专利名称：不补料酶解-膜分离耦合制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的方法
技术领域：
本发明涉及不补料酶解-膜分离耦合制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的方法，属于水 产品下脚料深加工技术领域。
背景技术：
中国是一个水产大国，在加工鱼产品的同时产生大量下脚料，其总量占加工鱼总 质量的50% -70%，其中约5%为鱼鳞。然而，受技术和传统观念的制约，在较长的一段时 间里，鱼鳞并没有被充分利用，而是当作垃圾被扔掉。据估计，我过每年鱼的废弃物总量就 达到200万吨以上，其中鱼鳞约10万吨。现有的研究表明鱼鳞可以加工成胶原蛋白、明 胶等应用于食品化妆品工业，将鱼鳞胶原蛋白水解得到的肽，与胶原蛋白相比，分子量相对 较低，现有的技术表明胶原蛋白水解得到的多肽，具有抑制血压升高、抑制血小板凝集等活 性，但是尚未见到将其用于抗氧化活性的报道。传统的制备鱼鳞胶原蛋白多肽的方法，多采用酸、酶或碱进行提取，所需时间大多 在12-72小时左右，而得到的水解度也只有20% -50%左右，这种方法生产加工耗时并需要 大量的酸、碱，污水处理量很大。用酶法制备可以上述的部分不足，但是实践证明，采用传统 的酶解技术，随着反应的进行，会出现产物抑制效应和多肽过度降解等问题。近年大量的研 究证明，酶解-膜分离耦合技术可以克服传统酶解技术存在不足，显著提高酶解反应效率 和产物的活性。尚未见到酶解_膜分离耦合技术应用于鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽制备的报 道。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术中的不足，公开一种了不补料酶解_膜分 离耦合制备多肽的方法，其特征在于按照下述步骤进行，配置一定底物浓度的原料溶液，装 入反应釜，调节反应液PH和反应温度，先使原料溶液在一定的循环泵转速下循环数分钟， 然后加入蛋白酶，再在恒速循环或“先高速后低速的变速循环”下进行连续酶解-膜分离耦 合反应，收集透过液即得多肽溶液。在不补料的情况下，将上述不补料酶解-膜分离耦合制备多肽的方法应用于鱼鳞 胶原蛋白抗氧化肽的制备，连续酶解_膜分离耦合制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的方法。本发明的技术方案按照下述步骤进行一定底物浓度的鱼鳞胶原蛋白溶液一调节 反应液PH、反应温度一超滤泵一定的转速循环数分钟一加酶一进行恒速循环或变速循环酶 解-膜分离耦合反应一收集透过液一测定底物蛋白转化率。其中所述的鱼鳞胶原蛋白溶液底物浓度质量比为0. 5% -4% ；其中所述的蛋白酶为Alcalase，调节反应液pH和反应温度为推荐的Alcalase的 最适酶解温度45 °C -60 °C，反应液为pH为8. 5-9. 5 ；其中所述的加酶量为占鱼鳞胶原蛋白质量比的0. 5% -4% ；
其中所述的加酶前原料溶液循环时间为5min ；其中所述的反应时间10_60min ；其中所述恒速循环，其循环速度为80-120r/min ；其中所述“先高速，后低速的变速循环”，即先在150r/min的循环泵转速下反应 20min,后将循环泵的转速调低至lOOr/min反应6min，进行变速循环酶解-膜分离耦合反 应；本发明中超滤过程中采用截留分子量为3kDa-10kDa的纤维素平板膜，优选3kDa 的纤维素平板膜。本发明应用不补料变速循环酶解-膜分离耦合技术制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽， 克服传统酶解技术存在不足，显著提高酶解反应效率和产物的活性。
图1为不补料变速循环连续酶膜耦合反应装置示意图，其中1-恒温水浴锅；2-酶 解反应器；3-精密酸度计；4-超滤膜组件；5-出肽阀门；6-循环泵；图2为酶解产物的DPPH自由基的清除率与纤维素平板膜的截留分子量的关系 图；图3为不补料变速循环连续酶膜耦合反应时不同循环泵转速下时间(t)对蛋白转 化率⑴的影响。
具体实施例方式下面以鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的制备为例，介绍本发明连续酶解-膜分离耦合制 备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的方法。本发明中通过测定鱼鳞胶原蛋白转化率来衡量本发明制 备方法的技术效果，其中蛋白含量的测定采用凯氏定氮法(GB/T5009. 3-2003)。蛋白转化率以膜过滤透过液中蛋白质含量占原料液中蛋白质含量百分比计算 式中x-蛋白转化率，原料液蛋白含量，mg/mL Λ-原料液总体积，mL K1-透 过液蛋白含量，mg/mL ;Vr透过液总体积，mL。本发明中通过测定酶解产物对DPPH自由基的清除率评价酶解产物的抗氧化活 性。酶解产物灭酶后稀释到统一浓度，测定DPPH自由基的清除率。测定方法将酶解上清液稀释成不同的浓度梯度，分别取2mL不同浓度的酶解 上清液于试管中，加入2mL浓度为0. 04mg/ml的DPPH溶液，混合均勻，反应20min后，于 3500rpm离心lOmin，取上清液在517nm处测其吸光值为Ai ；另各取2mL上述浓度上清液溶 液于试管中，分别加入无水乙醇2mL，反应20min后，于3500rpm离心分离lOmin，取上清液 在517nm处测其吸光值记为Aj ；以2mL 0. 04mg/mL DPPH和2mL无水乙醇反应做为参比，其 吸光值记为Atl。 式中E(dpph)-酶解上清液对DPPH自由基的清除率(％ )；A0-2mL DPPH溶液加入2mL无水乙醇的吸光值；
Ai-2mL DPPH溶液加入2mL酶解上清夜的吸光值；Ar2mL无水乙醇加入2mL酶解上清液的吸光值。EC5tl的计算=EC5tl是酶解产物的DPPH清除率达到50%时的浓度。首先把样品稀释 成一系列浓度，测定各浓度样品对DPPH的清除率，绘制清除率和浓度的关系曲线，在曲线 上查出样品的EC5tl值。纤维素平板膜的截留分子量的确定本发明中首先通过测定酶解产物的DPPH自 由基的清除率确定纤维素平板膜的截留分子量，试验按照下述步骤进行，底物浓度为2%的 鱼鳞胶原蛋白溶液一调节反应液反应温度50°C，反应液pH8. 5 —超滤泵的转速120r/min， 循环5min —加入占底物0. 5%的蛋白酶Alcalase —酶解40min —采用不同截留分子量的 纤维素平板膜进行超滤一收集透过液一测定产物对DPPH的清除率并计算EC5tl值。结果如图 2所示，综合考虑酶解产物对DPPH的清除率以及EC5tl值，本发明中优选截留分子量为3kDa 的纤维素平板膜对酶解后的产物进行超滤。实施例1本实施例按照下述步骤进行，底物浓度为2%的鱼鳞胶原蛋白溶液一调节反应液 反应温度50°C、反应液pH8. 5 —超滤泵在转速120r/min下循环5min —加入占底物0. 5% 的蛋白酶Alcalase — 120r/min恒速循环下进行“酶解-膜分离耦合反应”40min —收集透 过液一测定底物蛋白转化率。(其中膜分离采用截留分子量为3kDa的纤维素平板膜；鱼鳞 胶原蛋白，市售产品；Alcalase 2.4L，诺维信(中国)生物技术有限公司。)实施例2本实施例按照下述步骤进行，底物浓度为2%的鱼鳞胶原蛋白溶液一调节反应液 反应温度55°C，反应液pH9. 0 —超滤泵在转速lOOr/min下循环5min —加入占底物1. 5% 的蛋白酶Alcalase — 100r/min恒速循环下进行“酶解-膜分离耦合反应”30min —收集透 过液一测定底物蛋白转化率。(其中膜分离采用截留分子量为3kDa的纤维素平板膜；鱼鳞 胶原蛋白，市售产品；Alcalase 2.4L，诺维信(中国)生物技术有限公司。)实施例3本实施例按照下述步骤进行，底物浓度为2%的鱼鳞胶原蛋白溶液一调节反应液 反应温度60°C，反应液pH9. 5 —超滤泵的转速80r/min，循环5min —加入占底物1 %的蛋白 酶Alcalase — 80r/min恒速循环下进行“酶解-膜分离耦合反应” 50min —收集透过液一 测定底物蛋白转化率。(其中膜分离采用截留分子量为3kDa的纤维素平板膜；鱼鳞胶原蛋 白，市售产品；Alcalase 2.4L，诺维信(中国)生物技术有限公司。)实施例4本实施例按照下述步骤进行，底物浓度为4%的鱼鳞胶原蛋白溶液一调节反应液 反应温度55°C，反应液pH8. 5 —超滤泵的转速80r/min，循环5min —加入占底物1 %的蛋白 酶Alcalase — 80r/min恒速循环下进行“酶解-膜分离耦合反应” 50min —收集透过液一 测定底物蛋白转化率。(其中膜分离采用截留分子量为3kDa的纤维素平板膜；鱼鳞胶原蛋 白，市售产品；Alcalase 2.4L，诺维信(中国)生物技术有限公司。)实施例5本实施例按照下述步骤进行，底物浓度为2%的鱼鳞胶原蛋白溶液一调节反应液 反应温度55°C，反应液pH9. O —超滤泵的转速120r/min，循环5min —加入占底物0. 5%的蛋白酶Alcalase — 120r/min恒速循环下进行“酶解-膜分离耦合反应”40min —收集透过液一测定底物蛋白转化率。(其中膜分离采用截留分子量为3kDa的纤维素平板膜；鱼鳞胶 原蛋白，市售产品；Alcalase 2.4L，诺维信(中国)生物技术有限公司。)实施例6本实施例按照下述步骤进行，底物浓度为3%的鱼鳞胶原蛋白溶液一调节反应液 反应温度50°C，反应液pH9. 5 —超滤泵的转速80r/min，循环5min —加入占底物1. 5%的蛋 白酶Alcalase — 80r/min恒速循环下进行“酶解-膜分离耦合反应” 40min —收集透过液 —测定底物蛋白转化率。(其中膜分离采用截留分子量为3kDa的纤维素平板膜；鱼鳞胶原 蛋白，市售产品；Alcalase 2.4L，诺维信(中国)生物技术有限公司。)实施例7本实施例按照下述步骤进行，底物浓度为3%的鱼鳞胶原蛋白溶液一调节反应液 反应温度50°C，反应液pH9. 0 —超滤泵的转速lOOr/min，循环5min —加入占底物1. 5%的 蛋白酶Alcalase — 100r/min恒速循环下进行“酶解-膜分离耦合反应”50min —收集透过 液一测定底物蛋白转化率。(其中膜分离采用截留分子量为3kDa的纤维素平板膜；鱼鳞胶 原蛋白，市售产品；Alcalase 2.4L，诺维信(中国)生物技术有限公司。)本发明研究中发现循环泵转速对蛋白转化率有着的重要的影响，本实施例中通过 研究循环泵转速对蛋白转化率的影响，确定本发明的最优技术参数。酶膜耦合反应条件加酶量1.5%，反应液pH9. O,反应温度55°C，底物浓度3 %。 不同循环泵转速下蛋白转化率随时间变化的曲线如下图所示。由图3所示，循环泵的转速高时，随着时间的增加，蛋白质的转化率迅速上升，但 很快达到稳定阶段的转化点，其原因应当是快速循环，一方面有利于酶解出来的小分子多 肽及时排出反应系统，另一方面液体循环的强化传质作用有利于促进酶与底物的接触，但 20min后底物变得不足，快速的循环反而变得降低酶与底物的有效接触。从lOOr/min这条 曲线可以看出，对于较低的转速，在转化点30min以后，蛋白质的转化率还以一定的速度上 升，因此说明反应后期相对较低的循环速度，在不影响多肽排出的情况下，有利于促进蛋白 质的酶解。因此对于本发明中不补料的工作模式，优选采取先高速后低速的变速循环策略， 应当有利于改善蛋白质的转化率。实施例8本实施例采取了将循环泵先高速循环，再低速循环的变速循环策略，按照下述步 骤进行，底物浓度为3%的鱼鳞胶原蛋白溶液一调节反应液反应温度55°C，反应液pH9. O — 超滤泵的转速lOOr/min，循环5min —加入占底物1. 5%的蛋白酶Alcalase —先循环泵的 转速150r/min反应20min，再将循环泵的转速调低至lOOr/min反应6min变速循环下进行 “酶解-膜分离耦合反应”26min—收集透过液一测定底物蛋白转化率。(其中膜分离采用截 留分子量为3kDa的纤维素平板膜；鱼鳞胶原蛋白，市售产品；Alcalase 2. 4L，诺维信(中 国)生物技术有限公司。)实施例9本实施例按照下述步骤进行，底物浓度为3%的鱼鳞胶原蛋白溶液一调节反应液 反应温度55°C，反应液pH9. O —超滤泵的转速lOOr/min，循环5min —加入占底物1. 5%的 蛋白酶Alcalase—先循环泵的转速150r/min反应20min，再将循环泵的转速调低至IOOr/min反应6min变速循环下进行“酶解-膜分离耦合反应” 26min —收集透过液一测定底物 蛋白转化率。(其中膜分离采用截留分子量为3kDa的纤维素平板膜；鱼鳞胶原蛋白，市售 产品；AlCalase2. 4L，诺维信(中国)生物技术有限公司。)实施例10本实施例按照下述步骤进行，底物浓度为4%的鱼鳞胶原蛋白溶液一调节反应液 反应温度60°C，反应液pH9. 5 —超滤泵的转速120r/min，循环5min —加入占底物1. 5%的 蛋白酶Alcalase —先循环泵的转速150r/min反应20min，再将循环泵的转速调低至IOOr/ min反应6min变速循环下进行“酶解-膜分离耦合反应” 26min —收集透过液一测定底物 蛋白转化率。(其中膜分离采用截留分子量为3kDa的纤维素平板膜；鱼鳞胶原蛋白，市售 产品；AlCalase2. 4L，诺维信(中国)生物技术有限公司。)
权利要求
不补料酶解-膜分离耦合制备多肽的方法，其特征在于按照下述步骤进行，配置一定底物浓度的原料溶液，装入反应釜，调节反应液pH和反应温度，先使原料溶液在一定的循环泵转速下循环数分钟，然后加入蛋白酶，再在恒速循环或“先高速后低速的变速循环”下进行连续酶解-膜分离耦合反应，收集透过液即得抗氧化肽溶液。
2.根据权利要求1所述的不补料酶解_膜分离耦合制备多肽的方法，其特征在于所述 的原料为鱼鳞胶原蛋白，制备得到的产品为鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽。
3.根据权利要求2所述的不补料酶解_膜分离耦合制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的方 法，其特征在于其中所述的鱼鳞胶原蛋白溶液底物浓度质量比为0.5%-4%;其中所述的蛋 白酶为Alcalase，调节反应液pH和反应温度为推荐的Alcalase的最适酶解反应液pH为 8. 5-9. 5、温度为45°C -60°C;其中所述的加酶量为占鱼鳞胶原蛋白质量比的0. 5% -4%;其 中所述的加酶前原料溶液循环时间为5min ；其中所述的反应时间为10-60min ；其中所述的 恒速循环，即为在循环速度80-120r/min下进行恒速循环酶解-膜分离耦合反应；其中超滤 过程中采用截留分子量为3kDa-10kDa的纤维素平板膜。
4.根据权利要求2所述的不补料酶解_膜分离耦合制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的方 法，其特征在于其中所述的鱼鳞胶原蛋白溶液底物浓度质量比为0.5%-4%;其中所述的蛋 白酶为Alcalase，调节反应液pH和反应温度为推荐的Alcalase的最适酶解反应液pH为 8. 5-9. 5、温度为45°C -60°C ；其中所述的加酶量为占鱼鳞胶原蛋白质量比的0. 5% -4% ； 其中所述的加酶前原料溶液循环时间为5min ；其中所述的反应时间为10-60min ；其中所述 “先高速后低速的变速循环”，即先在150r/min的循环泵转速下反应20min，后将循环泵的 转速调低至lOOr/min反应6min，进行变速循环酶解-膜分离耦合反应；其中超滤过程中采 用截留分子量为3kDa-10kDa的纤维素平板膜。
5.根据权利要求3所述的不补料酶解_膜分离耦合制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的方 法，其特征在于超滤过程中采用截留分子量为3kDa的纤维素平板膜。
全文摘要
本发明公开了不补料酶解-膜分离耦合制备抗氧化肽的方法，涉及不补料酶解-膜分离耦合制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的方法，属于水产品下脚料深加工技术领域。按照下述步骤进行，配置一定底物浓度的原料溶液，装入反应釜，调节反应液pH和反应温度，先使原料溶液在一定的循环泵转速下循环数分钟，然后加入蛋白酶，再在恒速循环或“先高速，后低速的变速循环”下进行连续酶解-膜分离耦合反应，收集透过液即得抗氧化肽溶液。本发明应用酶解-膜分离耦合技术制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽，克服传统的酶解与膜分离分段操作的方法存在的不足，变速循环又克服了恒速循环存在的不足，显著提高酶解反应效率和产物的活性。
文档编号C12P21/06GK101845472SQ201010188410
公开日2010年9月29日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者任晓锋, 何荣海, 王中斌, 马海乐, 骆琳 申请人:江苏大学