专利名称：豚鼠胃促胰酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及到豚鼠胃促胰酶、编码豚鼠胃促胰酶的核苷酸序列、以及基于豚鼠胃促胰酶的鉴定抑制胃促胰酶活性和PAOD(周围动脉闭塞性疾病)以及抑制哮喘的化合物的办法。
胃促胰酶是一种胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，除大鼠以外，该酶存在于肥大细胞的分泌颗粒中。在免疫学上，肥大细胞由于其在变态反应和纤维变性反应中的重要作用而著称。如果肥大细胞被活化，胃促胰酶与组织胺和许多其它中间物一起经由脱粒作用释放入细胞外间隙。释放以后，胃促胰酶产生广泛的重要促炎症效应。胃促胰酶裂解多种生理上和病理上重要的蛋白质，例如干细胞因子、大血管内皮素、TGF-β或者载脂蛋白，并且胃促胰酶还能够通过蛋白水解活化胶原酶。除了这些作用之外，可以假定人胃促胰酶的主要作用之一是从血管紧张素I产生血管紧张素II。为此，人们还推测胃促胰酶在心脏衰竭、高血压、变态反应、皮炎、风湿性关节炎、哮喘和慢性炎症情况中具有重要作用。
人类物种仅具有一种胃促胰酶基因，而其他物种具有多种胃促胰酶基因。如果在一种生物体中仅包含一种胃促胰酶，则胃促胰酶彼此之间似乎非常相似。如果存在几种胃促胰酶，那么它们表现出不同的任务和适应性。因此仅具有一种胃促胰酶的动物模型最适宜用于临床试验，因为人类同样仅具有一种胃促胰酶。尤其以啮齿类如小鼠和大鼠为例，我们发现了多种胃促胰酶基因，并且甚至在仓鼠中我们也发现了两种胃促胰酶基因。
本发明的目的是发现仅具有单一一种胃促胰酶异形体(同时该异形体与人胃促胰酶高度同源)的动物物种。
本发明通过克隆和制备豚鼠胃促胰酶实现该目的。为此，从豚鼠器官样品、尤其是心脏中分离基因组和总RNA。为了能够以靶向方式复制胃促胰酶或胃促胰酶样序列，有必要设计对这些序列具有特异性的引物。这里设计产生的引物列于表5。应用这些引物，从基因组DNA开始进行PCR扩增。为了能够描述PCR结果，必须确定质粒插入部分的序列。经由数据库检索，将这些序列与目前已知的全部DNA序列进行比较，并检查同源性。因此也可以将DNA序列转换成为所得蛋白质的氨基酸序列。
对11个样品进行测序得到了已经所知且与胃促胰酶非常相似的丝氨酸蛋白酶的DNA序列。然而，对于一个样品首次发现了胃促胰酶样豚鼠部分序列，其示于图4。加下划线的碱基对应着引物部分。与其他DNA序列的同源性搜索显示，该序列与已知DNA分子例如小鼠的粒酶(gep_mmmmcp5a)或者胃促胰酶1(gep_mmctala1)十分相似，但是并不是完全相同。此种序列比较示于图5。
得到结果的反应包含引物GP_CHY_12_F和GP_CHY_17_R以及引物GP_CHY_15_F和GP_CHY_17_R。因此在目前所产生的所有引物中，引物GP_CHY_17_R与豚鼠胃促胰酶样序列具有最高特异性。
接着，基于从基因组DNA分离的序列确定了所编码的序列，这是因为使用特异性引物(表6)从作为模板的豚鼠cDNA中扩增了豚鼠胃促胰酶的更多片段。从该部分序列开始，选择了更多引物(表7)以便确定豚鼠胃促胰酶的更多cDNA序列。在多种反应中，可以确定更多的序列，其示于
图1(Seq ID No.1)。对图1中核酸序列进行翻译得到图2所示无信号肽的成熟胃促胰酶多肽序列(Seq ID No.2)。
总共对437条序列进行了测序。在该过程中，7次出现豚鼠胃促胰酶，7次出现粒酶，但是没有发现备选的胃促胰酶。
因此，本发明涉及包含序列Seq ID No.1的核酸序列。优选地，核酸序列是序列Seq ID No.1。此外，本发明还涉及包含序列Seq ID No.2的多肽序列，其中多肽序列优选地为序列Seq ID No.2。此外，本发明还涉及包含编码上面指定多肽序列的核酸序列的核酸序列。而且，本发明涉及包含上述核酸序列的表达载体。而且，本发明涉及包含上述表达载体的宿主细胞。
将豚鼠胃促胰酶多肽序列与已知序列进行了比较(表1和2)。
表1已知胃促胰酶序列与成熟豚鼠胃促胰酶多肽序列的比较
表2与人成熟胃促胰酶多肽序列的比较
在此处所比较的动物物种当中，豚鼠是一种其胃促胰酶与人类胃促胰酶具有高度同一性和同源性(77.9和86.3％)的动物。人类、小鼠和豚鼠的胃促胰酶彼此之间如此相似以致于所有这些胃促胰酶都是α胃促胰酶。图3显示豚鼠胃促胰酶包含胃促胰酶的所有重要特征·二硫键在相同的位置，·活性三角的位置同样也是相同的，
·两条序列在口袋1的入口处具有甘氨酸，·糖类一致。
既然豚鼠是最适合的动物模型，本发明涉及在体细胞和生殖细胞带有突变的胃促胰酶基因的豚鼠，其中至少一个等位基因通过突变的胃促胰酶基因的同源重组在功能上被阻断，其中该功能性阻断抑制功能性胃促胰酶基因在豚鼠细胞中的表达。
因此，本发明还涉及以下鉴定胃促胰酶调节物和PAOD抑制剂的方法。
公开了筛选调节胃促胰酶活性的化合物的方法，其包括以下步骤a)将化合物与根据权利要求3或4的所分离的豚鼠胃促胰酶多肽相接触；和b)测定豚鼠胃促胰酶的活性；其中抑制或刺激豚鼠胃促胰酶活性的化合物是调节豚鼠胃促胰酶活性的化合物。
还公开了鉴定调节胃促胰酶活性的化合物的方法，其包括以下步骤a)将化合物与根据权利要求3或4的所分离多肽相接触；和b)确定豚鼠胃促胰酶的活性；其中抑制或刺激豚鼠胃促胰酶活性的化合物是调节豚鼠胃促胰酶活性的化合物。
另一个方法是鉴定调节胃促胰酶活性的化合物的方法，其包括以下步骤a)将化合物与根据权利要求7的宿主细胞相接触；和b)测定在宿主细胞中表达的豚鼠胃促胰酶的活性；其中抑制或刺激豚鼠胃促胰酶活性的化合物是调节豚鼠胃促胰酶活性的化合物。
本发明还公开了鉴定调节胃促胰酶活性的化合物的方法，其包括以下步骤a)将化合物施用于豚鼠；和b)测定豚鼠胃促胰酶活性；其中抑制或刺激豚鼠胃促胰酶活性的化合物是调节豚鼠胃促胰酶活性的化合物。
最后，本发明涉及鉴定抑制PAOD的化合物的方法，其包括以下步骤a)将抑制豚鼠胃促胰酶的化合物施用于豚鼠；b)引起PAOD，和c)确定PAOD的程度；其中抑制PAOD的化合物是导致由步骤b引起的PAOD在一定程度上减轻的化合物。优选地，PAOD是通过施用月桂酸、通过球囊导管损伤脉管或者通过饲喂高脂肪含量的饵料引起的。通过施用月桂酸引起PAOD是特别优选的。引起PAOD的另一个特别优选的方式是通过球囊导管损伤豚鼠的脉管，其中脉管优选地为以颈动脉。
使用熟悉的方法来确定PAOD的程度。例如，通过确定球囊导管损伤后豚鼠颈动脉中新血管内膜的形成来确定PAOD的程度。另一种可能性是确定月桂酸模型中在踏旋器上跑动的豚鼠疲劳程度(Kawamura等人，1985，Arzneimittelforschung 35/7A1154-1156)。
本发明涉及鉴定抑制哮喘的化合物的方法，其包括以下步骤a)将抑制豚鼠胃促胰酶的化合物施用于豚鼠；b)引起哮喘；和c)确定哮喘的程度，其中抑制哮喘的化合物是导致由步骤b)引起的哮喘在一定程度上减轻的化合物。在该方法中，使用常见方法诱发哮喘和确定哮喘程度。
本发明还涉及如上所述的、尤其与下列实施例相关的序列、方法和豚鼠。
附图简述图1豚鼠胃促胰酶的核酸序列(Seq ID No.1)图2成熟豚鼠胃促胰酶的氨基酸序列(Seq ID No.2)图3人胃促胰酶和豚鼠胃促胰酶的比较图4从基因组DNA分离的豚鼠胃促胰酶的第一个序列图5小鼠胃促胰酶与所克隆的豚鼠序列的序列比较图6用于豚鼠胃促胰酶cDNA扩增和克隆的引物的位置图7来自cDNA的豚鼠序列图8豚鼠胃促胰酶与仓鼠胃促胰酶1和2的比较图9用于克隆更多的豚鼠胃促胰酶序列的引物的位置实施例实例1细胞破裂和从豚鼠心脏获得RNA为了能够证明胃促胰酶在豚鼠中的存在和活性，分离了总RNA。豚鼠心脏用作器官样品。
实施例1.1为获得RNA的细胞破裂通过使用所谓的Lysing Matrix D柱将细胞破裂。为此，分别将5×10mg和5×30mg的豚鼠心脏装入带有小陶瓷球的管内，并且覆盖300μlRLT缓冲液(RNeasy试剂盒)和β-巯基乙醇的混合物(每1ml RLT缓冲液加入10μl β-巯基乙醇)。随后，使用FastPrep匀浆器将管振荡2×20秒，通过剪切力使细胞破裂。通过离心，粗的细胞碎片沉淀下来，并将上清液转移至干净的管中。
随后，向每个管中加入590μl蒸馏水和10μl1mg/ml的蛋白激酶K，通过颠倒将溶液混匀并在55℃孵育10分钟以分解蛋白质。室温下以10,000转/分离心3分钟，沉淀粗细胞碎片并将900μl上清液转移至干净的管中。
实例1.2RNA分离用RNeasy Mini试剂盒按照说明书从该种蛋白质和其它细胞成分的混合物中分离总RNA(见RNeasy试剂盒，“从心脏、肌肉和皮肤组织分离总RNA”的方法)。
1.向每一反应加入450μl 100％EtOH用于变性RNA，颠倒混匀溶液。
2.向柱中加入700μl该混合物，于4℃以10,000转/分离心30秒，丢弃流出液，使RNA结合至带有收集管的RNeasy柱的二氧化硅薄膜上。
3.向柱子中加入350μl RW1缓冲液，于4℃以10,000转/分离心30秒洗涤柱子，丢弃流出液。
4.将柱子转移至新收集管中，向柱子中加入500μl RPE缓冲液并于4℃以10,000转/分离心30秒以洗涤柱子。
5.再向柱子中加入500μl RPE缓冲液并于4℃以10,000转/分离心2分钟，以便干燥二氧化硅薄膜。
6.转移柱子至干净的1.5ml管中。
7.向每个柱子里加入30μl无RNA酶水，随后通过于4℃以13,000转/分离心30秒洗脱RNA。
随后通过分光光度法在260nm波长下测定所得到的多种RNA溶液的浓度。
实例1.3从豚鼠RNA产生cDNA如下所述，使用Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒按照说明书产生cDNA。在这里，准备了使用两种不同引物的两个不同反应。
1.用移液管混合8μl RNA 30.11μl oligo(dT)引物或者2μl接头引物(Invitrogen)用H2O加至13μl2.在65℃孵育反应物10分钟以便将引物加到RNA上。
3.在冰上冷却反应物2分钟。
4.每一反应中，加入4μl 5×反应缓冲液0.5μl RNA酶抑制剂2μl dNTP0.5μl反转录酶5.50℃孵育反应物1小时进行反转录酶反应。
6.85℃孵育5分钟使反转录酶失活。
7.冰上冷却反应物2分钟。
为了去除低分子片段和RT-PCR中未使用成分，利用QIAquick PCR纯化试剂盒按照适用于微量离心机法的说明书纯化不同的反应物，如下1.向每一RT-PCR反应中加入250μl PB缓冲液，混合溶液。
2.将每一反应物加到具有收集容器的QIAquick柱子上，于4℃以13,000转/分离心1分钟使DNA结合至柱子的二氧化硅薄膜上，丢弃流出液。
3.为了洗涤柱子，向每个柱子中加入750μl PE缓冲液，于4℃以13,000转/分离心1分钟，丢弃流出液。
4.于4℃以13,000转/分离心柱子1分钟以便干燥二氧化硅薄膜。
5.转移柱子至一干净的1.5μl管中。
6.向每个柱子中加入30μl EB缓冲液，室温孵育1分钟，随后于4℃以13,000转/分离心1分钟洗脱cDNA。
实施例2细胞破裂和从豚鼠心脏获得基因组DNA证明豚鼠存在胃促胰酶的另一种可能性是利用基因组DNA。既然不能确定所找到的基因事实上是否表达，所以使用了该方法。
实例2.1细胞破碎与RNA的获得一样，为了获得基因组DNA必须将细胞破碎。再次，使用上述Lysing Matrix D柱实现该过程。为此，分别将2×100mg的豚鼠心脏加入到带有小搪瓷球的管中并覆盖1.2μl消化缓冲液。该缓冲液的组成示于表3表3消化缓冲液
随后，使用FastPrep匀浆器将管振荡2×20秒，通过剪切力将细胞破裂。
实例2.2通过酚抽取和乙醇沉淀分离DNA
使用相固定凝胶(Phase Lock Gel)按照说明书经酚抽取将蛋白质和DNA分离，如下1.以13,000转/分离心20-30秒将凝胶离心到管(2.0毫升)底部。
2.向每个管中加入100-750μl的破裂细胞。
3.加入同样体积的有机溶剂，在该例中为酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)。
4.通过间或颠倒混合10分钟(不进行旋涡)。
5.以13,000转/分离心5分钟进行相分离。
6.取上清液进行进一步处理。
随后，如下详述经乙醇沉淀洗涤并浓缩DNA。
1.将酚抽取后的上层相转移至一个新的杯中并加入其自身体积1/10的3M醋酸钠(NaAc)pH 5.0和其自身体积2.5倍体积的100％EtOH。
2.用无菌接种环捞取变性DNA分子并转移到新的杯中。
3.在1.5ml 10mM tris-HCl pH 7.5中复性DNA并重复加入EtOH、NaAc。
4.于4℃以11,200转/分离心15分钟。
5.去除上清液并将沉淀重悬于1.5ml 75％EtOH中。
6.为了去除盐分，颠倒悬浮液10分钟。
7.于4℃以11,200转/分离心10分钟，去除上清液，将沉淀空气干燥10-15分钟。
8.将沉淀溶解于1.5ml 10mM tris-HCl pH 7.5。
实施例3在基因组DNA中查找胃促胰酶编码序列为了能够鉴定其中各个基因失活的胃促胰酶序列，必须用PCR方法从基因组DNA模板中扩增这些序列。在该部分实验中，为了该目的，设计并使用了对豚鼠胃促胰酶具有特异性的不同简并性引物。
实例3.1豚鼠胃促胰酶引物设计据认为，胃促胰酶在所有动物模型中具有高的同源性。因此从已知的仓鼠胃促胰酶1序列出发，开始进行数据库搜索，查找尽可能相同的其它已知DNA序列。然后将此次搜索的阳性序列(其包括例如许多小鼠和大鼠丝氨酸蛋白酶和胃促胰酶)彼此之间进行比较，并且从各个序列之间具有最广泛变异的区域设计引物，可以设想这些引物将结合胃促胰酶和胃促胰酶样序列。为了获得更大的序列选择，在各个引物中允许在一定程度上存在变异。通过在序列的各个位置上允许出现几种不同的残基产生了这些变异。此类引物称为简并性引物。变异通过表4中所示的普遍应用的字母代码表示；这些引物由合同公司生产。
表4字母代码
表5引物设计
实施例3.2使用所产生引物的PCR使用简并性引物，尝试扩增了胃促胰酶或者胃促胰酶样序列。为此，每个F引物与每个R引物组合。
PCR反应体系如下1μl 模板(基因组DNA)1μl 第一个引物(GP_CHY_12_F至16_F)1μl 第二个引物(GP_CHY_17_F至21_R)20μlHotStarTaq Master Mix17μl H2OPCR反应按照以下程序进行95℃ 10分钟
72℃ 10分钟4℃ 保存使用1％琼脂糖/EtBr凝胶分析PCR产物。
实施例4已获得PCR产物的扩增为了获得足够量的关于已得到PCR产物的材料用于进一步研究，通过转化方式并经由细菌培养将这些PCR产物扩增。
实施例4.1PCR反应物的纯化为了去除低分子片段和干扰后续转化的其他物质，如上所述使用QIAquick PCR纯化试剂盒按照说明书将所选则的PCR反应物纯化。
实施例4.2用TOPO TA克隆试剂盒进行转化既然在PCR反应物中经常存在几种产物或低分子干扰片段，在绝大多数情况下直接测序是不可能的。因此，为了分离和扩增，将PCR产物整合入细菌载体中并随后将质粒导入感受态细胞。如下所述，这可以通过使用TOPO TA克隆试剂盒进行。
1.混合4μl PCR反应物，1μl盐溶液和1μl TOPO载体。室温孵育反应物5分钟。
2.向每管冰浴融化的感受态TOP 10F’细胞中加入2.5μl该混合物。
3.冰上孵育细胞5分钟，使质粒进入细胞。
4.42℃热休克30秒钟以终止细胞摄取DNA，并立即冰浴2分钟。
5.向每管细菌中加入300μl LB培养基并在振荡器上于37℃培养1小时。
6.对于每一反应物，涂布接种两块LB/amp平板，并且于37℃培养过夜。
实施例4.3PCR产物在培养物中的增殖和质粒分离为了获得仅扩增特定质粒的培养物，使用无菌移液管尖从4.2部分中获得的平板挑取菌落接种于1.5ml LB/amp培养基中，对于每一反应物挑取8个单独菌落。在摇床上37℃培养过夜。
培养完成后，取1ml每种培养物转移至干净的1.5ml管中或者96孔板中(取决于样品数量)。然后，将细胞于4℃以3,000转/分离心15分钟并去除上清液。随后，如下所述使用QIAprep 8Turbo小量制备试剂盒按照说明书利用QIAvac 6S设备进行质粒分离。
1.通过涡旋将细菌沉淀重悬于250μl P1缓冲液中。
2.每管加入250μl P2缓冲液以裂解细菌并小心颠倒混合4分钟。
3.加入350μl N3缓冲液以沉淀蛋白质并小心颠倒混合4分钟。
4.设定QIAvac 6S设备。
5.将上清液转移至上盘的涡轮过滤带(turbo filter strip)内并应用真空直到全部样品进入下面的柱子。
6.除去涡轮过滤带并将带有样品的柱带(column strip)放在上盘，用收集槽代替在基底盘内的带固定器(strip holder)。
7.应用真空直到全部液体已经流过柱子。
8.加入1ml PB缓冲液洗涤柱子并应用真空直到液体流过柱子。
9.加入1ml PE缓冲液洗涤柱子并应用真空直到液体流过柱子。重复此步骤一次。
10.应用最大真空5分钟以干燥柱薄膜，然后去除全部上层盘并用高度吸水的纸巾使柱子出口干燥。
11.用已经通过下面放置的微管架升高的96孔空板替换收集槽。
12.将上层盘安装到设备中并向每个柱子中加入100μl EB缓冲液，室温孵育1分钟。
13.为了洗脱样品，应用最大真空5分钟。
实施例4.4所分离质粒的限制性消化为了从细菌载体中分离插入部分并检测它们，按照以下方案进行限制性消化10μl 质粒1.5μl10×EcoRI缓冲液0.15μl BSA1μl EcoRI2.5μl H2O在37℃孵育1小时进行限制性消化，随后用1％的琼脂糖/EtBr凝胶检查。
实施例5扩增PCR产物的序列测定为了能够检测已经通过细菌质粒扩增的PCR产物是否为胃促胰酶序列，目前已经确定了胃促胰酶的序列。
实施例5.1所选质粒的序列测定由于采用限制性消化，可以鉴定具有不同插入部分的质粒，从而避免对相同插入部分进行重复测序。对于序列测定，首先必须使用荧光标记的ddNTP进行链终止合成反应。这些荧光标记的ddNTP可与反应缓冲液和正常dNTP一起以称作Big Dy的预混合物的形式得到。
以下体积用于序列测定5μl 质粒溶液5μl Big Dye1μl 引物M13-R引物M13-R用于序列测定，这是因为该引物结合到紧靠多克隆位点外面，因此每一插入部分可以完全不依赖于其类型而进行测序。
按照以下程序进行链终止合成反应95℃ 2分钟 4℃ 保存随后使用Dye Ex 2.0试剂盒按照说明书除去反应物中的剩余荧光染料，因为这些荧光染料将干扰序列测定。
1.将具有凝胶物质的Dye Ex柱子涡旋30秒钟。
2.将盖旋转1/4打开挡板。
3.通过弯曲(不要扭曲)折断柱子的挡板。
4.把柱子放入收集器并以3,000转/分离心3分钟。
5.将柱子转移到干净的1.5ml管中。
6.将样品点在倾斜凝胶表面的中心而不要用移液管头接触它。
7.以3,000转/分离心柱子3分钟以洗脱样品。
然后使用测序仪对纯化的样品进行自动测序，并且经过数据库检索将所得到的碱基序列与全部已知DNA分子进行比较。此外，同样经过数据库检索，从得到的DNA序列确定了所得到蛋白质的相应氨基酸序列。
实施例6使用特异引物寻找RNA中的胃促胰酶编码序列实施例6.1豚鼠序列特异引物的产生借助于来自豚鼠的第一条DNA部分序列，设计了对其特异的引物。为此，选择了豚鼠序列中与仓鼠和人类对照DNA序列最明显不同的那些部分序列，并设计了长度为30个碱基的引物。然后这些引物由合同公司合成。
表6豚鼠胃促胰酶的特异引物
用于随后PCR的引物示于图6。
实施例6.2使用不同引物进行PCR目的是再次在豚鼠RNA中大范围的寻找胃促胰酶序列。为此，将已经设计或迄今为止所使用的最不同的引物彼此相组合；在其它情况中，再次使用仓鼠胃促胰酶引物，并且还使用了oligo(dT)引物以及通用接头引物(UAP，Invitrogen)。使用引物oligo(dT)和接头引物产生的cDNA溶液用作模板。对于F和J的反应，仅使用接头引物模板，而对于G和K的反应，使用oligo(dT)引物模板。所有其它反应使用两种模板进行。此外，对于G和K的反应退火温度为45℃，而对于其它的反应退火温度为58℃。
使用这些引物组合准备反应物AHaChym_3_f+GP_CHY_17_RBGP_CHY_12_F+HaChym_4_rCGP_CHY_15_F+HaChym_4_rDGP_CHY_22_F+GP_CHY_17_REGP_CHY_22_F+HaChym_4_rFGP_CHY_22_F+UAP引物GGP_CHY_22_F+Oligo(dT)引物HGP_CHY_24_F+GP_CHY_17_RIGP_CHY_24_F+HaChym_4_rJGP_CHY_24_F+UAP引物KGP_CHY_24_F+Oligo(dT)引物LGP_CHY_24_F+GP_CHY_23_RMHaChym_3_f+GP_CHY_23_R反应物组成如下1μlcDNA模板1μl第一个引物1μl第二个引物20μl HotStarTaq Master Mix17μl H2OPCR反应按照以下程序进行95℃ 10分钟 72℃ 10分钟4℃ 保存使用1％琼脂糖/EtBr凝胶检测PCR反应物。
实施例7所选PCR产物的研究和扩增为了有足够材料用于研究，所选的有希望的PCR产物通过转化和细菌培养进行扩增，并且随后研究可能的豚鼠序列。为此，选择了反应FAP、JAP、HdI、HAP、IdI、IAP、LdI和LAP。
实施例7.1通过TOPO TA克隆扩增和质粒分离将所获得的并使用QIAquick纯化试剂盒纯化的PCR产物再次通过TOPO TA克隆试剂盒整合入细菌载体，并通过转化导入感受态细胞。将所得到的LB/amp平板在孵箱中于37℃培养过夜。
实施例7.2菌落PCR和细菌培养对于每一个反应物，用无菌的移液管尖从来自7.1部分的平板挑取6个单独菌落。这些菌落首先在PCR反应物中浸几次。在这个过程中，细菌被释放，它们在随后的PCR中被杀死并在第一个95℃步骤中破裂，以致于其中包含的质粒能够用作模板。
所产生的各反应物的组成如下1μl引物M13-F1μl引物M13-R5μl HotStarTaq Master Mix3μlH2OPCR反应按照以下程序进行95℃ 15分钟 72℃ 5分钟
4℃ 保存此外，将这些移液管尖然后照例用于接种，在每一情况下接种于48孔板中1.5ml LB/amp培养基中。液体培养物在摇床上于37℃培养过夜。随后，如上所述使用QIAprep 8 Turbo小量制备试剂盒分离质粒。
检测菌落PCR通过与培养同时进行的菌落PCR，本发明使得在早期就知晓液体培养物中所包含插入片段成为可能，并因此能够预选进一步操作的培养物。通过1％琼脂糖/EtBr凝胶研究菌落PCR的结果。
实施例7.3所选质粒的序列测定使用QIAprep 8 Turbo小量制备试剂盒分离质粒。对于来自上面所列反应物的质粒的序列测定，有必要使用预先荧光标记的ddNTP进行链终止合成反应。
每一反应的组成如下5μl质粒溶液5μl Big Dye1μl引物M13-RPCR序列测定按照以下程序进行95℃1分钟 4℃ 保存随后，使用Dye Ex 2.0试剂盒去除各反应中的剩余荧光染料，因为这些染料会干扰序列测定。然后使用测序仪对纯化的样品进行自动测序，并且经过数据库搜索将所获得的序列与全部已知DNA分子进行比较。此外，同样通过数据库搜索，从所获得的DNA序列确定了所得到蛋白质的相应氨基酸序列。
如此获得的豚鼠序列示于图7。
实施例8豚鼠胃促胰酶序列的完成在仓鼠胃促胰酶序列已经全部已知的情况下，到目前为止已经发现并测序的假定豚鼠胃促胰酶序列大致对应编码成熟胃促胰酶的核酸序列。目前的任务是从该部分序列确定胃促胰酶5’方向的剩余序列。这通过所谓的5’RACE进行。
实施例8.1设计新引物根据最近确定的序列选择新的特异性引物(表7)。引物由合同公司合成。
表7所设计引物
引物的位置如图9所示。
实施例8.2不同cDNA模板的产生为了取得最可能的结果并且能够排除任何模板降解，如下所述，通过使用两种不同的试剂盒产生了4种不同的cDNA模板。
Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒
1.用移液管混合，2×2μl RNA 30/1(见部分1.2)2μl 随机引物(cDNA 1)或接头引物(cDNA 2)9μl H2O2.在65℃孵育混合物10分钟以便引物加入。
3.冰上冷却2分钟。
4.向每一反应物中加入4μl 反应缓冲液0.5μl RNA酶抑制剂2μl dNTP0.5μl 反转录酶5.将反应物在50℃孵育1小时进行反转录反应过程。
6.在85℃失活反转录酶5分钟。
7.冰上冷却反应物。
用于cDNA末端快速扩增的5’RACE试剂盒1.产生cDNA·用移液管混合，2×0.25μl 20μM GP_CHY_28_R8μl RNA 30/3和30/4(见部分1.2)7.25μl H2O·在70℃孵育10分钟以便引物加入。
·冰浴1分钟。
·向每一反应物中加入2.5μl 10×PCR缓冲液2.5μl MgCl2溶液1μl dNTP2.5μl DTT·在42℃预热1分钟。
·向每一反应物中加入1μl SS II反转录酶。
·在42℃孵育50分钟以便进行反转录酶反应过程。
·在70℃失活反转录酶15分钟。
·在37℃孵育1分钟。
·向每一反应物中加入1μl RNA酶混合物。
·在37℃孵育30分钟以降解RNA。
·将反应物贮存于冰上。
2.反应物的S.N.A.P.纯化·向每一样品加入120μl结合缓冲液。
·将样品转移入S.N.A.P.柱子，于4℃以13,000转/分离心20分钟。
·为了安全起见，将流出液保存于冰上。
·向每个柱子中加入400μl冷的1×洗涤缓冲液，离心并丢弃流出液。重复此步骤3次。
·用400μl冷的70％EtOH洗涤柱子并丢弃流出液。
·于4℃以13,000转/分离心1分钟干燥薄膜。
·转移柱子到一个新管中，向每管中加入50μl已预热至65℃的水。
·以13,000转/分离心20秒钟洗脱cDNA(cDNA3)。
3.经dC加尾向一部分cDNA 3添加多聚胞嘧啶尾·用移液管混合6.5μl DEPC处理水5μl 5×加尾缓冲液2.5μl 2mM dCTP10μl纯化cDNA·94℃孵育2分钟。
·冰上冷却1分钟。
·向每一反应加入1μl TdT(名称)。
·在37℃孵育10分钟以便进行dC加尾过程。
·在65℃失活TdT 10分钟。
·将反应物在冰上冷却(cDNA 4)。
实施例8.3PCR扩增最新获得的cDNA片段因为已获得的cDNA数量太少不能进行深入的研究，通过如下描述的PCR对它们进行扩增。
对于PCR，在冰上用移液器混合34.4μl H2O5μl Expand High Fidelity PCR缓冲液+MgCl21μl dNTP2μl 第一个引物2μl 第二个引物5μl cDNA0.6μl Taq聚合酶(3.5U/μl)这里使用了这些引物的组合cDNA1GP_CHY_17_R+27_FcDNA2GP_CHY_17_R+27_F和UAP+GP_CHY_27_FcDNA3GP_CHY_24_F+29_RcDNA4GP_CHY_24_F+29_R和UAP+GP_CHY_29_R对于使用cDNA 2的反应(其中使用了UAP)进行3’RACE，并且相应地对于使用cDNA 4的反应进行5’RACE。
PCR反应按照以下程序进行95℃10分钟 72℃10分钟
4℃ 保存用1％琼脂糖/EtBr凝胶检测样品。
实施例8.4巢式扩增由于单一PCR几乎不足以产生可见数量的所获得cDNA，所以进一步PCR，关于这一点，其称为“巢式扩增”。
为此，用移液管混合36.4μl H2O5μl Expand High Fidelity PCR缓冲液+MgCl21μl dNTP1μl 第一个引物1μl 第二个引物5μl 来自PCR 1的cDNA(以1∶100稀释)0.6μl Taq聚合酶(3.5U/μl)在这里所使用了这些引物组合cDNA1GP_CHY_17_R+26_F(1)和GP_CHY_17_R+25_F(2)cDNA2-17GP_CHY_17_R+26_F(3)和GP_CHY_17_R+25_F(4)cDNA2-UAPUAP+GP_CHY_26_F(5)和UAP+GP_CHY_25_F(6)cDNA3GP_CHY_24_F+30_R(7)cDNA4-24GP_CHY_24_F+30_R(8)cDNA4-UAPGP_CHY_24_F+30_R(9)和UAP+30_R(10)随后用1％琼脂糖/EtBr凝胶检测扩增产物。
随后，将巢式扩增产物如上所述进行克隆、扩增和测序。
实施例9重组豚鼠胃促胰酶的表达利用克隆的序列(Seq ID No.1)在适当表达系统如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达重组豚鼠胃促胰酶并纯化(Nakabuko等人，2000，Yeast 16(4)，315-23；Takai等人，1997，Clin.Chim.Acta 265，13-20；Schechter等人，1993，J.Biol.Chem.268，23626-23633)。
实施例9.1豚鼠胃促胰酶的表达和纯化重组豚鼠胃促胰酶在BL21(DE3)细胞中作为N端融合蛋白表达，其中N端融合蛋白含有携带6×His标签和肠激酶切割位点的26个氨基酸多肽。由于蛋白质表达形成不可溶的包涵体，所以必须进行复性。在变性条件下用谷胱苷肽修饰所分离和纯化的包涵体，然后溶解于6M盐酸胍，20mMEDTA pH 4.5。通过将蛋白质溶液以1∶100稀释于大体积的重折叠缓冲液(50mM Tris/HCl pH 8.0，750mM精氨酸，1mM EDTA，2mM半胱氨酸)进行重折叠。选择碱性pH以促进硫醇阴离子的形成及由此发生的二硫化物交换。溶液在4℃保存两天。由于重折叠缓冲液的高离子强度，全部溶液不得不通过超滤进行浓缩并且在第一次层析之前进行透析。透析缓冲液包含50mM Tris/HCl、300mM NaCl和1mM β-巯基乙醇。通过使用相同缓冲液在Ni-NTA上层析并用梯度咪唑从柱子上洗脱蛋白，可以获得粗的但仍然无活性的胃促胰酶。然后用肠激酶切除N-末端6×His标签活化该酶。从而形成具有正确N-端的成熟豚鼠胃促胰酶。然而，除了激活作用以外，还观察到蛋白质的部分自身消化。活化的酶在Superdex 75柱子上进行两次层析，首先用含50mM Tris/HCl pH 8.0、300mM NaCl、1mMTCEP、10％甘油的溶液，然后用含50mM MES、300mM NaCl、1mMTCEP、10％甘油的pH5.5的微酸性溶液，因为胃促胰酶在那一pH(对应肥大细胞中的pH，在那里活性胃促胰酶被储存起来)时是无活性的。最后，如SDS-PAGE显示，所获得的蛋白质纯度＞98％。纯化的蛋白质是单体形式的(如通过分析型超速离心所检测)并且在荧光测定中是高活化的。
实施例10胃促胰酶活性测定使用常见方法(Muramatsu等人，2000，J.Biol.Chem.275，第5546页；Uehara等人，1999，Hypertension 35，第57页；Takai等人，1997，Clin.Chim.Acta 265，第15页)测量豚鼠胃促胰酶的活性。
实施例10.1胃促胰酶抑制作用的测定对于胃促胰酶，选择包含4氨基酸肽AAPF的底物作为胰凝乳蛋白酶样化合物标准底物(琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-[7-氨基-4-甲基香豆素]；Lockhart BE，等人，“Recombinant human mast-cell chymasean improvedprocedure for expression in Pichia pastoris and purification of the highlyactive enzyme.”Biotechnol Appl Biochem.在2004年5月26日的即刻出版物作为手稿BA20040074出版)。由Bachem(Bubendorf，瑞士)合成的肽的纯度为95％。从Calbiochem(Merck Biosciences，San Diego，California，美国)获得从人皮肤肥大细胞纯化的胃促胰酶。测定缓冲液为0.15MNaCl、0.05M Tris HCl、0.05％CHAPS、0.1mg/ml肝素(肝素钠，Sigma，猪肠粘膜)、0.02mM AAPF底物、1nM胃促胰酶，pH 7.4。测定在96孔板上(Packard Optiplate)进行，体积为0.05ml，室温。胃促胰酶的活性以从底物释放的游离的7-甲基-4-甲基香豆素在340/440nm(激发光/发射光)处荧光的初始增加率表示。与胃促胰酶在不含AAPF-底物的测定缓冲液中室温预孵育30分钟后，读取抑制化合物对活性的抑制作用。然后通过加入所指出浓度的AAPF-底物起始测定。
表8豚鼠胃促胰酶活性的抑制作用IC50nMGP胃促胰酶人胃促胰酶coli940570ref cpd Meiji Seika Kaisha SF2809-V345590ref cpd Toa Eiyo TY-51076
序列表<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)<120>豚鼠胃促胰酶<130>case 23232<160>21<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>954<212>DNA<213>豚鼠(Cavia porcellus)<220>
<221>豚鼠胃促胰酶<222>(1)..(954)<400>1agcacctgct gtgggcagcc tccctgagaa gatgtgtctt ctttctctcc ctctactact 60ctttctccag tacaccagag ccaaagctgg ggaagtcatc ggtggcacag agtgcaagcc120acactcccgc ccctacatgg cttacctaga aattgtctct tctgagggat atgagaaaga180ctgtagtggt ttcttgatac gacggaattt tgtgctaaca gcagctcact gtgcaggaag240gtctctaaca gtcaacctag gggtccacaa caaaaaaatg aaagaagaca catggcagag300gcttaaggtt ataaagcaat tcctgcatcc aaactacaat agctctgtac ttctccacga360catcatgtta ctcaagttgg agaagaaagc caacctgacc ctagccgtgg gcacactccc420cctcccacct gaatgcaact tcctcacatc tggaagaatg tgccgagcag caggctgggg480gcgcacgaat gtggaggagc ctgcctccga cactcttcag gaggtgaagc tgagactcat540ggatccccaa gcctgcaaac acttcccaaa ctttaaccac aatctccagc tgtgtgtggg600taatcctagg aagagaaaat ctgtattcaa gggagactct ggaggtcccc tcctgtgtgc660agggatagcc cagggcattg tatcctatgc acatcggaat gcaaaacctc ctgttgtctt720cacccgaatc tcccattacc ggccgtggat caacaagatc ttgaaagcaa attaaccatg780gagcctcggc cagccctgaa aggaaatctg gaactggatc tgagcaggtt ttctgtacca840cttactctgg ccctgtctct ggttcctgtt gaagccagcc catgtccttg agactccaga900aagtccctac aactcataga actctcaata aagcttcagc aaaaatccca aaaa 954<210>2<211>247<212>PRT<213>豚鼠
<220>
<221>豚鼠胃促胰酶<222>(1)..(247)<400>2Met Cys Leu Leu Ser Leu Pro Leu Leu Leu Phe Leu Gln Tyr Thr Arg1 5 10 15Ala Lys Ala Gly Glu Val Ile Gly Gly Thr Glu Cys Lys Pro His Ser20 25 30Arg Pro Tyr Met Ala Tyr Leu Glu Ile Val Ser Ser Glu Gly Tyr Glu35 40 45Lys Asp Cys Ser Gly Phe Leu Ile Arg Arg Asn Phe Val Leu Thr Ala50 55 60Ala His Cys Ala Gly Arg Ser Leu Thr Val Asn Leu Gly Val His Asn65 70 75 80Lys Lys Met Lys Glu Asp Thr Trp Gln Arg Leu Lys Val Ile Lys Gln85 90 95Phe Leu His Pro Asn Tyr Asn Ser Ser Val Leu Leu His Asp Ile Met100 105 110Leu Leu Lys Leu Glu Lys Lys Ala Asn Leu Thr Leu Ala Val Gly Thr115 120 125Leu Pro Leu Pro Pro Glu Cys Asn Phe Leu Thr Ser Gly Arg Met Cys130 135 140Arg Ala Ala Gly Trp Gly Arg Thr Asn Val Glu Glu Pro Ala Ser Asp145 150 155 160Thr Leu Gln Glu Val Lys Leu Arg Leu Met Asp Pro Gln Ala Cys Lys165 170 175His Phe Pro Asn Phe Asn His Asn Leu Gln Leu Cys Val Gly Asn Pro180 185 190Arg Lys Arg Lys Ser Val Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Leu195 200 205Cys Ala Gly Ile Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Ala His Arg Asn Ala210 215 220Lys Pro Pro Val Val Phe Thr Arg Ile Ser His Tyr Arg Pro Trp Ile225 230 235 240Asn Lys Ile Leu Lys Ala Asn245<210>3<211>33<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠<220>
<221>GP_CHY_12_F<222>(1)..(33)<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(9)<223>n为a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n为a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>n为a，c，g或t<400>3garkbyannc cncaytcccg nccytatcat ggc 33<210>4<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_13_F<222>(1)..(31)<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(9)
<223>n为a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n为a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>n为a，c，g或t<400>4garkbyannc cncaytcccg nccytatcat g 31<210>5<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_14_F<222>(1)..(29)<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(9)<223>n为a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n为a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>n为a，c，g或t<400>5
garkbyannc cncaytcccg nccytatca 29<210>6<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_15_F<222>(1)..(31)<400>6gagtcaaagc cacactcccg cccttacatg g 31<210>7<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_16_F<222>(1)..(31)<400>7gagtgcagac cacatgcccg cccctacatg g 31<210>8<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列
<220>
<221>GP_CHY_17_R<222>(1)..(29)<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>n为a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>n为a，c，g或t<400>8kyrcacasda rdggnccncc dgagtcycc 29<210>9<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_18_R<222>(1)..(29)<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>n为a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>n为a，c，g或t<400>9kyrcacasda rdggnccncc dgagtcycc 29
<210>10<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>n为a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>n为a，c，g或t<400>10kyrcacasda rdggnccncc dgag 24<210>11<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_20_R<222>(1)..(29)<400>11gcacacagaa gaggtccccc ggagtctcc 29<210>12<211>29<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_21_R<222>(1)..(29)<400>12ttacacacaa gaggccctcc agagtcccc 29<210>13<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>CHYGP_22_F<222>(1)..(28)<400>13gagaaagact gtagtggttt cttgatac 28<210>14<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>CHYGP_23_R<222>(1)..(28)<400>14gtatcaagaa accactacag tctttctc 28
<210>15<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>CHYGP_24_F<222>(1)..(24)<400>15atgctgcttc ttcctctccc cctg 24<210>16<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_25_F<222>(1)..(20)<400>16ctaacagtca acctaggggt20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列
<220>
<221>GP_CHY_26_F<222>(1)..(20)<400>17agctcactgt gcaggaaggt20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_27_F<222>(1)..(20)<400>18gacggaattt tgtgctaaca20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_28_R<222>(1)..(20)<400>19acccctaggt tgactgttag20<210>20<211>20<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_29_R<222>(1)..(20)<400>20accttcctgc acagtgagct20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_30_R<222>(1)..(20)<400>21tgttagcaca aaattccgtc20
权利要求
1.包含序列Seq ID No.1.的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸序列，其中所述核酸序列是根据Seq IDNo.1.的序列。
3.包含序列Seq ID No.2的多肽序列。
4.根据权利要求3所述的多肽序列，其中所述多肽序列是根据Seq IDNo.2.的序列。
5.核酸序列，其包含编码根据权利要求3或4所述多肽序列的核酸序列。
6.表达载体，其包含根据权利要求1、2或5所述的核酸序列。
7.宿主细胞，其包含根据权利要求6所述的表达载体。
8.在体细胞和生殖细胞中带有突变的胃促胰酶基因的豚鼠，其中至少一个等位基因通过突变的胃促胰酶基因的同源重组在功能上被阻断，其中该功能性阻断抑制功能性胃促胰酶基因在豚鼠细胞中的表达。
9.筛选调节胃促胰酶活性的化合物的方法，其包括以下步骤a)将化合物与根据权利要求3或4的所分离多肽相接触；和b)测定豚鼠胃促胰酶的活性；其中抑制或刺激豚鼠胃促胰酶活性的化合物是调节豚鼠胃促胰酶活性的化合物。
10.鉴定调节胃促胰酶活性的化合物的方法，其包括以下步骤a)将化合物与根据权利要求7的宿主细胞相接触；和b)测定在宿主细胞中表达的豚鼠胃促胰酶的活性；其中抑制或刺激豚鼠胃促胰酶活性的化合物是调节豚鼠胃促胰酶活性的化合物。
11.鉴定调节胃促胰酶活性的化合物的方法，其包括以下步骤a)将化合物施用于豚鼠；和b)测定豚鼠胃促胰酶活性；其中抑制或刺激豚鼠胃促胰酶活性的化合物是调节豚鼠胃促胰酶活性的化合物。
12.鉴定抑制PAOD的化合物的方法，其包括以下步骤a)将化合物施用于豚鼠；b)引起PAOD；和c)确定PAOD的程度；其中抑制PAOD的化合物是导致由步骤b)引起的PAOD在一定程度上减轻的化合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中PAOD是通过施用月桂酸、使用球囊导管损伤脉管或饲喂含高比例脂肪的食物引起的。
14.鉴定抑制哮喘的化合物的方法，其包括以下步骤a)将抑制豚鼠胃促胰酶的化合物施用于豚鼠；b)引起哮喘；和c)确定哮喘的程度，其中抑制哮喘的化合物是导致由步骤b)引起的哮喘在一定程度上减轻的化合物。
15.如上所述的、尤其与前述实施例相关的序列、方法和豚鼠。
全文摘要
本发明涉及豚鼠胃促胰酶的序列。由于豚鼠仅仅表达一种胃促胰酶异形体，因此它们特别适宜作为模型用于鉴定调节胃促胰酶的化合物的方法。
文档编号C12N9/64GK1896244SQ20061010144
公开日2007年1月17日 申请日期2006年7月13日 优先权日2005年7月13日
发明者J·比彻姆, J·芬格勒 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司