细胞内含有巨大叶绿体的转基因植物细胞系、及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：细胞内含有巨大叶绿体的转基因植物细胞系、及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，具体地，本发明涉及一种细胞内含有巨 大叶绿体的转基因细胞系及其制备方法和应用。
背景技术：
利用植物生物反应器生产口服疫苗已成为目前研究的热点。与传统疫苗相比， 植物源性疫苗具有安全、稳定、高效的特点。随着生物技术的不断完善，植物生 物反应器将会成为疫苗生产的有效途径，并部分替代传统疫苗的生产方式。叶绿体基因组转化由Boynton等20世纪80年代末首次在单细胞植物衣藻中 获得成功，之后多家实验室转化高等植物叶绿体获得成功，近年来的研究取得了 突破进展，并成为国际植物生物技术研究的一个热点，尤其是有关叶绿体转化的 高效表达特性的报道，使其在植物生物反应器的应用日益受到重视与常规外源基因核转化相比，叶绿体具有独特优点基因区域化高效表达、 母性遗传避免转基因花粉传播、生物安全性高、不会产生基因沉默现象、可直接 表达原核基因、产物区域化、可高效表达外源基因、以及利于同时进行多基因的 转化等等。因此，植物叶绿体基因工程越来越引起人们的广泛关注。目前该技术 主要应用于叶绿体作为生物反应器生产疫苗等医药蛋白；获得抗虫、抗病、抗 除草剂和耐旱的转基因植物。但是，植物叶绿体转化也存在明显的不足，高等植物细胞约有50-200个叶绿 体，叶绿体转化经过抗性筛选得到的植林一般是异质的(heteroplasmic)，即转化和 未被转化叶绿体同时存在于转基因植抹。这种杂合体遗传不稳定，目的基因表达
产量不高。然而，获得同质化(homoplasmic)转基因植林正是叶绿体转化相对于常 规细胞核转化的主要困难。因此，必须设法使转基因植抹达到同质化(homoplasmic) 状态。国内自90年代初期开展叶绿体遗传转化工作以来，已将编码氨基糖苷3' 腺苷酸转移酶的aadA基因以及编码PPT(Phosphinothricin)乙酰转移酶的bar基因、 编码苏云金芽孢杆菌晶体毒蛋白的Bt基因^口人丙肝病毒融合抗原基因NS3C等成 功地导入到高等植物的叶绿体基因组中，有些外源基因已获得表达。但分子检测 表明，几乎所有转基因植林均未能达到完全同质化状态1。如何才能快速获得同质 化叶绿体转基因植抹，已成为长期困扰我们而且也是亟待解决的难题。外源基因向叶绿体基因组中的整合是通过同源重组实现的。关于如何提高同 源重组的效率以及提高转化率和转基因抹系的同质化程度，国外已有一些文献对 此进行了报道。主要有如下几种方法(1) 在转化前设法降低受体细胞中叶绿体DNA的含量。这可以通过使用DNA 损伤试剂(DNA damaging agents)或用叶绿体DNA合成抑制剂处理受体细胞来实 现。Boynton等报道在基因枪转化前，将受体细胞(Chlamydomonas reinhardtii)用 5mmol/L的5氟脱氧尿苷(FdUrd， 5 fluorodeoxyuridine)处理，使其叶绿体基因组 的数量减少5-7倍，可使转化效率提高20-280倍];Kindle等用O.5mmol/L的FdUrd 处理衣藻细胞，并将其置于弱光(0.1w/m2)下培养一段时间再进行转化，也得出了 相似的结论;Ye等报道，用DNA促旋酶抑制剂(200mmol/L萘咬酮酸或30 mmol/L 新生霉素)处理受体细胞(Solanum nigrum),可有效降低叶绿体DNA的含量，从而 可用于提高高等植物叶绿体转化效率和同质化程度。(2) 紫外照射法转化前，将受体细胞用低剂量(1.7 x 105ergs/cm2)的UV (〈80nm)短暂照射，可将转化率提高4倍。紫外照射可促进蓝细菌转化过程中外 源序列的整合。(3) 野生型E.coli recA基因介导法:Cerutti等的研究结果表明，野生型E.coli RecA蛋白可使叶绿体DNA同源重组的频率提高15倍]。因此，将E.coli recA基 因导入叶绿体基因组中，可以提高DNA分子的重组频率从而提高转化子的同质化 水平。上述各种方法，虽然都取得了一定的成效，但也都存在一定的局限性。如 用FdUrd处理，只适用于藻类等低等真核生物，对于高等植物的叶绿体则没有效 果；UV照射的方法也只见于衣藻叶绿体转化的报道。而且无论是FdUrd，还是叶 绿体DNA合成抑制剂以及低剂量的UV C，虽然都能在不同程度上提高叶绿体转 化效率和同质化程度，但它们都对受体细胞的生长有相当程度的抑制和损害作用。 另外，还有一种方法就是在高浓度的选择压力下对转化细胞进行多轮次抗性筛选。 由于细胞内含有50-200个叶绿体，因而需要经过多个世代的选择与扩增才能占据 优势地位。要得到完全同质化的转基因植抹，最少也需要3 - 5年的时间。总而言之，目前叶绿体基因转化的同质化依然没有很有效的解决方法，这也 给该技术的广泛应用带来了困难。但是如果直接减少细胞中叶绿体的数量，甚至 每个细胞中仅有一个巨大的叶绿体，就会极大地提高叶绿体的转化效率以及同质 化筛选效率。发明内容为了完成上述问题提出并完成了本发明。本发明解决了目前叶绿体转化 中存在的上述问题。经研究发现植物叶绿体与原核生物的分裂机制类似，也利用FtsZ蛋白进行分 裂。本发明的发明人分别从烟草、龙胆、鸟巢蕨和衣藻等材料中克隆了多个ftsZ 基因，通过分析不同家族ftsZ基因的功能，证明了植物中不同家族的ftsZ基因均 参与了叶绿体的分裂过程。本发明从烟草中克隆了 1个ftsZ基因，已经在GenBank 登陆注册(No.AF205858)。进一步利用ftsZ正反义表达载体，转化烟草后得到了 只有1-3个巨大叶绿体的转基因烟草。转基因烟草叶绿体数目的明显减少意味着叶 绿体同质化筛选效率的提高，为研制高效叶绿体生物反应器奠定了基础。本发明的目的是提供一种细胞内含有巨大叶绿体的转基因细胞系。本发明的另 一 目的是提供一种制备上述细胞系的方法。本发明的再一目的是提供上述细胞系的应用。根据本发明的细胞内含有巨大叶绿体的转基因细胞系包含外源导入的正义、或反义ftsZ基因。优选地，所述ftsZ基因为NtFtsZ2-l基因，其GenBank登陆注 册号为No.AF205858。优选地，所述细胞系为包含外源导入的正义、或反义ftsZ基因的转基因烟草 细胞系。根据本发明的制备上述细胞系的方法包括以下步骤1) 构建包含正义、或反义ftsZ基因的表达载体；和2) 用构建的表达载体转化细胞系、优选烟草细胞系。优选地，所述ftsZ基因为NtFtsZ2-l基因，其GenBank登陆注册号为No. AF205858。本发明还提供了上述转基因细胞系作为生物反应器生产疫苗的应用。具体地，本发明的发明人进行了如下研究工作。 烟草NtFtsZ2-l基因的克隆提取烟草幼嫩叶片的总RNA并以其为模板，分别以Oligo dT和所设计的烟草 NtFtsZ2-l cDNA特异3'端引物NP6作逆转录，反应完成后各取2ul逆转录产物作
为模板，以特异引物NP5和NP6进行PCR扩增。结果是以特异3'引物NP6的逆 转录产物为模板扩增得到约1.4kb左右的单一产物(图1A)。将此扩增条带纯化回 收后，与pMD18-T Vector连接并转化大肠杆菌感受态细胞JM109。挑取单克隆质 粒进行酶切和PCR鉴定(图1 B)后，选取阳性克隆测序。测序结果表明所得到 的克隆与GenBank中已注册的烟草ftsZ cDNA ( accession number:AJ271750 )序列 一致。烟草NtFtsZ2-l基因的序列分析为了进一步分析NtFtsZ2-l的内含信息，将所获得的烟草NtFtsZ2-l蛋白序列 与公共数据库公布的其它高等植物及典型细菌的FtsZ蛋白序列做了同源性比较分 析，结果显示NtFtsZ2-l蛋白序列具有FtsZ蛋白的典型特征，其中部的功能区非 常保守，包含了所有FtsZ蛋白的两个保守基序FTSZ—1: VIGVGGGGSNAVNRM (PROSITE PS01134)和FTSZ一2: FATAGMGGGTGS/ TGAAPV/IV/IA (PROSITE PS01135)(图2),并且在FTSZ_2的保守序列中还包括了真核生物微管蛋白(tubulin)的典型基序:GGGTGSG (PROSITE PS00277),有研究表明该富含谷氨酸 的保守位点为GTPase的核心序列，此序列的保守性对于维持FtsZ蛋白的GTPase 活性是必须的，定点突变实验也证实FtsZ蛋白中的GGGTGTG序列的变化明显影 响其GTPase的活力(Dai et al，1994;RayChaudhuri et al,1994)。 FTSZ—1保守序列的 功能现在还不清楚。通过与原核生物FtsZ蛋白序列的比较分析显示，目前所发现 的高等植物FtsZ蛋白都有一个突出的N末端，这是与原核生物FtsZ蛋白相区别 的一个明显标志，而我们所克隆的NtFtsZ2-l蛋白序列N端也具有明显的延伸序 列。此外，又将NtFtsZ2-l蛋白与NtFtsZl-1， NtFtsZl-2以及具有光合能力的蓝细 菌的FtsZ蛋白序列做了蛋白序列的疏水性分析(结果见图3)和氨基酸组成的比 较分析(结果见图4)。为了解NtFtsZ2-l在烟草基因组中的存在状态，对其进行了 Southern杂交分析(图5A)。实验结果表明NtFtsZ2-l基因在烟草基因组中是以多拷贝的形式存在的。
为了解NtFtsZ2-1基因在烟草不同组织器官中的表达情况，分别提取了烟草根、 茎、叶、花的总RNA,以其部分序列作为探针进行了 Northern和半定量RT-PCR 杂交分析(图5B)。杂交结杲显示NtFtsZ2-l基因在烟草叶片和花中的表达最强， 而在茎和根中的表达较弱，几乎检测不到,，以上实验结果表明NtFtsZ2-1基因的表 达在烟草中有明显的组织差异性，其在叶片与花部位的表达较为活跃。基因的功能(1) 烟草NtFtsZ2-l基因在E.coli中的表达和定位分析将烟草NtFtsZ2-l与egfp构建成融合表达质粒pKN后(载体鉴定如图6)，转化 大肠杆菌后，通过显微观察分析了 NtFtsZ2-l:EGFP融合蛋白在大肠杆菌中的聚 合、定位及对菌体形态变化的影响。结果显示融合表达质粒pKN经lmM IPTG诱导后，在宿主菌中大量表达, 并严重干扰了宿主菌自身正常的细胞分裂周期，致使宿主菌体形态发生了明显的 伸长。通过焚光观察发现，沿宿主菌菌体纵轴方向有规律地分布着焚光点或焚光 带(图7 )。以上实验结果表明，烟草NtFtsZ2-l蛋白能够识别宿主菌中分裂位点的定位信 号，并且可以与宿主菌中的内源蛋白相互作用而参与分裂装置的组成，在分裂位 点聚集，从而在这些区域形成了荧光点或荧光带；同时，外源NtFtsZ2-l蛋白的过 量表达也严重干扰了宿主菌的正常分裂过程。这一现象与用GFP标记的内源FtsZ 蛋白在大肠杆菌中的过量表达结果相似。(2) 烟草NtFtsZ2-l基因的功能分析虽然目前植物FtsZ蛋白在叶绿体分裂过程中的功能研究已经取得了 一些进展， 但是人们对FtsZ蛋白的功能以及叶绿体分裂分子机制的认识还十分有限，并且对 于高等植物叶绿体分裂机制的研究主要集中在模式植物拟南芥上，而对其它物种 的研究还很少。本发明对烟草NtFtsZ2-l基因的表达及功能做了深入分析。将来自 烟草的NtFtsZ2-l基因构建了正义和反义表达质粒(载体鉴定如图8 ),并通过农杆 菌介导的叶盘法转化烟草叶片，利用抗性筛选、PCR和PCR-Southern杂交对转基 因植抹进行了鉴定(如图9),用微分千涉显微镜对所鉴定的阳性植抹进行了表型 观察，并对转化植株叶绿体的超微结构，叶绿体的相对表面积以及叶绿素的舍量 进行了测定。显微观察结果显示NtFts^2-l基因的正义转化和反义转化均导致了叶肉细胞中 叶绿体的形态和数目发生了明显变化，细胞中叶绿体的数目与野生型相比明显减 少而体积显著增加(如图10、 11)。但是通过对细胞内叶绿体表面积的测定(如图 12、 13 )则又表明在NtFtsZ2-l正反义转基因植抹中叶绿体总的光合面积没有发生 明显的变化；转化植抹的叶绿素含量测定(表l)也表明烟草NtFtsZ2-l基因的 正义和反义转化虽然改变了烟草细胞的叶绿体形态和数目，但是植物细胞的光合 色素含量却没有发生明显的变化。此外，对于内标分子叶绿素a，b结合蛋白Cab mRNA的半定量RT-PCR扩增结果(如图14 )也进一步表明在正反义转基因烟草 中叶绿素a,b结合蛋白的表达没有受到Nl:FtsZ2-l表达水平变化的影响，这也从侧 面说明转化植抹中的叶绿体仍然能够进行正常的光合作用。以上研究结果暗示着 植物细胞内存在着某种机制协调叶绿体的总体积与细胞体积之比相对稳定 (Pyke，1999;Robertson，1995 )，使其保持一个恒定的比值，从而保证了转化植抹中 数目减少、体积增大的叶绿体能够最大限度地吸收光能并使叶绿体的正常光合作 用得以维持。综上所述细胞内NtFtsZ2-l基因转录水平的升高或降低均会对叶绿体的分裂产 生抑制作用。这很可能是由于当增加NtFtsZ2-l基因的转录产物使细胞中的 NtFtsZ2-l蛋白过量表达时，其表达量超过正常叶绿体分裂所需，冗余的NtFtsZ2-l 蛋白会在正常的分裂位点处异常积累，从而干扰了其在分裂中正常功能的发挥， 抑制了叶绿体的分裂，并最终形成了体积膨大、数目减少的巨大叶绿体表型。反 之，反义抑制NtFtsZ2-l基因的表达会降低胞内NtFtsZ2-l基因的转录量，导致叶
绿体正常分裂所需的NtFtsZ2-l蛋白量不足，造成叶绿体分裂事件的减少及分裂过 程的停滞。因此NtFtsZ2-l对烟草叶绿体分裂和形态的影响是遵循动态平衡和剂量 效应的。表l:野生型及不同类型转基因烟草中的叶绿素含量分析转基因烟草 类型Wild typeSense-1Sense-2Sense-3Anti-lAnti-26.76±1.496.62±2.166.65±1.716.29±1.776.53±1.166.46±1.31cb2.50±0.422.51±0.632.52±0.522.55±0.562.79±0.272.51±0.41Ca+b9.30±2.459.12±2.869.28±2.158.84±2.259.33±1.268.99±1.68ca/cb2.58±0.292.63±0.262.65±0.492.46±0.382.34±0.342.58±0.30叶绿素总浓0.93±0.250.91±0.290.93±0.220.88±0.230.93±0.130.90±0.17度


图1 :解N!FlsZ2-l OT的RT-PCR和pNF3重纟JL^N^t刀及PCR鉴定，A: M为入DNA/ EcoRI+Hind111双切marker; lanel为Oligo dT逆转录后的 PCR结果；lane2为特异的3'端引物逆转录后的PCR结果；lane3为阴性对照；B: M为X DNA/ EcoRI+Hind111双切marker; lanel为XhoI+EcoRI双酶切；lane2 为HindIII单酶切;lane3为EcoRI单酶切;lane4为NtFtsZ2-l特异引物的PCR扩增结果。图2:已知植物ftsZ2家族成员的氨基酸序列比较，下划线示两个保守的基序， 各序列的GenBank登录号分别为A.thaliana FtsZ2-l, AF089738; A.thalianaFtsZ2-2, AF384167; L.longifloru FtsZ, AB042101; N.tabacum FtsZ2-l ， AJ271750; G.luteaFtsZ, AF205859。图3 :烟草不同家族FtsZ蛋白的疏水性分析，A为N.tabacum FtsZl-l; B为N.tabacum FtsZ 1-2; C为N.tabacum FtsZ2-l 。图4 :烟草不同家族的FtsZ蛋白及蓝细菌FtsZ蛋白的氨基酸组成分析，A为N.tabacum FtsZl-l; B为N.tabacum FtsZl-2; C为N.tabacum FtsZ2-l; D为Anabaena FtsZ。图5为烟草NtFtsZ2-1基因的核酸杂交分析，图A: Southern杂交结果，lanel为EcoRI酶切，lane2为EcoRV酶切，lane3 为HindIII酶切；图B:为烟草不同组织Northern杂交与半定量RT-PCR结果。图6: 融合表达质粒pKN的酶切及PCR鉴定图语，1. NtFtsZ2-l特异上游引物与egfp特异下游引物的PCR扩增；2. Xbal单酶切；3. eg^特异引物的PCR扩增；4. Kpnl+EcoRI双酶切；5. NtFtsZ2-l特异引物的PCR扩增；6. KpnI+SalI双酶切；7. Kpnl单酶切；M.人DNA/EcoRI+HindIII双酶切Marker。
图7:融合表达质粒pKN在大肠杆菌中的定位分析，A _ E为pKN重组质粒 过量表达对于大肠杆菌菌体形态的影响(图中标尺为10um)。图8:正义表达质粒pGZS3和反义表达质粒pGZA3的鉴定图谱，图A为正义表达质粒pGZS3的PCR和酶切鉴定；图B反义表达质粒pGZA3的PCR和酶切鉴定。图9:转化植林的PCR-Southern杂交检测，M:入DNA/EcoRI+Hindlll双切marker, Lane3-6为正义转化植才朱pGZS3的 PCR-Southern杂交检测；Lane7-10为反义转化植林pGZA3的PCR-Southern杂 交检测；Lane2为pBI121阳性植株对照；Lanel为pBI121阴性植抹对照。图10:正义表达7\^^22-/基因烟草叶绿体的表型观察，A-D,E-H,I-L分别为微分千涉显微镜，激光共聚焦显微镜及电镜显微镜的观察 结果；A,E,I，K:野生型烟草叶肉细胞的叶绿体表型；B-D，F-H,J，L:正义表达7WF"Z2-/基因的烟草叶肉细胞的叶绿体表型；(图中 A-D,E-H,I-J,K-L的标尺分别为10um，25um,2um，0.5um)。图11:反义表达MFfsZ2"基因烟草叶绿体的表型观察，A-C，D-F，G-I分别为微分千涉显微镜，激光共聚焦显微镜及电镜显微镜的观察 结果；A,D,G:野生型烟草叶肉细胞的叶绿体表型；B，C,E,F，H，I反义表达MfYsZ2-/基因的烟草叶肉细胞的叶绿体表型；(图中A-C，D-F，G-I的标尺分别为10um,25um，2um )图12: 野生型及不同类型转基因烟草中叶肉细胞表面积与叶绿体数目之间 的对应关系，A、 B、 C野生型及正义表达NtFtsZ2-l基因烟草中叶肉细胞表面积与叶绿体 数目之间的对应关系；D、 E野生型及反义表达NtFtsZ2-l基因烟草中叶肉细胞表面积与叶绿体数目 之间的对应关系。图13:野生型及不同类型转基因烟草中叶绿体面积的分布频率，A野生型烟草中叶绿体面积的分布频率；B、 C、 D正义表达NtFtsZ2-l基因烟草中叶绿体面积的分布频率；E、 F反义表达NtFtsZ2-l基因烟草中叶绿体面积的分布频率。表1: 野生型及不同类型转基因烟草中的叶绿素含量分析表中Ca代表叶绿素a含量(|ig ml-l extraction buffer), Cb代表叶绿素b含量 (ig ml-1 extraction, buffer), Ca+b H表叶绿二素a+b含量(|ng ral-1 extraction buffer), Ca/ Cb，代表叶绿素a与b比率，叶绿素总浓度为单位组织中叶绿素含量(昭g-1 fresh weight)。图14: 正反义转基因烟草中NtFtsZ2-l及叶绿素a,b结合蛋白表达水平的半 定量RT-PCR分析。
具体实施方式
实施例1烟草NtFtsZ2-l基因的克隆 1、植物材料烟草
2、 烟草总RNA的提取采用异疏氰酸胍-酚-氯仿一步法提取(Chomczynski P and Sacchi N， 1987)测定 总RNA A260/A280的比值，以检验所提RNA的纯度，琼脂糖变性凝肢电泳检奎 所提RNA的质量。3、 cDNA第一链的合成取1 ug总RNA作为模板，分别以Olig dT和特异的下游引物作为逆转录引物， 用cDNA合成试剂盒RNA PCR Kit (AMV) Ver.2.1,除了引物外其余操作按AMV 反转录说明书加入试剂，然后30°C 10min，42。C 40min，55。C 10min，60。C 5min， 99 °C 5min,4。C保存。4、 NtFtsZ2-l基因的PCR扩增根据GenBank中注册的烟草ftsZ基因序列(GenBank accession number: AJ271750)设计并合成PCR两端特异引物，以引导ftsZ基因的扩增，为方便后续 操作分别在上下游引物的5 '端加上相应的酶切位点Smal和EcoRI:Forward primer: 5'-TCCCCCGGGAACAATGGCTACTTGTACATCAGCTG-3'SmalReverse primer: 5'-AGGAATTCTTAAGCTCTTGGGTAGCGTGAT-3' EcoRI取5ul单链cDNA产物，分别加入特异的上游与下游引物2ul ( 50pmol)和lul (25pmol)' dNTPs (lOmM each) lul, lOxPCR buffer ( Mg2+ Plus) 5ul, Taq酶 2ul(2U/ul)， ddH20 37ul，总体积50ul。 PCR反应条件为:94。C预变性lmin45sec, 94'C变性45sec， 55。C复性30sec, 72。C延伸lmin30sec，共30个循环，最后72°C 延伸10min。扩增完毕后将扩增产物进行电泳检测。 5、 烟草NtFtsZ2-l cDNA的克隆 1)烟草NtFtsZ2-l cDNA的连接反应将纯化回收的PCR产物直接与pMD18-T Vector进行连接得到重组质粒，命名
为pNF3。连接体系如下回收的PCR产物4ul， pMD18-T Vector lul， Solution I 5ul， 共10ul体积，16'C连4矣过夜。2 )连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞3 )碱裂解法提取质粒。6、重组质粒pNF3的鉴定与序列测定根据质粒载体pMDl8-T Vector图谱选取适当的酶切位点,分别进行酶切和 PCR鉴定重组质粒pNF3。酶切反应体系如下10xbuffer2ul，质粒DNA10ul(约 5ug)，相应的限制性内切酶各lul，ddH20 6ul, 37。C保温3hr后电泳检测。PCR反 应体系为10xPCR buffer (Mg2+ Plus) 5ul, dNTPs ( 10mM each) 2ul,特异的 上下游引物各lul (25pmol),重组质粒模板lul， Taq酶lul (2U/ul), ddH20 39ul, 总体积50ul。 PCR反应的条件为:94'C预变性2min后，再进行94°C变性30sec, 55。C复性30sec， 72。C延伸lmin 30sec,共30个循环，最后72。C延伸10min。然 后将经过酶切和PCR鉴定的重组质粒进行DNA序列测定，此项工作由TaKaRa Biotech公司完成。NtFtsZ2-l的cDNA序列及其编码的蛋白质的氨基酸序列如下 1 atggccacca tgttaggact ctcttcaaac acaggaatcg atatattgtc ttcttcttcc 61 aattccttat cattttatca tagcactcgc ttcacacaat gcttctctcc gaaaagcctc 121 tgcaaacgac aacgacgaag attcagcatx tgcagttcct tgtcctctgc caagattaag 181 gttgtcggcg tcggtggcgg cggcaacaat gctgttaacc gtatgattgg cagcggcttg 241 cagggtgttg acttttatgc tgtaaacacg gatgctcaag cattgctgca gtctacggtt 301 g卿acccaa ttcaaattgg agaacttctg actcgtggac ttggtactgg tggcaatcct 361 ctgttggggg aacaggcagc ag鄉agtca aaggaacaca Ugcaaatgc tcttaa鄉t 421 tcggatatgg tgtttataac agcaggcatg ggtggcggta ctggatctgg tgctgctcct 481 gttgttgctc aaatagccaa agaagcaggt tatttgactg ttggtgtcgt cacgtatcca 541 ttcagctttg aaggacgtaa aagatctttg caggctttgg aagcaattga aaaacttcag 601 aaaaatgtag atactcttat agtaattccc aatgatcgtc ttctggatat tgctgatgag661C8g8caccacttcaasatgcttttcttcttgctgatgstgtactttgtcsLaggcgtccaa721ggaatatctgatataat cactatacctgggCtggt￡t￡LatgtggaUUgcagatgtt犯g781gcaatcatga犯gattctggaactgcta.tgctcggagttggggtttcttcC3gt3gg犯C841cgtgctg鄉犯gC3gCtggl￡LC￡L€LgC￡LSLCtctggcccctctceittggatc901tctgcaactggtg3tgt3t3taacattactatattactttgc郷郷tg961aataaggtgtcccaggttgtcacaagcttggctgatccatccgccaacatcatattcggt1021 gctgttgtgg atgagcgcta taatggag,ag atccaggtga ctctaattgc aactggtttc1081 gcacagtcat ttcagaattc tcttctaact gaccctcgag gagcaaagct agttgataag1141 agcaaaggaa ccacagaaag aacggtatca cctgatacct tgaggtcatc agagtctcct1201 tccacaaaac ctcgaccagc tactcggagg ctgttctttt agMATMLGLSSNTGIDILSSSSNSLSFYHSTRFTQCFSPKSLCKRGTIiRSSESPSTKPRPATRRLFF7、核酸杂交分析Southern杂交提取烟草基因组DNA,以烟草NtFtsZ2-l cDNA全序列作为杂 交探针，探针标记采用Prime a Gene标记kit(Promega)进行Southern杂交
Northern杂交采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取烟草根、茎、叶、花的总 RNA,以烟草NtFtsZ2-l cDNA部分序列作为杂交探针，探针标记采用Prime a Gene 标记kit(Promega)，进行Northern杂交。实施例2:烟草NtFtsZ2-l基因的原核表达与定位分析1 、烟草NtFtsZ2-1基因原核表达质粒的构建根据已知的烟草NtFtsZ2-l cDNA序列重新设计了 一对融合表达引物分别为 NP7: 5，-TCTAGAAACAATGGCTACTTGTACATCAGCGT-3，，和NP8: 5，-GGTACCGCTCTTGGGTAGCGTGATC-3，，并在引物的5，端加上 相应的酶切位点XbaI和KpnI,同时在下游特异引物中去除终止密码子，以便与绿 色荧光蛋白基因同框翻译。以经过测序鉴定的pNF3质粒为模板进行PCR扩增， 反应条件为94 °C 60 sec,55 °C 40sec,72。C 90 sec,共进行30个循环，最后72°C 延伸10min。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，以Xbal+Kpnl双酶切，然 后以无水乙醇-20'C沉淀回收，得到纯化的NtFtsZ2-l片段，将其克隆到中间质粒 pUC19上，再以Sall+Kpnl双酶切，并将含有NtFtsZ2-l片段的回收产物连接于 Sall+Kpnl双酶切的pEGFP质粒栽体上，得到融合表达的pKN重组质粒，转化 JM109感受态菌，在选择培养基上筛选转化子并进行DNA序列测定以确保在PCR 扩增过程中没有错误碱基的引入。分别以PCR扩增和酶切方法对重组质粒pKN 加以鉴定。 '2、融合表达质粒pKN在大肠杆菌JM109中的表达及对照体系的建立 将转化有融合表达质粒pKN的大肠杆菌JM109在选择培养基上划板(Ampr 80ug/ml)培养后，挑取单菌落于液体培养基中37。C摇培过夜，次日以1/100比例 取过夜培养物分别接种于含有OmM和lmM IPTG(Isopropyl- P -D-Thiogalactoside) 的LB液体培养基中(Ampr 80ug/ml),在37。C摇培4小时；同时对转化有pEGFP 质粒的大肠杆菌JM109做同样的处理，最终以lmM的IPTG加以诱导以作为融合 表达质粒pKN的对照体系。
(1)大肠杆菌JM109转化菌体形态的显微观察复红染色将转化有外源质粒的大肠杆菌JM109过夜培养物划于栽玻片上， 并以酒精灯加热固定菌体，滴加复红染料于室温染色lmin,然后用清水冲击多余 的复红染料，压片镜检。荧光观察将转化有外源质粒的JM109过夜培养物与等体积预热的0.5%低熔 点琼脂糖混匀后滴于无荧光载片上，压片后采用蓝光激发和标准滤光片进行镜检。实施例3:烟草NtFtsZ2-l基因的功能分析1、 真核表达栽体的构建为了解烟草NtFtsZ2-l基因在叶绿体分裂过程中的功能，我们将所克隆的建了正义和反义表达质粒pBZS3和pBZA3，然后将正义和反义表达质粒分别转化 大肠杆菌DH5 a ，并提取质粒对其进行相应的酶切和PCR鉴定。2、 真核表达质粒向农杆菌的转化采用冻融法将正义和反义表达质粒导入农杆菌LBA4404中(An,1988 )。将菌 液涂布于YEP选择培养基上(Sm 100ng/ml, Rif 100ug/ml,Kan 80ug/ml), 28。C倒 置培养l-2天。挑取单克隆菌落，提取质粒，分别以酶切和PCR方法进行鉴定， 具体操作同前。3、 叶盘法转化烟草叶片及转化植抹的再生 叶盘法转化烟草叶片用1/2 MS液体培养基将农杆菌原液稀释5倍，取生长约一个月左右的烟草无 菌苗叶片，将其切成边长约为lcm的小片，浸于农杆菌悬液中15min，然后用无 菌滤纸吸去多余的菌液，将外植体置于MS基本培养基上预培养两天。转化植抹的再生将预培养两天的烟草叶片转移到MS分化培养基中(Kan 80ug/ml,Cb 500ug/ml)继续培养，待幼芽长到约1cm长时，将其移至生根培养基上(Kan18 80ug/ml,Cb 500ug/ml)继续培养，待生根完全后将生根后的烟草幼苗移栽到含有 1/3蛭石的营养土中，以25-28。C条件下16/8小时的光/暗下进行培养。转化植抹的鉴定转化植抹的PCR鉴定分别选用NPTII的特异上下游引物及CaMV35S与NtFtsZ2-l特异引物组合对 转化植株进行PCR鉴定。所用引物序列如下 NPTII特异上游引物 5'-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3，， 特异下游引物 5 ， -ATCGGG AGCGGCGATACCGTA-3 ，； CaMV35S特异引物 5 ，- AATATCCGGAAACCTCCTCG-3 ，； NtFtsZ2-l特异上游引物NF7 5，陽TCCCCCGGGAACAATGGCTACTTGTACATCAGCTG-3', 特异下游引物NF8 5'-AGGAATTCTTAAGCTCTTGGGTAGCGTGAT-3';此外，为了进一步区分NtFtsZ2-l正反义转化植林中PCR扩增带的大小，又 在 NtFtsZ2-l 的中部合成了 一条新的特异下游引物 NF9 5'-ATCCACATTTACTAGCCCAG-3' 。 PCR的反应体系为10xPCR buffer 5ul， Mg2十(10mM) 3ul， dNTPs ( 10mMeach) 2ul，引物各lul (25pmo1),模板lul, Taq酶lul (2U/ul )， ddH20 36ul,总体积50ul。 PCR反应的条件为94。C预变性 2min后，再进行94。C变性30sec, 55。C复性30sec, 72。C延伸45sec，共30个循环， 最后72。C延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应结果。PCR-Southern杂交检测PCR扩增后的NPTII产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用碱法将DNA转移至
尼龙膜上(具体操作过程如前所述)。以0.4M NaOH作为转移液进行转印，转印 时间大于2hr。最后于8(TC烘箱中烘膜2hr,此膜即可用于杂交或置干燥器中备用。 以NPTII作为杂交探针，探针标记采用Prime a Gene标记kit ( Promega )。杂交采 用Church Buffer系统，其余操作同Southern杂交步骤。4、 转化植抹的叶绿体数目和形态观察待转化植抹生长约一个月时，按Pyke等(Pyke and Leech,1991)的方法处理其叶 片将材料用3.5%的戊二醛黑暗中处理lhr后，用0.1MNa2EDTA(pH 9.0)替换戊 二醛，置于6CTC保温2.5hr。处理好的样品可以直接进行压片賴j全或置于4'C冰箱 中备用。显微观察用Leica DMRE多功能显微镜进行，用微分干涉显微镜观察叶 绿体的数目和形态，叶绿体数目的统计以50个细胞中叶绿体数目的平均值来表示。 叶肉细胞及叶绿体的面积使用Spot Enhanced软件测量，按Pyke等方法计算每个 叶肉细胞中的叶绿体总面积(Pyke and Leech RM, 1994a; Pyke et al., 1994b)。图像 采集用Leica DC200 Digital Camera或通过Leica MPS60自动摄相系统用Kodak ISP 200胶巻记录结果，图像处理用Adobe Photoshop 5.0图像处理软件完成。此外， 为了进一步分析叶绿体形态特征，我们同时采用Leica TCS激光共聚焦显微镜对叶 绿体的数目和形态进行了观察，所用物镜为Leica 40x,用于叶绿素分子的激发波 长为458士20nm, Leica TCS PowerScan软件用于图像采集。5、 超微切片及电镜观察电镜观察的样品按Dormann等(1995)及Itoh等(1998)所描述的方法准备。将 3-4周植林未展开的幼嫩叶片在4。/0(V/V)戊二趁磷酸緩冲液(0.1 M,pH 7.2)中4°C固 定过夜。用磷酸緩沖液(O.l M，pH7.2)漂洗后，再用1。/。(V/V)的锇酸4。C固定2h，然 后用上述緩冲液漂洗，系列乙醇脱水，然后样品包埋于环氧树脂中，经超薄切片 和醋酸双氧铀染色后，在透射电镜(HitachiH600ATEM)下观察，并照相记录结果。6、 转化植林叶绿素含量的测定叶绿素含量的测定参照Lichtenehaler(1987)的方法转化4直才朱生长约一个月时，
称取O.lg叶片，液氮研磨后用80%的丙酮进行4由提，并以滤纸过滤，最后定容抽 提液为10ml。用紫外分光光度计测定其在645nm和663nm处的光吸收值，叶绿 素含量的计算按Ca=12.7A663-2.69A645, Cb=22.9A645-4.68A663， Ca+b=8.02A645+20.20A663进行。(l)转化植林中NtFtsZ2-l基因表达水平的半定量RT-PCR分析 分别取具有异常叶绿体表型的烟草NtFtsZ2-l基因正义和反义转化植林叶片 0.5g,用异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取总RNA。取5yg总RNA作为模板，以Oligo dT为下游引物合成cDNA第一链，取等量cDNA反转录产物进行半定量PCR扩 增。用于检测NtFtsZ2-l mRNA的特异上游引物为 5'-TCCCCCGGGAACAATGGCTACTTGTACATCAGCTG-3', 特异下游引物为5'-AGGAATTCTTAAGCTCTTGGGTAGCGTGAT-3'; 用于检测内标分子ubiquitin的特异上游引物为 5，-TGGAAACGGCTGCTAATACC- 3', 特异下游引物为5，-ACGGGTTGACTCTTTCTGGATA-3，； 用于检测内标分子actin的特异上游引物为 5 ，陽AGATGGAGTTATG ATAGTTAAAC-3 ，， 特异下游引物为5，-ATTCAGAAGATATTGTCATCAAGG-3,。此外，为了初步分析正反义转基因烟草中的叶绿体光合作用是否正常，我们 同时对叶绿素结合蛋白cab基因的转录水平进行了检测。 用于扩增叶绿素结合蛋白cab基因的特异上游引物为 5'-ATGGCTGCTGCTACAATGGC-3，， 特异下游引物为5，-TCACTTTCCGGGGACAAAGT-3，。PCR反应条件为94。C预变性2min;94。C lmin,55。C lmin,72。C 1 min， 35 个循环；72 。C ， 10min。
权利要求
1、一种细胞内含有巨大叶绿体的转基因细胞系，其特征在于，所述细胞系包含外源导入的正义、或反义ftsZ基因。
2、 如权利要求1所述的转基因细胞系，其特征在于，所述ftsZ基因为NtFtsZ2-l 基因，其GenBank登陆注册号为No. AF205858。
3、 如权利要求1或2所述的转基因细胞系，其特征在于，该细胞系为包含外 源导入的正义、或反义ftsZ基因的转基因烟草细胞系。
4、 一种制备权利要求1所述细胞系的方法，其特征在于，所述方法包括以下 步骤1) 构建包含正义、或反义ftsZ基因的表达载体；和2) 用构建的表达栽体转化细胞系。
5、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述ftsZ基因为NtFtsZ2-l基因， 其GenBank登陆注册号为No. AF205858。
6、 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的细胞系为 烟草细胞系。
7、 权利要求1所述的转基因细胞系作为生物反应器生产疫苗的应用。
全文摘要
本发明属于生物基因工程技术领域，具体地，本发明涉及一种细胞内含有巨大叶绿体的转基因细胞系及其制备方法和应用。本发明的细胞系包含外源导入的正义、或反义ftsZ基因。所述方法包括以下步骤1)构建包含正义、或反义ftsZ基因的表达载体；和2)用构建的表达载体转化细胞系。本发明所获得的转基因烟草叶绿体数目的明显减少意味着叶绿体同质化筛选效率的提高，为研制高效叶绿体生物反应器奠定了基础。
文档编号C12N5/10GK101165175SQ200610113810
公开日2008年4月23日 申请日期2006年10月18日 优先权日2006年10月18日
发明者何奕昆, 孔冬冬, 东 王, 勇 胡 申请人:首都师范大学