专利名称：肝炎重症化的监控药的制作方法
技术领域：
本发明涉及肝炎重症化的监控方法和该监控药。
背景技术：
已知原发性肝细胞癌(以下称为肝癌)，多数是B型和C型肝炎病毒感染患者在从慢性肝炎发展为肝硬化后发病。在病毒感染者中，特别是C型肝炎病毒感染患者向肝癌的转变率高，近年也有发病增加的趋势。作为肝癌的治疗方法，进行肝切除、经皮的局部疗法(射频消融疗法、乙醇注入疗法等)、肝动脉栓塞疗法(TAE)、持续动脉注射化学疗法、放射线疗法等，但大多不能达到完全治愈。因此，出于在肝癌转变阶段的慢性肝炎和肝硬化时除去病毒和增强免疫力的目的，近年开展通过各种抗病毒剂和各种干扰素的开发和临床应用、防止向肝癌转变的治疗。
现在，作为肝脏异常的检查，广泛使用AST(GOT)、ALT(GPT)和γ-GTP(γ-谷氨酰转酞酶)，此外，也使用TP(血清总蛋白)、A/G比(白蛋白/球蛋白比)、UA(尿酸)、T-Cho(总胆固醇)、TTT(麝香草酚浑浊试验)、ZTT(硫酸锌浑浊试验)、LDH(乳酸脱水酶)、ALP(碱性磷酸酶)、chE(胆碱酯酶)作为肝脏异常的指标。如此通过大量的检查，诊断肝脏异常，还通过病毒检查和活组织检查诊断向炎症、纤维化(filamentation)和癌化的发展程度。
病毒感染、肝炎、慢性肝炎、肝硬化、然后向肝癌的转变，现状是由各种标示的检查和活组织检查诊断向纤维化和癌化的转变。该措施对患者的负担大，不仅在医疗经济上存在问题，而且为了得到确实的医疗指导，也希望开发能够简便地预测肝癌发病的方法。
作为存在于细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfateproteoglycan)的新家族，报告了磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)家族的存在。迄今为止，作为磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成员，报告了6种磷脂酰肌醇蛋白聚糖(磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5和磷脂酰肌醇蛋白聚糖6)的存在。该家族的成员，具有均匀尺寸(约60kDa)的核蛋白质，共同具有特异地保持良好的半胱氨酸序列，由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定与细胞膜结合。
已知磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)与发生的细胞分裂及其图案的控制深切相关。已知GPC3在血液中分泌，由非专利文献1暗示在第358号氨基酸和第359号氨基酸之间受到裂解，如果在还原条件下进行SDS-PAGE，就会分成第1～358的断片(N端)和硫酸乙酰肝素链加成、巨大分子化的第359～580的断片(C端)。
另一方面，大量在肝癌细胞中发现GPC3基因，可知GPC3基因具有能够作为肝细胞癌标示而利用的可能性。并且，作为由测定GPC3诊断肝癌的方法，现在已知有专利文献1～3和非专利文献2。
在现有的GPC3测定药中，在使用识别GPC3的C端部位的抗体的专利文献1中，有肝癌的阳性率为53％、正常人和慢性肝炎在检出界限以下、肝硬化为5％的记载，在使用识别N端C端裂解附近部位的抗体的专利文献2中，有肝癌的阳性率为40％、正常人和慢性肝炎及肝硬化为0％的记载。另一方面，在使用识别N端部位的抗体的非专利文献2中，记载了肝癌TAE后的阳性率是73％、肝癌手术例是53％，因为与肝硬化有差别，所以可以有效地作为肝癌的诊断药。但是，GPC3在肝癌发病前如何变化则是完全未知的。
专利文献1WO 03/10042专利文献2WO 2004/018667专利文献3WO 2004/038420非专利文献1J.Cell.Biol.，163(3)625-35.2003非专利文献2CANCER RESEARCH 64，1-6，April 1，2004发明内容本发明的目的在于提供一种监控肝炎重症化的方法。
本发明人开发不识别C端部位和N端C端裂解附近部位、而是识别N端部位的新抗体，测定肝癌发病前阶段的肝炎和肝硬化患者血清中的GPC3浓度。测定该测定体系的肝脏疾病患者血清中的GPC3浓度，结果，截断值(cutoff value)为0.4的阳性率在正常人中是1.5％，但在慢性肝炎患者中显示36％、在肝硬化患者显示51.4％的高值。另一方面，肝癌患者是51％的阳性率。并且，对慢性肝炎患者和肝硬化患者的肝脏组织检查免疫染色，结果，在增殖肝细胞中显示阳性。由此发现，新的本GPC3测定体系不是肝癌的诊断药，而是从肝炎和肝硬化向肝癌转变的预测药，即，能够有效地作为肝炎重症化的监控药，本发明得以完成。
即，本发明提供一种含有抗GPC3抗体的肝炎重症化监控药。
另外，本发明是提供一种以使用抗GPC3抗体测定被检试样中的GPC3为特征的肝炎重症化的监控方法。
发明效果根据本发明，是一种监控用现有单一的肝脏异常检测药难以预测的肝炎重症化的简便方法，能够尽早拟定新的治疗计划。
图1是用于确认GPC3抗体识别部位的免疫印迹(western blotting)图。
图2是由识别C端部位和N端部位的抗体得到的标准曲线。
具体实施例方式
下面，详细说明本发明。
本发明是通过使用抗GPC3抗体测定被检试样中的GPC3而监控肝炎重症化的方法。
所谓测定，包括定量或非定量的测定，例如，作为非定量的测定，可以列举简单地测定GPC3是否存在、测定GPC3是否存在一定量以上、将GPC3的量与其它试样(例如对照试样等)比较的测定等；作为定量测定，可以列举GPC3浓度的测定、GPC3量的测定等。
所谓被检试样，只要是可能含有GPC3的试样，没有特别限制，但优选从哺乳类等生物体采集的试样，更优选从人采集的试样。作为被检试样的具体例子，例如，可以列举血液、组织间液、血浆、血管外液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、尿等，但优选为血液、血清、血浆。更优选从肝炎特别是从慢性肝炎或肝硬化患者采集的血液、血清、血浆。另外，从生物体采集的细胞培养液等从被检试样得到的试样也包括在本发明的被检试样中。
作为可以在本发明中使用的抗GPC3抗体，可以是单克隆抗体、多克隆抗体的任意1种。另外，作为抗GPC3抗体，从将血液、血清、血浆作为被检试样的观点出发，优选针对分泌型GPC3的抗体、即抗可溶性GPC3抗体。作为多克隆抗体，优选使用抗血清的多克隆抗体。更优选的是，特别优选使用识别N端部位的抗可溶性GPC3单克隆抗体。以下，对使用抗GPC3单克隆抗体的情况进行详细说明。
1.抗GPC3单克隆抗体的制作在本发明中使用的抗GPC3单克隆抗体，只要特异地与GPC3蛋白质结合即可，不管其来源和形状。具体而言，可以使用鸟类抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、人类抗体、嵌合(chimera)抗体、人源化抗体等公知的单克隆抗体。
另外，固定在支持体上的抗GPC3单克隆抗体和由标记物质标记的抗GPC3单克隆抗体，优选识别GPC3分子的不同抗原决定基。识别部位没有特别的限制，但优选识别N端的抗体。
在本发明中使用的抗GPC3单克隆抗体，可以使用公知的方法制造。作为在本发明中使用的抗GPC3单克隆抗体，优选来自哺乳动物和鸟类的单克隆抗体。来自哺乳动物和鸟类的单克隆抗体，包括在杂交瘤中产生的单克隆抗体，和通过基因工程方法以包含抗体基因的表达载体进行转化的宿主中产生的单克隆抗体。
产生单克隆抗体的杂交瘤，基本上使用公知技术，可以如下制作。即，使用GPC3或可溶性GPC3及其肽片段(segment peptide)作为免疫原，按照通常的免疫方法将其进行免疫，由通常的细胞融合法使得到的免疫细胞与公知的亲代细胞融合，由通常的筛选法，通过对单克隆的抗体产生细胞进行筛选而制作。
具体而言，可以如下制作单克隆抗体。
首先，作为抗体取得的免疫原使用的GPC3，可以通过培养HuH6、HepG2细胞株等，精制在其上清中所含的天然GPC3而得到。还可以通过发现在Lage，H.et al.，Gene 188(1997)，151-156中公开的GPC3(MXR7)基因/氨基酸序列而得到。即，将编码GPC3的基因序列插入公知的表达载体体系中，使适当的宿主细胞发生转化，然后采用公知的方法从该宿主细胞中或培养上清中精制目的重组GPC3蛋白质。
然后，将该精制GPC3用作免疫原，但也可以使用GPC3的部分肽作为免疫原。此时，该部分肽可以由人GPC3的氨基酸序列通过化学合成而得到，也可以在表达载体中组合GPC基因的一部分而得到，还可以由蛋白质分解酶分解天然的GPC3而得到。用作部分肽的GPC3的部分和大小没有限制。在本发明中，作为免疫原，优选使用天然的GPC3。
作为以免疫原免疫的哺乳动物和鸟类，没有特别的限定，优选考虑与在细胞融合中使用的亲代细胞的适合性来选择，一般使用啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或兔、猴、鸡等。
按照公知的方法，对动物进行免疫原的免疫。例如，作为一般的方法，通过在动物的腹腔内或皮下注射免疫原进行。具体而言，用PBS(Phosphate-Buffered Saline磷酸盐缓冲液)和生理食盐水等将免疫原稀释、悬浊为适当量，根据希望向其中适量混合通常的辅助剂，例如弗氏完全辅助剂(Freund’s complete adjuvant)，乳化后，对动物每4～21日给药数次。另外，在免疫原免疫时，可以使用适当的载体。特别是使用分子量小的部分肽作为免疫原时，希望使之与白蛋白、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)等载体蛋白质结合，进行免疫。
这样，对动物进行免疫，确认血清中上升到所希望的抗体水平，然后从动物采取免疫细胞，用于细胞融合，作为优选的免疫细胞，可以特别列举脾细胞。
作为与上述免疫细胞融合的其它亲代细胞，使用动物的骨髓瘤细胞。该骨髓瘤细胞，优选使用公知的各种细胞株，例如，P3(P3×63Ag8.653)(J.Immnol.(1979)123，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(CurrentTopics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.and Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.et al.，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.etal.，Nature(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.et al.，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277，131-133)等。
上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合，基本可以采用公知的方法，例如Kohler和Milstein等的方法(Kohler.G.and Milstein，C.，MethodsEnzymol.(1981)73，3-46)等进行。
进一步具体而言，上述细胞融合，例如在细胞融合促进剂的存在下在通常的营养培养液中实施。作为融合促进剂，例如使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，还可以根据希望，为了提高融合效率，添加二甲基亚砜等辅助剂。
免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，优选使免疫细胞为骨髓瘤细胞1～10倍。作为在上述细胞融合中使用的培养液，例如可以使用适合于上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、还有用于该种细胞培养的通常的培养液，还可以并用胎牛血清(FCS)等的血清补液。
细胞融合，在上述培养液中充分混合规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞，通常以30～60％(w/v)的浓度添加预先升温至37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量1000～6000左右)，混合而形成目的融合细胞(杂交瘤)。接着，逐渐添加适当的培养液，通过反复进行离心、除去上清的操作，除去在杂交瘤的生育中不理想的细胞融合剂等。
这样操作得到的杂交瘤，通过在通常的选择培养液，例如HAT培养液(包含次黄嘌呤、喋氨呤和胸苷的培养液)中培养而进行选择。上述HAT培养液中的培养，为了杀死目的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)，持续充分的时间(通常是数日～数周时间)。接着，实施通常的有限稀释法，进行产生目的抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
目的抗体的筛选和单克隆，可以采用基于公知的抗原抗体反应的筛选方法进行。例如，使抗原与聚苯乙烯等制成的中空珠和市售的96孔微量滴定板等载体结合，使之与杂交瘤的培养上清反应，洗净载体，然后使酶标记第2次抗体等反应，可以决定在培养上清中是否含有以与免疫原反应为目的的抗体。通过有限稀释法等，能够克隆产生目的抗体的杂交瘤。此时，作为抗原，可以使用在免疫中使用的抗原。
另外，除了在人以外的动物中使抗原免疫得到上述杂交瘤以外，使人淋巴球在生物体外(in vitro)与GPC3致敏(sensitizing)，使致敏淋巴球与来自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞融合，也可以得到具有与GPC3的结合活性的所希望的人抗体(参照日本特公平1-59878号公报)。此外，也可以向具有人抗体基因的全部库的转基因动物中给予作为抗原的GPC3，取得抗GPC3单克隆抗体产生细胞，从使其永生化的细胞取得针对GPC3的人抗体(参照WO94/25585、WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602)。
产生如此制作的单克隆抗体的杂交瘤，可以在通常的培养液中继代培养，并且可以在液氮中长期保存。
为了从该杂交瘤取得单克隆抗体中，采用按照通常的方法培养该杂交瘤，作为其培养上清得到的方法；或者将杂交瘤给予与其具有适合性的哺乳动物，使其增殖，作为其腹水而得到的方法等。前者方法适合于得到高纯度的抗体，而后者方法适合于抗体的大量生产。
在本发明中，作为单克隆抗体，可以使用从杂交瘤筛选抗体基因，组合入适当的载体，将其导入宿主，采用基因重组技术使之产生的重组型抗体(例如，参照Vandamme，A.M.et al.，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775，1990)。具体而言，从产生抗GPC3单克隆抗体的杂交瘤，离析编码抗GPC3单克隆抗体的可变(V)区的mRNA。mRNA的离析，使用公知的方法，例如通过胍超离心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.et al.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等进行，调制全RNA，使用mRNA PurificationKit(Pharmacia生产)等，调制目的mRNA。另外，通过使用QuickPrepmRNA Purification Kit(Pharmacia生产)，也可以直接调制mRNA。
使用逆转录酶从得到的mRNA合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成，使用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(Biochemical Industry Inc.生产)等进行。另外，为了进行cDNA的合成和扩增，可以采用使用5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech生产)和PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002，Belyavsky，A.et al.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)等。
从得到的PCR产物精制目的DNA片断，与载体DNA连接。再由此制作重组载体，导入大肠菌等中，选择群体(colony)，调制希望的重组载体。然后，采用公知的方法，例如双脱氧核苷酸链终止法等确认目的DNA的碱基序列。
得到编码目的抗GPC3单克隆抗体的V区的DNA后，将其与含有编码所希望的抗体正常区(C区)的DNA的表达载体组合。
为了制造在本发明中使用的抗GPC3单克隆抗体，在表达控制区，例如在增强剂、促进剂的控制下进行表达的表达载体中组合抗体基因。接着，通过该表达载体，使宿主细胞发生转化，使抗体进行表达。
抗体基因的表达，可以分别将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA组合入表达载体，使宿主细胞同时发生转化，或者也可以将编码H链和L链的DNA组合入单一表达载体中，使宿主细胞发生转化(参照WO94/11523)。
另外，为了产生重组型抗体，不仅可以使用上述宿主细胞，还可以使用转基因动物。例如，在编码乳汁中固有地产生的蛋白质(山羊β酪蛋白等)的基因的中途，插入抗体基因，作为融合基因进行调制。向山羊的胚胎中注入含有插入抗体基因的融合基因的DNA片段，将该胚胎导入雌山羊。从接受胚胎的山羊产生的转基因山羊或其子孙产生的乳汁中得到所希望的抗体。另外，为了使含有从转基因山羊产生的所希望抗体的乳汁量增加，也可以在转基因山羊中使用适当的激素(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
在本发明中，除了上述抗体以外，可以使用人为改变的基因重组型抗体，例如嵌合抗体、人源化(Humanized)抗体。这些改变抗体，可以使用已知的方法制造。
嵌合抗体，可以通过使如上述操作得到的编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将其组合入表达载体，导入宿主产生而得到。使用该已知的方法，能够得到本发明中有用的嵌合抗体。
人源化抗体也称为重构(reshaped)人抗体，是向人抗体互补性决定区移植人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR，complementarity determining region)的抗体，也已知其一般的基因重组方法(参照EP 125023、WO96/02576)。
具体而言，以连接小鼠抗体的CDR和人抗体的构架区(frameworkregion，FR)的方式设计的DNA序列，使用以在CDR和FR两个的末端区具有重叠部分的方式制作的几个低聚核苷酸作为引物，采用PCR法而合成(参照WO98/13388中记载的方法)。
通过CDR连接的人抗体的构架区，选择互补性决定区形成良好的抗原结合部位的区。根据需要，可以置换抗体可变区中的构架区的氨基酸，使得重构人抗体的互补性决定区形成适当的抗原结合部位(Sato，K.et al.，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
在嵌合抗体和人源化抗体的C区中，使用人抗体的区，例如，在H链中，可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4，在L链中，可以使用Cκ、Cλ。另外，为了改善抗体或其产生的稳定性，也可以修饰人抗体C区。
嵌合抗体由来自人以外的哺乳动物抗体的可变区和来自人抗体的确定区组成。另一方面，人源化抗体由来自人以外的哺乳动物抗体的互补性决定区和来自人抗体的构架区及C区组成。
在本发明中使用的抗体，不限于抗体的全部分子，只要与GPC3结合，可以是抗体的片段或其修饰物，包括二价抗体也包含一价抗体。例如，作为抗体的片段，可以列举Fab、F(ab′)2、Fv、具有1个Fab和完全Fc的Fab/c、或用适当的连接物(inker)使H链或L链的Fv连接的单链Fv(scFv)。具体而言，用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶处理抗体，生成抗体片段，或者构筑编码这些抗体片段的基因，将其导入表达载体，然后以适当的宿主细胞表达(例如，参照Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976、Better，M.&Horwitz，A.H.Methods inEnzymology(1989)178，476-496，Academic Press，Inc.、Plueckthun，A.&Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496，AcademicPress，Inc.、Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663、Rousseaux，J.et al.，Methods in Enzymology(1989)121，663-669、Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。
ScFv通过连接抗体的H链V区和L链V区而得到。在该scFv中，H链V区和L链V区通过连接物优选通过肽连接物连接(Huston，J.S.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。scFv的H链V区和L链V区，可以来自本说明书中的任意抗体。作为连接V区的肽连接物，例如可以使用由氨基酸12～19残基组成的任意单链肽。
编码scFv的DNA通过下述方法得到在编码上述抗体的H链或H链V区的DNA、和编码L链或L链V区的DNA中，构成编码这些序列全部或所希望的氨基酸序列编码的DNA部分，使用规定其两端的引物，采用PCR法进行扩增，接着组合以编码肽连接物部分的DNA、和其两端分别与H链、L链连接的方式规定的引物对，进行增幅。
另外，一旦制作编码scFv的DNA，就能够采用通常方法得到含有这些的表达载体和由该表达载体发生转化的宿主，另外，通过使用该宿主，能够采用通常方法得到scFv。
这些抗体的片段，可以和上述同样操作，取得其基因使其表达，由宿主产生。本发明中的“抗体”也包括这些抗体的片段。
作为抗体的修饰物，也可以使用与标记物质等各种分子结合的抗GPC3抗体。本发明中的“抗体”中也包括这些抗体修饰物。这样的抗体修饰物，可以由对得到的抗体实施化学修饰而得到。另外，抗体的修饰方法在该领域中已经确立。
此外，本发明中使用的抗体还可以是双特异性抗体(bispecificantibody)。双特异性抗体可以是具有识别GPC3分子上的不同抗原决定基的抗原结合部位的双特异性抗体，也可以一个抗原结合部位识别GPC3、另一个抗原结合部位识别标记物质等。双特异性抗体，可以使2种抗体的HL对结合而制作，也可以使产生不同单克隆抗体的杂交瘤融合制作双特异性抗体产生融合细胞而得到。还可以采用基因工程的方法制作双特异性抗体。
如上构筑的抗体基因，可以由公知的方法表达而取得。在为哺乳类细胞的情况下，可以使常用的有用促进剂、进行表达的抗体基因、在其3’侧下游使聚A信号功能性结合而表达。例如，作为促进剂/强化剂，可以列举人巨细胞病毒前期促进剂/强化剂(humancytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。
另外，作为其它在本发明中使用的抗体表达中能够使用的促进剂/强化剂，可以列举逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV40)等病毒促进剂/强化剂、或人延长因子1a(HEF1a，human elongationfactor 1a)等来自哺乳类细胞的促进剂/强化剂等。
在使用SV40促进剂/强化剂的情况下采用Mulligan等的方法(Nature(1979)277，108)，或在使用HEF1a促进剂/强化剂的情况下采用Mizushima等的方法(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)，能够容易地表达基因。
在为大肠菌的情况下，使常用的有用促进剂、用于抗体分泌的信号序列和发达的抗体基因功能地结合，能够表达该基因。作为促进剂，例如可以列举lacz促进剂、araB促进剂。在使用lacz促进剂的情况下，可以采用Ward等的方法(Nature(1098)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)进行表达，或者在使用araB促进剂的情况下，可以采用Better等的方法(Science(1988)240，1041-1043)进行表达。
作为用于抗体分泌的信号序列，在产生于大肠菌的周质的情况下，可以使用pelB信号序列(Lei，S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169，4379)。接着，分离产生于周质的抗体，然后适当重新组成(refold)抗体的结构使用。
作为复制起点，可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的物质，并且，为了宿主细胞系中基因复制数的增幅，表达载体可以包含氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸腺嘧啶激酶(TK)基因、大肠菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标记。
为了制造在本发明中使用的抗体，可以使用任意的表达体系，例如真核细胞或原核细胞体系。作为真核细胞，例如可以列举已确定的哺乳类细胞体系、昆虫细胞体系、真丝状菌细胞和酵母细胞等动物细胞等；作为原核细胞，例如可以列举大肠菌细胞等细菌细胞。
在本发明中使用的抗体，优选在哺乳类细胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK、Vero、HeLa细胞中表达。
然后，在生物体外或活的有机体内(in vivo)培养经过转化后的宿主细胞，产生目的抗体。宿主细胞的培养按照公知的方法进行。例如，作为培养液，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以并用胎牛血清(FCS)等的血清补液。
如上所述表达、产生的抗体，可以从细胞、宿主动物分离，精制到均匀。在本发明中使用的抗体的分离、精制，可以使用亲和色谱柱进行。例如，作为使用蛋白质A柱的柱，可以列举HyperD、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia生产)等。此外，可以使用在通常的蛋白质中使用的分离、精制方法，没有任何限制。例如，通过适当选择、组合上述亲和色谱柱以外的色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析等，能够分离、精制抗体(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow，DavidLane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。
在本发明中使用的抗体的抗原决定基，只要能够识别全长GPC3或其肽片段即可，但优选为希望识别GPC3的N端部位的抗体。
2.GPC3的测定在本发明中测定的GPC3，可以是附加有硫酸乙酰肝素等的GPC3蛋白质，也可以是GPC3核蛋白质。
被检试样中所含GPC3的测定，通过使用抗GPC3抗体的免疫学方法测定。作为免疫学的方法，例如可以列举放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析、发光免疫分析、免疫沉降法、免疫比浊法、免疫印迹法、免疫染色法、免疫扩散法等，优选酶免疫分析，特别优选酶结合免疫吸附定量法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)(例如sandwich ELISA)。ELISA等上述免疫学方法可以采用从业人员公知的方法进行。
作为使用抗GPC3抗体的一般的测定方法，例如可以列举将抗GPC3抗体固定在支持体上，向其中加入被检试样，进行孵育，使抗GPC3抗体与GPC3蛋白质结合，然后洗净，测定通过抗GPC3抗体与支持体结合的GPC3蛋白质，进行被检试样中的GPC3蛋白质的测定的方法。
作为在本发明中使用的支持体，例如可以列举琼脂糖、纤维素等的不溶性多糖类，硅树脂、聚苯乙烯树脂、聚丙烯酰胺树脂、尼龙树脂、聚碳酸酯树脂等合成树脂，和玻璃等的不溶性支持体。这些支持体能够以中空珠和板等形状使用。为中空珠的情况下，可以使用填充有这些的柱等。为板的情况下，可以使用多孔板(96孔多孔板等)或生物传感器芯片等。抗GPC3抗体与支持体的结合，可以采用化学结合或物理吸附等通常使用的方法结合。这些支持体可以均使用市售的支持体。
抗GPC3抗体与GPC3蛋白质的结合，通常在缓冲液中进行。作为缓冲液，例如可以使用磷酸缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等。另外，作为孵育的条件，在经常使用的条件下进行，例如4℃～室温下进行1小时～24小时的孵育。孵育后的洗净，只要不妨碍GPC3蛋白质与抗GPC3抗体的结合，任意即可，例如，使用含有Tween20等表面活性剂的缓冲液等。
在本发明的GPC3蛋白质测定方法中，除了欲测定GPC3蛋白质的被检试样以外，还可以设置对照试样。作为对照试样，有不含GPC3蛋白质的阴性对照试样和含有GPC3蛋白质的阳性对照试样等。此时，比较由不含GPC3蛋白质的阴性对照试样得到的结果和由含有GPC3蛋白质的阳性对照试样得到的结果，能够测定被检试样中的GPC3蛋白质。另外，调制使浓度阶段地变化的一系列对照试样，得到作为数值的相对各对照试样的测定结果，制成标准曲线，从被检试样的数值根据标准曲线也能够定量地测定被检试样中所含的GPC3蛋白质。
作为通过抗GPC3抗体与支持体结合的GPC3蛋白质测定的优选方式，可以列举使用由标记物质标记的抗GPC3抗体的方法。
例如，使被检试样于固定在支持体上的抗GPC3抗体接触，洗净后，使用特异地识别GPC3蛋白质的标记抗体进行测定。
抗GPC3抗体的标记可以采用通常已知的方法进行。作为标记物质，可以使用荧光色素、酶、辅酶、化学发光物质、放射性物质等从业人员公知的标记物质。作为具体的例子，可以列举放射性同位素(32P、14C、125I、3H、131I等)、荧光素、罗丹明、丹磺酰氯、伞形酮、荧光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶(β-gulcosidase)、山葵过氧化物酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖质氧化酶、微过氧化物酶、生物素(biotin)等。在使用生物素作为标记物质的情况下，优选在添加生物素标记抗体后，再添加与碱性磷酸酶等酶结合的抗生物素蛋白(avidin)。标记物质与抗GPC3抗体的结合，可以使用戊二醛法、马来酸酐缩亚胺法(malleimide method)、吡啶基二硫化物法、过碘酸法等公知的方法。
具体而言，在板等支持体上添加含有抗GPC3抗体的溶液，将抗GPC3抗体固定在支持体上。将板洗净后，为了防止蛋白质的非特异结合，例如，以BSA、明胶、白蛋白等进行封闭。再次洗净，向板上添加被检试样。孵育后，进行洗净，加入标记抗GPC3抗体。在适当的孵育后，将板洗净，测定在板上残留的标记抗GPC3抗体。测定可以采用从业人员公知的方法进行，例如，在由放射性物质标记的情况下，采用液体闪烁或RIA法进行测定。在由酶标记的情况下，加入基质(substrate)，由吸光光度计测定基质的酶的变化，例如发色。作为基质的具体例子，可以列举2，2-联氮二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1，2-苯二胺(邻苯二胺)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TME)等。
在荧光物质的情况下，可以使用荧光光度计进行测定。
作为本发明的GPC3蛋白质测定方法特别优选的方式，可以列举使用由生物素标记的抗GPC3抗体和抗生物素蛋白的方法。
具体而言，在板等支持体上添加含有抗GPC3抗体的溶液，固定抗GPC3抗体。将板洗净后，为了防止蛋白质的非特异结合，例如由BSA等进行封闭。再次洗净，在板上添加被检试样。孵育后，进行洗净，添加生物素标记抗GPC3抗体。适度的孵育后，将板洗净，添加与碱性磷酸酶、过氧化物酶等酶结合的抗生物素蛋白。孵育后，将板洗净，添加对应于与抗生物素蛋白结合的酶对应的基质，将基质的酶的变化等作为指标，测定GPC3蛋白质。
作为本发明的GPC3蛋白质测定方法的其它方式，可以列举使用一种以上特异地识别GPC3蛋白质的一次抗体和一种以上特异地识别该一次抗体的二次抗体的方法。
例如，使被检试样与固定在支持体上的一种以上的抗GPC3抗体接触，孵育后，进行洗净，由一次抗GPC3抗体和特异地识别该一次抗体的一种以上的二次抗体测定洗净后结合的GPC3蛋白质。此时，优选二次抗体由标记物质进行标记。
作为本发明的GPC3蛋白质测定方法的其它方式，可以列举利用凝集反应的测定方法。在该方法中，可以使用将抗GPC3抗体敏化后的载体，测定GPC3。作为敏化抗体的载体，只要是不溶性、不引起非特异反应、并且稳定，可以使用任意的载体。例如，可以使用乳胶颗粒、膨润土、火棉胶、高岭土、固定羊红血球等，优选使用乳胶颗粒。作为乳胶颗粒，例如可以使用聚苯乙烯乳胶颗粒、苯乙烯-丁二烯共聚物乳胶颗粒、聚乙烯基甲苯乳胶颗粒等，优选使用聚苯乙烯乳胶颗粒。将敏化后的颗粒与试样混合，搅拌一定时间。在试样中抗GPC3抗体的含有浓度越高，颗粒的凝集度越大，所以用肉眼观察凝集，就能够测定GPC3。另外，用分光光度计等测定由凝集产生的浊度，也能够测定GPC3。
作为本发明的GPC3蛋白质测定方法的其它方式，例如可以列举使用利用表面等离子共振(plasmon resonance)现象的生物传感器的方法。利用表面等离子共振现象的生物传感器，使用微量蛋白质、并且不标记蛋白质-蛋白质之间的相互作用，能够实时观察表面等离子共振信号。例如，通过使用BIAcore(Pharmacia生产)等的生物传感器，能够测定GPC3蛋白质与抗GPC3抗体的结合。具体而言，使被检试样与使抗GPC3抗体固定化后的传感器芯片接触，能够将与抗GPC3抗体结合的GPC3蛋白质作为共鸣信号的变化进行测定。
本发明的测定方法，可以使用各种自动检查装置而自动化，还能够一次对大量试样进行检查。
本发明的目的在于提供一种肝炎重症化的监控药，例如从肝炎和肝硬化向肝癌转变的预测判断药，该监控药至少含有抗GPC3抗体。在该监控药基于ELISA法时，可以含有使抗体固相化的载体，也可以预先使抗体结合在载体中。在该监控药基于使用乳胶等载体的凝集法时，可以含有吸附有抗体的载体。另外，该监控药也可以适当制成含有封闭溶液、反应溶液、反应停止液、用于处理试样的试剂等的试剂盒。
为了预测从肝炎和肝硬化向肝癌的转变，可以测定这些患者血清中的GPC浓度。血清中GPC3浓度越高，向肝癌转变的几率越高。例如，可以预测，在慢性肝炎和肝硬化患者血清中GPC3浓度是0.4ng/mL以上的情况下，向肝癌转变的可能性高；在小于0.4ng/mL的情况下，向肝癌发转变展的可能性低。
实施例下面，利用实施例具体地说明本发明。但本发明不限于这些实施例。
在本申请说明书所述的实施例中，使用以下材料。
作为天然的GPC3的产生细胞，从理研细胞库(Riken Cell Bank)购入来自肝母细胞瘤细胞株HuH-6，以10％FBS/Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，DMEM)(SIGMA CAT#D6429)/青霉素、链霉素(penicillin·streptomycin)(GIBCO BRL CAT#15140-122)进行培养。
杂交瘤以10％FBS/RPMI1640/(SIGMA CAT#R-8578)/庆大霉素(gentacin)(Scheling-plough)进行培养。
实施例1天然型GPC3的取得使用直径150mm的皿，进行HuH6细胞的大量培养，回收培养上清进行精制。在DEAE Sepharose Fast Flow(Amersham CAT#17-0709-01)中填充培养上清，洗净后，用含有500mM NaCl的缓冲液洗提。接着，用Centriprep-10(Millipore CAT#4304)浓缩后，通过Superdex 200HR 10/30(Amersham CAT#17-1088-01)的凝胶过滤进行精制，得到粗精制GPC3。
为了取得高纯度的GPC3，使用将粗精制GPC3作为抗原制作的单克隆抗体，制成亲和色谱柱，向其中填充HuH-6粗精制GPC3，然后用pH3.5、0.1M的甘氨酸盐酸洗净后，在4M的MgCl2·6H2O中洗提，然后，对50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl进行透析。
实施例2重组GPC3的取得使用含有完全长的人GPC3 cDNA的质粒DNA，构筑附加flag可溶型GPC3，即构筑表达重组GPC3cDNA的质粒DNA。使用以除去C末端侧的疏水区(564-580氨基酸)的方式设计的下游引物(5’-ATAGAA TTC CAC CAT GGC CGG GAC CGT GCG C-3’(序列编号1))和加入EcoRI识别序列、Kozak序列的上游引物(5’-ATA GGA TCC CTTCAG CGG GGA ATG AAC GTT C-3’(序列编号2))，进行PCR。在pCXND2-Flag中克隆得到的PCR片段(1711bp)。将制作的表达质粒DNA导入CHO细胞DXB11株，通过以500μg/mL Geneticin的选拔，得到可溶型GPC3高表达CHO株。
使用1700cm2的转瓶，进行附加flag可溶型GPC3高表现CHO株的大量培养，回收培养上清，进行精制。在DEAE Sepharose Fast Flow(Amersham CAT#17-0709-01)中填充培养上清，洗净后，由含有500mM NaCl的缓冲液洗提。接着，使用Anti-Flag M2 agarose affinity gel(SIGMA CAT#A-2220)进行亲和精制。由200μg/mL的FLAG肽进行洗提。以Centriprep-10(Millipore CAT#4304)浓缩后，进行Superdex200HR10/30(Amersham CAT#17-1088-01)的凝胶过滤，除去FLAG肽。最后，使用DEAE Sepharose Fast Flow柱进行浓缩，同时通过用不含Tween20的PBS(含有500mM NaCl)进行洗提，进行缓冲液置换。
实施例3抗GPC3单克隆抗体的制作对5只Balb/C小鼠(CRL)进行重组GPC3或天然型GPC3的免疫。在重组GPC3的情况下，在初次免疫时，调制使得免疫蛋白质为100μg/只；在天然型GPC3的情况下，调制使得为10μg/只。使用FCA(弗氏完全辅助药(H37Ra)、Difco(3113-60)、Becton Dickison(cat#231131))，将乳化后的药剂皮下给药。作为追加免疫，在2周后，在重组GPC3的情况下，调制使得为50μg/只；在天然型GPC3的情况下，调制使得为5μg/只。用FIA(弗氏不完全辅助药、Difco(0639-60)、Becton Dickison(cat#263910))将如上调制的药剂乳化，然后将乳化后的药剂皮下给药。以后，以1周时间间隔合计进行5次追加免疫。对最终免疫，向尾静脉给药与追加免疫相同的量。通过使用涂布有GPC3核蛋白质的免疫板(immunoplate)的ELISA，确认血清中的抗体效价相对于GPC3饱和，然后混合小鼠骨髓瘤细胞P3U1和小鼠脾脏细胞，由PEG1500(Roche Diagnostics，cat#783 641)进行细胞融合。在96孔培养板上播种，从翌日起，用ELISA筛选在HAT培养基中选择后的培养上清。对于阳性克隆，由有限稀释法单克隆化后，回收扩大培养的培养上清。由ELISA的筛选，以与GPC3核蛋白质的结合活性为指标进行，得到具有强烈结合能力的抗GPC3单克隆抗体。
抗体的精制使用Hi Trap ProteinG HP(Amersham CAT#17-0404-01)进行。在直接柱中填充杂交瘤培养上清，用结合缓冲液(20mM磷酸钠(pH7.0))洗净后，用洗提缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7))进行洗提。洗提在加入有中和缓冲液(1M Tris-HCl(pH9.0))的管中进行，立即进行中和。集中抗体断片，然后用0.05％Tween20/PBS透析一昼夜，置换缓冲液。添加NaN3，使得精制后的抗体为0.02％，然后在4℃下保存。
实施例4抗GPC3单克隆抗体的同型特异体(Isotyping)定量抗体浓度，进行使用山羊抗小鼠IgG(gamma)(ZYMEDCAT#62-6600)和碱性磷酸酶山羊抗小鼠IgG(gamma)(ZYMEDCAT#62-6622)的小鼠IgG夹心ELISA，以市售的精制小鼠IgG1抗体(ZYMED CAT#02-6100)作为标准。
抗可溶性GPC3单克隆抗体的同型特异体，使用ImmunoPureMonoclonal Antibody Isotyping Kit II(PIERCE CAT#37502)，方法按照附上的指南。同型特异体的结果，全部为IgG1型。
实施例5抗GPC3单克隆抗体的识别部位的确认免疫印迹大致为，以DMEM+10％FBS培养肝癌细胞株HuH-6 5天，应用5μl/lane的该培养上清，在还原和非还原条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。接着，向Hybond P膜(Amersham BioscienceCorporation生产)转移蛋白质，封闭转移膜后，使各抗体反应。接着，使HRP标记抗小鼠抗体反应，对于添加ECL检测试剂(AmershamBioscience Corporation生产)后得到的化学发光，使X射线薄膜感光而进行检测。由图1所示的免疫印记结果，可以判断PPMX018是识别N末端的抗体，PPMX001是识别C末端的抗体。另外，以同样方法进行研究，结果，作为识别N端部位的抗体，可以列举PPMX013、M18D04(FERM BP-10325)。
这里，产生M18D04的杂交瘤，保藏在日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)，独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。
实施例6抗GPC3多克隆抗体的制作使用重组GPC3或天然型GPC3，进行豚鼠多克隆抗体的制作。在制作中使用公知的方法。皮下给予使用助剂将GPC3乳化后的药剂，进行免疫。将此反复几次，确认抗体效价上升后，进行采血，得到血清，然后由硫酸铵沉淀得到多克隆抗体。
实施例7夹心ELISA体系抗体的构筑为了测定血中的可溶性GPC3，多数构筑GPC3的夹心ELISA体系，选择灵敏度和特异性优异的测定体系。另外，为了在发色中达到高测定灵敏度，使用Scytek公司的TMB。
在96孔免疫板上涂布用PBS(-)稀释为10μg/mL的抗GPC3单克隆抗体或多克隆抗体的稀释物，在4℃下孵育一晚。次日，用300μL/孔的PBS洗净3次后，加入150μL的ABI公司生产的免疫测定稳定剂(ABI#10-601-001)，进行封闭。在室温下放置数小时后或在4℃下保存一晚后，加入用含有动物血清等的稀释缓冲液(50mM Tris-Cl pH8.0，0.15M NaCl)将精制蛋白质、人血清等适当稀释的稀释物，在室温孵育2小时。接着，加入用含有动物血清等的PBS(-)稀释为20μg/mL的生物素标记的识别C端部位或N端部位的抗体，在室温下孵育2小时。弃去反应液，然后，加入用含有适当量动物血清的Cygnus公司生产的Stab-ELISA-r(Cygnus#I-030)将Vector公司生产的链霉亲和素(streptavidin)-HRPO(Vector#SA-5004)稀释为3μg/mL的稀释物，在室温下孵育0.5小时。用300μL/孔的洗净缓冲液洗净5次后，按照Scytek公司附加的协议，使用TMB(Cat#TM4999)使之发色，用微量阅板器(microplate reader)测定吸光度。
抗体的生物素化使用Pierce公司生产的Sulfo-NHS-LC-Biotin(CAT#21335)。另外，样品中的GPC3浓度的换算使用表计算软件GlaphPadPRISM(GlaphPad software Inc.ver.3.0)进行解析。图2是由识别C端部位的抗体PPMX001和PPMX013以及识别N端部位的PPMX018和PPMX013制作的使用ELISA测定体系的使用重组GPC3的标准曲线。在识别C端部位的测定体系，能够得到高于识别N端部位测定体系的吸光度。另外，可以预测在前者测定体系中识别全长GPC3和C端肽，在后者测定系中识别全长GPC3和N端肽。
实施例8使用识别C端部位和N端部位的抗体的测定体系的HuH6培养液和肝硬化患者血清中GPC3的测定使用用于制作上述标准曲线的2个ELISA测定体系，测定由HuH-6的培养上清精制的GPC3和20例肝癌患者血清中的GPC3浓度。结果得到从标准曲线的结果不能预测的结果(表1)。即，在使用GPC3的识别部位不同的测定体系的情况下，在重组GPC3、来自HuH6天然型GPC3和患者血清GPC3中，测定值有很大差异。在识别C端部位的测定体系中，作为重组GPC3和患者血清GPC3之间产生很大差异的原因，推测为由于在GPC3的C端部位中附加的硫酸乙酰肝素含量的差异。
表1使用N端和C端抗体的ELISA体系的来自HuH-6和肝癌患者血清中的GPC3的测定结果
实施例9使用识别N端部位的测定体系的正常人、慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者的血清中GPC3浓度的测定在识别N端部位的各种ELISA测定体系中，在使用灵敏度优异的M18D04(FERM BP-10325)单克隆抗体和豚鼠多克隆抗体的测定体系中测定正常人、慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者血清中的GPC3浓度。结果，截断值为0.4在正常人中血清中GPC3的阳性率是1.5％，慢性肝炎是36％，肝硬化是51.4％，肝癌患者是51％。接着，在因肝癌住院的3例肝癌患者中，测定在肝癌发作以前的8年定期地取样的血清中GPC浓度，可见随着肝疾病的发展，有GPC3在血中浓度上升的趋势。由上显示，本测定体系用于肝炎的重症化的监控比作为肝癌的诊断药更为有效。
表2使用N端抗体的ELISA体系的肝癌、肝硬化、慢性肝炎患者和正常人血清中的GPC3的测定结果
实施例10正常人、慢性肝炎、肝硬化的组织的免疫染色使用由活组织检查从慢性肝炎和肝硬化患者得到的病理组织标本，进行抗GPC3单克隆抗体的免疫染色。
各检体，将固定石蜡包埋标本切成为4μm的薄片，将该切片在贴附玻璃载片上，在37℃下放置16小时，使之充分干燥。在100％二甲苯中以5分钟浸渍3次，进行脱蜡，在100％乙醇(alcohol)浸渍3次，每次5分钟，用70％乙醇(ethanol)浸渍5分钟，进行亲水化。然后，用50mM TBS洗净5分钟、3次，然后在柠檬酸缓冲液(10mM，pH6.0)中进行120℃、10分钟的抗原活化。在抗原活化后，用TBS以5分钟洗净3次，然后与稀释为1μg/mL的抗GPC3抗体在室温下反应1小时。为了使内源性过氧化物酶失活，用0.3％过氧化氢在室温下作用15分钟。再用TBS洗净3次后，使二次抗体ENVISION+试剂盒(Kit)/HRP(DAKO)作用1小时。用TBS以5分钟洗净3次，然后发色基质使用DAB(3，3′-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐)。另外，核的对比染色使用苏木精。
慢性肝炎和肝硬化的免疫组织化学的结果，在任意疾病中GPC3都是阳性，在细胞膜中确认其染色像。另一方面，在正常肝脏组织中，未确认GPC3的染色。
因此，判断GPC3浓度测定对于肝炎重症化的监控是非常有用的。
序列表序列表<110>株式会社英仙蛋白质科学<120>肝炎重症化的监控药<130>PER0006<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>31<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>Designed DNA based on GPC3 gene<400>1atagaattcc accatggccg ggaccgtgcg c 31<210>2<211>31<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>Designed DNA based on GPC3 gene<400>2ataggatccc ttcagcgggg aatgaacgtt c 3权利要求
1.一种肝炎重症化的监控药，其特征在于含有抗GPC3抗体。
2.如权利要求1所述的监控药，其特征在于抗GPC3抗体是识别GPC3的N端部位的抗体。
3.如权利要求1或2所述的监控药，其特征在于能够预测从肝炎或肝硬化向肝癌的转变。
4.如权利要求1～3中任一项所述的监控药，其特征在于使用固定在支持体上的抗GPC3抗体和由标记物质标记的抗GPC3抗体。
5.一种肝炎重症化的监控方法，其特征在于使用抗GPC3抗体测定被检试样中的GPC3。
6.如权利要求5所述的监控方法，其特征在于抗GPC3抗体是识别GPC3的N端部位的抗体。
7.如权利要求5或6所述的监控方法，其特征在于被检试样是血液、血清或血浆。
8.如权利要求5～7中任一项所述的监控方法，其特征在于能够预测从肝炎或肝硬化向肝癌的转变。
9.如权利要求5～8中任一项所述的监控方法，其特征在于使用固定在支持体上的抗GPC3抗体和由标记物质标记的抗GPC3抗体。
全文摘要
本发明涉及以使用识别GPC3的N端部位的抗体测定GPC3为特征的监控肝炎重症化的方法。根据本发明，可以预测肝炎的重症化、即从肝炎或肝硬化向肝癌的转变。
文档编号C12N15/09GK101052878SQ200580034010
公开日2007年10月10日 申请日期2005年10月3日 优先权日2004年10月5日
发明者中岛淳, 油谷浩幸, 岩成宏子, 大口正夫, 佐藤广一 申请人:株式会社英仙蛋白质科学, 国立大学法人东京大学