专利名称：重组人源hgf激活因子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种重组人源性HGF激活因子 (rhHGFA)，及其rhHGFA在制备治疗急性或亚急性重症肝炎肝细胞坏死 的药物中的应用。
背景技术：
肝细胞生长因子激活因子(HGFA)是一种肝细胞分泌的血浆蛋白，Gene ID: 3083，活化的HGFA是一条33Kd多肽，仅分布于受损的组织器官， 可以在受损局部将肝脏非实质细胞分泌的单体肝细胞生长因子(pro-HGF) 活化为HGF，在受损组织器官局部发挥细胞保护和组织修复作用(参见文 献Shia S, Stamos J, Kirchhofer D， et al. Conformational lability in serine protease active sites: structures of hepatocyte growth factor activator (HGFA) alone and with the inhibitory domain from HGFA inhibitor-IB. J Mol Biol. 2005 Mar 11 ;346(5》1335-49. ; Miyazawa K， Shimomura T and Kitamura N. Activation of hepatocyte growth factor in the injured tissues is mediated by hepatocyte growth factor activator. J Biol Chem 1996; 271:3615-8.)。动物研究 发现，HGFA基因敲除小鼠的炎性肠病模型中，动物的死亡率高达72%， 而同期野生对照组的死亡率仅为25% (参见文献Itoh H, Naganuma S, Takeda N et al. Regeneration of injured intestinal mucosa is impaired in hepatocyte growth factor activator-deficient mice. Gastroenterology 2004; 127:1423-35.)，提示HGFA在pro-HGF活化、组织器官修复保护中发挥了 至关重要的作用。
急、慢性肝功能衰竭以大面积肝细胞凋亡坏死、肝细胞再生功能抑制 为主要病理特征。临床表现为重度黄疸、腹水、凝血障碍、肝性脑病，病 势凶险，但内科只能采用保肝、对症处理治疗，由于缺乏有效的救治手段， 患者死亡率高达70-90%。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人源性HGF激活因子(rhHGFA)，本 发明的另一目的是提供该rhHGFA在制备治疗急性或亚急性重症肝炎肝细 胞坏死的药物中的应用。
在急性、亚急性重症肝炎病程中，坏死的肝细胞可以刺激肝脏非实质 细胞分泌大量的肝细胞生长因子前体(pro-HGF)，因此患者血清中往往含 有高值pro-HGF，特别是急性肝衰时，其血中含量可以达到正常值的10倍。 pro-HGF只有被激活为HGF才能发挥其抗细胞坏死、凋亡，促进肝细胞再 生的功能，体内80M的pro-HGF被肝细胞合成的HGFA激活。但在急性肝 衰大面积肝细胞坏死或由于肝硬化等因素抑制肝细胞合成HGFA情况下， 机体产生的pro-HGF无法有效地转型为HGF发挥其肝细胞保护和修复功 能。因此本发明人推断补充体内减少的HGFA促进pro-HGF转型为HGF， 就可以使肝脏利用其自身产生的HGF进行抗凋亡及再生修复，预防和阻止 大面积肝细胞坏死造成的急性肝功能衰竭的发生及进展，为肝脏修复及进 一步治疗创造条件。
由于HGFA成熟肽段在体内消除较快，加之基因重组蛋白本身在体内 的稳定性较差，故本发明是在人源成熟肽段HGFA的基础上，与人免疫球 蛋白IgGFc片断重组成为融合蛋白(rhHGFA-Fc)增加在动物/人体内的蛋 白稳定性，并将该融合蛋白应用于制备治疗急性或亚急性重症肝炎肝细胞 坏死的药物。
本发明的具体技术方案是将HGFA成熟肽段基因(858bp，见SEQ ID NO:l)以及人免疫球蛋白(IgG)的Fc片断基因(693bp，见SEQ ID NO:2)。 采用重叠延伸剪切技术经两次PCR获得重组基因片段HGFA-Fc (1575bp， 见SEQ ID NO:3)。
本发明提供的一种重组人源性肝细胞生长因子激活因子，其核苷酸序 列及其编码的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。核苷酸序列具体为
atg+HGFA成熟肽段基因(SEQ ID NO:l ) +中间接头序列 (ggatccgcaggagtcgcaacc) + Fc片断基因(SEQ ID NO:2)。
上述核苷酸序列编码的氨基酸共计525aa，具体序列如下
PWLAAIYIGDSFCAGSLVHTCWVVSAAHCFSHSPPRDSVSVVLGQHFFNICLPEPGSTFPAGHKCQIAGWGHLDENVSGYSSSLREALVPLVADHKCSS
PEVYGADISP丽LCAGYFDCKSDACQGDSGGPLACEKNGVAYLYGIISW
GDGCGRLHKPGVYTRVANYVDWINDRIRPPRRLVAPSGSAGVATPKSCD
KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
上述氨基酸序列中划线部分为中间接头序列，划线之前部分为HGFA 序列，划线之后部分为Fc序列，见SEQIDNO:3或4。
本发明将HGFA-Fc基因片段连接到pMD19-T载体上，构建 pMD18-HGFA-Fc载体。PCR法筛选阳性克隆，并进行阳性克隆的DNA测 序。随后，将HGFA-Fc克隆到pcDNA3.1表达载体上，转化Eco.li Top 10 菌株，进行重组质粒制备、纯化，并转染人肾细胞293株进行重组融合蛋 白(rhHGFA-Fc)表达。重组蛋白经SDS-PAGE电泳确定其分子量为63Kd, 分别采用抗HGFA和抗人IgG Fc抗体证实rhHGFA-Fc重组蛋白的特异性。
经体外试验发现，该重组蛋白可以激活人源pro-HGF单体成为具有生 物学活性的HGF二聚体(HGF)，半数激活浓度(IC5。)为20nM。
本研究构建的真核细胞表达载体，将HGFA活性区域和人免疫球蛋白 IgG铰链区融合表达，理论上HGFA-Fc既具有肝细胞生长因子激活因子的 功能，又可以通过Fc片段增强融合蛋白的稳定性。将纯化的HGFA-Fc融 合蛋白与pro-HGF温育反应，用HGF多克隆抗体Western blot检测显示 pro-HGF被酶解为a链和(3链，且随着HGFA-Fc浓度增加酶切活性增强， HGFA-Fc的酶切活性呈剂量依赖效应。显示重组表达的HGFA-Fc具有较强 的激活pro-HGF功能。HAI-1是HGFA特异性抑制因子，因此将纯化的 HGFA-Fc与pro-HGF、 HAI-1共同温育反应，会抑制HGFA-Fc的酶切活性。 HGF多克隆抗体Western blot检测表明当HAI-1反应浓度为2uM以上时， HGFA-Fc的酶切活性被很好的抑制，从另外一个侧面证实融合HGFA-Fc具 有较强的生物学特异性。
经rhHGFA-Fc激活的HGF在体外试验中显示出显著的肝细胞凋亡抑制 作用(4.8% 25.1%);在动物肝纤维化肝细胞损伤模型中，rhHGFA-Fc治疗组可以明显减少肝细胞凋亡。因此，rhHGFA-Fc重组蛋白可以作为急 性、亚急性重症肝炎肝细胞凋亡坏死的治疗药物。
图1是表达载体pcDNA3.1-HGFA-Fc的酶切鉴定结果
其中M为DL 2000 DNA分子量标记；1为pcDNA3.1(+)用Xho I/Hind III双酶切；2、 3为pcDNA3.1-HGFA-Fc用Xho I/Hind III双酶切。 图2是10% SDS-PAGE鉴定rhHGFA-Fc重组蛋白的分子量结果
其中1为从转染pcDNA3.1-HGFA-Fc质粒的293细胞总蛋白中纯化的 rHGFA-Fc重组融合蛋白；2为转染pcDNA3.1(+)空白质粒的293细胞蛋白 纯化产物。
图3是rhHGFA-Fc重组蛋白western blot鉴定结果
其中M为预染蛋白质分子量标记；1、 2为从转染pcDNA3.1-HGFA-Fc 质粒的293细胞总蛋白中纯化的rHGFA-Fc重组融合蛋白；3为转染 pcDNA3.1(+)空白质粒的293细胞蛋白纯化产物。 图4是Western Blot检测HGFA-Fc的酶切活性结果
其中O为零反应时间的样品；Ctrl为未加入HGFA-Fc的样品；1 6为 HGFA-Fc浓度梯度4.8ug/ml 0.15ug/ml。
图5是HAI-1抑制HGFA-Fc激活pro-HGF的试验结果。
其中0表示终浓度为50ug/ml的pro-HGF溶液；Ctrl: 50ug/ml的pro-HGF 溶液中加入终浓度为2.4ug/ml的HGFA-Fc; 1:在ctri反应体系中加入0.5uM HAI-1; 2:在Ctrl反应体系中加入2uM HAI-1; 3:在ctrl反应体系中加入 8uMHAI曙l。
图6是流式细胞术实验检测AHGFA-Fc蛋白介导的肝细胞凋亡抑制作用结 果
其中A为空白细胞对照组；B为单独加入pro-HGF组；C为加入 HGFA-Fc和pro-HGF实验组。
图7是HGFA-Fc融合蛋白抗动物肝细胞凋亡的实验结果。 其中A为对照组，B为实验组凋亡细胞免疫组化结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作详细说明，但本发明的实施并不仅于此。
材料与主要试剂
1. 细胞株、菌种和质粒293细胞购自上海麦沙生物科技有限公司、大
肠杆菌DH5oc购自北京天根生化科技公司，pMD18-T购自TakaRa公司， pcDNA3.1购自Invitrogen公司。
2. 试齐U:抗人HGFA单抗、抗人HGF单抗购自R&D公司；抗His单 抗购自Chemicon公司；抗人Fc单抗购自Sigma公司；pro-HGF蛋白制品 和Recombinant Human HAI-1购自R&D公司；Lipofectamine 2000、 FBS和 DMEM为Invitrogen公司产品；N产层析树脂购自Qiagen公司；PVDF硝 酸纤维素膜和Ap显色试剂盒购自Bio-Rad公司；丙烯酰胺、双丙烯酰胺和 TEMED购自Sigma公司；9cm细胞培养皿购自Corning公司；Xho I和Hind III内切酶为TakaRa公司产品；细胞凋亡检测试剂盒购自Roche公司；其它 试剂均为分析纯试剂。
实施例1:重组人源HGFA-Fc融合蛋白的制备
用RT-PCR从肝组织cDNA文库钓取HGFA活性区域DNA片段(Gene ID:3083， 1104bp 1962bp)大小为858bp，通过Overlap重叠PCR (参见 曹阳等，《河北医药》2005第27巻第11期)与人免疫球蛋白Fc (Gene ID:2209) 693bp片段融合，获得1575bp HGFA-Fc片段，Xho I/Hind III双 酶切克隆到pcDNA3.1(+)载体。酶切鉴定正确后大量抽提、纯化、测定浓度 后备用。具体步骤如下 一、重组质粒pcDNA3.1-HGFA-Fc的构建
1. 扩增HGFA-Fc嵌合基因的引物合成
根据基因文库确定人源HGFA基因(ID: 3083)，设计引物扩增其中人 源HGFA基因1102bp 1965bp范围，相应的氨基酸起止序列为368-655。 Up5, :GC4 GC7TCTCACCAGAGTCCAACTGT3,
中间引物
Mup: ggagggagccacaagaaaactcacacatgc Mdown: cctccctcggtgttcttttgagtgtgtacg Down 5，-ATC7Ua4G TATTATCATT TACCCGGA-3'
2. RNA提取和检测取人的新鲜肝组织(可以是血管瘤的肝切标本)50-100mg，采用 Invitrogen Fast Track Kit (Invitrogen公司)提取RNA ，采用1.0%-1.5%甲醛 变性Agarose胶电泳，检测RNA质量。
3. RT-PCR扩增目的基因
3.1 采用TaKaRaRT-PCR试剂盒合成cDNA文库，反应结束后于95"C 加热5min使逆转录酶失活。
3.2 PCR扩增靶基因片断
采用重叠延伸剪切技术经两次PCR获得嵌合基因片段HGFA-Fc。
(1) 第一次PCR扩增用引物Up与中间引物Mup，以cDNA为摸板 扩增HGFA成熟肽858bp，以Mdown 、 Down为引物，以含有人Fc片段 基因的pCMVsFc质粒(pCMVsFc质粒由休斯顿Baylor大学医学院细胞和 基因治疗中心副教授陈思毅博士惠赠)为摸板扩增。
(2) 第二次PCR扩增分别以第一次PCR产物为摸板，以引物Up， Mdown为引物扩增嵌合基因片段HGFA-Fc片段。
4. pMD18-HGFA-Fc载体的构建及测序
4.1采用Takara T4 DNA ligase于16度连接过夜，将HGFA-Fc嵌合片 段连接到pMD19-T载体上，构建pMD18-HGFA-Fc载体。
4.2将连接液涂布于氨苄抗性LB固体培养基平板，置于37度培养 12-16h。
4.3挑取转化子用PCR法鉴定，阳性克隆会有1576bp大小片断扩增 出；鉴定后再挑取同一菌斑置于液体LB培养基过夜，收集菌液并抽取质粒， 即为pMD18-HGFA-Fc。
4.4重组质粒酶切鉴定用Takara Xho I/Hind III双酶切，阳性克隆会 有1576bp大小片断被切下；阴性克隆无此片断放出。
4.5将阳性克隆进行DNA测序(上海生工生物工程技术公司测序)， 确定其没有碱基突变或者碱基缺失。测序结果，如SEQIDNO:3所示。
5. 真核表达载体pcDNA3.1 -HGFA-Fc的构建及鉴定
将HGFA-Fc克隆到pcDNA3.1表达载体上采用Takara Xho I/Hind III 双酶切，Qiagen Gel Extraction kit (Qiagen公司)割胶回收，Takara T4 DNA ligase连接，连接液涂布于氨苄抗性LB固体培养基平板，PCR法筛选阳性 重组子并酶切鉴定。构建的表达载体pcDNA3.1-HGFA-Fc酶切鉴定结果见图1。 Xho I/Hind III双酶切可获得1.6kb DNA片段，表明1575bp HGFA-Fc片段已经克隆进 入pcDNA3.1(+)载体。
6.真核表达载体pcDNA3.1-HGFA-Fc制备
将pcDNA3.1-HGFA-Fc质粒转化五co.// Top 10，接种于10ml试管培养 过夜，再转接于500ml三角摇瓶中，37度培养8h，收集菌液。采用Qiagen EndoFree Plasmid Maxi Kit ( Qiagen公司)纯化pcDNA3.1 -HGFA-Fc ，去除
内毒素等杂质，用于下步细胞转染实验。
二、 细胞转染
人肾293细胞培养于含10%FBS胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml 链霉素的DMEM培养液中，置于37"C、 5%(302,饱和湿度的培养箱中培养。 将上述构建好的pcDNA3.1-HGFA-Fc禾n pcDNA3.1(+)空载体按照 Lipofectamine 2000试剂说明转染293细胞。
三、 HGFA-Fc表达产物的纯化
转染后细胞培养36h，待细胞密度为80% 90%时用预冷的PBS洗两 次，细胞刮刀收集细胞，4'C离心5min，冰浴下于RIPA缓冲液(50mM Tris.HCl， pH7.4， l%NP-40， 0.25%脱氧胆酸钠，150mMNaCl， lmMEDTA， 0.5%蛋白酶抑制剂Cocktail)中裂解，4°C 12000g离心15min，收集上清液。 上清液上样于平衡好的N产柱，用含有100 mM咪唑的缓冲液洗脱收集目的 蛋白质，将纯化好的HGFA-Fc融合蛋白在20mM Hepes pH7.5、 150mM NaCl、 5mMCaCl2中4"C透析过夜，分装成小份用于Western blot检测、酶 活性以及抗肝细胞凋亡测定。
四、 HGFA-Fc表达产物免疫学活性的鉴定 BCA蛋白定量试剂盒(购自上海业力生物科技公司)进行蛋白浓度测
定，取20ug总蛋白上样于10% SDS-PAGE，湿法在110mA恒流条件将蛋白 质从凝胶转移至PVDF膜。将膜在PBST(含0.1% Tween 20的PBS)5。/。脱脂 奶粉中4。C封闭过夜，室温一抗结合1.5h,用PBST洗膜三次，每次10min, 室温二抗结合lh,再用PBST洗膜三次，每次10min,加入Ap显色试剂盒反 应1 3min。
将pcDNA3.1-HGFA-Fc转染人的293细胞，继续培养36h，收集细胞 提取总蛋白。经N产柱层析法纯化重组HGFA-Fc片段，纯化蛋白产物经10%
9SDS-PAGE电泳鉴定，主要在62kD处显单一蛋白条带，见图2。
上述纯化蛋白用Western blot法(WB)鉴定HGFA-Fc的特异表达。结 果显示，从转染了pcDNA3.1-HGFA-Fc质粒的293细胞中提取的蛋白，经 蛋白纯化后，其62kD的重组蛋白可以与抗人HGFA抗体及抗人IgG抗体 发生特异性反应，而转染pcDNA3.1(+)空白载体的细胞中无rhHGFA-Fc重 组蛋白表达，见图3。
实施例2: rhHGFA-Fc重组融合蛋白的酶切活性及抗肝细胞凋亡作用
一、 HGFA-Fc激活pro-HGF酶活性的检测
在终浓度为50ug/ml的pro-HGF反应缓冲液中，分别加入HGFA-Fc浓 度梯度为0,15ug/ml， 0.3ug/ml， 0.6ug/ml， 0.12ug/ml， 0.24ug/ml， 4.8ug/ml， 反应lh后Western blot检测各反应体系中proHGF(92kD)和HGF(62kD)表达 情况。结果显示，rhHGFA-Fc重组蛋白可以将pro-HGF酶切为a链和P链， 且酶活性随rhHGFA-Fc浓度增加而增强，结果见图4。经计算，该重组蛋 白的IC50酶活性值为20nM。
在浓度为50ug/ml的pro-HGF溶液中，加入终浓度为2.4ug/ml的 HGFA-Fc融合蛋白，和终浓度分别为0.5uM、 2uM和8uM的HAI-1共同 孵育lh。 Western blot检测显示2uM以上的HAI-1可以完全抑制HGFA-Fc 的酶切活性，进一步证实融合HGFA-Fc具有较强的生物学特异性。见图5。
二、 HGFA-Fc蛋白介导的抗肝细胞凋亡
人源肝细胞株HL-7702 (来源于美国ATCC,购自上海中科院细胞所) 培养至对数生长期，按照5><105个/孔接种6孔细胞培养板。37°C、 5%C02, 恒温培养箱中培养24h后，实验组加入终浓度2.4ug/ml的HGFA-Fc、 50ug/ml的pro-HGF;阴性对照组只加入50ug/ml的pro-HGF;空白对照组 不加入任何蛋白制品。继续培养12h，实验组和阴性对照组分别加入终浓度 60uM的顺铂，培养24h收集细胞，固定并进行Annexin V/PI双染色，进行 流式细胞术检测细胞凋亡情况。
流式细胞术实验显示，实验组的细胞早期凋亡率4.8% (Annexin V+/ PI-)，阴性对照组细胞早期凋亡率为25.1%，空白对照组细胞早期凋亡率 3.3%。表明rhHGFA-Fc通过激活pro-HGF为HGF，发挥其抗肝细胞凋亡作 用见图6。
四氯化碳诱导小鼠肝纤维化肝损模型(5y。四氯化碳/橄榄油(v/v)， 3次/
10周灌胃，共8周，剂量为20ml/kg体重)，模型鼠随机分为对照组(尾静脉注射0.5ml生理盐水，1次/天，共7天)和实验组(尾静脉注射0.2ug/0.5mlHGFA-Fc蛋白，l次/天，共7天)， 一周后处死小鼠取全血和肝脏。肝组织浸泡于福尔马林液中，制备石蜡切片进行细胞凋亡的免疫组化检测(TUNEL试剂盒购于美国Chemicon公司)DAB显色。结果显示rhHGFA-Fc治疗组肝细胞凋亡明显少于对照组，表明rhHGFA-Fc可以介导抗肝细胞凋亡作用见图7。SEQUENCE LISTING
〈110〉上海交通大学医学院附属仁济医院〈120〉重组人源HGF激活因子及其应用〈130〉说明书，权利要求书〈160〉 4
〈170〉 Patentln version 3.1
〈210〉 1
〈211〉 858
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 1
ctcaccagag tccaactgtc accggatctc ctggcgacccgggcgccagg cctgcggc已g gaggcac犯g a卿gg已cgtggcggctcct cctcgctgcc cggctcgcac ccctggctggagcttctgcg ccgggagcct ggtccacacc tgctgggtggtcccacagcc cccccaggga cagcgtctcc gtggtgctggacgacgg已cg tgacgcagac cttcggcatc gagaagtacagtgttcaacc ccagcgacca cgacctcgtc ctgatccggctgtgccacac gctcgcagtt cgtgcagccc atctgcctgccccgcaggac acaagtgcca gattgcgggc tggggccacttactccagct ccctgcggga ggccctggtc cccctggtcgcctgaggtct acggcgccga catcagcccc aacatgctctaagtccgacg cctgccaggg ggactc鄉g gggcccctgg
tgcctgagcc agcctccccg 60
tcctgcggcc acgtatcatc 120
ccgccatcta catcggggac 180
tgtcggccgc ccactgcttc 240
gccagcactt cttcaaccgc 300
tcccgtacac cctgtactcg 360
tg已agaaga已aggggaccgc 420
ccgagcccgg cagcaccttc 480
tggatgagaa cgtgagcggc 540
CCg￡LCCetC￡L￡L gtgCElgCELgC 600
gtgccggcta cttcgactgc 660
cctgcgagaa gaacggcgtg 720
12gcttacctct acggcatcat
gtctacaccc gcgtggccaa
cggcttgtgg ctccctcc
〈210〉 2〈211〉 693〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈400〉 2ccca犯tctt gtgacaa犯c
ggaccgtcag tcttcctctt
cctgaggtca certgcgtggt
tggtacgtgg acggcgtgga
aacagcacgt accgtgtggt
aagg3gtaca agtgc犯ggt
tccaaagcca aagggcagcc
gagctgacca agaaccaggt
atcgccgtgg agtggg卿g
gtgctggact ccgacggctc
tggcagcagg gg咖gtctt
acgcagaaga gcctctccct
cagctggggt gacggctgcg ggcggctcca caagccgggg 780ctatgtggac tggatc犯cg accggatacg gcctcccagg 840
858
tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 60
ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 120
ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 180
ggtgcataat gccaag已caa agccgcggga ggagcagtsc 240
cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 300
ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 360
ccgagaacca csggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 420
cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 480
caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 540
cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 600
ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 660
gtctccgggt aaa
693
13〈210〉 3〈211> 1575〈212〉 DNA〈213> 人工序列<220〉
〈221〉 CDS
〈222> (1)..(1575)
〈223〉
<400〉 3
atg etc acc aga gtc caa ctg tea ccg gat etc ctg gcg ace ctg cct 48Met Leu Thr Arg Val Gin Leu Ser Pro Asp Leu Leu Ala Thr Leu Pro15 10 15
gag cca gccGlu Pro Ala
tec ccgSer Pro20
gggGly
cgc
cagGin
gccAla25
tgcCys
ggcGly
aggArg
鄉Arg
cacHis30
幼gLys
卿Lys
96
agg acg ttc ctg egg cca cgt ate ate ggc ggc tec tec teg ctg ccc 144Arg Thr Phe Leu Arg Pro Arg lie lie Gly Gly Ser Ser Ser Leu Pro35 40 45
ggc teg cac ccc tgg ctg gcc gcc ate tac ate ggg gac age ttc tgc 192Gly Ser His Pro Trp Leu Ala Ala lie Tyr lie Gly Asp Ser Phe Cys50 55 60
gcc ggg age ctg gtc cac acc tgc tgg gtg gtg teg gcc gcc cac tgc 240Ala Gly Ser Leu Val His Thr Cys Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys65 70 75 80
ttc tec cac age ccc ccc agg gac age gtc tec gtg gtg ctg ggc cag 288Phe Ser His Ser Pro Pro Arg Asp Ser Val Ser Val Val Leu Gly Gin85 90 95
cac ttc ttc aac cgc acg acg gac gtg acg cag acc ttc ggc ate gag 336His Phe Phe Asn Arg Thr Thr Asp Val Thr Gin Thr Phe Gly lie Glu100 105 110aag tacLys Tyr
atelie115
ccgPro
tacTyr
a_ccThr
ctgLeu
tacTyr120
tegSer
gtgVal
ttcPhe
Asn
cccPro125
ageSer
gacAsp
cacHis
384
gac etcAsp Leu130
gtcVal
ctgLeu
atelie
eggArg
ctgLeu135
肪gLys
sagLys
Lys
gggGly
gacAsp140
cgcArg
tgtCys
gccAla
Thr
432
cgc tegArg Ser145
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ttcPhe
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cagGin150
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atelie
tgcCys
ctgLeu
cccPro155
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Glu
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ageSer
3CC
Thr160
480
ttc cccPhe Pro
gC3
Ala
Gly
C3C
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tgcCys
C8g
Gin
attlie
gcgAla170
ggcGly
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ggcGly
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His
ttgLeu175
g3tAsp
528
g观朋cGlu Asn
gtgVal
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Ser180
ggcGly
tacTyr
tecSer
3gC
Ser
tecSer185
ctgLeu
eggArg
gagGlu
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ctgLeu190
gtcVal
cccPro
576
ctg gtcLeu Val
gccAla195
gacAsp
cacHis
肪gLys
tgcCys
ageSer200
Ser
cctPro
g恥Glu
gtcVal
tacTyr205
ggcGly
gccAla
g3C
Asp
624
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cccPro
Asn
atgMet
etcLeu
tgtCys215
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ggcGly
tacTyr
ttcPhe
gacAsp220
tgcCys
aa_gLys
tecSer
g3C
Asp
672
gcc tgcAls Cys225
C3g
Gin
gggGly
gacAsp
teaSer230
gggGly
gggGly
cccPro
ctgLeu
gccAla235
tgcCys
gagGlu
肪gLys
sacAsn
ggcGly240
720
gtg getVal Ala
tacTyr
etcLeu
t￡LC
Tyr245
ggcGly
atelie
atelie
ageSer
tggTrp250
Gly
gacAsp
ggcGly
tgcCys
gggGly255
eggArg
768
15etc cac aag ccg ggg gtc tac acc cgc gtg gcc aac tat gtg gac tgg 816Leu His Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ala Asn Tyr Val Asp Trp260 265 270
ate aac gac egg ata egg cct ccc agg egg ctt gtg get ccc tec gga 864lie Asn Asp Arg lie Arg Pro Pro Arg Arg Leu Val Ala Pro Ser Gly275 280 285
tec gca gga gtc gca acc ccc aaa tct tgt gac aeta act cac aca tgc 912Ser Ala Gly Val Ala Thr Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys290 295 300
cca ccg tgc cca gca cct gaa etc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc ctc 960Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu305 310 315 320
ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tec egg acc cct gag 1008Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu325 330 335
gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag 1056Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys340 345 350
ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg c已t aat gcc aag aca犯g 1104Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys355 360 365
ccg egg gag gag cag tac犯c age acg tac cgt gtg gtc age gtc etc 1152Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu370 375 380
acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 1200Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys385 390 395 400
16gtc tec aac aaa gcc etc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate tec aaa 1248
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys
405 410 415
gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac ace ctg ccc cca tec 12%
Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 420 425 430
egg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa 1344
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 435 440 445
ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gsg age aat ggg cag 1392
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 450 455 460
ccg gag aac aac t已c已ag acc已cg cct ccc gtg ctg gac tec gac ggc 1440
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
465 470 475 480
tec ttc ttc etc tac age aag etc acc gtg gac aag age agg tgg cag 1488
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin
485 490 495
cag ggg aac gtc ttc tea tgc tec gtg atg cat gag get ctg cac aac 1536
Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 500 505 510
cac tac acg cag aag age etc tec ctg tct ccg ggt aaa 1575
His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 515 520 525
〈210〉 4 〈211〉 525 〈212〉 PRT〈213>人工序列 〈400> 4
Met Leu Thr Arg Val Gin Leu Ser Pro Asp Leu Leu Ala Thr Leu Pro 15 10 15
Glu Pro Ala Ser Pro Gly Arg Gin Ala Cys Gly Arg Arg His Lys Lys 20 25 30
Arg Thr Phe Leu Arg Pro Arg lie lie Gly Gly Ser Ser Ser Leu Pro 35 40 45
Gly Ser His Pro Trp Leu Ala Ala lie Tyr lie Gly Asp Ser Phe Cys 50 55 60
Ala Gly Ser Leu Val His Thr Cys Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys 65 70 75 80
Phe Ser His Ser Pro Pro Arg Asp Ser Val Ser Val Val Leu Gly Gin 85 90 95
His Phe Phe Asn Arg Thr Thr Asp Val Thr Gin Thr Phe Gly lie Glu 100 105 110
Lys Tyr lie Pro Tyr Thr Leu Tyr Ser Val Phe Asn Pro Ser Asp His 115 120 125
Asp Leu Val Leu lie Arg Leu Lys Lys Lys Gly Asp Arg Cys Ala Thr 130 135 140
Arg Ser Gin Phe Val Gin Pro lie Cys Leu Pro Glu Pro Gly Ser Thr 145 150 155 160
Phe Pro Ala Gly His Lys Cys Gin lie Ala Gly Trp Gly His Leu Asp 165 170 175
18Leu Val Ala Asp His Lys Cys Ser Ser Pro Glu Val Tyr Gly Ala Asp 195 200 205
lie Ser Pro Asn Met Leu Cys Ala Gly Tyr Phe Asp Cys Lys Ser Asp 210 215 220
Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Glu Lys Asn Gly 225 230 235 240
Val Ala Tyr Leu Tyr Gly lie lie Ser Trp Gly Asp Gly Cys Gly Arg 245 250 255
Leu His Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ala Asn Tyr Val Asp Trp 260 265 270
lie Asn Asp Arg lie Arg Pro Pro Arg Arg Leu Val Ala Pro Ser Gly 275 280 285
Ser Ala Gly Val Ala Thr Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 290 295 300
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 305 310 315 320
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu 325 330 335
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 340 345 350
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 355 360 365Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 370 375 380
Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 385 390 395 400
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys 405 410 415
Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 420 425 430
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 435 440 445
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 450 455 460
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 465 470 475 480
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 485 490 495
Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 500 505 510
His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 515 520 525
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权利要求
1、一种重组人源性肝细胞生长因子激活因子，其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。
2、 一种如权利要求1所述的重组人源性肝细胞生长因子激活因子在制备治 疗急性或亚急性重症肝炎肝细胞坏死的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物医药领域。肝细胞生长因子激活因子是一种肝细胞分泌的血浆蛋白，活化的HGFA是一条33Kd多肽，仅分布于受损的组织器官，可以在受损局部将肝脏非实质细胞分泌的单体肝细胞生长因子活化为HGF，在受损组织器官局部发挥细胞保护和组织修复作用。急、慢性肝功能衰竭以大面积肝细胞凋亡坏死、肝细胞再生功能抑制为主要病理特征。临床表现凶险，由于缺乏有效的救治手段，患者死亡率高达70-90％。本发明提供了一种重组人源性HGF激活因子，其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示，可用于制备治疗急性或亚急性重症肝炎肝细胞坏死的药物中的应用。
文档编号C12N15/12GK101649320SQ200910195670
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月15日 优先权日2009年9月15日
发明者强 夏, 峰 薛 申请人:上海交通大学医学院附属仁济医院