专利名称：使用AtBG1基因产生对多种胁迫具有增加的抗性的转基因植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及AtBGl (拟南芥e—葡糖苷酶1)基因的用途和具有 ^MW基因插入的转基因植物，更精确地，力M67基因通过增加一种植物 激素脱落酸(ABA)的水平用于产生对多种环境胁迫具有抗性的转基因植 物的用途，和具有基因插入的具有胁迫抗性的转基因植物。
背景技术：
植物激素脱落酸(ABA)在包括种子休眠、萌发和对环境胁迫的适 应性反应的生理过程中起关键作用(Finkelstein R. R. et al. ， /^a/7t
14: 515， 2002; J. K. Zhu. jy^i; 7fey尸h/7t53: 247， 2002;Zeevaart J. A. D. and Creelman R. A.， 爿/7/ . 7 ey. 尸〗朋t 尸/ j^io丄尸h/7t #。丄 39: 439，1988;Leung J. 和
Giraudat J. j層齡尸〗朋t尸/ ，'o"7朋t U肠丄49: 199， 1998)。 ABA几乎同时被两个研究组发现F. T. Addincott和P. F. Wareing。 F. T. Addincott组研究未成熟果实的脱落，从棉花果实的落叶分离了作 为刺激剂的abscisll。 P. F. Wareing的另一个研究组研究树芽的冬眠， 从一种白桦Betula Pubescence分离了休眠的诱导剂，然后将其命名为休 眠素。在1965年，证实了休眠素和abscisll是相同的，然后他们开始被 称作脱落酸(下文中称作"ABA")。
休眠的种子、树芽和鳞茎含有大量的ABA并且随着它们萌发，ABA 含量降低。ABA还涉及气孔运动。精确地，当植物脱水时，ABA合成加速 并且叶孔被关闭，导致保护植物免于失水。例如，称作flacca的转基因 番茄植物与野生型植物相比由于低水平的ABA而不显示出气孔关闭。
细胞ABA水平不断波动以允许植物调节来改变生理和环境条件。具
体地，细胞ABA水平受到生物合成和降解之间的平衡的控制。从头蛋白质 合成是增加细胞ABA水平必需的。同时，由于氧化导致ABA降解或者连接 成无活性形式而使ABA水平降低(Zeevaart J. A. D.和R. A. Creelman， 爿/7/7. "朋t尸力j^j'o丄尸^3/^#。丄A'o丄，39: 439, 1988; Leung J.
禾卩Giraudat J. , J/7/7i/ Zfe7尸^373t尸/ j^j'cJ /^3/7t #。2 49: 199， 1998;
Cutler A. J. and Krochko J. E, ， 7^e油尸J朋"cj'面e 4: 472， 1999; Qin X.禾口 Zeevaart J". A.，尸潔.淑丄爿cW. 5"cj'.狙96: 15354， 1999)。
低水平的ABA导致多种生理缺陷，包括提前萌发、枯萎或者对环境 胁迫敏感(Cutler A. J.禾口 Krochko J. E. ， Tre油7/7尸^a/7t 5""'e雄4: 472， 1999; Koor騰ef M. et al. ， 粉丄61: 385， 1982;
Rock C. D.禾口 Zeevaart丄A.，尸roc. ^cad 5"c丄〃5"A 88: 7496，
1991)，其表明合成和降解之间的平衡正确控制ABA水平对于多种生理应 答是非常重要的。细胞ABA含量通过两种途径降低。第一种途径是通过细 胞色素P470CYC707A在8，位对ABA的氧化以形成不稳定的8'-羟基ABA。 该不稳定的中间体随后通过自发异构化转化成菜豆酸(Zeevaart丄A. D. 禾口 Creelman R. A. ， j朋./fey.尸Za/7t尸力j^j'o丄 39; 439， 1988; T. Kushiro， " a丄，^M 0 / 23: 1647， 2000)。
其他降低细胞ABA含量的途径是通过糖基转移酶介导的缀合葡萄 糖，从而产生ABA葡萄糖酯(ABA-GE) (Cutler A. J.和Krochko J. E.， 7>e72cfe j'/7尸7a/7t5^'e/7ce4: 472， 1999; Walton D, C.和Li Y. ， j.y /^a/3t //onz a/7es1 .■尸/ ysj'cJo^7, 5ioc力e;z j.s1 tzy朋di/WeciAZai-万j'o7c^， 140-157; Xu Z. J. et al.，尸力y幻'o/. 129: 1285， 2002)。缀合的ABA-GE 在液泡或者质外体空间保存(Kaiser W. et al. ， / 尸h/7t119: 237， 1985; Dietz K. J. et al. ， /. ^ ta77y 51: 937， 2000)。然
而，生物学上无活性的ABA-GE是否组成保留或者保存形式的ABA的问题 仍然有待澄清。
在本发明中，发明人证实定位在ER的一种拟南芥e —葡糖苷酶同 源物AtBGl显示出ABA-GE水解活性，并且在脱水胁迫条件下快速聚合低
分子量AtBGl成为较高分子量的形式而增加细胞ABA含量。在中具 有T-DNA插入的突变的拟南芥(下文中称作"突变atbgl")显示出降低 的ABA水平、有缺陷的气孔闭合、由于叶绿体缺少产生的黄叶表型和对非 生物胁迫的敏感应答。另一方面，过表达^"W基因的突变拟南芥显示出 比对照高2. 5倍的ABA水平和对环境胁迫的更强的抗性。
因此，本发明人通过证实JMW基因对于对包括盐损害、冷损害和 脱水的多种环境胁迫具有强烈耐受性的植物可以有很大帮助。
公开 技术问题
本发明的一个目的是提供产生对多种环境胁迫具有强烈抗性的转 基因植物的方法。
技术解决方案
为了实现上面的目的，本发明提供了编码AtBGl (拟南芥P—葡糖 苷酶1)的基因增加植物或者其变种中对环境胁迫的抗性的用途。
本发明通过插入编码AtBGl或者其变体的基因提供了对环境胁迫具
有抗性的转基因植物。
本发明还通过增加植物中的ABA水平提供了产生对环境胁迫具有抗
性的植物的方法。
本发明还通过插入JW67基因或者AtBGl蛋白质提供了增加植物中
对胁迫的抗性的方法。
下文详细描述本发明。
本发明提供了编码AtBGl (拟南芥P—葡糖苷酶1)的基因增加植 物或者其变种中对环境胁迫的抗性的用途。
植物激素脱落酸(ABA)在包括种子休眠、萌发、对环境胁迫条件 的适应性应答的多种生理过程中起重要作用。较低水平的细胞ABA导致多 种表型，如提前萌发或枯萎。通过诸如糖基转移酶介导的缀合葡萄糖而转 化成无活性的ABA葡萄糖酯(ABA-GE)的途径降低细胞ABA含量。在本发明 中，证实从拟南芥分离的P葡糖苷酶同源物AtBGl可以通过将ABA-GE转
化成ABA而增加ABA水平，其导致植物中对环境胁迫的增强的抗性。环境 胁迫包括高温、盐损害、干旱、污染、病原体、创伤、低温、过度光条件、 臭氧、除草剂、过度暴露于紫外线和渗透压休克。
为了确定在多种环境胁迫下，J"W基因的表达模式，对拟南芥给 予高浓度的NaCl、低温和脱水，接着观察的表达。结果，在野生 型植物中NaCl胁迫诱导^MG2的表达，而没有诱导编码其他3葡糖苷酶 同源物的Gluc和psr3. l基因(图2)。结果表明在P葡糖苷酶同源物中， 仅仅Jt万67在植物中增加胁迫抗性。
还进行了间接研究以证实J"W是否可以增加植物中对环境胁迫的 耐受性。观察到具有'突变atbgl'的T-DNA插入的突变株系中 的表型。不像野生型，突变株显示出黄叶和矮株高(图9和
图10)。在野 生型植物中，气孔在白天开放并且在也见关闭。然而，在'突变atbgl' 中，甚至在夜间也没有观察到气孔闭合(图13)。在干燥条件下，突变体 中失水量比野生型高1.5倍(图15)并且脱水水平也更高，显示出多数 叶子的枯萎(图16)。
从结果可以证实由于缺少AtBGl蛋白质，在'突变atbgl'中对环
境胁迫的抗性被弱化。
本发明人将^"W基因插入到'突变atbgl，中，导致构建了另一 种转基因拟南芥植物株系(下文中称作"拯救的atbgl")。以与使用'突 变atbgl'的实验中所述的相同的方式进行实验以确定^突变atbgl' 的表型是否由于力"67基因中的突变引起。
结果，"拯救的atbgl"类似于野生型，在萌发后1周(lw) 、 2周(2w) (图9)和4周(4w)(图IO)后显示出清楚的绿色，高度很高并且显示出 正常的气孔作用(即，与野生型一样，气孔在白天打开，在夜间关闭)(图 13)。在脱水条件下失水量低于野生型(图15)。在脱水条件下培养21天 后，观察到"拯救的atbgl"正常生长，没有显示出脱水引起的微暗的叶 子(图16)。
从这些结果证明"突变的abtgl"的表型由于^4t^77基因中的突变引起。
^MC7基因编码的AtBGl蛋白质增加了植物中脱落酸水平，并且从
而增强了对环境胁迫的抗性。
在本发明的优选实施方案中，检査了 AtBGl蛋白质是否可以水解 ABA糖基转移酶产生的ABA-GE。将野生型AtBGl蛋白质和在」WW基因中 具有替代或者缺失突变得到的突变的AtBGl蛋白质与ABA-GE (脱落酸葡 萄糖基酯)反应，接着用HPLC分级分离ABA级分。使用抗ABA特异性抗 体，通过ELISA证实和定量ABA级分。结果，从野生型AtBGl和ABA-GE 的反应观察奧高水平的ABA。另一方面，从突变的AtBGl蛋白质和ABA-GE 的反应没有检测到ABA(图17和图18)。结果表明JMW基因编码的AtBGl 蛋白质通过水解ABA-GE增加ABA的水平。
通过插入将"突变的abtgl"的黄叶表型转变成正常绿色(图 12)并且通过力M^/插入也诱导了气孔闭合(图14)。这些结果还支持通 过AtBGl的ABA产生促进植物中胁迫抗性。
其他证实的结果是AtBGl定位于ER， 一种细胞内细胞器(图23到
26)。
从而，本发明提供了 ^WW基因用于增强植物中对胁迫抗性和它的 同源基因在另一植物中的用途。可以将本发明的基因独立地或者根据常规 植物转染方法使用载体插入到植物中。例如，可以利用本领域中公知的拟 南芥介导的方法、基因枪、PEG方法和电穿孔。
变体指蛋白质，其中AtBGl的氨基酸序列中的一些氨基酸已经突变 但是没有功能改变。变体包括天然或者人工变体，其与AtBGl蛋白质同源 物具有相似的结构和生理功能。
本发明还通过插入编码AtBGl或者其变体的基因，提供了具有胁迫
抗性的转基因植物。
为了产生对环境胁迫具有抗性的转基因植物，本发明人构建了含有 」MW基因的植物表达载体、BI121::AtBGl'和用该载体转染的农杆菌 (LBA4404)，其在2004年11月18保藏在韩国生物科学和生物技术研究所 (KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号KCTC 10729BP)。
通过花浸染法用上面的载体、BI121::AtBGl'转化的农杆菌转染 拟南芥产生了转基因植物。
观察到含有^"67基因的转基因拟南芥的环境胁迫依赖的表型。结果，高水平的NaCl导致野生型枯萎，但是AtBGl转基因拟南芥正常生长 (图4)。尽管增加NaCl浓度减小了野生型的根生长速率，但是增加NaCl 浓度到固定含量增加了转基因拟南芥的根生长速率(图5)。上面的结果表明具有」"W插入的转基因植物显示出对环境胁迫如 高浓度NaCl的抗性。含有编码AtBGl或者其变体的基因的另一转基因植物也包括在本发明中。还理解本发明包括通过^"W插入显示出对环境胁迫的抗性的转基 因植物的后代或者克隆的植物和该植物的种子、果实、穗、块茎、块状根、 树、愈伤组织或原生质体。本发明还提供了通过增加细胞ABA水平产生对环境胁迫具有抗性的植物的方法。上面的方法包括下列步骤iii) 向植物中插入另一植物的^"W基因/同源基因或者含有该 基因的载体；禾口iv) 通过组织培养再分化该植物细胞。本发明人用含有」^67基因的pBI121: :AtBGl载体转染拟南芥，所 述载体可以用于通过花浸染法转化拟南芥，产生转基因植物。由于JM67 基因的过表达导致增加水平的游离ABA，该转基因植物显示出对多种胁迫 条件的抗性。本发明还提供了用^"W基因或者AtBGl蛋白质插入产生胁迫耐受 性转基因植物的方法。如前文所述，AtBGl通过水解将脱落酸葡萄糖酯(ABA-GE)转化成脱 落酸(ABA)，并且增加水平的ABA增加了植物中对胁迫条件的抗性，所述 水平的增加通过AtBGl多聚化促进。在脱水条件下，AtBGl过表达的植物由于AtBGl的激活而显示出增 加的ABA含量(见图27 —图31 )并且在生产生长条件下，ABA-GE通过AtBGl 多聚化转变成ABA以调节ABA的昼夜升高见图32—图34和图36 —图38)。 结果表明不是信号转导途径而是AtBGl促进了细胞ABA的活性库的增加。
不像从头生物合成(其是相当复杂和耗时的过程)，通过AtBGl介导的 ABA-GE水解产生ABA是简单和容易的，使得可以根据胁迫条件和持续时 间快速调节活性ABA库。据此判断从ABA-GE增加细胞ABA含量的途径是 抵抗植物中的脱水胁迫。附图描述参考附图更好地理解本发明的优选实施方案的应用，附图中图1是图表，显示了 AtBGl (拟南芥P —葡糖苷酶1)和其他一葡 糖苷酶同源物之间的氨基酸序列的比较，图2 —图6描述了环境胁迫诱导」MW表达并且含有」t^ 7基因的 转基因植物显示出对NaCl胁迫的增强的抗性，图2是一组电泳照片，显示了使用JZ^W、血67we (AF082157)和 *戸7^. 7 (U72153)的cDNA作为探针的RNA印迹分析的结果，其中"野生 型"拟南芥接受不同的化学胁迫(低温、脱水、高浓度NaCl) 30分钟、1 小时或者6小时，然后提取总RNA，图3是一组电泳照片，显示了使用从用JMW基因转化的转基因拟 南芥提取的总RNA进行的RNA印迹分析的结果，图4是一组照片，显示用ZMG7或者空载体pBI121转化的转基因 拟南芥在土壤中培养10天，然后用NaCl处理4天，图5是照片，显示了在MS板上培养4天然后转化到含有高浓度NaCl (n=50)的另一平板的植物的根的生长，图6是一组照片，显示了在含有处于^MW启动子控制下的6Y/S和 组织特异性^"^表达的转基因植物培养开始后分别1周(1W)、2周(2W) 和三周(3W)得到的X-Glue的结果。图7A是示意图，显示了具有」MW的T-DNA插入的突变株，图7B是凝胶电泳照片，通过使用从含有T-DNA的突变的拟南芥(下 文中"突变的atbgl")分离的基因组DNA与基因特异性引物进行 PCR，证实使用JMC7的T一DNA插入是否突变了拟南芥。图8 —图16描述了 "突变的atbgl"和"拯救的atbgl"的表型， "拯救的atbgl"的基因缺失通过用JMW;;朋基因转染恢复，
图8是凝胶电泳照片，通过RT-PCR使用基因特异性引物证 实"突变的atbgl"不含有XWW转录物，图9和图10是每种野生型、"突变的atbgl"和"拯救的atbgl" 萌发后l周(1W)、 2周(2W)和4周(4W)后拍摄的照片，图11是照片，显示了使用抗一HA抗体(Roche)通过蛋白质印迹分析 证实的"拯救的atbgl"中〃^^;:朋表达，图12是一组照片，显示了通过」MW插入对"突变的atbgl"恢复到类似于野生型的表型，图13是曲线图，显示了在白天和黑夜测量的在16/8小时的白天/ 黑夜周期下培养的拟南芥的叶子的孔径(n=150，条线=标准误)，图14是曲线图，显示了插入ABA或者用抑制NO合酶活性的NAME 处理后，在白天和黑色测量的"突变的atbgl"的叶子在气孔闭合期间的 孔径(n二200，条线=标准误)，图15是曲线图，显示了为了比较失水量，在20。C下10。X的相对湿 度的脱水条件下放置的叶子称重的结果，图16是一组照片，显示了在脱水条件下，野生型、"突变的atbgl" 和"拯救的atbgl"培养14天(14d)或21天(21d)的结果，图17 —图22是照片和曲线图，显示了通过AtBGl对ABA-GE的水解 和由此ABA水平的改变，图17是照片，显示了在用AtBGl :HA、AtBGl [E207Q] 、AtBGl [AC105] 和空载体转化的野生型植物的原生质体中使用抗一HA抗体免疫纯化的结 果，图18是一组照片，显示了在合适的缓冲液中ABA-GE存在下，通过 免疫纯化的AtBGl :HA蛋白质产生的反应产物的HPLC结果，图19是曲线图，显示了使用抗一ABA抗体，对HPLC的ABA级分的 ELISA结果，图20是曲线图，显示了使用ABA抗体(Agdia)用ELISA测量野生型、 "突变的atbgl"和"拯救的atbgl"种子中ABA水平的结果，图21是蛋白质印迹分析的照片，显示了"拯救的atbgl"中AtBGl :HA 水平，通过使用抗一HA抗体证实，
图22是曲线图，显示了野生型、"突变的atbgl"和"拯救的atbgl"的萌发测定的结果，图23—图26是照片，显示了 AtBGl的细胞内位置，图23是示意图，显示了 GEP标记的JMW基因的结构，图24是一组荧光显微照片，通过使用Bip:RFP作为ER标记和GFP作为胞质溶胶可溶蛋白显示了 ER，图25是一组荧光显微照片，显示了 AtBGl:HA和BiP:REP的细胞内位置，图26是照片，显示了从用AtBGl:HA转化但是不用衣霉素处理的原 生质体得到的蛋白质提取物用内切酶H和PNGase F处理，制备试样，并 从用AtBGl:HA转化并用衣霉素处理的原生质体得到的蛋白质提取物通过 印迹分析，图27和图31是曲线图和照片，表明微粒体中AtBGl的ABA-GE水解活性在脱水调节下通过AtBGl的快速多聚化增强，图27是曲线图，显示了从用脱水处理或不处理的"拯救的atbgl"得到的微粒体级分的ABA-GE水解活性，图28是一组照片，显示了在脱水胁迫下AtBGl多聚化， 图29是曲线图，显示了高分子AtBGl的ABA-GE水解活性， 图30和图31是照片和曲线图，显示了高分子AtBGl的形成， 图32 —图34是照片和曲线图，显示了与ABA的水平成比例，AtBGl多聚化形成高分子量形式，图32是曲线图，显示了在"拯救的atbgl"中ABA水平的昼夜变化， 图33是一组照片，显示了从"拯救的atbgl"得到的蛋白质提取物中AtBGl的一天检测的结果，图34是曲线图，显示了定量高分子量形式的AtBGl的结果， 图35是照片，显示了使用抗一T7抗体，接着使用抗一HA抗体通过蛋白质印迹对来自具有PEG8000的渗透胁迫的转基因植物的原生质体得到的蛋白质提取物的免疫沉淀结果，图36 — 38是照片和曲线图，显示了涉及从头ABA生物合成途径的基因表达，
图36是一组照片，显示了使用涉及从头生物合成的基因和AtBGl 的引物的半定量RT-PCR的结果图37和图38是曲线图，显示了依赖时间的水平。发明方式如下面的实施例中所示阐明本发明的实际的当前优选的实施方案。然而，将理解本领域技术人员考虑本公开，可以在本发明的精神 和范围内做出修饰和改进。实施例1:制备转基因拟南芥 〈1-1>从cDNA文库分离AtBGl基因本发明人得到了 "扣除cDNA文库"(PihK. T. et al.，脱Ce仏 7: 567， 1997)，其含有表达通过高浓度的NaCl (渗透压胁迫之一)诱 导的基因。从该文库分离了编码一种P —葡糖苷酶同源物的拟南芥基因 」z^ 2 (图1)。用SEQ. ID. No 1代表的正向引物和SEQ. ID. No 2代表 的反向引物，通过使用DNA聚合酶(Taq聚合酶，Takara)进行PCR。 PCR 条件如下在94。C预变性5分钟，在94"变性30秒，5(TC退火1秒，72 t:聚合l分钟，从变性到聚合进行50个循环，并在72"C最终延伸10分 钟。<1-2〉构建用于植物转化的表达载体为了产生用AtBGl基因转化的拟南芥，本发明人首先将AtBGl基因 克隆到表达载体中。具体地，将具有卡那霉素抗性并含有CaMV 35S启动子的pBI121 (Pharmacia LKB Biotechnology)的GUS位点用具有SEQ. ID. No 3代表 的核苷酸序列的AtBGl基因替换，得到用于植物转化的表达载体 、BI121::AtBGl，。将 pBI121::AtBGl 载体插入农杆菌 (^ro&c^j.咖)，并将农杆菌转化体LBA4404在2004年11月18日保
藏在韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号KCTC 10729BP)。〈1-3>产生转基因拟南芥本发明人用上面实施例〈l-2〉中构建的含有AtBGl基因的表达载体 转染拟南芥。具体地，通过花浸染法进行转染(Steven J. C.和Andrew F.B. The Plant Journal, 16(6): 735-743， 1998)。为了产生转基因植物，将拟南 芥培养在MS培养基中，然后转移到土壤。花序轴抽条后，将拟南芥的幼芽切割两次以制备样品。将pBI121::AtBGl转染的农杆菌在LB培养基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl)中培养直到稳定期，并通过离心回收细胞，将细 胞重悬浮在接种培养基(5%蔗糖，0. 05% Silwet L-77 (Osi Specialties)) 中。当悬浮液的0D值达到0. 8时，将拟南芥切片底朝上浸入悬浮液中并 平缓地搅拌3 —5秒。然后，将拟南芥切片转移到塑料盘中。用塑料圆盖 覆盖拟南芥切片并保持湿润并在黑暗中培养12 — 24小时，得到转基因植是生活力2:通过多种胁迫改变转基因拟南芥 〈2-1> AtBGl基因根据多种胁迫的表达为了检査AtBGl的表达是否通过胁迫诱导，从野生型拟南芥提取总 RNA。然后，对野生型植物给予环境胁迫，然后通过RNA印迹分析测量AtBGl 基因的表达。确切地，在诸如高浓度的NaCl (150 mM)和4。C的低温的胁迫条件 下，在MS板上培养植物两周并同时取出平板的遮盖以给予脱水胁迫。使 用AtBGl， Glue (AF082157)和psr3. 1 (U72153) cDNA作为探针，通过 RNA印迹分析总RNA。使用整个cDNA文库作为模板，用SEQ. ID. No 4代 表的正向引物和SEQ. ID. No 5代表的反向引物和DNA聚合酶(Taq聚合 酶，Takara)，通过PCR得到67"c (AF082157)和(U72153)基因 的cDNA作为探针。PCR条件如下在94。C预变性5分钟，在94。C变性3014
秒，5CTC退火1秒，72'C聚合1分钟，从变性到聚合进行50个循环，并 在72。C最终延伸IO分钟。从RNA印迹分析证实通过NaCl胁迫在野生型植物中诱导AtBGl表 达，但是通过环境胁迫没有诱导Glue和psr3.1表达(Leah R. et al. ， /O e瓜，270: 15-789， 1995; Malboobi M.，和Lefebvre D. D.，尸Za肘 U. 34: 57， 1997)，表明仅仅表达了编码P葡糖苷酶同源物的AtBGl基因(图2)。 g卩，不像其他P—葡糖苷酶同源物，仅仅AtBGl基因 可以增加植物的胁迫抗性。〈2-2〉在多种胁迫下转基因拟南芥的表型本发明人检查了在多种环境胁迫下，用AtBGl基因转化的转基因拟 南芥的表型。具体地，从每种AtBGl转基因拟南芥Tl(转化体l)、 T2(转化体2) 和T3(转化体3)和用空载体pBI121转化的对照拟南芥提取物总RNA，接 着使用AtBGl cDNA作为探针进行RNA印迹分析。结果，除了用空载体转 化的对照拟南芥外，在T1、 T2和T3中观察到AtBGl基因表达(图3)。将Tl在土壤中培养10天，然后每2小时通过浓度为200 mM的NaCl 溶液处理土壤4天，产生高浓度的NaCl胁迫条件。然后将T1转移到新鲜 的新MS板。移植后7天测量根生长(n=50)。通过高浓度的NaCl使空载体pB工121转化的拟南芥枯萎，而用AtBGl 转化的Tl在高浓度NaCl下显示出正常生长(图4)。没有用AtBGl转化的野生型中根生长速率随着NaCl的浓度升高而 减小，但是用AtBGl转化的Tl、 T2和T3的根生长速率在高达100mMNaCl 浓度下增加(图5)。为了进一步检查表达模式，将」MW上游区放置在P葡糖苷酶(GUS) 编码区前面。具体地，将pBI121载体的35S:GUS区的35S启动子用限制 酶切割并用通过PCR得到的AtBGl的启动子区替换。用SEQ. ID. No 9和 No 10代表的引物和DNA聚合酶(Taq聚合酶，Takam)通过使用染色体 DNA作为模板进行PCR。 PCR条件如下在94。C预变性5分钟，在94。C变 性30秒，5(TC退火30秒，72'C聚合1分钟，从变性到聚合进行50个循
环，并在72。C最终延伸IO分钟。结果得到AtBGl上游启动子，将其插入 载体中。即，AtBGl基因的启动子区用GUS标记并且通过与如上面实施例 中描述的相同方式插入到植物中。通过使用X-葡糖苷酸(Rose Scientific Ltd)根据以前的文章(Hwang I,和Sheen J. Nature. 413(6854) :383-9， 2001)描述的常规方法测量GUS活性。转基因植物中的GUS表达非常低并 且对于莲座叶丛和茎生叶的排水器高度特异(图6)。同时，将培养两周 的转基因植物置于脱水条件2周，然后通过使用X-葡糖苷酸测量GUS活 性。在莲座叶丛和茎生叶的排水器和维管系统中强烈诱导AtBGl启动子驱 动的GUS表达，提示AtBGl参与干旱应答(图6)。实施例3:"突变的atbgl"的表型 〈3-1〉"突变的atbgl"的表型为了检查AtBGl的生物功能，本发明人观察了在多种环境胁迫下， 具有AtBGl基因的T-DNA插入的"突变的atbgl"的表型。具体地，在SALK研究所，USA构建的具有T-DNA插入的突变株中， 分离了在AtBGl基因的第9位内含子中具有T-函A插入的突变株(图7A) 并证实其中的T-面A插入。用SEQ. ID. No 6代表的左边引物和SEQ. ID. No 7代表的正向引物和SEQ. ID. No 8代表的反向引物，通过使用DNA 聚合酶(Taq聚合酶，Takara)进行PCR。 PCR条件如下在94匸预变性5 分钟，在94。C变性30秒，5(TC退火1秒，72t聚合l分钟，从变性到聚 合进行50个循环，并在72i:最终延伸10分钟。结果，得到410 bp PCR 产物并证实了 T-DNA插入(图7B)。使用SEQ. ID. No 25代表的AtBGl特异性正向引物和SEQ. ID. No 26代表的反向引物，通过RT-PCR研究"突变的atbgl"的总RNA。如图8 中所示，证实不存在AtBGl mRNA。在萌发后l周(1W)、 2周(2W)(图9)和4周(4W)(图IO)观察 了野生型和具有T-DNA插入的"突变的atbgl"。结果，突变植物显示出 黄叶和矮株高表型。对培养1周的"突变的atbgl"应用外源ABA，接着继续培养3天。 随着ABA水平的升高，黄叶变成正常的绿色(图12)。
〈3-2〉"突变的atbgl"的气孔大小的测量为了以另一种方法测量AtBGl的生物功能，本发明人测量了 "突变 的atbgl"的气孔大小。具体地，将转基因植物培养在2(TC与70%相对湿度和16/8小时光 /暗循环下并在中午和午夜测量气孔大小(n=150)(图13)。在野生型植 物中，气孔在白天打开并在夜晚关闭，但是在"突变的atbgl"中，气孔 关闭不在夜晚发生。为了研究外源ABA对气孔关闭的影响，将"突变的atbgl"植物用 10 uM禾P50 P M ABA在23时处理并在24时测量气孔大小(图14)。对 照组在气孔闭合的时间内，即从4点开始的IO小时内用100pl NAME(L-硝基精氨酸甲酯)处理，已知NAME为NO合酶抑制剂，并在午夜测量气孔 大小。用NAME处理野生型导致气孔闭合的缺陷，用ABA处理"突变的 atbgl"诱导夜间气孔闭合，提示ABA参与夜间气孔闭合的调节(n二200， 条线标准误)。通过加入外源ABA使"突变的atbgl"恢复了野生型表型的这一结 果表明AtBGl基因中的突变抑制了 AtBGl基因的表达，显示出ABA-介导 的应答中的缺陷。<3-3〉在脱水条件下"突变的atbgl"的表型为了研究AtBGl的生物功能，本发明人观察到在脱水条件下"突变 的atbgl"的失水和枯萎。为了比较失水，将叶子在2(TC与10%相对湿度(干燥条件)下保 持3小时，然后测量叶子的重量(称量了20片莲座叶在花芽形成前短 茎上附着的叶子)。结果，"突变的atbgl"显示出比野生型高1.5倍的失 水(图15)。将野生型和"突变的atbgl"移植在温室的土壤中并在2(TC和70 %相对湿度不提供水的条件下分别培养14天(14d)和21天(21d)。野生
型的叶子颜色改变成浅黑色，并且"突变的atbgl"的叶子遭受严重的脱 水并且它们的多数枯萎(图6)。从而，"突变的atbgl"与野生型相比显示出对环境胁迫的抗性。<3-4〉通过互补证实为了证实"突变的atbgl"的表型是否规因于AtBGl的突变，用AtBGl 基因转化"突变的atbgl"以过表达AtBGl基因，然后通过与实施例2中描述的相同的方式进行实验。将病毒HA(红细胞凝集素)标记的野生型AtBGl cDNA (AtBGl::HA) 插入植物中以诱导AtBGl表达，导致转化体中突变诱导的AtBGl缺失的互 补，将该转化体称作"拯救的atbgl"。使用抗一HA抗体，通过蛋白质印迹分析检查"拯救的atbgl"的蛋 白质提取物。如图ll中所示，证实了 AtBGl蛋白质表达。通过与实施例3中描述的相同的方式检查"拯救的atbgl"。结果， 萌发后l周(lw)、 2周(2w)(图9)和4周(图IO观察到与野生型一样， "拯救的atbgl"的叶子很绿和高表型，并且还拯救了缺陷的气孔闭合， 这意味着气孔在白天打开在夜晚闭合(图13)。在脱水条件下，"拯救的 atbgl"中的失水量小于野生型中的失水量(图15)。在脱水条件下培养 21天后，转化体显示出正常生长，没有变成浅黑色叶子(图16)。从结果可以证实"突变的atbgl"的表型规因于AtBGl基因的突变。实施例4: AtBGl对ABA-GE水解〈4-1〉通过ELISA定量HPLC的ABA级分本发明人检查了 AtBGl蛋白质是否可以通过ABA糖基转移酶水解 ABA-GE(Xu Z. J. et al.，尸h/7t129: 1285， 2002)。具体地，用AtBGl:HA、 AtBGl [E207Q] :HA、 AtBGl [AC105] :HA和作 为对照的空白载体转化拟南芥，并在转化后24小时得到蛋白质提取物。 AtBGl[E207Q] :HA含有207位核苷酸的替代突变，207位核苷酸是P _糖 苷酶的活性位点(G. Davies禾B B. Henrissat， 5Yr"c"re 3: 853，1995; Marana S. R. et al.，肠c/ j'瓜肠p/ /s.爿cZia， 1545: 41， 2001)。 AtBGl[AC105]含有缺失突变，其在C-末端缺少105个氨基酸残基。用抗一HA抗体免疫纯化表达的蛋白质(图17)，并将免疫纯化的蛋 白质与ABA-GE (APEX ORGANICS LTD.)在体外在100 mM拧檬酸盐缓冲液 (pH 5.5) 37。C下温育1.5小时。通过装配特定溶剂(40%甲醇，0.1 M 乙酸，10mg/l苯甲醇丁酸酯)包装柱(RT 250-4柱，MERCK)的HPLC分离 反应物。结果，AtBGl :HA和AtBGl [E207Q] :HA在ABA位置显示出新的峰(图18) 。使用抗ABA抗体(不能识别ABA-GE)通过ELISA定量ABA峰。AtBGl [E207Q]:HA释放的ABA的量显著减少到野生型的20% (图19) ，表明207位的谷氨酸对于水解活性是重要的，与其他e—葡糖苷酶 类似(Davies G.禾口 Henrissat B. ， 5"加ct, 3: 853， 1995; Ma腦a S. R. etal.，扁c力j'瓜Az.o*s.爿"a 1545: 41， 2001)。然而，AtBGl [△ C105]:HA和载体对照都没有显示出从ABA-GE产生的ABA的可检测的水平， 与ABA产生在"突变的atbgl"中减少或者受到抑制的其他结果相一致。 这些结果一起表明AtBGl :HA水解ABA-GE形成ABA。〈4-2〉种子中ABA水平的研究种子比植物的任何其他部分含有更多的ABA。为了验证上面的结果， 本发明人测量了野生型、"突变的atbgl"和"拯救的atbgl"的种子中 ABA水平。使用80%乙醇从通过液氮磨碎的种子提取化合物，通过装备C18 柱(J. T. Baker)的HPLC得到ABA峰。使用抗一ABA抗体(Agdia)通过ELISA 测量ABA级分。"突变的atbgl"种子中ABA含量为野生型的约40% (图20)。在 "拯救的atbgl"植物种子中，ABA含量为野生型的86。/。到250X。即，"突 变的atbgl"种子中ABA含量与野生型中相比非常低，但是"拯救的atbgl" 种子中ABA含量与野生型中的含量相似或者加倍。还使用抗一HA抗体定 量"拯救的atbgl"种子中AtBGl :HA含量(图21)，得到与通过HPLC定量的相似的ABA水平(图20)。因此，证实ABA含量与AtBGl蛋白质水平 密切相关。<4-3〉萌发研究本发明人检查了种子中ABA含量是否与萌发有关。确切地，在野生 型、"突变的atbgl"和"拯救的atbgl"中进行萌发测定。结果，与野生 型相比，萌发在"拯救的atbgl"中延迟，而"突变的atbgl"更早萌发 (图22)。结果表明"atbgl突变体"比野生型含有更低水平的ABA，不 再含有atbgl突变基因的AtBGl蛋白质不水解ABA-GE形成ABA，即使含 有少量ABA。实施例5:使用荧光显微镜证实细胞AtBGl的位置 <5-1〉在荧光显微镜上观察GFP-标记的AtBGl一种惰性脱落酸ABA-GE定位于ER。 AtBGl水解ABA-GE形成ABA并 且含有REEL的序列继续，其在C-末端类似于ER保留序列KDEL(Davies G. 和B. Henrissat， 5^2T/cz^re 3: 853， 1995)。基于此，本发明人在荧光 显微镜下观察了 AtBGl以证实AtBGl像ABA-GE —样也定位于ER。具体地，将拟南芥用GFP:AtBGl和BiP:RFP转化，GFP:AtBGl是其 中前导序列的下游用绿色荧光蛋白(GFP)标记的重组AtBGl基因，BiP:RFP 是其中ER伴侣蛋白结合蛋白BiP (免疫球蛋白结合蛋白)用红色荧光蛋 白(REP)标记的重组BiP，然后在荧光显微镜下观察(图24)。GFP:AtBGl显示出多种网络模式(小图c)，暗示ER结构，而GFP 仅显示出扩散的模式(图23，小图a)。 GFP:AtBGl模式与BiP:REP (小图 d)、 ER伴侣蛋白结合蛋白(小图e)的紧密重叠(Jin J. B. ， eta丄，/^s"t13: 1511， 2001)。结果表明AtBGl与Bip—起定位于ER。使用抗一HA抗体通过免疫组织化学检査AtBGl :HA以证实AtBGl定 位于ER。结果，AtBGl:HA显示出与BiP:RFP的紧密重叠的特征性ER特异 性网络模式(图24)。<5-2〉 AtBGl糖基化为了证实上面的结果AtBGl定位于ER，本发明人检査了 AtBGl糖 基化。蛋白质的糖基化产生聚糖并且定位于ER的蛋白质的该聚糖部分对 于内切H和PNGase F都是敏感的，意味着糖基部分可以容易地被内切H 和PNGaseF酶活性消化(KuznetsovG. et al. ， / O e瓜268: 2001，1993)。衣霉素是糖基化的抑制剂。使用抗HA抗体，通过印迹检查了从用内切H和PNGaseF处理(没 有用衣霉素处理)的AtBGl:HA转染的植物的原生质体得到的蛋白质提取 物、从衣霉素处理的用AtBGl转化的拟南芥的原生质体得到的蛋白质提取 物和用AtBGl转化的没有用衣霉素处理的拟南芥的原生质体得到的蛋白 质提取物。从衣霉素处理的原生质体得到的AtBGl:HA的大小小于用没有用衣 霉素处理的原生质体得到的AtBGl:HA的大小，表明通过衣霉素不发生糖 基化，从而不产生聚糖。其中用内切H和PNGase F消化的聚糖部分的 AtBGl:HA与衣霉素处理的AtBGl:HA具有相同大小，其支持上面的说明。 即，AtBGl:HA的聚糖部分对内切H和PNGase F非常敏感并且对此类酶的 消化非常敏感，导致与衣霉素处理的AtBGl具有相同大小(图25)。结果 表明AtBGl定位于ER。实施例6:通过脱水胁迫诱导的多聚化对AtBGl的ABA-GE水解活性为了确定受到脱水的"拯救的atbgl"植物中ABA含量的实质增加 的原因，本发明人比较了在30。^相对湿度的条件下脱水10小时的"拯救 的atbgl"植物与在正常条件下生长的"拯救的atbgl"的微粒体从ABA-GE 产生ABA的能力。将植物的微粒体在匀浆缓冲液(250mM蔗糖25mMHEPES pH 7. 0， 10 mM MgCl2， 1 mM DTT)中粉末化，然后以3， 000 rpm离心5分 钟和以14， 000离心5分钟。将分离的上清液以100， OOOg超速离心。通过 将所得的微粒体在100 mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)中反应并使用含有 ABA抗体的ELISA试剂盒(Agdia)定量ABA含量。结果，与在正常条件下 生长的对照微粒体相比，用脱水预处理的"拯救的atbgl"植物的微粒体 显示出ABA产生的显著增加(图27)。
本发明人还研究了脱水胁迫激活AtBGl的机理。以前的研究表明P一葡糖苷酶的聚合形式比二聚体形式具有更高的酶活性(Kim和Kim， 1998)。从而，本发明人研究了脱水胁迫激活AtBGl的机理是否规因于 AtBGl多聚化。根据与上述实施例中所述的相同方法，从用AtBGl、 AtBGl :HA和AtBGl :T7的两种不同标记的形式共转化的原生质体制备蛋白 质提取物，并用于用抗一T7抗体共免疫沉淀。使用抗一HA抗体通过蛋白 质印迹分析免疫沉淀物以研究AtBGl分子之间的相互作用。结果，在用 T7抗体免疫沉淀的沉淀物中检测到HA标记的AtBGl (图35)。此外，当 用10% PEG 8000 (—种诱导脱水胁迫的化学品)处理原生质体12小时时， 沉淀物中HA标记的AtBGl的量增加大约3倍(通过密度计量软件测量， 图35)。因此，本发明人断定AtBGl经历同数相互作用，其在脱水胁迫条 件下被增强。为了进一步解决该可能性，在脱水胁迫存在和不存在下，在匀浆缓 冲液(50mM磷酸钠，pH7.0， 0. 15MNaCl， 0. 02%關3， 0. 1% Triton X-100) 中破碎"拯救的atbgl"植物的叶子，然后以14,000 g离心5分钟。从 上清液得到蛋白质提取物。将蛋白质提取物装载到S印hacryl S-300高分 辨柱(Amersham)上并通过使用洗脱缓冲液(50 mM磷酸钠，pH 7.0， 0.15 M NaCl， 0. 02% NaN3)以0. 5 ml/min每3. 0 ml级分体积的流速得到蛋白 质级分。使用抗一HA抗体通过蛋白质印迹分析级分。结果，没有受到脱水胁迫的来自"拯救的atbgl"的AtBHl:HA主要 作为单体存在，存在少数的高分子量形式(图30)。相比，进行脱水胁迫 的来自"拯救的atbgl"的AtBHl:HA以更高的分子量形式存在，几乎没 有二聚体或者单体(图28)。脱水处理的植物中AtBGl的主要峰的分子量 对应于600 kDA以上，其等同于AtBGl 10聚体。结果表明脱水胁迫诱导 了 AtBGl的多聚化。比较了 AtBGl的高和低分子量形式的酶活性。使用与上面实施例中 使用的相同的柱子从凝胶过滤得到的高和低分子量级分用抗HA抗体免疫 沉淀，然后通过ELISA定量ABA含量。高分子量形式显示出4倍更高的 AtBGl活性(图29)，其与如下发现一致来自脱水胁迫的植物的微粒体 具有增强的ABA-GE水解活性(图27)。 接着，发明人测量了脱水胁迫时AtBGl装配成更高分子形式的速率。在脱水胁迫时30分钟、1小时和3小时的不同时间点从进行脱水的"拯 救的atbgl"植物制备蛋白质提取物，并通过凝胶过滤层析分级分离，使 用抗一HA抗体通过蛋白质印迹检查。结果，脱水后30分钟出现了更高分子量形式并且其随着时间逐渐 增加(图30和31)。在脱水胁迫后10小时，观察到80%的更高分子量 AtBGl (图30和图31)。从而，当脱水胁迫时，AtBGl向更高分子量形式 的装配是快速和广泛的。实施例7: AtBGl向更高分子量形式的多聚化模式在正常生长条件下l天内，植物中的水状态不断改变。在明亮阳光 下，蒸腾速度在中午达到最高水平，其周期性降低水势或导致中午时的暂 时水不足。因此，本发明人假设叶子中的ABA水平经历昼夜波动。具体地， 当阳光更明亮时的中午观察到更高的细胞ABA水平，在夜晚具有较低的 ABA水平。为了证实该理论，本发明人每6小时测量了在正常条件下生长的野 生型和"拯救的atbgl"植物的叶子中的ABA水平。具体地，切割叶子的 上面部分并浸入80X甲醇中并通过研钵破碎，并在4'C下进行提取3小时， 然后分离的上清液穿过C-18柱(BMS)，然后冷冻干燥。将所得物质溶解 在TBS缓冲液(Agdia)中并通过ELISA测量ABA水平。结果，叶子的ABA 水平在给定的一天内显示出昼夜波动，在"拯救的atbgl"植物中在8:00 AM和2:00PM分别具有最低和最高的浓度(图32)。野生型植物显示出类 似的ABA模式，但是具有稍低的水平。为了研究ABA的昼夜波动中该增加的原因，本发明人在一天内不同 时间点测量了野生型植物中AtBGl转录物以及AtABAl、AtABA2和AtNCED3 转录物的水平，它们对于从头ABA生物合成是关键的(图36)。用10 mg 总RNA和10 ng每种引物(总反应体积为100 ml, RT反应混合物5ml) 如下进行RT-PCR: 94X:30秒，5CTC30秒和72°C30秒，根据基因水平确 定的循环数为15到35。 SEQ. ID. No 11和No 12 (AtBGl) ， No 13和No 14 (ABAl)， No 15和No 16 (ABA2)， No 17和No 18 (NCED3)' No 19和 No 20 (阳性对照CCA1), No 21和No 22 (阳性对照T0C1)，和No 23禾口 No 24 (阴性对照肌动蛋白)代表的基因特异性引物用于RT-PCR。从RT-PCR证实在使用的正常生长条件下，给定的一天内，AtBGl 和AtABA2mRNA水平保持恒定(图36—图38)，表明在这些条件下，植物 不经历脱水胁迫。而且，更高的ABA含量不是由于AtBGl的增强的表达。 AtABAl转录物的水平发生波动，在下午2:00增加约1. 7倍(图36和图 37)。此外，AtNCED3 mRNA表达在下午8:00增加1.8倍，并且保持升高 直到上午2:00，但是在上午8:00恢复到基底水平。上面的结果表明AtABAl 和AtNCED3mRNA水平都显示出昼夜波动。然而，这些mRNA水平的振荡模 式不与ABA水平的重叠。此外，mRNA水平的波动程度小于2倍。如上述，涉及从头生物合成的基因的表达模式与ABA的不同，其表 明ABA的从头合成不可能对中午时ABA水平的升高有贡献。检査了 CCA1和T0C1转录物浓度作为生理节律的阳性对照，肌动蛋 白作为生理节律的阴性对照(Wang和Tobin， 1998; Strayer et al., 2000) (图36和38)。本发明人接着检查了 AtBGl是通过AtBGl的多聚化介导的激动促进 ABA水平的昼夜波动。在不同时间点从正常条件下生长的"拯救的atbgl"植物得到的总 蛋白质提取物用凝胶过滤柱分级分离，并使用抗一HA抗体通过蛋白质印 迹分析。结果，较高分子量的AtBGl显示出昼夜波动(图33和34)。水 平在下午2:00达到峰值，接着快速下降，在上午8:00最低。在下午2:00， 约半数总AtBGl以更高的分子量形式存在，而在上午8:00，观察到少于 10X的高分子量AtBGl。高分子量AtBGl的浓度与日间叶组织中ABA含量 的增加显著相关，强烈表明AtBGl的多聚化介导的激活造成昼夜波动期间 ABA水平的升高。工业实用性如前文解释的，含有本发明的AtBGl基因的转基因植物可以极大地 促进农业产量的提高，因为在转基因植物中表达的AtBGl蛋白质激活脱落 酸(ABA)并从而增加对多种环境胁迫的抗性。
序列表文件SEQ. ID. No l和No 2时用于从扣除cDNA文库分离一种拟南芥基 因JMW的引物序列，SEQ. ID. No 3是AtBGl基因的核苷酸序列，SEQ. ID. No4和No5是用于从完整cDNA文库得到67wc (AF082157) 和psi^.7 (U72153)的引物序列，SEQ. ID. No 6、 No 7和No 8是用于证实AtBGl基因中T-DNA插入 的引物序列，SEQ. ID. No 9和No 10是用于得到AtBGl上游1. 7 kb区的引物序列，SEQ. ID. No ll和No 12是AtBGl特异性引物序列，SEQ. ID. No 13和No 14是ABA1特异性引物序列，SEQ. ID. No 15和No 16是ABA2特异性引物序列，SEQ. ID, No 17和No 18是NCED3特异性引物序列，SEQ. ID. No 19和No 20是阳性对照CCA1特异性引物序列，SEQ. ID. No 21和No 22是阳性对照T0C1特异性引物序列，SEQ. ID. No 23和No 24是阴性对照肌动蛋白的特异性引物序列，SEQ. ID. No 25和No 26是AtBGl特异的引物序列。本领域技术人员将理解前面描述中公开的概念和具体实施方案可 以容易地用作修饰或设计用于执行本发明的相同目的的其他实施方案的 基础。本领域技术人员将还理解此类等同实施方案不背离所附权利要求 书中给出的本发明的精神和范围。
权利要求
1.用于增强植物对环境胁迫抗性的组合物，其含有编码衍生自拟南芥的β-葡糖苷酶1(AtBG1)或者其变体的基因。
2. 如权利要求1所述的用于增强植物对环境胁迫抗性的组合物，其中所 述基因具有SEQ. ID. No3代表的核苷酸序列。
3. 如权利要求1所述的用于增强植物对环境胁迫抗性的组合物，其中环 境胁迫选自高温、盐损害、干旱、污染、病原体、创伤、低温、过度光 条件、臭氧、除草剂、过度暴露于紫外线和渗透压休克。
4. 如权利要求1所述的用于增强植物对环境胁迫抗性的组合物，其通过 ABA葡萄糖酯(ABA-GE)的水解增加脱落酸(ABA)含量而提供对植物的胁 迫抗性。
5. 如权利要求1所述的用于增强植物对环境胁迫抗性的组合物，其中所 述基因插入到载体中。
6. 如权利要求1所述的用于增强植物对环境胁迫抗性的组合物，其中所 述载体是pBIG:AtBGl:HA (保藏号KCTC 10729BP)。
7. 用权利要求5的载体转化的植物细胞。
8. 含有权利要求7的植物细胞的转基因植物。
9. 权利要求8的转基因植物的后代或者克隆。
10. 权利要求8的转基因植物的种子、果实、穗、块茎、块状根、树、愈 伤组织或原生质体。
11. 产生对环境胁迫具有抗性的植物的方法，其包括以下步骤i) 向植物细胞中插入权利要求1的基因或者含有该基因的载体；禾口i i)通过组织培养再分化该植物细胞。
12. 给植物提供胁迫抗性的方法，其包括增加衍生自拟南芥的P —葡糖苷酶1"MW)基因的表达。
13. 如权利要求12所述的给植物提供胁迫抗性的方法，其通过ABA葡萄 糖酯(ABA-GE)的水解增加脱落酸(ABA)含量而提供对植物的胁迫抗性。
14. 如权利要求13所述的提供对植物的胁迫抗性的方法，其中通过AtBGl 多聚化催化ABA-GE的水解。
全文摘要
本发明涉及AtBG1(拟南芥β-葡糖苷酶1)基因的用途和具有AtBG1基因插入的转基因植物，更精确地，AtBG1基因通过增加一种植物激素脱落酸(ABA)的水平用于产生对多种环境胁迫具有抗性的转基因植物的用途，和具有AtBG1基因插入的具有胁迫抗性的转基因植物。由于升高水平的ABA，植物对包括低温、盐损害和脱水的多种环境胁迫具有增强的抗性。从而，增加ABA水平的方法可以极大地促进农业产量的提高。
文档编号C12N15/29GK101133159SQ200580046713
公开日2008年2月27日 申请日期2005年12月22日 优先权日2004年12月22日
发明者李光熙, 黄仁焕 申请人:学校法人浦项工科大学校;Fnp株式会社