专利名称：与AtbHLH29协同调控植物铁元素吸收的基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及二个与AtbHLH29共同作用协同调控植物铁元素吸收和代谢的基因及其编码蛋白与其在调控植物对铁元素吸收和代谢中的应用。
背景技术：
铁元素作为很多重要酶和蛋白质的组成成分参与生命活动中最基本的生化过程，如呼吸和光合作用等。婴儿缺铁会导致贫血病，严重影响婴儿的智力和体能发育。通过生物学方法提高农产品中的铁含量和铁的生物有效性，是改善人类铁营养的最经济、有效和持久的方法。在农业生产中，铁也是限制农作物生长发育的主要因子之一。土壤中铁的总含量一般很高，但绝大多数铁都以三价氧化铁的形式存在，在中性和碱性土壤中，三价铁的可溶性极低，不能被植物吸收和利用。在长期进化过程中，植物为了满足其生长发育的需要，进化出两条活化和吸收铁的高效途径，分别称为strategy I和strategy II(Ion uptake mechanisms of individual cells and rootsin Mineral nutrition of higher plants，ed by Marschner(second edition)，Academic Press，New York，1995，6-78)。禾本科植物属于strategy II植物，除禾本科以外的植物都属于strategy I植物。克隆出调控植物对铁元素吸收和代谢的关键基因将为用生物技术方法提高植物中的铁含量开辟一条新的途径。
AtbHLH29(GenBank号NM_102582/NP_174138)是本发明的发明人先前从拟南芥基因组中鉴定出的番茄FER基因的同源基因，参与调控植物铁元素吸收和代谢。FER和AtbHLH29基因的缺失，突变体植株不能启动整个缺铁胁迫的生理适应性反应和有效地从土壤中获取铁元素，表现出黄化、致死(The tomato FER gene encoding a bHLHprotein controls iron-uptake responses in roots by Ling H-Q，Bauer P，BereczkyZ，Keller B and Ganal M，Proc Natl Acad Sci USA 99，13938-43，2002；The essentialbasic helix-loop-helix protein FIT1 is required for the iron deficiencyresponse by Colangelo PE and Guerinot ML，Plant Cell 16，3400-3412，2004)。通过农杆菌介导的方法将拟南芥AtbHLH29基因转化到番茄FER基因的缺失突变体T3238fer，能恢复FER的缺失功能，在低铁胁迫时转基因植株启动整个缺铁生理适应性反应和与铁吸收相关的基因的表达，从而转基因植株叶片中的铁含量恢复到了正常水平(AtbHLH29 of Arabidopsis thaliana is a functional ortholog of tomato FERinvolved in controlling iron acquisition in strategy I plants by Yuan YX，ZhangJ，Wang DW and Ling H-Q，Cell Research 15，613-621，2005)。
发明内容
本发明的目的是提供二个与AtbHLH29共同作用协同调控植物铁元素吸收和代谢的基因。
本发明所提供的与AtbHLH29协同调控植物铁元素吸收和代谢的基因，名称为AtbHLH38和AtbHLH39，来源于拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)，其cDNA是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №4分别为AtbHLH38和AtbHLH39基因的编码序列；2)编码序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №6的DNA序列；3)与序列表中序列1或SEQ ID №4限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且在调控植物铁元素吸收和代谢中起重要作用的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由762个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-762位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第202-369位碱基编码bHLH保守结构域，将具有SEQ ID №1 cDNA序列的该基因命名为AtbHLH38；序列表中的SEQ ID №4由777个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-777位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №6的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第217-384位碱基编码bHLH保守结构域，将具有SEQ ID №4 cDNA序列的该基因命名为AtbHLH39。
其基因组序列，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2和SEQ ID №5分别为AtbHLH38和AtbHLH39的基因组序列；2)与序列表中序列2或SEQ ID №5限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且在调控植物铁元素吸收和代谢中起重要作用的核苷酸序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2或SEQ ID №5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由985个碱基组成，自5′端第1-312位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第313-441位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端第442-891位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第1-3位碱基为该基因组基因的起始密码子ATG，自5′端第889-891位碱基为该基因组基因的终止密码子TAG，自5’端第202-498位碱基编码bHLH保守结构域；序列表中的SEQ ID№5由949个碱基组成，自5′端第1-327位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第328-433位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端第434-883位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第1-3位碱基为该基因组基因的起始密码子ATG，自5′端第881-883位碱基为该基因组基因的终止密码子TGA，自5’端第217-490位碱基编码bHLH保守结构域。
本发明与AtbHLH29协同调控植物铁元素吸收和代谢基因编码的蛋白(AtbHLH38和AtbHLH39)，具有下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID №3和SEQ ID №6分别为AtbHLH38和AtbHLH39蛋白的氨基酸残基序列；2)将序列表中SEQ ID №3或SEQ ID №6的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与AtbHLH29共同作用调控植物铁元素吸收和代谢功能的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №3为AtbHLH38的氨基酸序列，由253个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第68-123位氨基酸残基为bHLH保守结构域；序列表中的SEQ ID №6为AtbHLH39的氨基酸序列，由258个氨基酸残基组成，自氨基端第73-128位氨基酸残基为bHLH保守结构域。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增AtbHLH38/AtbHLH39中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种调控植物对铁元素吸收和代谢的方法。
本发明所提供的调控植物对铁元素吸收和代谢的方法，是将AtbHLH29和所述与AtbHLH29协同调控植物对铁元素吸收和代谢的基因AtbHLH38/AtbHLH39导入植物组织或细胞，植物对铁元素的吸收和代谢获得调控。
所述AtbHLH29和AtbHLH38/AtbHLH39可通过分别含有AtbHLH29、AtbHLH38/AtbHLH39，或含有AtbHLH29和AtbHLH38/AtbHLH39的植物表达载体导入外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBinplus(VAN ENGELEN，F.A.，et al.，1995 pBINPLUSan improved plant transformat ion vector based on pBIN19.Transg.Res.4288-290)、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。
使用AtbHLH29和AtbHLH38/AtbHLH39构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)和水稻肌动蛋白基因启动子(Actin)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
以pBI121为出发载体，构建的含有AtbHLH38的植物表达载体为pBI-38，含有AtbHLH39的植物表达载体为pBI-39；以pBinplus为出发载体，构建的含有AtbHLH29的植物表达载体为pBinplus-29。
分别携带有AtbHLH29、AtbHLH38、AtbHLH39，或携带有AtbHLH29和AtbHLH38/AtbHLH39的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
上述调控植物对铁元素吸收和代谢的方法对所有植物都适用，既适用于玉米、水稻、小麦等单子叶植物，也适用于拟南芥、烟草、棉花等双子叶植物。
本发明提供了一个与AtbHLH29共同作用协同调控植物铁元素吸收和代谢的基因AtbHLH38和AtbHLH39及其编码蛋白。转基因实验表明，AtbHLH38和AtbHLH39与AtbHLH29在蛋白水平上共同作用，可显著提高植物对Fe元素的吸收能力。该基因对提高植物的耐低铁能力和铁元素利用效率具有重要的理论及实际意义，并为农产品中铁含量的生物强化(Biofortification)和重金属污染土壤的生物修复(Phytoremediation)提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业和生物修复领域具有广阔的应用和市场前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
图1为AtbHLH38和AtbHLH39在缺铁条件下表达情况的定量PCR检测结果图2为在酵母细胞中检测AtbHLH38和AtbHLH39与AtbHLH29对三价铁还原酶基因AtFRO2和亚铁离子转运蛋白基因AtIRT1转录调控作用的GUS组织化学染色和GUS蛋白的酶活性测定结果图3为AtbHLH38，AtbHLH39和AtbHLH29的单、双过量表达植株经低铁胁迫处理后的生长情况图4为正常生长和经低铁胁迫处理后AtbHLH38和AtbHLH39的单过量表达植株以及与AtbHLH29的双过量表达植株地上部叶片铁含量的测定结果图5为单、双过量表达AtbHLH38/AtbHLH39和AtbHLH29提高三价铁还原酶基因AtFRO2和亚铁离子转运蛋白基因AtIRT1转录水平的RT-PCR检测结果图6A为pBI-38和pBI-39的部分物理图谱图6B为pBinplus-29的部分物理图谱具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由北京奥克生物技术有限责任公司完成。
实施例1、与AtbHLH29协同调控植物铁元素吸收和代谢的基因AtbHLH38和AtbHLH39的克隆根据拟南芥基因组DNA序列和预测的与AtbHLH29协同调控植物铁元素吸收和代谢的基因(分别命名为AtbHLH38和AtbHLH39)的编码序列设计两对引物(P38和P39)，引物序列如下引物对P38P38F(上游引物)5′-TCTAGAATGTGTGCATTAGTCCCTTCA-3′P38R(下游引物)5′-CCCGGGTTAAACGAGTTTTCACATTT-3′；引物对P39P39F(上游引物)5′-TCTAGAATGTGTGCATTAGTACCTCCA-3′P39R(下游引物)5′-CCCGGGATATATGAGTTTCCACATTC-3′将拟南芥幼苗置于不含铁元素的MS培养基上缺铁处理4天，然后提取经缺铁处理幼苗的总RNA，用逆转录法合成其cDNA，并以此cDNA为模板，分别在引物对P38和P39的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为先95℃2分钟；然后95℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分钟，共35个循环；最后72℃5分钟。反应结束后，对PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果在引物对P38和P39的引导下分别扩增出了770 bp和785 bp的条带，回收两个目的片断，并用DNA纯化试剂盒(Phamacia公司)对其进行纯化，然后将纯化的目的片断分别克隆入载体pGEM T-easy(Promega公司)中，将含有引物对P38扩增片断的重组载体命名为pGEM T-easy/AtbHLH38，将含有引物对P39扩增片断的重组载体命名为pGEM T-easy/AtbHLH39，然后将pGEMT-easy/AtbHLH38和pGEM T-easy/AtbHLH39分别用CaCl2法转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性单克隆，提质粒，测序，测序结果表明引物对P38扩增片断具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №1由762个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-762位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第202-369位碱基编码bHLH保守结构域，将具有SEQ ID №1 DNA序列的基因命名为AtbHLHt38；引物对P39扩增片断具有序列表中SEQ ID №4的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №4由777个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-777位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №6的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第217-384位碱基编码bHLH保守结构域，将具有SEQ ID №4 DNA序列的基因命名为AtbHLH39。
根据扩增的AtbHLH38和AtbHLH39的cDNA序列和拟南芥的基因组DNA序列获得了AtbHLH38和AtbHLH39的基因组DNA序列，AtbHLH38的基因组DNA序列具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №2由985个碱基组成，自5′端第1-312位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第313-441位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端第442-891位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第1-3位碱基为该基因组基因的起始密码子ATG，自5′端第889-891位碱基为该基因组基因的终止密码子TAG，自5’端第202-498位碱基编码bHLH保守结构域；AtbHLH39的基因组DNA序列具有序列表中SEQ ID №5的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №5由949个碱基组成，自5′端第1-327位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第328-433位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端第434-883位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第1-3位碱基为该基因组基因的起始密码子ATG，自5′端第881-883位碱基为该基因组基因的终止密码子TGA，自5’端第217-490位碱基编码bHLH保守结构域。
实施例2、定量PCR检测AtbHLH38和AtbHLH39在缺铁条件下的表达情况将拟南芥种子置于MS培养基(sigma，USA)上使其萌发(1周)，然后将幼苗分别置于不含铁(Fe)、锰(Mn)、锌(Zn)元素的MS培养基上进行缺乏不同金属营养元素的胁迫处理4天，以未经胁迫处理的植株为对照，然后分别提取经胁迫处理幼苗和对照的根部和地上部的总RNA并以此为模板，在引物15’-GACGGTACCACAGACTTATGAAGT-3’和引物25’-TAAGCTCTTTGAAACCGTTTCAGGA-3’的引导下定量PCR检测/AtbHLH38的表达情况，在引物35’-GACTTATGGAGCTGTTACAGCGGT-3’和引物45’-CTTCAAGCTTCGAGAAACCGTCGCA-3’的引导下定量PCR检测AtbHLH39的表达情况，在引物55’-GATCGAAAAAAGCAATAACGGTGGTT-3’和引物65’-GATGTGGCAACCACTTGGTTCGATA-3’的引导下定量PCR检测三价铁还原酶基因AtFRO2(GenBank号NM_100040/NP_171664)的表达情况，在引物75’-GAGTTTCCGTTCACAGGCTTTATC-3’和引物85’-TTCCACGCCAACAATCCCGT-3’的引导下定量PCR检测锌转运蛋白基因ZIP5(GenBank号NP_973762)的表达情况，检测结果如图1所示(图1中的A、B、C、D图分别为对照和不同胁迫处理情况下AtbHLH38、AtbHLH39、AtFRO2、ZIP5在根部和地上部的表达情况)，表明AtbHLH38和AtbHLH39在根部和地上部的表达均受缺铁诱导，在缺铁情况下上调表达，而不受其它金属元素(如锰和锌)的影响。
实施例3、检测AtbHLH38/AtbHLH39与AtbHLH29对三价铁还原酶基因AtFRO2和亚铁离子转运蛋白基因AtIRT1的转录调控作用一、检测AtbHLH38/AtbHLH39与AtbHLH29相互作用的酵母双杂交实验用酵母双杂交实验检测AtbHLH38/AtbHLH39与AtbHLH29是否发生相互作用。用Strategene公司的酵母双杂交检测试剂盒并按参照试剂盒说明书进行操作，分别将AtbHLH38/AtbHLH39和AtbHLH29克隆入两个酵母表达载体pBD-GAL4 Cam和pAD-GAL4-2.1，再通过热击双转化酵母菌株YRG-2。根据酵母双杂交原理，如果两个基因能发生互作，转酵母菌株能在不含Histidine的培养基上正常生长，并可检测到X-GAL酶活性，反之菌株不能正常生长，也检测不到X-GAL酶活性。在阳性克隆中检测到了报告基因lacZ表达的X-GAL活性以及HIS3表达的Histidine，阳性菌株能再不含Histidine的培养基上正常生长.表明AtbHLH38和AtbHLH39可与AtbHLH29在蛋白质水平上发生相互作用。
二、在酵母细胞中检测AtbHLH38/AtbHLH39与AtbHLH29互作对三价铁还原酶基因AtFRO2和亚铁离子转运蛋白基因AtIRT1的转录调控作用鉴于AtbHLH38/AtbHLH39编码蛋白都含有bHLH保守结构域，并且该基因受低铁诱导表达，推测AtbHLH38/AtbHLH39可能是一个转录因子，参与植物对铁元素吸收的调控，此外，酵母双杂交结果表明AtbHLH38和AtbHLH39可与AtbHLH29在蛋白质水平上发生相互作用，因此，推测AtbHLH38和AtbHLH39能分别与AtbHLH29互作形成异源二聚体，调控下游功能基因的表达，如三价铁还原酶基因AtFRO2和亚铁离子转运蛋白基因AtIRT1。用下述方法进行验证1)以pBD-GAL4 Cam和pAD-GAL4-2.1(Stategene，USA)为出发载体，构建分别含有AtbHLH38、AtbHLH39、AtbHLH29、AtbHLH38+AtbHLH29、AtbHLH39+AtbHLH29编码序列的重组酵母表达载体，上述基因在酵母表达载体中的位置为多克隆位点的EcoRI和SalI酶切位点之间，然后将上述重组酵母表达载体转化酵母细胞YRG-2(Strategene，USA)，得到分别携带有上述基因的重组酵母细胞；2)将三价铁还原酶基因AtFRO2的启动子序列(AtFRO2起始密码子ATG至上游的947bp，该启动子命名为PFRO2)和亚铁离子转运蛋白基因AtIRT1的启动子序列(AtIRT1起始密码子上游-18bp至-1598bp，命名为PIRT1)分别与报道基因GUS的DNA序列(GenBank号AAL92040)融合，启动子序列位于GUS的上游，然后将两种融合基因(PFRO2∷GUS和PIRT1∷GUS)分别克隆入酵母表达载体pBD-GAL4 Cam和pBD-GAL4-AtbHLH29 Cam(Stategene，USA)的PmacI酶切位点之间，得到分别含有上述不同融合基因的重组酵母表达载体，然后再将两种携带不同融合基因的重组酵母表达载体分别转入到步骤1)获得的携带有不同基因组合(AtbHLH38、AtbHLH39、AtbHLH29、AtbHLH38+AtbHLH29、AtbHLH39+AtbHLH29)的重组酵母细胞中；3)对步骤2)获得的重组酵母细胞进行GUS组织化学染色并测定GUS蛋白的酶活性。结果如图2所示(A、B图为酵母细胞的GUS组织化学染色结果1.pAD-WT+pBD-WT-PFRO2∷GUS；2.pAD-WT+pBD-A tbHLH29-PFRO2∷GUS；3.pAD-AtbHLH38+pBD-WT-PFRO2∷GUS；4.pAD-AtbHLH38+pBD-AtbHLH29-PFRO2∷GUS；5.pAD-AtbHLH39+pBD-WT-PFRO2∷GUS；6.pAD-AtbHLH39+pBD-AtbHLH29-PFRO2∷GUS；7.pGAL4+pBD-AtbHLH29-PFRO2∷GUS；8.pAD-AtbHLH40+pBD-WT-PFRO2∷GUS；9.pAD-WT+pBD-WT-PIRT1∷GUS；10.pAD-WT+pBD-AtbHLH29-PIRT1∷GUS；11.pAD-AtbHLH38+pBD-WT-PIRT1∷GUS；12.pAD-AtbHLH38+pBD-AtbHLH29-PIRT1∷GUS；13.pAD-AtbHLH39+pBD-WT-PIRT1∷GUS；14.pAD-AtbHLH39+pBD-AtbHLH29-PIRT1∷GUS；15.pGAL4+pBD-AtbHLH29-PIRT1∷GUS；16.pAD-AtbHLH40+pBD-WT-PIRT1∷GUS。C、D图为GUS蛋白的酶活性测定结果，*表示与其它菌株存在显著差异)，AtbHLH29，AtbHLH38和AtbHLH39单独表达，不能在酵母细胞中启动PFRO2∷GUS和PIRT1∷GUS的转录，当AtbHLH29与AtbHLH38或AtbHLH39在酵母细胞中共同表达时能启动PFRO2∷GUS和PIRT1∷GUS的表达。
实施例4、转基因拟南芥的获得及基因的功能验证实验以拟南芥为例，对本发明的基因进行功能验证实验，具体实验方法如下一、转AtbHLH38和AtbHLH39单基因拟南芥的获得用限制性内切酶Xba I和Sma I将AtbHLH38和AtbHLH39分别从实施例1构建的重组质粒pGEM T-easy/AtbHLH38和pGEM T-easy/AtbHLH39中分离出来，再将两片断分别克隆入含有35S增强型启动子的载体pBI121的Xba I和Sma I酶切位点之间得到AtbHLH38和AtbHLH39的过量表达载体，分别命名为pBI121-38和pBI121-39，部分物理图谱如图6A所示。然后将重组载体pBI121-38和pBI121-39用热激法分别导入农杆菌GV3101中，再用侵花法转化拟南芥，获得分别转有AtbHLH38和AtbHLH39的转基因植株，分别命名为AT38和AT39。
二、转AtbHLH38/AtbHLH39和AtbHLH29双基因拟南芥的获得以拟南芥总RNA经逆转录得到cDNA的为模板，在引物P9(5’-cacccatggaaggaagagtcaac-3’)和引物P10(5’-ttagtcgacctagtaaatgacttgatg-3’)的引导下，PCR扩增AtbHLH29的cDNA序列，然后将该片断克隆到pGEM T-easy载体多克隆位点的Xba I和Sac I酶切位点之间，得到中间载体，命名为pGEMT-easy/AtbHLH29，对其进行测序，测序结果表明克隆的AtbHLH29的cDNA序列正确，用限制性内切酶Xba I和SacI将AtbHLH29从重组载体pGEM T-easy/AtbHLH29中分离出来，再将其克隆入含有35S增强型启动子的农杆菌转化载体pBinplus的Nco I和Sal I酶切位点之间得到AtbHLH29转化载体，命名为pBinplus-29，其部分物理图谱如图6B所示。然后将该载体导入农杆菌菌株GV3101中，分别转化步骤一获得的AT38和AT39转基因植株，得到携带有AtbHLH29+AtbHLH38和AtbHLH29+AtbHLH39的双基因过量表达植株，分别命名为AT38/29和AT39/29。
三、AtbHLH38/AtbHLH39和AtbHLH29的单、双过量表达植株的耐低铁试验将步骤一和步骤二获得的AtbHLH38和AtbHLH39的单过量表达植株AT38和AT39以及与AtbHLH29的双过量表达植株AT38/29和AT39/29，移植到含10μM Fe-EDTA的MS培养基上在低铁条件下处理10天，以在MS培养基上生长的植株为对照，在低铁条件下各植株的生长情况如图3所示(WT为野生型对照)，结果双过量表达植株AT38/29和At39/29在低铁胁迫时，生长正常，而野生型和单过量表达植株表现出缺铁黄花症状。同时，对AtbHLH38和AtbHLH39的单过量表达植株以及与AtbHLH29的双过量表达植株地上部叶片的铁含量进行了测定，测定结果如图4所示(A图表示在正常MS培养基上生长的各植株的Fe含量，B图表示在缺铁培养基上生长的各植株的Fe含量，☆表示差异显著性α＝0.05水平，★表示差异显著性α＝0.01水平)，表明AtbHLH38+AtbHLH29和AtbHLH39+AtbHLH29双过量表达植株的叶片的铁含量显著高于野生型和AtbHLH38、AtbHLH29、AtbHLH39单过量表达植株，而单过量表达植株的铁含量与野生型没有显著差异。
四、单、双过量表达AtbHLH38/AtbHLH39和AtbHLH29提高三价铁还原酶基因AtFRO2和亚铁离子转运蛋白基因AtIRT1转录水平的验证实验将步骤一和步骤二获得的AtbHLH38和AtbHLH39的单过量表达植株AT38和AT39以及与AtbHLH29的双过量表达植株AT38/29和AT39/29的种子置于MS培养基上使其发芽，然后将1周大小的幼苗分别转移到含有100μM铁浓度的MS固体培养基和无铁培养基上生长4天，再分别提取上述转基因植株根和地上部叶的总RNA(以未转任何基因并在相同条件下处理的拟南芥植株为对照)，并以所提取的不同的总RNA为模板，用RT-PCR的方法分析AtbHLH38/AtbHLH39和AtbHLH29及其下游功能基因(三价铁还原酶基因AtFRO2和亚铁离子转运蛋白基因AtIRT1)的表达丰度，在引物P115’-GACGGTACCACAGACTTATGAAGT-3’和引物P125’-TAAGCTCTTTGAAACCGTTTCAGGA-3’的引导下，PCR扩增AtbHLH38；在引物P135’-GACTTATGGAGCTGTTACAGCGGT-3’和引物P145’-CTTCAAGCTTCGAGAAACCGTCGCA-3’的引导下，PCR扩增AtbHLH39；在引物P155’-CAGTCACAAGCGAAGAAACTCA-3’和引物P165’-CTTGTAAAGAGATGGAGCAACACC-3’的引导下，PCR扩增AtbHLH29；在引物P17；5’-GATCGAAAAAAGCAATAACGGTGGTT-3’和引物P185’-GATGTGGCAACCACTTGGTTCGATA-3’的引导下，PCR扩增三价铁还原酶基因AtFRO2(GenBank号NM_100040/NP_171664)；在引物P195’-GAATGTGGAAGCGAGTCAGCGA-3’和引物P205’-GATCCCGGAGGCGAAACACTTA-3’的引导下，PCR扩增亚铁离子转运蛋白基因AtIRT1(GenBank号NM_118089/NP_567590)；在引物P215’-GCTGTTCGTGGTGTTGAGATGC-3’和引物P225’-AGGCTCTGAGGTGAGGAAGTCT-3’的引导下，PCR扩增EF1B-a(GenBank号NM_121956)。反应结束后，将上述PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示(“+”表示在含100μM铁浓度下，“-”表示在不含铁情况下)，WT为未转任何基因并在相同条件下处理的拟南芥对照植株，AT38-18，AT39-17，AT29-3，AT38/29-2，AT39/29-12分别为不同的AtbHLH38和AtbHLH39的单过量表达株系以及与AtbHLH29的双过量表达株系，表明双过量表达植株中的三价铁还原酶基因AtFRO2和亚铁离子转运蛋白基因AtIRT1的转录水平比对照明显提高，特别是在铁充足的条件下。
序列表<160>6<210>1<211>762<212>DNA<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atgtgtgcat tagtcccttc atttttcaca aacttcggtt ggccgtcaac gaatcaatac 60gaaagctatt acggtgccgg agataaccta aataacggca catttcttga attgacggta120ccacagactt atgaagtgac tcatcatcag aatagcttgg gagtatctgt ttcgtcagaa180ggaaatgaga tagacaacaa tccggttgtg gtcaagaagc ttaatcacaa tgctagtgaa240cgtgaccgac gcaagaagat caacactttg ttctcatctc tccgttcatg tcttccagct300tctgatcaat cgaagaagct aagtattcct gaaacggttt caaagagctt aaagtacata360ccagagctgc aacagcaagt gaagaggcta atacaaaaga aggaagaaat tttggtacga420gtatcgggtc aaagagactt tgagctttac gataagcagc aaccaaaggc ggtcgcgagt480tatctctcaa cggtttctgc cactaggctt ggtgacaacg aagtgatggt ccaagtctca540tcgtccaaga ttcataactt ttcgatatca aatgtgttgg gtgggataga agaagatggg600tttgttcttg tggatgtttc atcatcaaga tctcaaggag agaggctctt ctacactttg660catcttcaag tggagaatat ggatgattac aagattaatt gcgaagaatt aagtgaaagg720atgttgtact tgtacgagaa atgtgaaaac tcgtttaact ag 762<210>2<211>985<212>DNA<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2atgtgtgcat tagtcccttc atttttcaca aacttcggtt ggccgtcaac gaatcaatac 60gaaagctatt acggtgccgg agataaccta aataacggca catttcttga attgacggta120ccacagactt atgaagtgac tcatcatcag aatagcttgg gagtatctgt ttcgtcagaa180
ggaaatgaga tagacaacaa tccggttgtg gtcaagaagc ttaatcacaa tgctagtgaa240cgtgaccgac gcaagaagat caacactttg ttctcatctc tccgttcatg tcttccagct300tctgatcaat cggtaagatc gctagtagct actctgatat gtcatctaca tctgtttcta360ataagctcgt ctatacagct atacaattct aaagaagaac accgagttaa cccttatttc420tttttcttta ctttcttgca gaagaagcta agtattcctg aaacggtttc aaagagctta480aagtacatac cagagctgca acagcaagtg aagaggctaa tacaaaagaa ggaagaaatt540ttggtacgag tatcgggtca aagagacttt gagctttacg ataagcagca accaaaggcg600gtcgcgagtt atctctcaac ggtttctgcc actaggcttg gtgacaacga agtgatggtc660caagtctcat cgtccaagat tcataacttt tcgatatcaa atgtgttggg tgggatagaa720gaagatgggt ttgttcttgt ggatgtttca tcatcaagat ctcaaggaga gaggctcttc780tacactttgc atcttcaagt ggagaatatg gatgattaca agattaattg cgaagaatta840agtgaaagga tgttgtactt gtacgagaaa tgtgaaaact cgtttaacta ggtgactaat900tcatataatg gtgtgtttat ccactagttc tcatttcttt ttagctgtgt ccttttctca960tatgaatcta acactgatct ggacc 985<210>3<211>253<212>PRT<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>3Met Cys Ala Leu Val Pro Ser Phe Phe Thr Asn Phe Gly Trp Pro Ser1 5 10 15Thr Asn Gln Tyr Glu Ser Tyr Tyr Gly Ala Gly Asp Asn Leu Asn Asn20 25 30Gly Thr Phe Leu Glu Leu Thr Val Pro Gln Thr Tyr Glu Val Thr His35 40 45His Gln Asn Ser Leu Gly Val Ser Val Ser Ser Glu Gly Asn Glu Ile50 55 60Asp Asn Asn Pro Val Val Val Lys Lys Leu Asn His Asn Ala Ser Glu65 70 75 80Arg Asp Arg Arg Lys Lys Ile Asn Thr Leu Phe Ser Ser Leu Arg Ser85 90 95Cys Leu Pro Ala Ser Asp Gln Ser Lys Lys Leu Ser Ile Pro Glu Thr100 105 110
Val Ser Lys Ser Leu Lys Tyr Ile Pro Glu Leu Gln Gln Gln Val Lys115 120 125Arg Leu Ile Gln Lys Lys Glu Glu Ile Leu Val Arg Val Ser Gly Gln130 135 140Arg Asp Phe Glu Leu Tyr Asp Lys Gln Gln Pro Lys Ala Val Ala Ser145 150 155 160Tyr Leu Ser Thr Val Ser Ala Thr Arg Leu Gly Asp Asn Glu Val Met165 170 175Val Gln Val Ser Ser Ser Lys Ile His Asn Phe Ser Ile Ser Asn Val180 185 190Leu Gly Gly Ile Glu Glu Asp Gly Phe Val Leu Val Asp Val Ser Ser195 200 205Ser Arg Ser Gln Gly Glu Arg Leu Phe Tyr Thr Leu His Leu Gln Val210 215 220Glu Asn Met Asp Asp Tyr Lys Ile Asn Cys Glu Glu Leu Ser Glu Arg225 230 235 240Met Leu Tyr Leu Tyr Glu Lys Cys Glu Asn Ser Phe Asn245 250<210>4<211>777<212>DNA<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>4atgtgtgcat tagtacctcc attgtttcca aactttgggt ggccatcaac gggagagtac 60gacagctact acctcgccgg agatatcctc aacaacggcg ggtttcttga ttttccggta120ccggaggaga cttatggagc tgttacagcg gtgactcaac atcagaatag ctttggtgtt180tctgtttcgt cggagggaaa tgaaatagac aacaatccgg tggtcgtcaa gaagcttaat240cacaatgcta gtgagcgtga ccgtcgcagg aaaattaact ctttgttctc atctctccgt300tcatgtcttc ctgcctctgg ccaatcgaag aagctaagca ttcctgcgac ggtttctcga360agcttgaagt acataccaga gctgcaagag caagtgaaga agctaataaa aaagaaggaa420
gagctcttgg tgcaaatttc aggtcaaaga aacactgaat gttacgttaa gcagccacca480aaggccgtcg cgaattatat ctcgaccgtt tctgcgacta ggcttggtga caacgaagtg540atggtccaaa tctcatcgtc caagattcat aacttttcga tatctaatgt tttaagtggg600ttagaagaag ataggtttgt tcttgtggac atgtcatctt caaggtctca aggagaaagg660cttttctaca ctttgcattt acaagtggag aagattgaaa attacaagct gaattgcgaa720gagttaagtc agaggatgtt gtacttgtat gaggaatgtg gaaactcata tatatga 777<210>5<211>949<212>DNA<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>5atgtgtgcat tagtacctcc attgtttcca aactttgggt ggccatcaac gggagagtac 60gacagctact acctcgccgg agatatcctc aacaacggcg ggtttcttga ttttccggta120ccggaggaga cttatggagc tgttacagcg gtgactcaac atcagaatag ctttggtgtt180tctgtttcgt cggagggaaa tgaaatagac aacaatccgg tggtcgtcaa gaagcttaat240cacaatgcta gtgagcgtga ccgtcgcagg aaaattaact ctttgttctc atctctccgt300tcatgtcttc ctgcctctgg ccaatcggta agaagctact ccgactcatt gattagaccc360gttatagttt atgcatctat acaatttaga agaagaatac tgcgttaaac cttttttctt420tcctttcttg cagaagaagc taagcattcc tgcgacggtt tctcgaagct tgaagtacat480accagagctg caagagcaag tgaagaagct aataaaaaag aaggaagagc tcttggtgca540aatttcaggt caaagaaaca ctgaatgtta cgttaagcag ccaccaaagg ccgtcgcgaa600ttatatctcg accgtttctg cgactaggct tggtgacaac gaagtgatgg tccaaatctc660atcgtccaag attcataact tttcgatatc taatgtttta agtgggttag aagaagatag720gtttgttctt gtggacatgt catcttcaag gtctcaagga gaaaggcttt tctacacttt780gcatttacaa gtggagaaga ttgaaaatta caagctgaat tgcgaagagt taagtcagag840gatgttgtac ttgtatgagg aatgtggaaa ctcatatata tgagaatttg gtcttgtttc900tttatagtta tgttatgtcg tcctttttct cttcgaaatc taacattct949<210>6<211>258
<212>PRT<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>6Met Cys Ala Leu Val Pro Pro Leu Phe Pro Asn Phe Gly Trp Pro Ser1 5 10 15Thr Gly Glu Tyr Asp Ser Tyr Tyr Leu Ala Gly Asp Ile Leu Asn Asn20 25 30Gly Gly Phe Leu Asp Phe Pro Val Pro Glu Glu Thr Tyr Gly Ala Val35 40 45Thr Ala Val Thr Gln His Gln Asn Ser Phe Gly Val Ser Val Ser Ser50 55 60Glu Gly Asn Glu Ile Asp Asn Asn Pro Val Val Val Lys Lys Leu Asn65 70 75 80His Asn Ala Ser Glu Arg Asp Arg Arg Arg Lys Ile Asn Ser Leu Phe85 90 95Ser Ser Leu Arg Ser Cys Leu Pro Ala Ser Gly Gln Ser Lys Lys Leu100 105 110Ser Ile Pro Ala Thr Val Ser Arg Ser Leu Lys Tyr Ile Pro Glu Leu115 120 125Gln Glu Gln Val Lys Lys Leu Ile Lys Lys Lys Glu Glu Leu Leu Val130 135 140Gln Ile Ser Gly Gln Arg Asn Thr Glu Cys Tyr Val Lys Gln Pro Pro145 150 155 160Lys Ala Val Ala Asn Tyr Ile Ser Thr Val Ser Ala Thr Arg Leu Gly165 170 175Asp Asn Glu Val Met Val Gln Ile Ser Ser Ser Lys Ile His Asn Phe180 185 190Ser Ile Ser Asn Val Leu Ser Gly Leu Glu Glu Asp Arg Phe Val Leu195 200 205Val Asp Met Ser Ser Ser Arg Ser Gln Gly Glu Arg Leu Phe Tyr Thr210 215 220
Leu His Leu Gln Val Glu Lys Ile Glu Asn Tyr Lys Leu Asn Cys Glu225 230 235 240Glu Leu Ser Gln Arg Met Leu Tyr Leu Tyr Glu Glu Cys Gly Asn Ser245 250 255Tyr Ile
权利要求
1.与AtbHLH29协同调控植物铁元素吸收和代谢基因的cDNA，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №4分别为AtbHLH38和AtbHLH39基因的编码序列；2)编码序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №6的DNA序列；3)与序列表中序列1或SEQ ID №4限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且在调控植物铁元素吸收和代谢中起重要作用的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于其cDNA具有序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №4的DNA序列。
3.与AtbHLH29协同调控植物铁元素吸收和代谢基因的基因组序列，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2和SEQ ID №5分别为AtbHLH38和AtbHLH39的基因组DNA序列；2)与序列表中序列2或SEQ ID №5限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且在调控植物铁元素吸收和代谢中起重要作用的核苷酸序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2或SEQ ID №5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.权利要求1所述基因编码的蛋白，具有下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID №3和SEQ ID №6分别为AtbHLH38和AtbHLH39蛋白的氨基酸残基序列；2)将序列表中SEQ ID №3或SEQ ID №6的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与AtbHLH29共同作用调控植物铁元素吸收和代谢功能的蛋白质。
5.根据权利要求4所述的蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №3或SEQ ID №6的氨基酸残基序列。
6.含有权利要求1或2或3所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
7.一种调控植物对铁元素吸收和代谢的方法，是将AtbHLH29和权利要求1所述的与AtbHLH29协同调控植物对铁元素吸收和代谢的基因导入植物组织或细胞，植物对铁元素的吸收和代谢获得调控。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述AtbHLH29和与AtbHLH29协同调控植物对铁元素吸收和代谢的基因通过分别含有AtbHLH29、与AtbHLH29协同调控植物对铁元素吸收和代谢的基因，或含有AtbHLH29和与AtbHLH29协同调控植物对铁元素吸收和代谢的基因的植物表达载体导入外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体为pBinplus、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301或pCAMBIA1300。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述含有与AtbHLH29协同调控植物对铁元素吸收和代谢的基因植物表达载体为pBI-38或pBI-39，含有AtbHLH29的植物表达载体为pBinplus-29。
10.根据权利要求7或8或9所述的方法，其特征在于所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
全文摘要
本发明公开了与AtbHLH29协同调控植物铁元素吸收和代谢基因及其编码蛋白与应用。其目的是提供一个与AtbHLH29协同调控植物铁元素吸收和代谢的基因及其编码蛋白与其在调控植物对铁元素吸收和代谢中的应用。该基因的cDNA是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №4的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №6的DNA序列；3)与序列表中序列1或SEQ ID №4限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且在调控植物铁元素吸收和代谢中起重要作用的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
文档编号C12N15/82GK1884538SQ20061001219
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月9日 优先权日2006年6月9日
发明者袁有喜, 凌宏清 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所