专利名称：高β-葡聚糖含量的酿酒酵母突变菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及酵母突变菌株及其应用，特别涉及高β -葡聚糖含量的酿酒酵母突变 菌株及其应用。
背景技术：
酵母属于单细胞真核微生物，细胞壁厚度约为0. 1 0. 3 μ m，占细胞干重的20%， 其主要构成为葡聚糖35% 45%、甘露聚糖40% 45%、蛋白质5% 10%，另外还含有 少量脂肪等物质。酵母葡聚糖属于结构多糖，位于细胞壁的最内层，和原生质体膜相连 接，其主要生理功能是维持细胞壁的机械结构，保持细胞正常的生理形态。酵母葡聚糖 具有显著的生理功效，研究发现其可以与特异的巨噬细胞受体结合以增强机体免疫活力， 还可以通过激活巨噬细胞以起到抗肿瘤、抗菌和愈合伤口的功效。此外，酵母β-葡聚糖还 具有良好的降低胆固醇和血脂的功效。酵母葡聚糖因其突出的功能活性而引起人们的 关注，目前报道的提高酵母中葡聚糖含量的方法主要有培养基优化法、紫外照射法等。空间诱变是利用返回式空间飞行器，将植物种子、微生物菌种等材料送入太空，利 用太空特殊的环境条件，如微重力、空间辐射、超真空等，促使生物发生有益变异，从而培育 出高产、优质新品种的方法。微生物空间诱变研究目前主要集中在空间诱变对微生物产酶 活性、次级代谢产物以及菌肥活性的影响方面。有研究表明，空间诱变可使大肠杆菌、沙 门氏菌和枯草杆菌的生长加快，生长延迟期缩短，对数生长期延长。此外，空间诱变能使 嗜油细菌菌落生长率提高，并能使某些碳水化合物发酵，同化半乳糖。刘志恒等利用 “90105”科学返回卫星，研究了 24株微生物空间诱变条件下的生长与代谢性状，发现多数 菌株能够存活，一些细菌和放线菌的生长速度加快、生物量增加。
发明内容
本发明的目的是提供高β -葡聚糖含量的酿酒酵母突变菌株。本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)突变菌株FFLM2. 0016，其 保藏号为CGMCC No. 3730，于2010年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研 究所，邮编100101)。所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FFLM2. 0016的细胞形态呈卵圆形， 细胞长度2. 5-3. 8 μ m，宽度2. 2-3. 0 μ m，菌落颜色为乳白色，菌落形态为球形突起、表面 光滑而光泽、不透明、奶油状，易挑起。繁殖方式为芽殖，具有完整的细胞核和线粒体等， 细胞壁组成主要为葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质、几丁质等。有发酵能力，能够发酵葡萄糖、 果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖，不能够发酵乳糖，该结果与菌种鉴定手册中酿酒酵母属酵母 (Saccharomyce cerevisiae)发酵糖类结果一致。能够同化硫酸铵，但不能够同化硝酸钾， 同化结果符合酿酒酵母对氮源的同化规律。酿酒酵母的生活史如下子囊孢子在适宜条件 下发芽产生单倍体营养细胞一单倍体营养细胞生长、出芽繁殖一两个性别不同的营养细胞结合，质配一核配成二倍体营养细胞一不断出芽繁殖。所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)FFLM2. 0016 可用于生产 β -葡聚糖。具体可在YEPD培养基、32 °C、初始ρΗ为5的条件下培养酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)FFLM2. 0016，以得到高产量的 β -葡聚糖。所述突变菌株，是由酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 2. 0016 (Y-8)经过 搭载“实践8号”卫星空间诱变后，筛选出的高葡聚糖含量的酿酒酵母突变菌株。该 突变菌株的生物量、细胞壁厚度及葡聚糖含量均比诱变前菌株显著增加，分别增加了 57.70%、73.2%和169.6%。该突变菌株的获得对生产β _葡聚糖具有重要的意义。
图1为突变菌株FFLM2. 0016的生长曲线。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、高β -葡聚糖含量的酵母突变菌株的筛选及测定一、筛选1、空间诱变样品的培养、制备从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买酿酒酵母(Saccharomyce scerevisiae)2. 0016 (Y_8)(该菌株由东北科学院大连分所筛选得到，CGMCC菌种保藏手册 可以查到)，经YEPD培养基28°C、160r/min培养72h，收集、洗净、冷冻干燥。2、“实践8号”卫星搭载过程将冷冻管保存的冷冻干燥后的酵母菌体送入卫星装载舱。卫星于2006年9月9 日15时升空，经过15d的绕地在轨运行，于2006年9月24日10时分返回地面。卫星运行 的近地点高度为180km，远地点高度为469km，轨道倾角为63°。卫星运行期间回收舱内温 度在20. 72 7.21 °C之间。3、卫星搭载后返回样品的初筛将搭载样品洗脱到IOml无菌水中，稀释至10_4，取0. Iml涂布于YEPD平板上，28°C 培养72h。选择生长良好的100个单菌落，每个菌落转接一支YEPD斜面作为原始菌株保藏。 然后，每个菌株接一个摇瓶(100ml YEPD培养基)，28°C震荡培养72h，选出生物量较高的菌 株20株。4、卫星搭载后返回样品的复筛将上述斜面保藏的生物量较高的菌株，选取3个不同部位菌体，接种于YEPD液体 种子培养基中(50ml YEPD培养基)，12h后接于100ml YEPD液体发酵培养基、28°C震荡培 养72h，选出生物量及葡聚糖含量高的菌株4株。此4株菌株再按照上述方法复筛，得 到1株生物量及β -葡聚糖含量最高的菌株，记为FFLM2. 0016。该突变菌株细胞形态呈卵圆形，细胞长度为2. 5-3. 8 μ m，宽度2. 2-3. 0 μ m，菌落 颜色为乳白色，菌落形态为球形突起、表面光滑而有光泽、不透明、奶油状，易挑起。繁殖方 式为芽殖，具有完整的细胞核和线粒体等，细胞壁组成主要为葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质、几丁质等。有发酵能力，能够发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖，不能够发酵乳糖，该结 果与菌种鉴定手册中酿酒酵母属酵母(Saccharomycecerevisiae)发酵糖类结果一致。能 够同化硫酸铵，但不能够同化硝酸钾，同化结果符合酿酒酵母对氮源的同化规律。酿酒酵母 的生活史如下子囊孢子在适宜条件下发芽产生单倍体营养细胞一单倍体营养细胞生长、 出芽繁殖一两个性别不同的营养细胞结合，质配一核配成二倍体营养细胞一不断出芽繁 殖。该突变菌株已于2010年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究 所，邮编100101)。二、测定1、突变菌株FFLM2. 0016的生物量、细胞壁厚度及β -葡聚糖含量测定将诱变的出发菌株Saccharomyces cerevisiae 2. 0016 (Y-8)和突变菌株 FFLM2. 0016分别接种于50ml YEPD液体种子培养基中，28 °C培养12h ；然后取3ml种子 培养液接种于100ml YEPD液体发酵培养基，28°C震荡培养72h。离心收集菌体，测定 Saccharomyces cerevisiae 2. 0016 (Y-8)和突变菌株 FFLM2. 0016 的生物量、细胞壁厚度 及β-葡聚糖含量。生物量的测定方法如下取发酵液5ml，4200r/min离心15min，收获菌体，蒸馏水 洗至上清液苯酚硫酸法滴定呈无色，洗净的酵母菌体于80°C下干燥至恒重。细胞壁厚度的测定方法如下取发酵液5ml，4200r/min离心15min，收获菌体，蒸 馏水洗5次，戊二醛固定过夜，乙醇脱水，冰点干燥，喷金后使用扫描电子显微镜(Hitachi SEM-2500)观察酵母细胞，随即选取细胞拍照，使用Photoshop软件测量照片中细胞壁尺 寸，根据比例尺计算实际厚度。β-葡聚糖含量测定方法如下取发酵液5ml，4200r/min离心15min，收获菌 体，蒸馏水洗至上清液苯酚硫酸法滴定呈无色，沉淀中加入0. 5ml蒸馏水和0. 5g直径在 0. 45-0. 55mm的玻璃珠。采用涡流振荡方法破壁，每次20s循环4次，离心取沉淀，蒸馏水 洗至上清液苯酚硫酸法滴定呈无色，得到细胞壁，细胞壁先用72%硫酸100μ 1在室温条件 下预处理3h，然后稀释至1ml，使硫酸的最终浓度为4mol/L，在100°C条件下酸水解4h后用 NaOH中和，G0P0D双酶法测定葡萄糖含量，乘以校正因子0. 9即得β -葡聚糖含量。三次重复实验的结果表明突变菌株FFLM2. 0016的生物量为932士4. 2mg/100ml 发酵液、细胞壁厚度为183. 1 士 1.7nm、β -葡聚糖含量为149. 1 士0. 8mg/100ml发酵液；原 始菌株 Saccharomyces. cerevisiae 2. 0016 (Y-8)的生物量为 591 士 12. 7mg/100ml 发酵 液、细胞壁厚度为105.7±4.8nm、β -葡聚糖含量为55. 3士0. 9mg/100ml发酵液。所述突 变菌株的β-葡聚糖占酵母细胞比重为16. 00%，原始菌株Saccharomyces. cerevisiae 2. 0016 (Y-8)的β-葡聚糖占酵母细胞比重为9. 36%。突变菌株FFLM2. 0016的生物量、细 胞壁厚度及β-葡聚糖含量均比诱变前菌株Saccharomyces cerevisiae 2. 0016(Y_8)显 著增加，分别增加了 57.70%、73.2%和169.6%。经过连续15次转接，所述突变菌株的生 物量、β-葡聚糖含量稳定，未出现回复突变状况。2、突变菌株FFLM2. 0016的生理特性测定突变菌株FFLM2. 0016生长曲线测定方法如下先将突变菌株FFLM2. 0016接种
5于YEPD液体种子培养基中，28°C培养12h，然后取3ml种子培养液接种于YEPD液体发酵培 养基中。前24h内，每隔2h测定菌株生物量与β -葡聚糖含量；24h-48h内，每隔4h测定 菌株生物量与β-葡聚糖含量；48h-96h内，每隔6h测定菌株生物量与β-葡聚糖含量； 96h-120h内，每隔8h测定菌株生物量与β -葡聚糖含量。由突变菌株FFLM2. 0016生长曲线(图1)测定得出，接种后所述突变菌株未经延 迟期便迅速进入对数生长期，60h后，酵母菌的生长和β -葡聚糖生成量均进入稳定期。突变菌株FFLM2. 0016培养条件优化方法如下先将突变菌株FFLM2. 0016接种于 YEPD液体种子培养基中，28°C培养12h后接种于YEPD液体发酵培养基。基础培养条件为温 度28°C、接种量3ml、起始pH值为4。按照实验设计的不同培养条件对基础培养条件做相应 的改变，测定所得酵母生物量及葡聚糖含量。单因素实验设计如下培养温度26°C、 28°C、30°C、32°C、34°C ；接种量:lml、2ml、3ml、4ml、5ml ；起始 pH 值3、4、5、6、7。在单因素 实验结果的基础上，通过三因素、五水平正交实验得到该突变菌株FFLM2. 0016的最佳培养 条件为温度32°C、pH值5、接种量5ml。
权利要求
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FFLM2.0016，其保藏号为CGMCCNo.3730。
2.权利要求1所述的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)FFLM2. 0016在制备 葡聚糖中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae) FFLM2. 0016 在 32°C、pH 为 5 的条件下进行培养。
全文摘要
本发明公开了高β-葡聚糖含量的酿酒酵母突变菌株(Saccharomycescerevisiae)FFLM2.0016。该突变菌株的保藏号为CGMCC No.3730，是由菌株Saccharomyces cerevisiae 2.0016(Y-8)经过搭载“实践8号”卫星空间诱变后，筛选出的高3-葡聚糖含量的突变菌株。该突变菌株的生物量、细胞壁厚度及β-葡聚糖含量均比诱变前菌株Saccharomyces cerevisiae 2.0016(Y-8)显著增加。
文档编号C12P19/08GK101880635SQ20101018841
公开日2010年11月10日 申请日期2010年5月24日 优先权日2010年5月24日
发明者刘红芝, 王强 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所