii)KYKEGK基序，其允许在任意位置的一个氨基酸取代和任意的保守的氨基酸取代；和(iii)GRAYLF基序，其允许在任意位置的一个氨基酸取代和任意的保守的氨基酸取代。推定的锌结合基序通常发现2×CXXC在第一个和第二个CXXC之间存在约52个氨基酸残基的间隔，即CXXC{52个氨基酸}CXXC。术语“任意保守的氨基酸取代”意指任一或多个氨基酸残基可以被保守的取代代替。在本技术领域可以容易地获得保守取代表。下表给出保守的氨基酸取代的实例。
表1保守氨基酸取代的实例


可以用本领域内众所周知的常规技术容易地鉴定“YIPPEE样多肽或其同源物”。上述定义的基序是高度保守的，因此，本领域的技术人员可以根据这些基序的存在容易地鉴定其它YIPPEE样序列。
基于与果蝇转录因子的同源性发现了由SEQ ID NO1的核酸编码、SEQ ID NO2所代表的植物YIPPEE样多肽序列。归入“YIPPEE样多肽或其同源物”定义的植物衍生的多肽实例包括所有来自拟南芥(Arabidopsis thalialiana)的At3g08990(SEQ ID NO4)、At3g11230(SEQ IDNO6)、At2g40110(SEQ ID NO8)、At4g27740(SEQ ID NO10)和At5g53940(SEQ ID NO12)；来自马铃薯的AB061267(SEQ ID NO14)；玉米中的预测蛋白质AY109711.1(SEQ ID NO16)和AY104347.1(SEQID NO18)；稻中的预测蛋白质NM_196100.1(SEQ ID NO20)、AK121352.1(SEQ ID NO22)和AK109500.1(SEQ ID NO24)。下表展示了上述YIPPEE样多肽序列与SEQ ID NO2基于整体序列比对的同源性百分比。表中登录号1到7指蛋白质，其余登录号指具有给出蛋白质序列预测的相应SEQ ID NO的mRNA。同一性的百分数用NCBI比对程序进行缺省参数的计算得出。
表2基于整体序列比对的YIPPEE样蛋白质序列与SEQ ID NO2的同源性


应该理解的是，归入“YIPPEE样多肽或其同源物”定义的序列不限于由SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22和SEQ ID NO24所代表的序列，而是任何符合以下标准的多肽，所述标准包括(i)推定的锌结合基序2×CXXC，其中X指任意氨基酸残基；和(ii)KYKEGK基序，其允许在任意位置的一个氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；和(iii)GRAYLF基序，其允许在任意位置的一个氨基酸取代和可以适用于本发明方法的任意保守的氨基酸取代。当多肽具有至少一种上述(i)到(iii)的基序时，也可以执行本发明的方法。
编码YIPPEE样多肽或其同源物的核酸可以是任何天然的或合成的核酸。以上定义的YIPPEE样多肽或其同源物是由YIPPEE样核酸/基因编码的。因此，本文定义的术语“YIPPEE样核酸/基因”是编码如上定义的YIPPEE样多肽或其同源物的任何核酸/基因。YIPPEE样核酸的实例包括SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ IDNO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21和SEQ ID NO23中任一所代表的那些序列。YIPPEE样核酸/基因及其变体可能适于实施本发明的方法。YIPPEE样核酸/基因的变体包括YIPPEE样核酸/基因的部分和/或能与YIPPEE样核酸/基因杂交的核酸。
本文定义的术语“部分”指包括至少249个核苷酸的DNA片段，并且该部分编码包含下述的任一或多个(优选所有)基序的多肽(i)推定的锌结合基序2×CXXC，其中X指任意氨基酸残基；(ii)KYKEGK基序，其允许在任意位置的一个氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；(iii)GRAYLF基序，其允许在任意位置的一个氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代。可以，例如，通过在YIPPEE样核酸中产生一个或多个缺失来制备部分。部分可以以分离的形式应用，或者它们可以与其它编码(或非编码)序列融合以，例如，产生组合多种活性的蛋白质。当与其它编码序列融合时，翻译产生的多肽产物可能大于预测的YIPPEE样片断。优选地，功能部分是由以下任一所代表核酸的部分SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21和SEQ ID NO23。
另一YIPPEE样核酸/基因变体是在降低的严格条件下(优选在严格条件下)能够与上文所定义的YIPPEE样核酸/基因杂交的核酸，该杂交序列编码包含下述的任一或多个(优选所有)基序的多肽(i)一个推定的锌结合基序2×CXXC，其中X指任意氨基酸残基；(ii)KYKEGK基序，其允许在任意位置的一个氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；(iii)GRAYLF基序，其允许在任意位置的一个氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代。优选地，杂交序列能与由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21和SEQID NO23所代表的任何核酸序列杂交，或与上文所定义的上述核酸序列的任何部分杂交。
本文定义的术语“杂交”指其中基本同源互补的核酸序列彼此退火的过程。杂交过程能够完全在溶液中发生，即互补的核酸都在溶液中。杂交过程也可以在这种情况下进行，即互补核酸之一固定于基质上，如磁珠、琼脂糖珠或任何其它树脂上。此外，杂交过程也可以如此进行，即其中互补核酸之一固定在固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜上，或者如用照相平板印刷固定在硅质玻璃支持物上(后者称之为核酸阵列或微阵列，或称之为核酸芯片)。为了使杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链，和/或除去单链核酸中的发夹结构或其它二级结构。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。
在核酸杂交实验(如Southern和Northern杂交)的情况中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”依赖于序列，并且在不同的环境参数下不同。熟练的技术人员知道可以在杂交和洗涤过程中改变的多种参数，从而保持或者改变严格条件。
Tm是在确定的离子强度和pH值下，50％的靶序列与完全配对的探针杂交的温度。Tm依赖于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性杂交。在低于Tm值16℃到32℃获得最大杂交率。在杂交溶液中存在一价阳离子会减少两核酸链之间的静电排斥作用，从而促进杂合体形成；当钠浓度高达0.4M时，这一作用明显。每个百分点的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度降低0.6到0.7℃，加入50％甲酰胺使杂交在30到45℃完成，尽管这将降低杂交率。碱基对错配降低杂交率和双链体的热稳定性。平均而言，对于大的探针，每个百分点碱基错配使Tm值下降约1℃。Tm值可以用依赖于杂合体类型的下列方程式计算1、DNA-DNA杂合体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138267-284，1984)Tm＝81.5℃+16.6×log[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×[Lc]-1-0.61×％甲酰胺2、DNA-RNA或RNA-RNA杂合体
Tm=79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc3、寡DNA或寡RNAd杂合体＜20个核苷酸Tm=2(ln)20-35个核苷酸Tm=22+1.46(ln)a或对于其它一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内精确。
b仅对于在30％到75％范围内的％GC精确。
cL=双链体的碱基对长度。
d寡，寡核苷酸；ln，引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。
注释对于每1％甲酰胺，Tm值降低约0.6到0.7℃，而6M尿素的存在可使Tm值降低约30℃。
杂交特异性通常是杂交后洗涤的函数。为了除去非特异杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。这类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度盐浓度越低、洗涤温度越高，洗涤的严格性就越高。洗涤条件通常在等于或低于杂交严格性条件下进行。一般地，如上设置适用于核酸杂交测定或基因扩增检测操作的严格条件。也可以选择更高或更低的严格性条件。通常，对于在确定的离子强度和pH值下的特定序列，选择比热解链温度(Tm)低50℃的低严格条件。中等严格条件是温度比Tm低20℃，高严格条件是温度比Tm低10℃。例如，严格条件是至少像如条件A-L一样严格；降低的严格条件是至少像如条件M-R一样严格。可以通过许多已知技术中的任一来控制非特异性结合，所述技术诸如，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，在杂交缓冲液中添加异源RNA、DNA和SDS，和用RNA酶处理。在以下表3中列出杂交和洗涤条件的实例。
表3杂交和洗涤条件的实例



“杂交长度”是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸杂交时，可以通过比对序列及鉴别本文所述的保守区域来确定杂合体长度。
在杂交和洗涤缓冲液中，可以用SSPE(1×SSPE是0.15M NaCI，10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)代替SSC(1×SSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠)；杂交完成后洗涤15分钟。杂交和洗涤可以另外地包括5×Denhardt's试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化的鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠、和高达50％的甲酰胺。
*Tb-Tr对于预期长度小于50个碱基对的杂合体，杂交温度应该比杂合体的解链温度Tm低5-10℃；根据上述方程式确定Tm。
±本发明还包括以PNA或修饰的核酸代替任一或多个DNA或RNA杂交配偶体。
为了定义严格性水平，可以参考Sambrook等人(2001)的分子克隆实验室手册，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，或者CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)。
YIPPEE样核酸或其变体可以来自任何天然或人工的来源。核酸/基因或其变体可以分离自微生物来源(如细菌、酵母或真菌)，或分离自植物、藻类或动物(包括人类)。可以通过仔细的人为操作在组成和/或基因组环境上修饰所述核酸的天然形式。优选植物来源的核酸，无论来源于同一植物物种(例如对于其被导入的物种而言)或来源于不同植物物种。可以从双子叶物种，优选从十字花科，更优选从拟南芥分离所述核酸。更优选地，从拟南芥中分离的YIPPEE样核酸表示为SEQ ID NO1，并且YIPPEE样氨基酸序列表示为SEQ ID NO2。
可以通过导入遗传修饰(优选在YIPPEE样基因座)提高YIPPEE样多肽或其同源物的活性。本文所定义的基因座意指基因组区，其包括目的基因和编码区上游或下游的10KB。
可以通过任一(或多个)如下方法导入遗传修饰，所述方法包括TDNA激活、TILLING、定点诱变、定向进化、同源重组或通过在植物中导入和表达编码YIPPEE样多肽或其同源物的核酸。导入遗传修饰之后的步骤是选择活性增加的YIPPEE样多肽，其活性的增加使植物具有改良的生长特性。
T-DNA激活标记(Hayashi等人Science(1992)1350-1353)包括将通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA插入在目的基因的基因组区或基因编码区上游或下游10KB，从而在构型上使启动子能够指导靶向基因的表达。通常天然启动子对靶基因表达的调控被破坏，基因由新导入的启动子控制。启动子一般包含于T-DNA中。，例如，通过农杆菌(Agrobacterium)感染将此T-DNA随机插入植物基因组并导致在插入T-DNA附近的基因过表达。得到的转基因植物由于导入的启动子附近基因过表达而表现出显性表型。导入的启动子可以是任意能够在所希望的生物体内(在本案中是植物)指导基因表达的启动子。例如，组成型的、组织偏好的、细胞类型偏好的和诱导型的启动子都适用于T-DNA激活。
也可以通过TILLING(定点诱导的基因组局部突变)技术将遗传修饰导入YIPPEE基因座。这是一种诱变技术，其用于产生和/或鉴定、及最后分离诱变的能呈现YIPPEE样活性的YIPPEE样核酸变体。TILLING还允许选择携带此种突变变体的植物。这些突变变体甚至可能比其天然形式基因呈现更高的YIPPEE样活性。TILLING结合了高密度诱变和高通量筛选方法。TILLING一般遵循的步骤有(a)EMS诱变(Redei和Koncz，1992；Feldmann等人，1994；Lightner和Caspar，1998)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以形成杂双链体；(e)DHPLC，其中库中存在的杂双链体会在色谱图上检测到额外的峰；(f)突变个体的鉴定；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域内众所周知的(McCallum Nat Biotechnol.2000 Apr；18(4)455-7，由Stemple综述，2004(TILLING-a high-throughput harvest for functional genomics.Nat Rev Genet.2004 Feb；5(2)145-50.))。
定点诱变可用于产生YIPPEE样核酸或其部分的变体。可以通过几种方法来完成定点诱变，最常见的是基于PCR的方法(current protocols inmolecular biology.Wiley编辑http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。
定向进化也可以用于产生YIPPEE样核酸的变体。这包括DNA改组的重复，继之以适当筛选和/或选择，以产生编码具有修饰的生物活性多肽的YIPPEE样核酸的变体或其部分的变体(Castle等人，(2004)Science304(5674)1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
TDNA激活、TILLING、定向进化和定点诱变是能产生新的等位基因和YIPPEE样变体的技术的实例。
同源重组允许向基因组中的指定选择位置导入所选的核酸。同源重组是生物科学中常规使用的标准技术，其用于低等有机体如酵母或小立碗藓(physcomitrella)。在植物中执行同源重组的方法已经不仅在模式植物中被描述(Offringa等人Extrachromosomal homologous recombination andgene targeting in plant cells after Agrobacterium-mediated transformation.1990EMBO J.1990Oct；9(10)3077-84)，而且也在农作物植物，如稻中被描述(Terada R，Urawa H，Inagaki Y. Tsugane K，Iida S.Efficient genetargeting by homologous recombination in rice.Nat Biotechnol.2002.Iidaand TeradaA tale of two integrations，transgene and T-DNAgenetargeting by homologous recombination in rice.Curr Opin Biotechnol.2004 Apr；15(2)132-8)。所靶向的核酸(其可能是上文中定义的YIPPEE样核酸或其变体)不需靶向YIPPEE样基因座，但是可以被导入例如高表达的区域。所靶向的核酸可以是改良的等位基因，其用于替换内源基因或额外引入到内源基因中。
根据本发明的优选实施方案，通过在植物中导入和表达编码YIPPEE样多肽或其同源物的核酸，可以改良植物的生长特性。
导入遗传修饰(在本案中不需导入YIPPEE样基因座中)的优选方法是在植物中导入和表达编码YIPPEE样多肽或其同源物的核酸。上述YIPPEE样多肽或其同源物包含(i)推定的锌结合基序2×CXXC，其中X指任意氨基酸残基；和(ii)KYKEGK基序，其允许在任意位置的一个氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；和(iii)GRAYLF基序，其允许在任意位置的一个氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代。导入植物的核酸可以是全长的核酸或者是上述定义的部分或杂交序列。
蛋白质的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且具有与其衍生自的未修饰形式蛋白质相似的生物学活性和功能活性。为了产生这样的同源物，蛋白质的氨基酸由具有相似性质(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破α螺旋结构或β片层结构的倾向)的其它氨基酸所替换。保守取代表是本领域内众所周知的(例如见Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company和上述表1)。
根据本发明优选的方面，同源物与SEQ ID NO2所代表的氨基酸序列有至少45％的序列同一性。通过序列比对可以容易地确定多肽是否与SEQID NO2所代表的氨基酸序列有至少45％的序列同一性。用于比较的序列比对方法是本领域内众所周知的，这些方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP应用Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.48443-453，1970)来查找两个全序列的比对，使配对数最大化和空位数最小化。BLAST算法计算序列同一性的百分比，并对两序列之间的相似性进行统计分析。执行BLAST分析的软件可从生物技术信息国家中心公开地获得。通过查询序列(优选蛋白质序列)与已知YIPPEE样蛋白质序列的比对(见例如在图1所示的比对)，可以容易地鉴别与SEQ ID NO2所代表的氨基酸序列有至少45％的序列同一性的YIPPEE样多肽或其同源物。可以使用例如VNTI AlignX多重比对程序进行查询序列的比对(与已知的YIPPEE样序列)，其基于改良的clustal W算法(InforMax，Bethesda，MD，http://www.informaxinc.com)，带有空位开放罚分为10以及空位延伸为0.05的缺省设置。
术语“同源物”也包括两种具体形式的同源物，其包括直系同源序列和旁系同源序列，其涵盖用于描述基因祖先关系的进化概念。术语“旁系同源”涉及在物种基因组内部的基因复制产生的旁系基因。术语“直系同源”涉及由于物种形成产生的不同有机体中的同源基因。
例如可以通过所谓的交互(reciprocal)blast搜索容易地找到例如在单子叶植物种中的直系同源物。这可以通过使用所研究序列(例如SEQ IDNO1或SEQ ID NO2)针对任何序列数据库(诸如可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov找到的公共可获得的NCBI数据库)进行一次blast而实现。例如，如果寻找稻中的直系同源物，对研究序列的blast应该在可从NCBI获得的针对稻(Oryza sativa)日本晴(Nipponbare)的28，469个全长cDNA克隆中进行。当从核苷酸开始时可使用具有标准缺省值的BLASTn或tBLASTX，或当从蛋白质开始时可使用具有标准缺省值的BLASTP或TBLASTN。Blast结果可以被过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对所研究序列源自的生物体的序列进行反向blast(二次blast)。然后比较第一次和第二次blast的结果。例如，当所述二次blast结果给出与YIPPEE样核酸或YIPPEE样多肽具有最高相似性序列时，如果生物体之一是拟南芥，那么找到了旁系同源物。大家族的情况下可以使用Clustal W，继之以邻近连接树来辅助聚类可视化。
同源物可能是蛋白质的“取代变体”的形式，即在氨基酸序列中至少有一个残基被除去，并且在这一位置插入不同的残基。氨基酸取代通常是单个残基的取代，但是视施加于多肽的功能性限制而定也可能是成簇取代；插入通常在1到10个氨基酸残基数量级。优选地，氨基酸取代包括保守的氨基酸取代。
同源物也可能是蛋白质的“插入变体”的形式，即在蛋白质的预定位置导入一个或多个氨基酸残基。插入可以包括氨基端和/或羧基端的融合，以及单个或多个氨基酸的内部序列插入。一般氨基酸序列内部的插入将小于氨基或羧基端的融合，数量级在约1到10个残基。氨基或羧基端融合蛋白质或肽的实例包括在酵母双杂交系统中应用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白质、(组氨酸)6标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag.100表位、c-myc表位、FLAG表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。
蛋白质“缺失变体”形式的同源物特征在于从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。
可通过本领域内众所周知的肽合成技术，如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作容易地得到蛋白质的氨基酸变体。用于产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的DNA序列操作方法是本领域内众所周知的。例如，本领域内的技术人员熟知在DNA预定位置产生取代突变的技术，其包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的定点诱变或其它定点诱变方法。
YIPPEE样多肽或其同源物可以是衍生物。“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与天然产生形式的蛋白质，例如SEQ ID NO2所代表的氨基酸序列相比，其可以包括取代、缺失或添加的天然的和非天然产生的氨基酸残基。蛋白质的“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与天然产生形式多肽的氨基酸序列相比，其可以包括天然产生的改变的、糖基化、酰基化的氨基酸残基或非天然产生的氨基酸残基。衍生物还可以包括相对于其源自的氨基酸序列的一个或多个非氨基酸取代基(例如共价或非共价地结合于氨基酸序列的报告分子或其它配体，例如与之结合有利于衍生物检测的报告分子)，以及相对于天然产生蛋白质的氨基酸序列而言非天然产生的氨基酸残基。
YIPPEE样多肽或其同源物可能由YIPPEE样核酸/基因的选择性剪接变体编码。本文所用的术语“选择性剪接变体”包括其中选择的内含子和/或外显子已被切除、替换或添加的核酸序列的变体。这样的变体保持了蛋白质的生物活性，这可能通过有选择地保留蛋白质的功能性片段来实现。这样的剪接变体可以是天然的或人工的。产生这类剪接变体的方法是本领域内众所周知的。优选的剪接变体是SEQ ID NO1代表的核酸的剪接变体。更优选编码包含下列任一或多个(优选所有)基序的多肽的剪接变体(i)推定的锌结合基序2×CXXC，其中X指任意氨基酸残基；(ii)KYKEGK基序，其允许一个氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；(iii)GRAYLF基序，其允许一个氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代。
同源物还可以由编码YIPPEE样多肽或其同源物的核酸的等位基因变体所编码，优选SEQ ID NO1代表的核酸的等位基因变体。更优选由等位基因变体编码的，包含下列任一或多个(优选包含所有)基序的多肽(i)推定的锌结合基序2×CXXC，其中X指任意氨基酸残基；(ii)KYKEGK基序，其允许在任意位置的一个氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；(iii)GRAYLF基序，其允许在任意位置的一个氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代。等位基因变体天然存在，并且这些天然等位基因的用途包含于本发明的方法中。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小型插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL在大多数生物体天然存在的多态性品系中形成最大的一组序列变体。
根据本发明的优选方面，YIPPEE样核酸或其变体的表达有所提高或增加。获得提高或增加的基因或基因产物表达的方法在本领域内有充分的记录，其包括，例如由适当的启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以将用作启动子或增强子元件的分离的核酸导入非异源形式多核苷酸的适当位置(一般是上游)，从而上调YIPPEE样核酸或其变体的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代，体内地改变内源启动子(见Kmiec，美国专利No.5,565,350；Zarling等人，PCT/US93/03868)，或者将分离的启动子在本发明基因的适当方向和距离导入植物细胞中，从而控制基因的表达。
如果期望多肽表达，通常要在多肽编码区域的3’-末端包括多腺苷酸化区域。多腺苷酸化区域可以源自天然基因、多种其它植物基因或T-DNA。例如，加入的3’末端序列可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或备选地源自其它植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。
也可以在5’非翻译区或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的数量。已显示，在植物和动物表达构建体的转录单位中包含的可剪接的内含子均可以在mRNA和蛋白质水平增加高达1000倍的基因表达，Buchman和Berg，Mol.Cell biol.84395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.11183-1200(1987)。通常这种内含子被放置在转录单位5’末端附近时，其提高基因表达的作用达到最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。通常见The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，N.Y.(1994)。
本发明还提供遗传构建体和载体，以促进用于本发明方法中的核酸序列的导入和/或表达。
因此，提供的基因构建体包含(i)YIPPEE样核酸或其变体；(ii)一个或多个能驱动(i)中核酸序列表达的控制序列；和任选的(iii)转录终止序列。
可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术构建用于本发明方法的构建体。可以将基因构建体插入可商购的，适合于转化进入植物和在转化的细胞中表达目的基因的载体中。
使用包括目的序列(即YIPPEE样核酸或其变体)的载体转化植物。将目的序列有效连接于一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在本文中都可交换的使用，从广义上是指能够影响其连接序列表达的调控核酸序列。上述术语包括源自典型真核生物基因组基因(包括具有或没有CCAAT盒序列的TATA盒，其对于精确的转录起始是必需的)的转录调控序列，以及另外的调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，其通过应答发育刺激和/或外部刺激或通过组织特异的方式改变基因表达。该术语还包括了经典原核生物基因的转录调控序列，在此情况下可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”也包含合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或提高细胞、组织或器官中核酸分子的表达。本文所用的术语“有效连接”指在启动子序列和目的基因之间的功能性连接，以使启动子序列能起始目的基因的转录。
有利地，可以使用任意类型的启动子驱动核酸序列的表达。启动子可以是诱导型启动子，即应答发育、化学、环境或物理的刺激，具有诱导的或增加的转录起始。诱导型启动子的实例是胁迫诱导型启动子，即当植物暴露于多种胁迫条件下时激活的启动子。另外或备选的，所述启动子可以是组织偏好的启动子，即能够在某些组织，如在叶、根、种子等组织中优先地起始转录。能够仅在某些组织中起始转录的启动子在本文中称为“组织特异的”。
优选的，YIPPEE样核酸或其变体有效的连接于组成型启动子。组成型启动子在大多数(但无需全部)生长和发育阶段有转录活性，并且是基本上普遍表达的。优选的组成型启动子是GOS2启动子(源自稻)(SEQ ID NO25)。应该明确的是本发明的应用并不限于SEQ ID NO1代表的YIPPEE样核酸，也不限于由GOS2启动子驱动的YIPPEE样核酸的表达。其它组成型启动子的实例显示于以下表4中。
表4组成型启动子的实例


任选的，还可以在导入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。术语“终止子”包括控制序列，其为位于转录单位末端的DNA序列，传递信号引发原始转录本的3’加工和多腺苷酸化以及转录的终止。另外的调控元件可以包括转录和翻译的增强子。本领域的那些技术人员将知道适合用于进行本发明的终止子和增强子的序列。这种序列为本领域技术人员所公知或者可以容易地获得。
本发明的遗传构建体还包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制序列的起点。一个实例是当需要将遗传构建体作为附加型遗传元件(如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持时。优选的复制起点包括(但不限于)f1-ori和colE1。
遗传构建体可以任选地包括可选择的标记基因。如本文所用，术语“可选择的标记基因”包括赋予细胞表型的任意基因，该基因在细胞中的表达有利于鉴定和/或选择经本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。适当的标记可以选自带有抗生素或除草剂抗性的标记。含重组DNA的细胞将因而能够在杀死非转化细胞浓度的抗生素或除草剂存在下存活。可选择的标记基因的实例包括提供除草剂Basta抗性的bar基因；赋予针对抗生素卡那霉素抗性的npt基因；赋予潮霉素抗性的hpt基因。可视的标记，如绿色荧光蛋白(GFP，Haseloff等人，1997)，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或萤光素酶也用作可选择的标记。更多适当的可选择标记基因的实例包括氨苄青霉素抗性(Ampr)，四环素抗性基因(Tcr)，膦丝菌素抗性基因，潮霉素抗性基因和氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因等等。
本发明还包括由本发明方法可获得的植物。本发明因此提供由本发明方法可获得的植物，该植物中被导入本文的YIPPEE样核酸或其变体，和/或该植物优选在YIPPEE样基因座具有遗传修饰。
本发明还提供产生具有改良生长特性的转基因植物的方法，其包括在植物中导入和表达YIPPEE样核酸或其变体，和/或包括优选地在YIPPEE样基因座导入遗传修饰。
更具体地，本发明提供产生具有改良生长特性的转基因植物的方法，该方法包括(i)向植物或植物细胞中导入YIPPEE样核酸或其变体，和/或优选地在YIPPEE样基因座导入遗传修饰；和(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
可以将核酸直接导入植物细胞或植物本身(包括导入组织、器官或植物的任何其它部分)。根据本发明的优选方面，优选通过转化将核酸导入植物。
本文所指术语“转化”包含将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用的方法。由器官发生或者胚胎发生的能够随即克隆增殖的植物组织都可以使用本发明的遗传构建体转化并从其再生整个植物。具体的组织选择将因可提供和最适于转化的具体物种的克隆增殖系统而改变。示例性的靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、存在的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时的或稳定的导入宿主细胞，并且可以，例如作为质粒保持非整合的状态。备选地，其可以整合进入宿主基因组。得到的转化植物细胞可以接着用于以本领域技术人员熟知的方式再生为转化的植物。
植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，可以使用几种转化方法的任一向适当的祖先细胞导入目的基因。转化方法包括用脂质体、电穿孔、增强游离DNA摄取的化学品、直接向植物注射DNA、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化和显微投影(microprojection)。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等人，1882，Nature296，72-74；Negrutiu I.等人，June1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等人，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)；植物材料的显微注射(Crossway A.等人，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)DNA或RNA包被的粒子轰击(Klein T.M.等人，1987，Nature327，70)；(非整合的)病毒感染等等。优选使用任何通过农杆菌介导转化产生表达YIPPEE样基因/核酸的转基因稻的熟知方法，例如在任何以下文献中描述的方法公开的欧洲专利申请EP1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人(PlantJ.6(2)271-282，1994)，其公开的内容如同其陈述的全部内容那样并入本文作为参考。至于谷物转化，优选的方法如Ishida等人(Nat.Biotechnol.1996，14(6)745-50)或Frame等人(Plant Physiol.2002，129(1)13-22)中所述，其公开的内容如同其陈述的全部内容那样并入本文作为参考。
通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞组中，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，继之转化的材料再生成整个植物。
DNA转移和再生之后，可评估假定的转化植物，例如用Southern分析目的基因的存在、拷贝数和/或基因组组成。备选的或额外的，可用Northern和/或Western分析监测新导入基因的表达水平，这两种技术都是本领域内普通技术人员熟知的。
产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如用克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交得到纯合的第二代(或T2)转化体，T2植物进一步通过经典育种技术繁殖。
产生的转化生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如经过转化包含表达盒的所有细胞)；转化和非转化组织的嫁接体(例如在植物中，转化的根茎嫁接到非转化的接穗上)。
本发明显然延及由本文所述方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有植物的部分和其无性繁殖体。本发明还涵盖由任意上述方法产生的原代转化或转染的细胞、组织、器官或整个植物的后代，所述后代的唯一要求是与本发明方法产生的亲本呈现同样的基因型和/或表型特性。本发明也包括含有分离的YIPPEE样核酸或其变体的宿主细胞。本发明优选的宿主细胞是植物细胞。本发明也延及植物可收获的部分，例如，但不限于种子、叶、果实、花、茎培养物、根茎、块茎和球茎。
本发明还包括YIPPEE样核酸或其变体的用途和YIPPEE样多肽或其同源物的用途。
一种这样的用途涉及改良植物的生长特性，特别是改良产率/生物量，尤其是种子产率。种子产率可能包括如下的一个或多个增加的(饱满)种子数、增加的种子重量、增加的收获指数等等。
可以在育种程序中使用YIPPEE样核酸或其变体，或者YIPPEE样多肽或其同源物，其中鉴定可以遗传地连接于YIPPEE样基因或其变体的DNA标记。可以使用YIPPEE样核酸/基因或其变体，或者YIPPEE样多肽或其同源物界定分子标记。接着可以将此DNA或蛋白质标记在育种程序中使用，以选择具有改良的生长特性的植物。例如，YIPPEE样基因或其变体可以是任意一个由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21和SEQ ID NO23代表的核酸。
YIPPEE样核酸/基因的等位基因变体也可以用于标记辅助的育种程序。这类育种程序有时需要使用，例如EMS诱变，通过植物诱变处理导入等位基因变体；备选的，此程序可以以收集无意产生的所谓“天然”起源的等位基因变体开始。然后通过例如PCR鉴定等位基因变体。随后是选择步骤用以选择所讨论序列的较好等位基因变体，所述等位基因变体赋予植物改良的生长特性。一般通过监测含有所研究序列的不同等位基因变体植物的生长行为来进行选择，所述研究序列的不同等位基因变体是例如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ IDNO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21和SEQ ID NO23中任一的不同等位基因变体。可以在温室或田地中监测生长行为。更多任选的步骤包括，将经鉴定含有较好等位基因变体的植物与另一植物杂交。例如，可使用这种方法产生目的表型特征的组合。
YIPPEE样核酸或其变体还可以作为探针，用于对其为基因一部分的基因进行遗传和物理的作图，以及作为那些基因连锁性状的标记。这些信息可以在植物育种中使用，以得到具有所希望表型的品系。YIPPEE样核酸或其变体的这类应用仅需要至少15个核苷酸长的一段核酸序列。YIPPEE样核酸或其变体也可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可用YIPPEE样核酸或其变体探测限制酶切消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Maniatis)。随后使用计算机程序如MapMaker(Lander等人，1987)对产生的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。此外，可以使用核酸在含有一组个体的限制性内切酶处理的基因组DNA中探测Southern印迹，所述一组个体为代表明确的遗传杂交的亲本和子代的一组个体。DNA多态性的分离被记录并用于计算在先前用此群体获得的遗传图谱中YIPPEE样核酸或其变体的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32314-331)。
在遗传作图中使用的植物衍生探针的产生和用途描述于Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 437-41中。很多出版物中描述过用上述方法或其变通形式对特定cDNA克隆进行遗传作图。例如，可以使用F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近亲同基因系和其它个体组作图。这类方法是本领域技术人员众所周知的。
核酸探针也可以用于物理作图(即在物理图谱上安置序列；见Hoheisel等人InNon-mammalian Genomic AnalysisA Practical Guide，Academicpress1996，第319-346页，及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，核酸探针用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7149-154)尽管目前FISH作图的方法倾向用于大的克隆(几个到几百个KB；见Laan等人(1995)Genome Res.513-20)，但是灵敏性的提高允许在FISH作图中应用较短的探针。
用于遗传和物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸进行。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med1195-96)PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics16325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science2411077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.183671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.Genet.722-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.176795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域内技术人员众所周知的。使用基于PCR的遗传作图的方法，可能需要鉴定跨越相应于本发明核酸序列区域作图的亲本之间DNA序列的差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。
还发现YIPPEE样核酸或其变体，或者YIPPEE样多肽或其同源物作为生长调节物的用途。由于这些分子已显示在促进植物生长特性中有用，所以它们也是有用的生长调节物，如除草剂或生长刺激物。因此，本发明提供用作生长调节物的组合物，其包括YIPPEE样核酸/基因或其变体或者YIPPEE样多肽或其同源物、以及适当的载体、稀释剂或赋形剂。
根据本发明的方法得到如前所述具有改良生长特性的植物。这些有利的生长特性还可以组合其它经济上有利的性状，如进一步提高产率的性状、对多种胁迫的耐受性、改变各种构造特征和/或生化和/或生理学特征的性状。


现参考以下附图描述本发明，其中图1显示几种植物YIPPEE样多肽的多重比对。推定的锌结合基序2×CXXC中的半胱氨酸残基用粗体表示，其中X可以是任意氨基酸。框中为KYKEGK基序和GRAYLF基序。At表示拟南芥。
图2显示在GOS2启动子(内参PRO0129)控制下在稻中表达拟南芥YIPPEE样(内参CDS1522)的二元载体。
图3详述了用于执行本发明方法的序列的实例。
实施例现参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅意在举例说明。
DNA操作除非另外说明，重组DNA技术根据描述于(Sambrook等人(2001)分子克隆实验室手册，第三版，冷泉港实验室出版，CSH，纽约或者Ausubel等人(1994)，分子生物学最新指南的第一卷和第二卷)的标准方法执行。植物分子操作的标准材料和方法由R.D.D.Croy描述于PlantMolecular Biology Labfase(1993)由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
实施例1基因克隆使用拟南芥幼苗cDNA库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板通过PCR扩增拟南芥YIPPEE样基因(CDS1522)。从幼苗提取的RNA经反转录后，将cDNA克隆进pCMV Sport6.0中。该库平均插入大小为1.5kb，并且原始克隆数的数量级在1.59×107cfu。在6×1011cfu/ml的第一次扩增之后，确定原始滴度为9.6×105cfu/ml。提取质粒之后，将200ng模板用于50μlPCR混合物中。PCR扩增所用引物(其包括Gateway重组的AttB位点)为prm03196(正义，起始密码子用粗体表示，AttB1位点用斜体表示5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGCTGTCGGAGATGAT-3’)和prm03199(反义，互补的，终止密码子用粗体表示，AttB2位点用斜体表示5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAATCAAGCATCATCTCCATCACTAAC3’)。在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。同样用标准方法扩增和纯化366bp的PCR片段。接着进行Gateway过程的第一步，BP反应，在此期间将PCR片段与pDONR201质粒体内重组以产生(根据Gateway术语)“进入(entry)克隆”，p3956。作为Gateway技术部分的质粒pDONR201购自Invitrogen。
实施例2载体构建接着，将进入克隆p3956与用于稻转化的指定载体p0640一起被用于LR反应。此载体在T-DNA边界内包含以下部分作为功能性元件植物可选择的标记；可筛选的标记表达盒；旨在与已克隆到进入克隆中的目的序列进行体内重组的LR的Gateway表达盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(PRO0129)在此Gateway盒的上游(De Pater等人，Plant J.1992Nov；2(6)837-44)。
LR重组步骤之后，将产生的表达载体(图2)转化进入农杆菌菌株LBA4044，随后转化进入稻类植物。使转化的稻类植物生长并随后检测实施例3中描述的参数。
实施例3评估和结果大约产生了15到20个独立的T0稻类转化体。初级转化体由组织培养室转移到温室生长并收获T1种子。5个事件得以保留，其中T1后代发生转基因存在/缺乏的3∶1分离。通过监测可视标记的表达，在每一事件中选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的T1幼苗，和大约10个缺少转基因(无效合子)的T1幼苗。
统计分析F-检验使用双因子ANOVA(变异分析)作为植物表型特性整体评估的统计模型。在由本发明基因转化的所有事件的所有植物中，对所有测量参数进行F检验。进行F检验来检查所有转化事件中基因的有效性，并且验证基因的整体效果，亦称为整体基因效应。真实的整体基因效应显著性的阈值设定为F检验的5％概率水平。显著性F检验值指向基因效应，其意味着不仅仅是基因的存在或位置引起表型的差异。
3.1种子相关参数的测量成熟的原代圆锥花序被收获、包装、标记条形码，然后在37℃烘箱中干燥三天。然后敲打圆锥花序并对所有种子收集和计数。用吹风装置将饱满的壳与空壳分离。丢弃空壳，并再次计数剩余的部分。饱满的壳在分析天平上称重。在分离步骤之后剩余的饱满壳数确定为饱满种子数。通过称量从植物收获的全部饱满的壳测量总的种子产率。本发明中的收获指数定义为总种子产率与地上面积(mm2)的比值乘以因子106。
3.2地上面积通过计算排除背景后地上植物部分的像素总数确定植物地上面积。此值是在同一时间点从不同角度获得图片的平均值，并通过校准将其转换为用平方毫米表示的物理表面值。实验显示这种方法测量的地上部分植物面积与植物地上部分的生物量相关联。
以下结果表显示了T1评估和产生额外T1事件的F检验的p值。还显示了转基因和相应无效合子之间的百分数差异。例如，对于总种子重量，6个品系中的3个品系为总种子重量阳性(即与相应无效合子植物的种子重量相比，总种子重量增加(大于32％))。这样的6个品系中的1个品系显示总种子重量显著增加，F检验的p值为0.18。
表5T1代的结果

表6T1额外事件

序 列 表<110>克罗普迪塞恩股份有限公司<120>具有改良生长特性的植物及其制备方法<130>CD-118-prio<150>EP04103303.6<151>2004-07-12<150>US60/588,917<151>2004-07-16<160>27<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>591<212>DNA<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1acaatttcct ccttctcccg ttataaacta aagactcgat tttgtgttga ttgttcgatt 60cacgtaatta aggagatttt tggatcaaaa gatgggtagg gtttttatgg ttgatctgga120agggaacatc tacatctgca aactctgtaa gacccatctt tctacagacc aagacatcat180gtccaagtct tttcaatgca agaacggaag agcttatctt ttcaacaacg ttgtaaacgt240atctgttgga gagaaagaag acagaatgat gataactgga ctacacaacg tagttgacat300tttctgtgtt ggttgtggat caaacgttgg ctggaaatac gagtttgcac atgaaaagag360ccagaagtat aaggaaggaa aatctgttct tgaattatac aagatttcgg gtcctcatga420tagcaacgac ttggttagtg atggagatga tgcttgattg aggctttttc cttgtctagt480tatctctctc tcagatttct tttaaatttg tacattcttg ggcctagatt ttaattcgtt540tcaatatgcg tagtggaaga ccggtttaat aattaggggt tttattttca t 591<210>2<211>121<212>PRT<213>拟南芥<400>2Met Gly Arg Val Phe Met Val Asp Leu Glu Gly Asn Ile Tyr Ile Cys1 5 10 15Lys Leu Cys Lys Thr His Leu Ser Thr Asp Gln Asp Ile Met Ser Lys20 25 30Ser Phe Gln Cys Lys Asn Gly Arg Ala Tyr Leu Phe Asn Asn Val Val35 40 45
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Met Gly Arg Ile Phe Thr Val Glu Leu Glu Gly Arg Ser Tyr Arg Cys1 5 10 15Arg Phe Cys Arg Thr His Leu Ala Leu Pro Asp Asp Leu Val Ser Arg20 25 30Ser Phe His Cys Arg Arg Gly Lys Ala Tyr Leu Phe Asn Arg Ser Val35 40 45Asn Ile Ser Met Gly Pro Leu Glu Glu Arg Leu Met Leu Ser Gly Met50 55 60His Thr Val Ala Asp Ile Phe Cys Cys Cys Cys Gly Gln Asn Val Gly65 70 75 80Trp Lys Tyr Glu Ser Ala His Glu Lys Ala Gln Lys Tyr Lys Glu Gly85 90 95Lys Phe Val Leu Glu Arg Gly Arg Ile Val Asp Glu Ile Asp Leu Ser100 105 110Thr Glu Val Tyr Ile Asp Thr His Gly Ser Thr Ser Asp Thr Glu Asp115 120 125Ser<210>13<211>741<212>DNA<213>马铃薯(Solanum tuberosum)<400>13ccgaaacaaa aactattacc cctttttgga caagtccttt tccattttgg ttcttcaatt 60ttcttgtgat ctcaaaaatc tttgatgggg agattatttg tgttgactct tgaaggcaag120atctacagct gcaagcactg tggaactcat cttgcccttt ctgaaaacat tgtttccaag180tctttccact gcaaacatgg gaaggcatac cttttcagta aagtggtgaa tgtcacttct240ggcgagatag aaaatagaat gatgatgact ggtatgcaca ctgtggcaga cattttctgc300gtctgttgtg ggtcaattgt tggatggaaa tatgagaccg cccatgagaa gagccaaaag360tacaaagaag gaaaatcagt gcttgagcgg tttaagatta ctggacctga tggaagccat420tactgggcta gtcatgatac tcatgttgca ggaagtgatg ctgatgatgt ttgatcacca480ttcagaacaa aaattctatc caaaaatgta cattctttaa cccaccaccc tattagttct540ttatggacca ttggattctt gaatagctta agctctacaa cttctttaag cttgtcctct600attgtgtatg atgatatgga agcaccatgt gttgttgcaa actaacacga ccatctgcct660gtatttgttt gcaatgacaa gacattacta gtagcaacca ctctgctttc attgcttcga720aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 741<210>14<211>129<212>PRT<213>马铃薯
<400>14Met Gly Arg Leu Phe Val Leu Thr Leu Glu Gly Lys Ile Tyr Ser Cys1 5 10 15Lys His Cys Gly Thr His Leu Ala Leu Ser Glu Asn Ile Val Ser Lys20 25 30Ser Phe His Cys Lys His Gly Lys Ala Tyr Leu Phe Ser Lys Val Val35 40 45Asn Val Thr Ser Gly Glu Ile Glu Asn Arg Met Met Met Thr Gly Met50 55 60His Thr Val Ala Asp Ile Phe Cys Val Cys Cys Gly Ser Ile Val Gly65 70 75 80Trp Lys Tyr Glu Thr Ala His Glu Lys Ser Gln Lys Tyr Lys Glu Gly85 90 95Lys Ser Val Leu Glu Arg Phe Lys Ile Thr Gly Pro Asp Gly Ser His100 105 110Tyr Trp Ala Ser His Asp Thr His Val Ala Gly Ser Asp Ala Asp Asp115 120 125Val<210>15<211>1032<212>DNA<213>玉蜀黍(Zea mays)<220>
<221>misc_feature<222>(242)..(249)<223>n为a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(954)..(978)<223>n为a、c、g或t<400>15aagcgtgcag ctattcggtt atttaagagt gacgttggaa ccgaacacac aatacaatgc 60agatttgtac atactgccct cgcttgacac ccaggtcgac cagacacttg agaaatttac120tttacttatt tggtcactag tgcttggcat acaactcaga tggacttata agcaacacag180gttacgcaca tatacagcgg taacatctaa tgacttccag aagcaatagg agggatatga240tnnnnnnnnc atgtcacctg gaacagcaac aatttacgcc ggcgaattat ttcaatggag300caatccccgg ctgtcggctg cctaaagagc aacgccaccc aggttattta caggggatca360
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<400>17gcacgagaac aaaccccgca cgactcgttc tcattccact ctccaacgcg caccgggcgg 60tttttcgttc ctttcttttt ttttcccctc ttccccttcc ccttctcctt ccagcggcgc120tcaggccacc gccggccaat cccatcaccc gccggatagg gatcgacccg ttcgttgatt180ggcgcgcgcc tgcgatcgat cgattggatt gcagggttag ggcggccgcc gtcgagatag240atcgatccat ccatcgatcg aattggtttt gttggtggat cggagatatt cattcgggtc300catgggtcgg ctgctgctgg tgagcctccc ggcgacgggc gccgtcatct accgctgcaa360gcactgcgac acccacctcg cctacgacac cgacatcatc gcaaggacgt tccgctgcaa420gaacggcaag gcctacctct tcaacaggat cgtgaatgtg aatgttggta cgaaggagga480ggaccggatg atgacgacgg gcctgcacac cgtgtgcgac atcttctgcg tcgcctgcgg540agccatactc ggctggaaat acctcgtcgc cttcgacaag agccagaggt acaaggaagg600caagttcatc ctcgacaggt ccaccgcctt ggcagccgct cctggtgatg ccgctgctga660ccaccaccac caccacgctc gcgtagcaag ctccgatgac gaagatgacc atatgtgaat720gatgatgatg atgaatgtca tctgcattgc attcaccata atcccttgct atctgtaaat780actctactcc gcttgttgta gtcgttcgtc gtaaagcacc tatatgtttc catttgttca840acctatcaga ctatgatatg atcagcaagt aaggtccatt tgtttggatg cagcgacagt900tacaaacaaa aaaattaaaa920<210>18<211>138<212>PRT<213>玉蜀黍<400>18Met Gly Arg Leu Leu Leu Val Ser Leu Pro Ala Thr Gly Ala Val Ile1 5 10 15Tyr Arg Cys Lys His Cys Asp Thr His Leu Ala Tyr Asp Thr Asp Ile20 25 30Ile Ala Arg Thr Phe Arg Cys Lys Asn Gly Lys Ala Tyr Leu Phe Asn35 40 45Arg Ile Val Asn Val Asn Val Gly Thr Lys Glu Glu Asp Arg Met Met50 55 60Thr Thr Gly Leu His Thr Val Cys Asp Ile Phe Cys Val Ala Cys Gly65 70 75 80Ala Ile Leu Gly Trp Lys Tyr Leu Val Ala Phe Asp Lys Ser Gln Arg85 90 95Tyr Lys Glu Gly Lys Phe Ile Leu Asp Arg Ser Thr Ala Leu Ala Ala100 105 110Ala Pro Gly Asp Ala Ala Ala Asp His His His His His Ala Arg Val115 120 125Ala Ser Ser Asp Asp Glu Asp Asp His Met130 135
<210>19<211>360<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>19atggggctgc tgttcgtgga gctgctcccg cggcacggcg acgggggagg ccccgcgtcg 60gcggtgctca agtgccgccg gtgccgcgtc gacgccgcct ccgccgacgc catcctctca120cgggacttcc gcggccgatt cggccgcgcc tacctcttcg accacgtggt gaatatatcc180ttagggccta atgaggatcg gtatctgatg accggactgc atacggtgaa agatatctac240tgtagctgtt gccagcaaat tctcggctgg agatatgaga aagcatacga agagagcgag300aagtacaagg aaggcaagtt catcctggag aaggccagga tgtggaaaga agcccggtga360<210>20<211>119<212>PRT<213>稻<400>20Met Gly Leu Leu Phe Val Glu Leu Leu Pro Arg His Gly Asp Gly Gly1 5 10 15Gly Pro Ala Ser Ala Val Leu Lys Cys Arg Arg Cys Arg Val Asp Ala20 25 30Ala Ser Ala Asp Ala Ile Leu Ser Arg Asp Phe Arg Gly Arg Phe Gly35 40 45Arg Ala Tyr Leu Phe Asp His Val Val Asn Ile Ser Leu Gly Pro Asn50 55 60Glu Asp Arg Tyr Leu Met Thr Gly Leu His Thr Val Lys Asp Ile Tyr65 70 75 80Cys Ser Cys Cys Gln Gln Ile Leu Gly Trp Arg Tyr Glu Lys Ala Tyr85 90 95Glu Glu Ser Glu Lys Tyr Lys Glu Gly Lys Phe Ile Leu Glu Lys Ala100 105 110Arg Met Trp Lys Glu Ala Arg115<210>21<211>836<212>DNA<213>稻
<400>21gatttttctt ctcccaaact ccggcgactc ctccgctaat cccctccggc gccgcctcct 60ctccgctccc cgcgcccccc acctccggtc acgcccgatc ggattggttg agttgcctcg120agggattttt gctctcgagg tatggtgttc atggcggagc tggtgggtcc gcgggtgtac180agctgctgca actgccggaa ccacgtctgc ctccacgacg acatcatctc caaggctttt240caggggagga atggccgtgc ctttctgttc tctcatgcca tgaatgttgt tgtgggcgcg300aaggaggaca ggcaacttat gacggggctt cacactgttg ctgatatcta ttgcaatgat360tgccgggagg tgttgggctg gaagtacgag agagcctatg aggaaacaca gaagtacaag420gaagggaagt tcatatttga gaagtcaaaa atcgtcaaag agaactggta gaatccaaaa480gattaggcac tccaaacttt ctttagagga tgaaacattc actgttccaa ggttatcagt540gtgttctggt tctttatgtc tttgtaaata tcagtcatcc acaagtttta atcttaagtc600tgcctgttct tgccttgccg tgaagtgtaa attgttcttg ctcccgtttc tttctgtgaa660taacatatgg cctgtgggta tttgttcttg aaccatgtgt gctaatgtgc gtaattttat720aggtactaaa agaatgtttg tatctttctc ctgcacaaga ataccgcgtg gagatttaca780gtcaaatata atctgacatg atttaatcaa aatttgttgg gaagttgtga agtaag836<210>22<211>109<212>PRT<213>稻<400>22Met Val Phe Met Ala Glu Leu Val Gly Pro Arg Val Tyr Ser Cys Cys1 5 10 15Asn Cys Arg Asn His Val Cys Leu His Asp Asp Ile Ile Ser Lys Ala20 25 30Phe Gln Gly Arg Asn Gly Arg Ala Phe Leu Phe Ser His Ala Met Asn35 40 45Val Val Val Gly Ala Lys Glu Asp Arg Gln Leu Met Thr Gly Leu His50 55 60Thr Val Ala Asp Ile Tyr Cys Asn Asp Cys Arg Glu Val Leu Gly Trp65 70 75 80Lys Tyr Glu Arg Ala Tyr Glu Glu Thr Gln Lys Tyr Lys Glu Gly Lys85 90 95Phe Ile Phe Glu Lys Ser Lys Ile Val Lys Glu Asn Trp100 105<210>23<211>913<212>DNA<213>稻<400>23gctgcttttg cttcggtcac ccggtcagtg ctgcagacaa gccaccccct tcctcgcgta 60
gactgctccc cccacaaaca aaagcaatcc taatctcgga ttcgaggcga acgagcggcg120gcgagggagg gggactagcg gcgatcgcga ttggagtcgg gtggacaccg atcgcggcgg180cgctctgggg gatcggggtg tggaatcgag ggggagggag gaggagacgg aggcgatggg240gcggctgttc gtgatgcacc tggaagggaa ggtgtacagc tgcaagcact gccacacgca300cctcggcctc tcctccgaca tcatctccaa gtccttccat tgcaagcacg ggaaggcgta360cctcttcaat aaggttgtca atgtgacttc tggagtaaaa gaggatcgca tgatgataac420cggaatgcat actgtgtctg atatcttctg tgttggctgc ggatccattg ttggatggaa480atatgaagct gcacatgaga agagccagag gtacaaggaa gggaaattta ttttagagag540gtataaggtg tctggtcctg atggcagcca ctactttgtt acacatgatg ctcatgttgg600gggaagcgac gtggacgacg tatgaagcac aactcgacat gctcaagcct tatccatgta660atccatgtaa ataacccaag tgtttgttgg tcttagttac ccggggattt gcttccattc720agagcaaccc cagcgtaatt gttgtcctag atgacctaat atcctatcat cttccttcag780gagttcaggt tattattggg tgttaccgtc tgtatatgca tgtaaccagt gatgcctgta840gtagccccct aaaagctgtt gtaatcctgg aatgtatctc aggccctaat gactaaataa900aattctgctt ctc 913<210>24<211>129<212>PRT<213>稻<400>24Met Gly Arg Leu Phe Val Met His Leu Glu Gly Lys Val Tyr Ser Cys1 5 10 15Lys His Cys His Thr His Leu Gly Leu Ser Ser Asp Ile Ile Ser Lys20 25 30Ser Phe His Cys Lys His Gly Lys Ala Tyr Leu Phe Asn Lys Val Val35 40 45Asn Val Thr Ser Gly Val Lys Glu Asp Arg Met Met Ile Thr Gly Met50 55 60His Thr Val Ser Asp Ile Phe Cys Val Gly Cys Gly Ser Ile Val Gly65 70 75 80Trp Lys Tyr Glu Ala Ala His Glu Lys Ser Gln Arg Tyr Lys Glu Gly85 90 95Lys Phe Ile Leu Glu Arg Tyr Lys Val Ser Gly Pro Asp Gly Ser His100 105 110Tyr Phe Val Thr His Asp Ala His Val Gly Gly Ser Asp Val Asp Asp115 120 125Val<210>25
<211>2193<212>DNA<213>稻<400>25aatccgaaaa gtttctgcac cgttttcacc ccctaactaa caatataggg aacgtgtgct 60aaatataaaa tgagacctta tatatgtagc gctgataact agaactatgc aagaaaaact120catccaccta ctttagtggc aatcgggcta aataaaaaag agtcgctaca ctagtttcgt180tttccttagt aattaagtgg gaaaatgaaa tcattattgc ttagaatata cgttcacatc240tctgtcatga agttaaatta ttcgaggtag ccataattgt catcaaactc ttcttgaata300aaaaaatctt tctagctgaa ctcaatgggt aaagagagag atttttttta aaaaaataga360atgaagatat tctgaacgta ttggcaaaga tttaaacata taattatata attttatagt420ttgtgcattc gtcatatcgc acatcattaa ggacatgtct tactccatcc caatttttat480ttagtaatta aagacaattg acttattttt attatttatc ttttttcgat tagatgcaag540gtacttacgc acacactttg tgctcatgtg catgtgtgag tgcacctcct caatacacgt600tcaactagca acacatctct aatatcactc gcctatttaa tacatttagg tagcaatatc660tgaattcaag cactccacca tcaccagacc acttttaata atatctaaaa tacaaaaaat720aattttacag aatagcatga aaagtatgaa acgaactatt taggtttttc acatacaaaa780aaaaaaagaa ttttgctcgt gcgcgagcgc caatctccca tattgggcac acaggcaaca840acagagtggc tgcccacaga acaacccaca aaaaacgatg atctaacgga ggacagcaag900tccgcaacaa ccttttaaca gcaggctttg cggccaggag agaggaggag aggcaaagaa960aaccaagcat cctcctcctc ccatctataa attcctcccc ccttttcccc tctctatata 1020ggaggcatcc aagccaagaa gagggagagc accaaggaca cgcgactagc agaagccgag 1080cgaccgcctt cttcgatcca tatcttccgg tcgagttctt ggtcgatctc ttccctcctc 1140cacctcctcc tcacagggta tgtgcccttc ggttgttctt ggatttattg ttctaggttg 1200tgtagtacgg gcgttgatgt taggaaaggg gatctgtatc tgtgatgatt cctgttcttg 1260gatttgggat agaggggttc ttgatgttgc atgttatcgg ttcggtttga ttagtagtat 1320ggttttcaat cgtctggaga gctctatgga aatgaaatgg tttagggtac ggaatcttgc 1380gattttgtga gtaccttttg tttgaggtaa aatcagagca ccggtgattt tgcttggtgt 1440aataaaagta cggttgtttg gtcctcgatt ctggtagtga tgcttctcga tttgacgaag 1500ctatcctttg tttattccct attgaacaaa aataatccaa ctttgaagac ggtcccgttg 1560atgagattga atgattgatt cttaagcctg tccaaaattt cgcagctggc ttgtttagat 1620acagtagtcc ccatcacgaa attcatggaa acagttataa tcctcaggaa caggggattc 1680cctgttcttc cgatttgctt tagtcccaga attttttttc ccaaatatct taaaaagtca 1740ctttctggtt cagttcaatg aattgattgc tacaaataat gcttttatag cgttatccta 1800gctgtagttc agttaatagg taatacccct atagtttagt caggagaaga acttatccga 1860tttctgatct ccatttttaa ttatatgaaa tgaactgtag cataagcagt attcatttgg 1920attatttttt ttattagctc tcaccccttc attattctga gctgaaagtc tggcatgaac 1980tgtcctcaat tttgttttca aattcacatc gattatctat gcattatcct cttgtatcta 2040cctgtagaag tttctttttg gttattcctt gactgcttga ttacagaaag aaatttatga 2100agctgtaatc gggatagtta tactgcttgt tcttatgatt catttccttt gtgcagttct 2160tggtgtagct tgccactttc accagcaaag ttc2193<210>26<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物prm03198
<400>26ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgggt agggttttta tggttgatc 59<210>27<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物prm03199<400>27ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta atcaagcatc atctccatca ctaac 5权利要求
1.改良植物生长特性的方法，包括步骤(A)增加植物中YIPPEE样多肽或其同源物的活性，所述YIPPEE样多肽或其同源物包括下列任一或多个基序，优选包含所有基序(i)推定的锌结合基序2×CXXC，其中X是任意的氨基酸残基；(ii)KYKEGK基序，其允许在任意位置的一个氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；(iii)GRAYLF基序，其允许在任意位置的一个氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；和(B)任选地选择具有改良的生长特性的植物。
2.根据权利要求1的方法，其中通过优选地在编码YIPPEE样多肽或其同源物的基因座导入遗传修饰来实现所述增加的活性是。
3.根据权利要求2的方法，其中通过定向诱变、定向进化、同源重组、TILLING、T-DNA激活中的任一或多个以及通过在植物中导入和表达编码YIPPEE样多肽的核酸实现所述遗传修饰。
4.改良植物生长特性的方法，包括在植物中导入和表达YIPPEE样核酸或其变体，所述YIPPEE样核酸或其变体编码包括下列任一或多个基序优选包括所有基序的YIPPEE样多肽或其同源物(i)推定的锌结合基序2×CXXC，其中X是任意氨基酸残基；(ii)KYKEGK基序，其允许在任意位置的一个氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代；(iii)GRAYLF基序，其允许在任意位置的一个氨基酸取代和任意保守的氨基酸取代。
5.根据权利要求4的方法，其中所述变体是YIPPEE样核酸的部分或者能与YIPPEE样核酸杂交的序列。
6.根据权利要求4或5的方法，其中所述YIPPEE样核酸或其变体在植物中过表达。
7.根据权利要求4到6中任一项的方法，其中所述YIPPEE样核酸或其变体是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科(Brassicaceae)，更加优选核酸来自拟南芥。
8.根据权利要求4到7中任一项的方法，其中所述YIPPEE样核酸或其变体有效地连接于组成型启动子。
9.根据权利要求8的方法，其中所述构成型启动子是GOS2启动子。
10.根据权利要求1到9中任一项的方法，其中所述改良的植物生长特性是相对于相应的野生型植物而言增加的产率。
11.根据权利要求1到10中任一项的方法，其中所述改良的植物生长特性是增加的植物生物量。
12.根据权利要求10的方法，其中所述增加的产量是增加的种子产量。
13.根据权利要求12的方法，其中所述增加的种子产率选自以下的任一个或多个(i)增加的种子生物量；(ii)增加的(饱满)种子数；(iii)增加的种子大小；(iv)增加的种子体积；(v)增加的收获指数；和(vi)增加的千粒重(TKW)。
14.根据权利要求1到13中任一项的方法，其中所述改良的植物生长特性是增加的生长速率。
15.可根据权利要求1到14中任一项的方法获得的植物。
16.构建体，包括(i)YIPPEE样核酸或其变体；(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的(iii)转录终止序列。
17.根据权利要求16的构建体，其中所述启动子是组成型启动子。
18.根据权利要求17的构建体，其中所述启动子是GOS2启动子。
19.使用根据权利要求16到18中任一项的构建体转化的植物。
20.产生具有改良生长特性的转基因植物的方法，该方法包括(i)向植物中导入YIPPEE样核酸或其变体和/或在YIPPEE样基因座导入遗传修饰；(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
21.具有改良生长特性的转基因植物，其通过将YIPPEE样核酸或其变体导入所述植物产生和/或通过在YIPPEE样基因座导入遗传修饰产生。
22.根据权利要求15、19或21的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物，如甘蔗，或者其中所述植物是谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦或高粱。
23.根据权利要求15、19、21或22中任一项的植物的可收获部分。
24.根据权利要求23的可收获部分，其中所述可收获部分是种子。
25.从根据权利要求15、19、21或22中任一项的植物直接衍生的产品，和/或从根据权利要求23或24的可收获部分直接衍生的产品。
26.YIPPEE样核酸/基因或其变体或YIPPEE样多肽或其同源物在改良植物生长特性，特别是改良产率/生物量，尤其是种子产率中的用途。
27.根据权利要求25的用途，其中所述种子产率包括以下的一个或多个增加的(饱满)种子数、增加的种子重量、增加的收获指数和增加的TKW。
28.YIPPEE样核酸/基因或其变体或YIPPEE样多肽或其同源物作为分子标记的用途。
全文摘要
本发明涉及通过增加植物中YIPPEE样多肽或其同源物的活性来改良植物生长特性的方法。这样的方法包括向植物中导入YIPPEE样核酸或其变体。本发明还涉及含有导入了本文的YIPPEE样核酸或其变体的转基因植物，所述植物与相应的野生型植物相比，具有改良的生长特性。本发明也涉及在本发明方法中有用的构建体。
文档编号C12N15/82GK101014614SQ200580029273
公开日2007年8月8日 申请日期2005年7月12日 优先权日2004年7月12日
发明者C·鲁兹 申请人:克罗普迪塞恩股份有限公司