专利名称：铁线莲Clematis Multi－Blue组织培养方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养方法，具体地说是涉及铁线莲Clemati Multi-Blue组织培养方法。
背景技术：
铁线莲隶属毛茛科Ranunculaceae铁线莲属(Clematis L.)(Wang Wen-Tsai.2000，Notes on the genus Clematis(Ranunculaceae)(I).Acta PhytotaxonomicaSinica.38(4)305-336；Wang Wen-Tsai.2000，Notes on the genusClematis(Ranunculaceae)(II).Acta Phytotaxonomica Sinica.38(5)401-429；Wang Wen-Tsai.2000，Notes on the genus Clematis(Ranunculaceae)(III).ActaPhytotaxonomica Sinica.38(6)497～514；Wang Wen-Tsai.2001，Notes on thegenusClematis(Ranunculaceae)(IV).ActaPhytotaxonomicaSinica.，39(1)1-19；Wang W-T.2004.A revision of Clematis sect.Aspidanthera s.1.(Ranunculaceae).Acta.Phytotaxonomica Sinica 421-72，97-135)。是一类观赏价值高、具有多种抗逆性的藤本植物，有很高的观赏价值(Brandenburg WA.2000.Meclatis in ClematisYellow Flowering Clematis Species.Systematic Studies in Clematis I.(Ranunculaceae)，Inclusive of CultonomicAspects.WageningenWageningen Universiteit.Durzan D J，Gupta P K.1987，Somatic embryogenesis and polyembryogenesis in Douglas-fir cellsuspension cultures.Plant Sci，52229～235；Essig F B.1991.Seedlingmorphology in Clematis(Ranunculaceae)and its taxonomic implications.Sida 14377-390；Grey-Wilson C.2000.Clematis the genus.Portland，OregonTimber Press)。铁线莲属植物的现有繁殖技术如下(1)播种繁殖播种繁殖多用于原始种类。种子(瘦果)成熟后及时采收，清除残存花柱，晾干。沙藏处理，翌春再播，或直接秋播。但Clematis Multi-Blue为铁线莲属植物的一个著名栽培重瓣品种(Mary Toomey.，Everett Leeds.2001，Anillustrated Encyclopedia of Clematis，Timber Press.UK.19-22)。由于雄蕊瓣化，雌蕊较单瓣品种退化，很难得到甚至得不到健壮的种子，且用种子繁殖不能很好地保持母本的重瓣性状，故不宜用此法(Tamura M，Mizumoto Y，KubotaH.1977.Observations on seedlings of the Ranunculaceae.The Journal ofJapanese Botany 52293-304)。
(2)扦插繁殖扦插繁殖多用于栽培品种的繁殖。选择优良品种的健壮无病株(P.van deGraaf，etc.2002，Prepenetration stages in infection of Clematis by PhomaClematidina.Plant Patbology 51，331-337.P.van de Graaf，T.M.O’Nell，etc.2003，Aspects of the Biology and Control of Benzimidazole ResistantIsolates of Phoma Clematidina.cause of Leaf Spot and Wilt in Clematis.Phytopathology，151，442-450)。在春季3-5月间，植株生长旺盛进入开花期进行。但扦插的繁殖系数相对较小。且Clematis Multi-Blue为早花类型，故剪取插穗影响植株的正常开花。
(3)压条、嫁接繁殖压条繁殖选作压条的母株应是优良无病、枝条旺盛的(管开云，李志坚，李景秀等。2002，铁线莲属植物的引种栽培研究初报.云南植物研究.28(2)392-396.李志坚，管开云，李景秀等。2002，铁线莲属植物的病虫害及防治.植物保护.28(2)35-36)。在雨季来临前进行压条处理。将选好的条子中段最壮的节段弯下，用清洁的利刀划破形成层部位，平卧压于土中，填土3-4cm，经常保存植株周围与被压枝条填土的潮湿。3个月生根后，可与母株分离，独立生长。嫁接对于铁线莲杂交种，可用单节接穗以劈接法接于C.vitalba或C.viticella根砧上(王瑞江，陈忠毅.2000，国产毛茛科植物资料.云南植物研究.22(2)126-128；张美珍，方明渊，凌苹苹等。1980，中国植物志.北京科学出版社，28286-300)。节上具1-2芽，节下长5-10cm，在加温而密闭的嫁接匣里嫁接，易促进成活。但这两种方法的缺点均为繁殖系数太小，不能达到大量引种繁殖的需要。
发明内容
1.发明目的本发明的目的是针对铁线莲(Clematis Multi-Blue)现有繁殖技术较落后的问题，提供一种采用组织培养方法来提高其繁殖系数以适应引种推广的需求。
2.技术方案铁线莲(Clematis Multi-Blue)的组织培养方法、其丛生芽繁殖的步骤如下(1)取铁线莲ClematisMulti-Blue的茎尖于超净工作台上用70％-75％酒精消毒，无菌水冲洗，再用0.1％-0.15％升汞消毒，无菌水冲洗后备用；(2)初代培养将灭菌好的外植体茎尖接种入MS+BA0.3-0.8mg·L-1+NAA0.01-0.05mg·L-1，25-35天后进行继代培养；
(3)继代培养将初代培养的外植体转接到1/2MS+TDZ0.3-1.0mg·L-1+NAA0.01-0.05mg·L-1培养基上进行继代培养，培养25-40天；(4)生根培养剪取2.5cm-3.5cm长的丛生芽接入到生根培养基中1/2MS+NAA0.1-0.5mg·L-1，暗培养7-10天后进行光下培养，光照强度为1500-3000lx，2周后生根；铁线莲Clematis Multi-Blue组织培养方法其胚状体繁殖的步骤如下(1)取铁线莲Clematis Multi-Blue的茎尖于超净工作台上用70％-75％酒精消毒，无菌水冲洗，再用0.1％-0.15％升汞消毒，无菌水冲洗后备用；(2)初代培养将灭菌好的外植体茎尖接种入MS+BA0.3-0.8mg·L-1+NAA0.01-0.05mg·L-1，25-35天后进行继代培养；(3)继代培养1将初代培养的外植体茎尖转接到1/2MS+TDZ0.3-1.0mg·L-1+NAA0.01-0.05mg·L-1培养基上进行继代培养，25-40天后转至继代培养2培养基中培养(4)继代培养2将继代培养1得到的培养材料转接到MS+BA0.3-0.8mg·L-1+NAA0.01-0.05mg·L-1培养基上，培养35-45天后，可逐渐产生胚状体；(5)生根培养剪取2.5cm-3.5cm的丛生芽接入到生根培养基中1/2MS+NAA0.1-0.5mg·L-1，暗培养7-10天后进行光下培养，光照强度为1500-3000lx，2周后生根。
以上培养基的配方中MS的成份为(单位mg/L)(一)、大量元素1、硝酸钾 KNO319002、硝酸铵 NH4NO316503、磷酸二氢钾 KH2PO4170 4、硫酸镁 MgSO4·7H2O 3705、氯化钙 CaCl2.4H2O440(二)、微量元素6、碘化钾 KI 0.837、硼酸 H3BO36.28、硫酸锰 MnSO4.4H2O22.39、硫酸锌 ZnSO4.7H2O 8.610、钼酸钠 Na2MoO4.2H2O 0.2511、硫酸铜 CuSO4.5H2O 0.02512、氯化钴 CoCl2.6H2O0.025(三)、铁盐13、乙二胺二乙酸二钠 Na2.EDTA 37.314、硫酸亚铁FeSO4.7H2O 27.8(四)、有机成分
15、肌醇C6H12O6.2H2O100 16、甘氨酸NH2.CH2.COOH 217、盐酸硫胺素C12H17ClOS.2HCl 0.1 18、盐酸吡哆醇C8H11O3N.HCl 0.519、烟酸NC5H4COOH 0.51/2MS的成分为大量元素是MS的一半，其余成分相同。
外源激素名称BA6-苄基腺嘌呤； NAA萘乙酸 TDZN-苯基-N′-噻二唑-5-脲3.有益效果应用组织培养方法，能较好地保持母本的观赏价值，有效地提高铁线莲的繁殖系数。与播种繁殖相比，组织培养法能有效地保持母本的优良性状，不易产生性状变异；与常规扦插繁殖相比，在一个生长季内(2-3个月)组织培养法的繁殖系数为扦插繁殖的30-50倍。
具体实施例方式
1、丛生芽繁殖的实施方式1.1取铁线莲Clematis Multi-Blue的茎尖于超净工作台上用70％酒精消毒，无菌水冲洗，再用0.1％升汞消毒，无菌水冲洗后备用；1.2初代培养将灭菌好的外植体接种入MS+BA0.5mg·L-1+NAA0.01mg·L-1，30天后进行继代培养；1.3继代培养将初代培养的外植体转接到1/2MS+TDZ0.5mg·L-1+NAA0.01mg·L-1培养基上进行继代培养，培养30天；1.4生根培养剪取3.5cm长的丛生芽接入到生根培养基中1/2MS+NAA0.3mg·L-1，暗培养1周后进行光下培养，光照强度2000lx，2周后生根。
2、胚状体繁殖的实施方式2.1取铁线莲Clematis Multi-Blue的茎尖于超净工作台上用70％酒精消毒，无菌水冲洗，再用0.1％升汞消毒，无菌水冲洗后备用；2.2初代培养将灭菌好的外植体接种入MS+BA0.5mg·L-1+NM0.01mg·L-1，30天后进行继代培养；2.3继代培养1将初代培养的外植体转接到1/2MS+TDZ0.5mg·L-1+NAA0.01mg·L-1培养基上进行继代培养，25天后转至继代培养2培养基中培养；2.4继代培养2将继代培养1得到的培养材料转接到MS+BA0.8mg·L-1+NM0.01mg·L-1培养基上，培养35天后，可逐渐产生胚状体；2.5生根培养剪取3.5cm长的丛生芽接入到生根培养基中1/2MS+NAA0.1-0.5mg·L-1，暗培养1周后进行光下培养，光照强度2000lx，2周后生根。
权利要求
1.一种铁线莲Clematis Multi-Blue组织培养方法，其丛生芽繁殖的步骤如下(1)取铁线莲Clematis Multi-Blue的茎尖于超净工作台上用酒精消毒，无菌水冲洗，再用升汞消毒，无菌水冲洗后备用；(2)初代培养将灭菌好的外植体茎尖接入MS+BA0.3-0.8mg·L-1+NAA0.01-0.05mg·L-1，25-35天后进行继代培养；(3)继代培养将初代培养的外植体转接到1/2MS+TDZ0.3-1.0mg·L-1+NAA0.01-0.05mg·L-1培养基上进行继代培养，培养25-40天；(4)生根培养剪取2.5cm-3.5cm长的丛生芽接种到生根培养基中1/2MS+NAA0.1-0.5mg·L-1，暗培养7-10天后进行光下培养；
2.一种铁线莲Clematis Multi-Blue组织培养方法，其胚状体繁殖的步骤如下(1)取铁线莲Clematis Multi-Blue的茎尖于超净工作台上用酒精消毒，无菌水冲洗，再用升汞消毒，无菌水冲洗后备用；(2)初代培养将灭菌好的外植体接种入MS+BA0.3-0.8mg·L-1+NAA0.01-0.05mg·L-1，25-35天后进行继代培养；(3)继代培养1将初代培养的外植体转接到1/2MS+TDZ0.3-1.0mg·L-1+NAA0.01-0.05mg·L-1培养基上进行继代培养，25-40天后转至继代培养2培养基中培养；(4)继代培养2将继代培养1得到的培养材MS+BA0.3-0.8mg·L-1+NAA0.01-0.05mg·L-1培养基上，培养35-45天后，可逐渐产生胚状体；(5)生根培养剪取2.5cm-3.5cm的丛生芽接入到生根培养基中1/2MS+NAA0.1-0.5mg·L-1，暗培养7-10天后进行光下培养，。
3.根据权利要求1或2所述的铁线莲的组织培养方法，其特征在于所述的酒精浓度为70％-75％，所述的升汞浓度为0.1％-0.15％。
4.根据权利要求1或2所述的铁线莲的组织培养方法，其特征在于所述的光下培养，其光照强度为1500-30001x。
全文摘要
本发明公开了一种铁线莲Clematis Multi－Blue组织培养方法，其培养步骤为丛生芽繁殖(1)取铁线莲茎尖分别用酒精及升汞消毒，用天菌水冲洗后，进行(2)初代培养→(3)继续代培养→(4)生根培养；胚状体繁殖第(1)、(2)、(3)步骤通丛生芽繁殖，(4)继代培养2→(5)生根培养。采用组织培养方法，能较好地保持母本的观赏价值，有效地提高铁线莲地繁殖系数，与播种繁殖相比，组织培养法能有效地保持母本的优良性状，不易产生性状变异，与常规扦插繁殖相比在一个生长季内，组织培养法的繁殖系数为扦插繁殖的30－50倍。
文档编号C12N5/04GK1868263SQ20061008574
公开日2006年11月29日 申请日期2006年6月29日 优先权日2006年6月29日
发明者方炎明, 张启香 申请人:南京林业大学