将甘氨酸和/或甘氨酸衍生物用作抗食品和/或饮料中革兰氏阴性细菌病原体的抗菌剂的用途的制作方法

专利名称：将甘氨酸和/或甘氨酸衍生物用作抗食品和/或饮料中革兰氏阴性细菌病原体的抗菌剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用抗菌剂抗食品和饮料中的革兰氏阴性细菌病原体。所述抗菌剂特别适用于冷藏食品和饮料，更特别的是新鲜的或煮熟的肉(包括禽肉和鱼肉)制品。另外，所述抗菌剂特别用于抗所述食品和饮料制品中来自大肠杆菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌属和弯曲杆菌属的细菌。
背景技术：
通常，在食品和饮料中细菌的生长是通过以下方法控制和/或预防的pH调节、水活性控制、添加质量防腐剂，例如，亚硝酸盐和/或使用各种加工技术，例如热处理、辐射或高压处理。然而，在控制革兰氏阴性细菌病原体时，上述方法通常是不充分的，不理想的或不适合食品或饮料的类型。
例如，产品中水活性的控制通过例如添加盐实现。然而，通过添加盐控制或预防产品中细菌生长需要高盐浓度。所述高浓度通常会导致味道丧失，因为所述产品会变得太咸。另外，出于健康考虑，例如，对于心血管疾病或血压来说，过高的盐分含量同样是不希望的。另外，在含蛋白的制品中，例如肉类(包括鱼肉和禽肉)，所述高盐浓度可能导致产品质地的破坏。由于众所周知革兰氏阴性细菌病原体，如大肠杆菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌属和弯曲杆菌存在于含蛋白制品，如乳制品、肉制品、奶酪等中，控制水活性通常不是可行的解决途径。
另外，将pH值的pH调节作为控制细菌生长的方法可能导致产品味道丧失和/或产品质地损失，特别是对于富含蛋白的食品和饮料制品来说。另外，某些革兰氏阴性病原体细菌对添加酸不敏感。例如，弯曲杆菌和沙门氏菌的生长可以通过在分别低于4.0和3.8的pH下停止，所述pH对某些食品来说是不理想的，因为它影响味道和质地。
为了保持产品质量，将亚硝酸盐添加到腌肉(包括禽肉和鱼肉)制品中。亚硝酸盐能够阻止某些类型细菌的生长，例如，梭菌属。在某些场合下，亚硝酸盐是作为着色剂添加的，以便保持肉制品中的某些颜色。由于它的着色作用，亚硝酸盐并非适用于所有肉类制品。未经腌制过的，不含亚硝酸盐的制品(德国)有香肠、鸡肉和火鸡肉以及烤牛肉。如上文所述，特别是革兰氏阴性细菌病原体通常存在于这些食品中。目前的立法致力于减少亚硝酸盐在食品中的应用。不言而喻，一些加工技术，例如，热处理、辐射或高压处理作为食品防腐的方法并非总是适用于食品和饮料用途，如沙拉和其他蔬菜制品、饮料和乳制品，快餐和某些类型的鱼肉，例如小河虾，因为加工速度，成本，消费者的偏好以及对质地和/或味道的影响。
因此，上述添加盐、pH调节、添加亚硝酸盐的方法和处理技术，例如，热处理，并非总是满足食品和饮料防腐的目的，特别是在控制革兰氏阴性细菌病原体时。因此，含有蛋白的食品、pH敏感性食品和冷藏食品，如饮料和乳制品、沙拉和其他蔬菜制品、干燥食品和方便食品，例如，快餐，特别是肉制品(＝包括鱼肉和禽肉)制品的防腐被证实仍然存在问题，特别是如果需要防止食品因为例如，温度滥用和/或食品和饮料制品的污染而导致食物中毒的情况。已知的是，食物中毒的最重要的原因之一是由于不正确地处理食品和饮料制品而导致的污染。另外，食品通常在不正确的条件下保存。温度滥用(例如，偶然在高温下保存)可能导致业已存在于食品中的、但是没有活性的细菌再次生长，导致因为病原体细菌造成的食物中毒。本发明提供了有效的替代方案，以克服在防止食物中毒的食品和饮料的防腐中的上述问题，并且，进一步提供了抵抗由于食品和饮料制品中的病原体细菌造成的食物中毒，例如，由于温度滥用和/或污染，例如，由于不适当地处理和/或不适当地制备造成的食物中毒的方法。
已知的是，可以将甘氨酸用于抑制能导致食物腐败，又被称为腐烂的细菌的生长。通常这些细菌是乳酸菌，即，革兰氏阳性细菌。在食物腐败时，食物味道和/或它的外观受到影响，不过消费者的健康不受影响。然而，本发明涉及食物中毒的预防。食物中毒是由革兰氏阴性细菌病原体，如大肠杆菌和阪崎肠杆菌、沙门氏菌属和弯曲杆菌引起的。所述病原体会产生毒素和/或导致感染。例如，阪崎肠杆菌大量存在于婴儿奶粉中，并且可能导致婴儿出现严重的健康问题。由于存在细胞壁，并因此存在完全不同的化学和物理特性，一般来说，革兰氏阴性细菌病原体是比革兰氏阳性细菌更难于对付的病原体。
存在各种的披露甘氨酸抗食物腐败的抗菌作用的出版物JP2000-224976披露了食品防腐剂，用乳酸钙和甘氨酸与有机酸盐，例如，柠檬酸、乙酸或葡糖酸组合。另外，所述文献披露了所述防腐剂具有抗诸如乳酸菌的抗微生物的作用。所述出版物涉及甘氨酸与所述有机酸盐组合使用以预防食物腐败而不是预防由革兰氏阴性细菌病原体造成的食物中毒。
JP2001-245644披露了改善加工过的食品，如加工过的肉制品或可食用家常菜的可保存时间的方法，包括至少使用乳酸盐和乙酸盐。可以根据需要添加甘氨酸。所述出版物披露所述方法能够抑制与腐烂或腐败相关的微生物的生长。所述出版物没有提到所述方法对食品病原体细菌的任何影响。
UK 1510942披露了同时将麦芽糖和甘氨酸用于防止粮食腐烂，如日式甜食、果酱、果冻、冷藏点心、乳制品和蜜饯。披露了一种试验方法，其中，测试了所述麦芽糖和甘氨酸的组合抗杆菌对牛肉浸膏的腐败作用。该文献涉及乳酸菌造成的食物腐败而不是由革兰氏阴性细菌病原体引起的食物中毒。
US 2711976披露了甘氨酸可用于抗食物腐败，通过抗“耐热的原有的或天然的菌群，它能够在通常的烹饪或热处理操作中存活”，并且进一步抗由产肠毒素的微生物，如酿脓微球菌或更常见的是被称作葡萄球菌导致的食物中毒。
发现某些出版物公开了甘氨酸的抗菌作用，不过这些文献没有明确针对哪些细菌JP 08-154640 A披露了将抗微生物剂用于食品中以改善防腐作用，其中，所述制剂含有1-30wt％乙酸，优选1-30wt％的甘氨酸，优选0.05-1wt％的烘烤的钙。炸肉团(肉馅水饺)和春卷(蛋饼包裹切碎的蔬菜、肉类等的小卷并在热油中油炸)是所披露的食品，其中，使用了所述抗菌剂。所述文献没有提到所述制剂起作用的具体的细菌。
JP 03 290174 A披露了将甘氨酸和其他有机酸，如乙酸添加到未加热过的或低温热处理过的食品中，调整pH到5.5或以下，然后将它放入要进行高压处理的容器中，用水压介质进行消毒。该文献没有提到甘氨酸起作用的食品病原体细菌。该文献没有提到进行甘氨酸试验的具体的食品和/或饮料。
另一篇文献披露了将甘氨酸用于抗霉菌和酵母和大肠杆菌International Food Information，XP002315132，Hozova等，″Prolonging the storage life of foods by non-traditionalpreservation methods″，Slovak.Inst.Of Tech.，Czechoslovakia，1989；该文献披露了甘氨酸对延长防腐食品的保存寿命的作用。将生猪肉、菜炖牛肉用作试验制品。所有样品通过热处理进行加工。结果表明，添加甘氨酸对存在于生猪肉中的霉菌和酵母的生长有作用，然后对所述生猪肉进行热处理和巴氏灭菌。涉及大肠杆菌微生物和需氧成孢子微生物的微生物部分，不会受到甘氨酸存在的显著影响。

发明内容
本发明涉及将甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯用作抗食品或饮料中革兰氏阴性细菌病原体大肠杆菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌属和弯曲杆菌的抗菌剂的用途，其前提是，除了所述甘氨酸和/或甘氨酸衍生物之外，在所述食品和饮料中不使用含有杂多糖的高分子，也不使用1，5-D-脱水果糖作抗菌剂。
尽管在某些现有技术的文献中，提到了复杂的甘氨酸化合物，据说具有抗菌特性，本发明涉及″简单的″甘氨酸化合物，如甘氨酸和碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和甘氨酸与C1-C8醇的酯的用途。甘氨酸与C1-C8醇的酯表示甘氨酸与包括1-8个碳原子的醇的酯。所述碳原子链可以是分支的或直的。碱金属甘氨酸盐的例子有甘氨酸钠和甘氨酸钾；碱土金属甘氨酸盐的例子有甘氨酸镁和甘氨酸钙；C1-C8醇的甘氨酸酯的例子有甘氨酸甲酯、甘氨酸乙酯、甘氨酸丁酯和甘氨酸己酯。例如，发现甘氨酸钠是本发明的对于革兰氏阴性细菌病原体来说是非常有效的抗菌剂。
尽管在实验中通常以将诸如酸、防腐剂(例如，山梨酸)等的添加剂添加到肉汤中用作它在实际食品和饮料制品中的作用的预测，但我们发现，甘氨酸在肉汤中的作用不会提供它在实际食品和饮料制品中的作用的任何指示。存在于实际食品和饮料制品中的介质包括蛋白和脂肪，具有所存在液体的特定的迁移率，在食品中可能出现甘氨酸的吸附或掺合。在不受理论约束的前提下，认为实际上甘氨酸是食品和饮料制品的氨基酸和天然结构单元，并且大量存在于食物成分中，导致它以相当不可预测的方式影响实际食品和饮料制品。
在US 6200619，EP 1252827A1和US 4820520中，提到了复杂的抗菌剂，如含有杂多糖的高分子和1，5-D-脱水果糖和甘氨酸的组合用途。本发明排除了使用上述复杂的抗菌剂。
我们业已发现，甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯可有效用作食品和饮料制品的唯一的抗菌剂，其浓度仍然能够接受，而又不会对产品质量，例如，味道和质地造成负面影响。我们业已发现，甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯可以用作唯一的抗菌剂，用于防腐目的，并且用于预防食品和饮料制品污染的后果，如由于温度滥用和/或污染由病原体细菌造成的食物中毒。没有必要添加辅助抗菌剂获得需要的防腐效果，这与上述专利所披露的结果不同。这不仅导致了较低的材料成本，而且还导致了更高的产品质量。获得了辅助成分添加较少，同时保持甚至改善所述产品的质量和货架寿命的产品。另外，它与致力于最小化在食品和饮料中使用添加剂的立法规定一致。再者，还能防止所获得的产品的温度滥用或污染的后果。
甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯能非常好地用作本发明的抗革兰氏阴性细菌病原体的抗菌剂用于非-冷藏食品，例如，汤、面条、乳酪和某些香肠和(粉末状)干燥制品中。例如，已知沙门氏菌属可以在脱水食品中长时间存活。另外，阪崎肠杆菌的存在也因为它在婴儿配方中的出现而臭名昭著。
我们业已发现，甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯可适当地用于冷藏食品和饮料制品中。冷藏食品和饮料制品被认为是需要在较低温度下保存，以便在(准备)消费之前提高细菌稳定性的食品和饮料制品。温度通常在4-7℃下，偶尔的最高温度为12℃。甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯的使用在冷藏食品中具有特殊优点，因为通常不希望采用其他方法保存这种类型的食品，这是由于其他方法会破坏产品质量(味道、质地、风味)。本发明的甘氨酸和它的衍生物的使用，适用于控制冷藏食品中的沙门氏菌属，因为众所周知沙门氏菌属能够在冷藏食品中长时间保持活力，并且其存活力能够随着保存温度的升高而提高。另外，冷藏食品对因为食品的不正确的处理而导致的温度滥用和/或污染特别敏感。温度滥用可能在食品从供应商向储存地转移期间出现(例如，货车车箱的不适当的冷却)，不过通常还出现在将产品从保存地运送到家庭期间。即使对于冷藏食品的偶然的温度升高来说，在使用甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯时可以确保食品安全。所述冷藏食品的例子有肉制品(腌制的和/或未经腌制的、新鲜的和/或烹饪过的)、沙拉和其他蔬菜制品、饮料和乳制品、半加工的食品、方便食品，例如，快餐和干燥食品。
发现甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯是肉制品，包括鱼肉和禽肉、腌制的和未经腌制的肉和鲜肉的非常有效的抗菌剂。革兰氏阴性细菌病原体沙门氏菌属、大肠杆菌、阪崎肠杆菌和弯曲杆菌，特别是鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌通常出现在这种类型的制品中。上述细菌对pH控制，水活性或添加亚硝酸盐相对不敏感。为了获得对细菌生长的某些作用，必须以高浓度添加酸、盐或亚硝酸盐，不过这种高浓度对产品质量会产生负面影响，表现为肉制品较差的口味和质地丧失。发现甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯可用作有效抗所述细菌的抗菌剂而不会损失口味并且不会损失质地。另外，上述方法和其他加工技术，例如，用于防腐的热处理不能防止由于温度滥用和/或污染造成的食物中毒。
鲜肉的例子有牛肉、牛排、牛尾、颈骨、排骨、烤牛肉、炖肉、牛胸肉、猪肉、猪排、熟火腿、炸肉排、烤猪肉、羔羊肉、小牛肉、game goat、americain肉片、鞑靼牛排、寿司、或生牛肉片、鸡肉、火鸡肉、鸭肉和其他禽肉。上述某些鲜肉制品是生吃的，而其他鲜肉制品是在仅进行部分热处理之后食用的，例如有意中等煮熟的牛排或由于不恰当的制备或不恰当的处理食品无意造成的。将甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯用作抗菌剂，即使在部分热处理的情况下也能确保食品安全性。
抗菌活性不仅包括防止细菌进一步生长的细菌抑制活性，而且还包括实际上能减少细菌数量的某些杀菌活性。
发现占产品总重量0.5-3wt％的甘氨酸浓度是大肠杆菌的有效的抗菌剂，并且发现占产品总重量0.5-1.5wt％的甘氨酸浓度适合确保产品的口味。
发现占产品总重量0.5-3wt％的甘氨酸浓度是阪崎肠杆菌的有效的抗菌剂，并且发现占产品总重量0.5-1.5wt％的甘氨酸浓度适合确保产品的口味。
占产品总重量0.2-3wt％的甘氨酸浓度表现出针对沙门氏菌属的抗菌活性，特别是针对鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的抗菌活性。发现占产品总重量0.2-1.5wt％的甘氨酸浓度适合确保产品的口味。
试验表明，大约占产品总重量1-1.5wt％的甘氨酸浓度开始影响所述产品的口味。在所述产品中，不存在辅助抗菌剂和其他影响口味的成分。占产品总重量1.5wt％以上的甘氨酸浓度使产品具有甜味。根据产品的类型，这种甜味是可接受的或不可接受的。例如，对于甜味饮料来说，甘氨酸的增甜作用不被认为是问题。因此，对于不负面影响产品口味的来说，最大可接受的甘氨酸浓度可以提高到占产品总重量1.5wt％以上的甘氨酸浓度。另外，根据影响口味的其他成分在产品中的存在，例如掩蔽剂的存在，甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯的最大浓度还可以提高到产品的口味开始受到甘氨酸和/或所述甘氨酸衍生物的存在的负面影响的点。
业已发现，可以将本发明的用作食品和饮料的抗菌剂的甘氨酸和/或它的衍生物与一种或多种有机酸和/或它们的一种或多种盐，例如苯甲酸、抗坏血酸、乳酸、柠檬酸、乙酸等组合。所述有机酸和/或它的盐可以单独与本发明的甘氨酸和/或衍生物使用，或者可用于有机酸和/或它们的一种或多种盐的混合物中，例如，乳酸钾和二乙酸钠的混合物与本发明的甘氨酸和/或它的衍生物组合。
所述组合和/或混合物，例如，本发明的乳酸和/或它的衍生物的混合物可以得到除了抗菌活性之外具有各种功能特性的抗菌剂。这些附加的功能特性的例子是(矿物)富集或强化作用，一般其具有若干种积极的健康效果、改善口味、保持颜色和pH调节。乳酸盐的例子有乳酸钠、乳酸钙、乳酸钾、乳酸亚铁、乳酸锌、乳酸镁。
业已发现，可以将用作食品和饮料的抗菌剂的甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯与占所述食品和饮料重量的0.2-3wt％浓度的乳酸和/或它的盐组合。
在某些场合下，优选将本发明的甘氨酸和/或它的衍生物与前面所提到的一种或多种加工技术，例如，热处理、辐射和/或高压处理组合用于防腐。
通过以下实施例对本发明作进一步的说明，这些实施例不应被理解成限定性的。
具体实施例方式
比较实施例1A.甘氨酸对肉汤中单核细胞增多性李斯特菌的抑制作用制备单核细胞增多性李斯特菌(ATCC 7644)培养物。每天将培养物转移到装有10ml脑心浸液肉汤(OxoidCM0225，Basingstoke，UK)的螺纹盖试管(100×16mm)中。培养物在30℃、不搅拌的条件下培养。
肉汤制备用逐渐增加数量的甘氨酸(ex SigmaG 7126)制备脑心浸液肉汤。甘氨酸的浓度为0-400mM，提高的梯度为50mM。由此得到了90种不同的培养基。根据配方不同，培养基的pH在7-7.4的范围内，并且不进行调节。以10ml的数量制备培养基，并且通过过滤消毒(Sartorius硝酸纤维素膜，孔径为0.45μm)。将300μl的每一种培养基转移到无菌Bioscreen蜂巢100孔平板上。整个孔平板在-20℃下冷冻，在聚乙烯袋中进行真空密封，最终在-20℃下保存直到进一步使用。
生物筛分生长实验将孔平板快速解冻，然后使用无菌Hamilton 5μl重复分配器(Hamilton，Bonaduz，Switserland)接种5μl在脑心浸液肉汤中生长过夜的培养物。使用Bioscreen C(Labsystems，Helsinki，Finland)测定生长速度，该装置能通过垂直测光法动态测定浊度的发展。在37℃下培养所述平板16-24小时，在420-580nm波长下使用宽频带滤波器每隔30分钟测定培养物的光学密度。
所述Bioscreen以预定的时间间隔测定培养物的光学密度。所述Bioscreen可以根据测量的数据计算最大比生长速度。在

图1中，示出了增加甘氨酸浓度对单核细胞增多性李斯特菌最大比生长速度的影响。
数据表明，单核细胞增多性李斯特菌的甘氨酸的P0.5值(导致1/2最大抑制作用的浓度)为0.20。因此，在肉汤中甘氨酸表现出对单核细胞增多性李斯特菌的抑制作用。
B1.甘氨酸对熟香肠A中的单核细胞增多性李斯特菌的抑制作用制备了由三个熟香肠组成的批料，每一个香肠的重量为大约500g。下面披露了熟香肠A的基本配方熟香肠A的基本配方成分 ％牛肉(10％脂肪)7.00猪肉(8％脂肪) 0.20熏肉(40％脂肪)69.00水/冰 9.00Colorozo盐2.00香料 0.35磷酸盐0.35抗坏血酸钠0.05谷氨酸钠 0.05小麦淀粉 2.00香肠在0℃下保存1天，直到进行进一步检查。
将熟香肠放入消过毒的实验室切割器(Scharf)的碗中，切割成小片，并且接种单核细胞增多性李斯特菌类型4a(ATCC 19114)的悬浮液，使每克产品最终含量分别为大约102和104个。在接种之后，将所述香肠切碎，并且匀化2分钟。然后，将切碎的产品分成40g一份，并且真空包装于在20℃下氧渗透率低于5.0×10-11·m3·m-2·Pa-1·天-1的塑料袋中。所获得的包装在7℃下保存长达21天。在实验期间，用数据记录器记录温度。
以适当的时间间隔，取每一批切碎的熟香肠样品双份，用于微生物学分析。从每一个包装中，在无菌条件下取20g样品，用生理蛋白胨盐水(PPS)稀释10倍，并且用细菌分离器匀化1分钟。用PPS制备其他系列稀释液。
使用Palcam琼脂(OxoidCM877和SR150)测量单核细胞增多性李斯特菌的数量。平板在37℃下培养2天。
在表1中提供了在7℃下真空包装保存期间熟香肠A的微生物学分析结果。
表I在7℃下保存期间添加了甘氨酸的真空包装的熟香肠的单核细胞增多性李斯特菌的数量结果

向熟香肠中添加1wt％甘氨酸对单核细胞增多性李斯特菌没有抑制作用，而在肉汤中存在这种作用。
B2.甘氨酸对熟香肠B中的单核细胞增多性李斯特菌的抑制作用对具有不同配方的香肠香肠B进行如B1所述相同的实验。下面提供了熟香肠B的基本配方熟香肠B的基本配方成分 ％牛肉(20％脂肪)7猪肉(8％脂肪) 10.2熏肉(30％脂肪)69水/冰 9.00Colorozo 2.00香料 0.35磷酸盐0.35抗坏血酸钠0.05谷氨酸钠 0.05小麦淀粉 2.00在表II中提供了在7℃下真空包装保存期间熟香肠B的微生物学分析的结果。
表II在7℃下保存期间添加了甘氨酸的真空包装的熟香肠B的单核细胞增多性李斯特菌数量的结果

同样，向熟香肠中添加1wt％甘氨酸不会对单核细胞增多性李斯特菌产生抑制作用，而在肉汤中存在这种作用。
例2将冷冻研磨的绞细牛肉解冻，并且分成1.7kg的部分，与不同浓度的占内部分总重量的0.5wt％，1.0wt％和1.5wt％的甘氨酸混合。然后通过消过毒的铰肉机上的6mm的平板将肉切碎一次。
每一部分(1.5kg)接种大肠杆菌O157:H7(ATCC 43895)的悬浮液，使每克产品的最终含量为大约104cfu。在用大肠杆菌O157:H7接种保持斜面培养的培养物之前，用脑心浸液(BHI，OxoidCM 225)在30℃下在24小时内预培养两次。用生理蛋白胨盐水(PPS)稀释成熟的培养物，以便获得预期含量的接种。通过3mm的平板将接种过的肉切碎两次，然后将绞细牛肉分成80g的部分在改进的气氛(MAP)中包装，该气氛包括70％O2和30％CO2，气体体积约为120ml。所有包装在12℃下保存12天。在实验期间用数据记录器记录温度。
以适当的时间间隔取绞细牛肉的每一部分的样品双份，用于微生物学分析。在无菌条件下从每一部分取20g样品。用生理蛋白胨盐水(PPS)将样品稀释10倍，并且在细菌分离器中匀化1分钟。用PPS制备其他系列稀释液。使用山梨糖醇MacConkey琼脂(SMAC，OxoidCM813)，参见NEN-ISO 16649-22001，测定大肠杆菌O157:H7细菌的数量。所述平板在42℃下培养1天时间。
表III表示用大肠杆菌O157:H7接种的并且添加了三种不同甘氨酸浓度的绞细牛肉在12℃于MAP中保存期间的微生物学分析的结果(重复测定)。
表III具有不同的甘氨酸浓度的绞细牛肉在12℃下于MAP中保存期间的大肠杆菌O157:H7细菌数量的结果。

结果表明，占产品总重量0.5wt％的甘氨酸浓度具有针对大肠杆菌O157:H7的抗菌活性。占产品总重量1.0wt％的甘氨酸浓度表现出针对大肠杆菌O157:H7的明确的杀菌活性，并且甚至能够在7天保存时间内将每克产品的细菌数量的对数cfu从4降低到2。
例3大肠杆菌O157:H7(ATCC700728)的培养物在BHI肉汤(脑心浸液，OxoidCM225)上预培养，并且在30℃下培养24小时。用蛋白胨生理盐水(PPS)将培养物稀释50倍。
将3000克辐射过的绞细牛肉分成3个样品，并且与甘氨酸充分混合，以便制备分别含有0，1.0，和1.5wt％甘氨酸的样品。然后，将每一份样品分成各25克的30份。将所述部分放入无菌袋(Intersciencebagfilters，400ml，Model P)中，并且用稀释过的培养肉汤接种，使每克产物的最终含量为大约105cfu(250μl培养物/PPS)。通过手工充分混合所述培养物和样品。然后在需氧条件下直接密封所述袋。最后在8℃下培养所述样品。
以适当的时间间隔，用PPS将每一种浓度的各个部分稀释2倍，并且用细菌分离器(Lab Blender400)匀化1分钟。用PPS制备其他系列稀释液。
将稀释液放置在″Violet Red Bile Glucose Agar″(OxoidCM485)上，并且在30℃下培养24小时。
在表IV中提供了用大肠杆菌O157:H7接种过的并且添加了三种不同甘氨酸浓度的辐射过的绞细牛内在8℃下保存期间的微生物学分析的结果。
表IV含有不同甘氨酸浓度的辐射过的绞细牛肉在8℃下保存期间的大肠杆菌O157:H7细菌数量的结果。

添加1.0％的甘氨酸观察到了小的抑制作用，而添加1.5％甘氨酸产生了杀菌作用。
例4来自臀尖的鲜猪肉通过消过毒的铰肉机上的12mm平板切碎一次，并且进行手工匀化。将所述猪肉分成2.5kg的七份，并且与不同浓度的占肉部分总重量的0.5wt％、1.0wt％和1.5wt％的甘氨酸混合。
然后通过6mm平板将肉切碎一次。每一批次(2.3kg)接种10ml的大肠杆菌O157:H7(ATCC 43895)悬浮液，使每克产品的最终含量为大约104cfu。在接种之前将保持斜面培养的培养物放在脑心浸液(BHI，OxoidCM225)中在30℃下预培养24小时两次。用生理蛋白胨盐水(PPS)稀释成熟的培养物，以便获得需要的含量。
再次通过3mm平板将接种过的肉切碎两次，然后将绞细好猪肉在改进的气氛(MAP)中包装成24份，每份80g，所述气氛包括80％O2和20％CO2，气体体积为大约120ml。然后将9个包装在12℃下保持长达12天时间。在实验期间，用数据记录器记录温度。
以适当的时间间隔，取每一批次的绞细的猪肉样品两份用于微生物学分析。从每一个包装中在无菌条件下取20g样品，于(PPS)中稀释10倍，并且用细菌分离器匀化1分钟。用PPS制备其他系列稀释液。使用CT-SMAC(山梨糖醇MacConkey Agar，OxoidCM813和头孢克肟-亚碲酸盐添加剂，OxoidSR172)，参见NEN-ISO 16649-22001，测定大肠杆菌O157:H7细菌数量。所述平板在42℃下培养1天时间。
表V表示用大肠杆菌O157:H7接种，并且添加了三种不同甘氨酸浓度的绞细的猪肉在12℃下保存期间的微生物学分析的结果(双份)。
表V具有不同的甘氨酸浓度的绞细的猪肉在12℃下在MAP中保存期间的大肠杆菌O157:H7细菌数量结果。

在12℃下保存5天之后，发现绞细的猪肉的外观具有微小的差别。7天之后没有添加剂和具有较小数量甘氨酸的绞细的猪肉表现出灰色。10天之后，所有产品被判断为灰色。
例5用消毒牛奶试验了0.5，1.0，1.5％(w/t)甘氨酸对大肠杆菌O157:H7的作用。大肠杆菌O157:H7(ATCC 700728)培养物在BHI肉汤(OxoidCM225)上预培养两次，并且在30℃下培养24小时。用生理蛋白胨盐水(PPS)将所述培养物稀释2次，每次稀释10倍。
通过将0，0.5，1.0，1.5％(w/t)的甘氨酸与消毒牛奶(半脱脂，Landhof)混合制备4份250克的样品。将样品放入真空袋(Hevel，S.E.plus 0，1，300×150mm)中。将0.5ml的稀释过的培养基添加到所述样品中。然后，用细菌分离器(Lab Blender400)将所述样品匀化1分钟。每一个样品分成5ml的8份，并且放入无菌试管(150×17/18mm)中。最后，将所述试管在11℃下保存几天。
以适当的时间间隔，取每一份样品的2个试管用于微生物学分析。通过涡旋搅拌(Scientific Industries，Vortex Genie 2)将每一个试管充分混合。用PPS制备系列稀释液(10倍)。
将所述牛奶和系列稀释液放置在VRBG平板(Oxoid，CM485)上。在30℃下培养24小时之后，统计大肠杆菌菌落的数量。
在表VI中，提供了接种在含有不同甘氨酸浓度的消毒牛奶上的大肠杆菌O157:H7(VRBG琼脂)的平板计数结果。
表VI在11℃下接种在具有不同甘氨酸浓度的消毒牛奶上的大肠杆菌O157:H7(VRBG琼脂)的平板计数

结果表明，在添加至少1wt％甘氨酸时在消毒牛奶中能有效地控制大肠杆菌。
例6在本实验中，用大肠杆菌O157:H7对外卖的商业化″快餐″(Tagliatelle with Carbonara sauce)进行了接种研究。
从外卖餐厅购买四份快餐意大利面食(Tagliatelle withCarbonara sauce)。所测定的该产品的pH和Aw(水活性)分别为5.93和0.996。将食品级甘氨酸用作抗菌剂。
大肠杆菌O157:H7(ATCC 700728)的培养物在BHI肉汤(脑心浸液，OxoidCM225)上预培养两次，在30℃下培养24小时。用生理蛋白胨盐水(PPS)将培养物稀释10倍2次，11倍1次。
意大利面食(1200g)在-20℃下冷冻3小时，并且然后用厨用搅拌器(Moulinex，Ovatio 3)匀化。将所述意大利面食分成样品，并且与甘氨酸充分混合，以便制备240g的样品，各自分别含有0.0，0.5，1.0，的1.5wt％的甘氨酸。
每一份样品在121℃下消毒20分钟，然后冷却到11℃。然后将每一份样品分成10份，每份20克，放入无菌袋(Intersciencebagfilters，400ml，Model P)中。
所述部分用稀释过的(1100倍)培养肉汤接种，使每克产品的最终含量为大约104cfu/g(～200μl PPS)。所述部分在需氧条件下密封并且在11℃下保存11天时间。
将每一种浓度的两份样品用PPS稀释2倍，并且用细菌分离器(LabBlender400)匀化1分钟。用PPS制备其他系列稀释液。
将所述稀释液放置在″Violet Red Bile Glucose Agar″(Oxoid，CM485)平板上，并且在30℃下培养24小时。
在表VII中提供的在11℃下在Tagliatelle with Carbonara调味剂上进行的大肠杆菌O157:H7的微生物学分析结果。
表VII在11℃下接种到含有不同甘氨酸浓度的″快餐″中的大肠杆菌O157:H7平板计数结果。

在1.0％(w/w)甘氨酸浓度下测定了甘氨酸的抑菌作用。
浓度为1.5％(w/w)的甘氨酸甚至能提供杀菌作用.。
例7将六个批次，每个批次大约1500g的粉末婴儿配方在室温下保存4天时间，然后用于进一步检查。
向每一批婴儿配方中添加特定数量的甘氨酸，以便制备分别含有0.0，0.5，1.0，1.5，和3.0wt％甘氨酸的样品。用两种阪崎肠杆菌菌株(ATCC 29544(LMG 5740)和LMG 2759)的混合物接种所述样品。在接种于冰箱中保持斜面培养的培养物之前，用脑心浸液肉汤(BHI，OxoidCM225)在30℃下预培养24小时，两次。用生理蛋白胨盐水(PPS)稀释成熟的培养物，以便获得所需水平的悬浮液。
用10ml的阪崎肠杆菌悬浮液接种每一种组成的婴儿配方样品(大约1000ml)，使最终含量为每克产品大约103cfu。在接种之后，通过搅拌使婴儿配方匀化。然后，将所述产品分成12份，每份50ml，放置在塑料样品盘(180ml)中，在密封之后具有足以保持需氧条件的空气层。所获得的样品盘在12℃下保存14天时间。在实验期间记录保存温度。
以适当的时间间隔，取每一批婴儿配方的样品双份，用于微生物学分析。通过摇晃匀化每一个样品盘。用PPS制备其他系列稀释液。
使用Violet Red Bile Glucose Agar(VRBGA，OxoidCM485)测定阪崎肠杆菌的数量，参见ISO 55521997。所述平板在37℃下培养1天时间。
在表VIII中提供了在12℃下在需氧包装保存期间含有不同甘氨酸浓度的重建婴儿配方的微生物学分析结果。
表VIII在12℃下需氧保存期间含有不同甘氨酸浓度的重建婴儿配方的阪崎肠杆菌数量结果。

结果表明，在含有起始含量为0.5％的甘氨酸的婴儿配方中阪崎肠杆菌生长受到抑制。在1％或更高的含量下观察到阪崎肠杆菌的失活达到不可检测水平。
例8按以下配方制备六批包括三个煮熟的鸡肉香肠的制品，各自大约500g熟香肠的基本配方成分 ％鸡胸肉(1％脂肪) 91.15磷酸盐 0.35盐(NaCl) 1.50水/冰7.00每一根煮熟的鸡肉香肠用鼠伤寒沙门氏菌(M90003246/0550)混合物接种。在接种所述保持斜面培养的培养物之前，用脑心浸液(BHI，OxoidCM225)，在30℃下预培养24小时两次。用生理蛋白胨盐水(PPS)稀释成熟的培养物，以便获得所需含量的混合物。
将每一种组成的两根香肠(大约1000g)放入消过毒的实验室切割器(Scharf)的碗中，切割成小片，并且用10ml的单核细胞增多性李斯特菌和沙门氏菌属的悬浮液接种，使每克产品的最终含量分别为大约102或103。在接种之后，将煮熟的鸡肉香肠切碎，并且匀化2分钟。然后，将切碎的产品分成40g一份的部分，并且用塑料袋进行真空包装，所述塑料袋在20℃下的氧气通透率低于5.0×10-11m3.m-2.Pa-1.天-1。所获得的包装在12℃下保存21天。在实验期间，用数据记录器记录温度。
以适当的时间间隔，取每一批切碎的熟鸡肉香肠的样品双份用于微生物学分析。在无菌条件下取每一个包装的20g样品，用PPS稀释10倍，并且用细菌分离器匀化1分钟。
用PPS制备其他系列稀释液。使用Violet Red Bile Glucose Agar(OxoidCM485)测定沙门氏菌属的数量。平板在37℃下培养1天。
在表XIV中提供的在12℃下在真空包装保存期间具有不同添加剂的煮熟的鸡肉香肠的微生物学分析的结果。
表XIV在12℃下保存期间，真空包装的具有不同添加剂的煮熟的鸡肉香肠的沙门氏菌数量的结果。

结果表明，占产品总重量0.5wt％或以上的甘氨酸浓度具有针对煮熟的鸡肉中的鼠伤寒沙门氏菌的抗菌活性。占产品总重量0.5wt％或以上甘氨酸钠浓度明确起着抗菌剂的作用。甘氨酸钠具有强的杀菌作用，并且在12℃下保存时只需要4天时间就能够将每克产品的细菌数量降低到每克低于1个对数cfu。
例9制备由两个真空包装的各自大约1500g的辐射过的碎鸡肉组成的批次，分别含有0.0，0.5，1.0，和1.5wt％的甘氨酸作为抗菌剂。所述成批的碎鸡肉在0℃下保存1天时间，直到进一步检查。
用鼠伤寒沙门氏菌(M90003246/0550)接种每一批碎鸡肉。在接种之前，放置在冰箱中的保持斜面培养的培养物用脑心浸液肉汤(BHI，OxoidCM225)在30℃下预培养24小时两次。用生理蛋白胨盐水(PPS)稀释成熟的培养物，以便获得所需含量的悬浮液。
将每一种组成的一定量的碎鸡肉(大约1000g)放入消过毒的托盘中，并且接种10ml的鼠伤寒沙门氏菌悬浮液，使每克产品的最终含量为大约104cfu。在接种之后，用手工使碎鸡肉匀化。然后，将产品分成50g一份，并且在需氧条件下包装在塑料袋(16×11×1.5cm，约250ml)中。所获得的包装在30℃下保存24小时，并且在7℃下保存30天。在实验期间，记录保存的温度。
以适当的时间间隔，取每一批碎鸡肉的样品两份用于微生物学分析。在无菌条件下取每一个包装的20g样品，用PPS稀释10倍，并且用细菌分离器匀化1分钟。
用PPS制备其他系列稀释液。用Violet Red Bile Glucose Agar(VRBGA，OxoidCM485)，参见ISO 55521997，测定鼠伤寒沙门氏菌的数量。平板在37℃下培养1天时间。
在表X中提供了在7℃下在需氧包装保存期间具有不同数量甘氨酸的碎鸡肉的微生物学分析的结果。
表X在7℃下保存期间具有不同数量的甘氨酸的需氧包装的碎鸡肉的鼠伤寒沙门氏菌数量的结果。

在7℃下保存期间，在含有0.5％的甘氨酸的碎鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌的发育在整个30天的保存期间受到了抑制。在含有1-1.5％的甘氨酸的碎鸡肉中，发现在保存期间鼠伤寒沙门氏菌的数量减少了两个对数值。
例10在例10中，用巴氏灭菌的蛋黄进行了肠炎沙门氏菌的接种研究。为此，从300个鸡蛋中获得了大约2千克的蛋黄并且过滤。向蛋黄中添加甘氨酸，以便将400克的样品分别在装有0.0，0.5，1.0和1.5wt％甘氨酸的无菌罐子中制备。通过摇晃充分混合甘氨酸和蛋黄。在60℃下对样品进行巴氏灭菌60分钟。
用两种肠炎沙门氏菌菌株(ATCC13076和RKI 01-02637)接种所述蛋黄。从肠炎沙门氏菌母液中取出4ml在100ml TSB(BiokarBK046HA)上在30℃下预培养24小时。从该培养物中取出0.1ml再次在100ml TSB上在30℃下预培养18小时。每一个400克的蛋黄样品接种1ml的TSB，并通过摇晃人工混合(5分钟)。然后将每一个样品分成20克一份，并且在需氧条件和分别在7℃，11℃和12℃的温度下在塑料盒中培养。
在几天之后分析在7℃和12℃下培养的两种样品的微生物学数量。
从盒子中称取每一种蛋黄样品20克，并且放入细菌分离器袋中。然后，用90ml的BPW(BiokarBK018HA)通过使用细菌分离器(Colworth，20sec)对样品进行匀化。用PPS制备其他系列稀释液(BiokarBK014HA)。
将所述稀释液放置在亮绿琼脂平板(BiokarBK091HA)上，参见ISO 65792002。
在表XI和XII中提供了在7℃和12℃下蛋黄的肠炎沙门氏菌的微生物学分析的结果。
表XI在7℃下接种在含有不同甘氨酸浓度的蛋黄上的肠炎沙门氏菌的平板计数。

表XII在12℃下接种在含有不同甘氨酸浓度的蛋黄上的肠炎沙门氏菌的平板计数。

在7℃下，当添加0.5％甘氨酸时肠炎沙门氏菌的存活率降低。在12℃下，在添加0.5％甘氨酸时观察到了轻微的抑制作用。在较高浓度下，抑制作用更强。
例11在本实施例中，用巴氏灭菌蛋黄进行了肠炎沙门氏菌的接种研究。为此，从70个鸡蛋中取出大约1千克蛋黄并且过滤。向蛋黄中添加甘氨酸，以便在装有0.0，0.5，1.0和1.5wt％甘氨酸的无菌罐子中制备各自150ml的样品。通过摇晃混合甘氨酸和蛋黄。在60℃下对样品进行巴氏灭菌60分钟。
用肠炎沙门氏菌(ATCC13076)接种蛋黄。肠炎沙门氏菌的培养物在BHI(OxoidCM 225)上在30℃下预培养24小时。用生理蛋白胨盐水(PPS)稀释培养物10倍。每一种样品接种0.6ml培养试管介质，通过手工摇晃混合(5分钟)。
然后将每一个样品分成5ml一份，在11℃下保存。
在几天之后分析在11℃下培养的样品的微生物学数量。
用PPS制备每一种浓度的10倍稀释液。将所述稀释液放置在″Violet Red Bile Glucose Agar″(Oxoid，CM485)平板上，并且在30℃下培养24小时。
在表XIII中提供了在11℃下培养的蛋黄的肠炎沙门氏菌的微生物学分析结果。
表XIII在11℃下接种在具有不同甘氨酸浓度的蛋黄上的肠炎沙门氏菌的平板计数。

权利要求
1.将甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯用作抗食品和/或饮料中革兰氏阴性细菌食品病原菌大肠杆菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌属和弯曲杆菌的抗菌剂的用途，其前提是，除了所述甘氨酸和/或甘氨酸衍生物之外，在所述食品和饮料中不使用含杂多糖的高分子，也不使用1，5-D-脱水果糖作为抗菌剂。
2.如权利要求1的将甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯用作食品和/或饮料中唯一的抗菌剂的用途。
3.如权利要求1或2中的甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯用于冷藏食品和/或冷冻饮料中的用途。
4.如权利要求1，2或3的甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯用作肉类食品的抗菌剂的用途。
5.如权利要求1，2或3的甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯用于鲜肉制品的抗菌剂的用途。
6.如权利要求1-4中任意一项的甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯用作抗沙门氏菌，优选抗鼠伤寒沙门氏菌和/或肠炎沙门氏菌的抗菌剂的用途。
7.如权利要求1-4中任意一项的甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯用作抗大肠杆菌，优选抗大肠杆菌O157:H7的抗菌剂的用途。
8.如权利要求1-7中任意一项的甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯与一种或多种有机酸和/或它们的一种或多种盐组合用作食品和/或饮料的抗菌剂的用途。
9.如权利要求8的甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯与乳酸和/或它的乳酸盐组合用作食品和/或饮料的抗菌剂的用途。
10.如权利要求1-9中任意一项的甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯用作抗菌剂的用途，其中甘氨酸和/或所述甘氨酸衍生物占所述食品或饮料重量的浓度为0.5-3wt％，优选0.5-1.5wt％。
11.如权利要求8或10的甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯用作抗菌剂的用途，其中一种或多种有机酸和/或它们的一种或多种盐占产品总重量浓度为0.5-3wt％。
12.如权利要求9的甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1-C8醇的酯用作抗菌剂的用途，其中乳酸和/或它的盐占产品总重量的浓度为0.5-3wt％。
全文摘要
本发明涉及将甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1－C8醇的酯用作抗食品和/或饮料中的革兰氏阴性细菌病原体大肠杆菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌属和弯曲杆菌的抗菌剂的用途，前提是，除了所述甘氨酸和/或甘氨酸衍生物之外，在所述食品和饮料中不使用含有杂多糖的高分子或1，5D－脱水果糖作为抗菌剂。优选将甘氨酸和/或碱(土)金属甘氨酸盐、甘氨酸铵和/或甘氨酸与C1－C8醇的酯用作食品和/或饮料中唯一的抗菌剂。
文档编号A23B4/20GK101035441SQ200580032348
公开日2007年9月12日 申请日期2005年8月29日 优先权日2004年8月27日
发明者E·E·W·博腾鲍尔, D·B·T·韦德特 申请人:普拉克生化公司