专利名称：脉络丛制品及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养的培养基领域和在体外或离体培养细胞的方法。本发明应用于细胞培养和组织移植领域。
背景技术：
为了成功地在体外或离体培养细胞，细胞培养的培养基必须包括能支持细胞生长和增殖所需的所有营养，包括糖、氨基酸、维生素、盐，和在某些情况下的痕量金属离子、嘌呤及嘧啶。这些培养基也通常补充有动物血清。
血清通常源自胎牛、初生小牛或马，并被以0.5至20％v/v的浓度加入到细胞培养的培养基中。血清除了提供促进生长的组分外，还对不稳定的或水不溶性的分子以及毒素中和剂、蛋白酶抑制剂、细胞粘附促进剂起载体/缓冲液/螯合剂的作用，并且作为搅拌的混悬液培养物的保护剂。
然而，血清在细胞培养的培养基中的用途具有几个缺点。其相对较昂贵，其组分不确定，不同批次的血清可能在存在的化合物的浓度方面不同，因此导致不可预见的培养物生长和生产力。血清也可以是污染比如支原体、噬菌体、病毒和毒素的来源。另外，血清中的蛋白质可使细胞产物从细胞培养的培养基中的纯化复杂化。
在努力克服包含血清的培养基的缺点方面，已经研究了不含血清的培养基，其中血清被较好规定的或更特征化的组分代替。由于血清的复杂性和不同类型的细胞生长所需条件不同，这导致多种不同的培养基组合物。在大多数这样的不含血清的培养基中，血清被微量元素、脂质、激素、生长因子以及纯化的蛋白质的“混合物(cocktails)”代替。不幸地是，这样的纯化的蛋白质，比如人血清白蛋白，具有许多血清的缺点。例如，人血清白蛋白很昂贵和定期缺乏，不同的来源可能在化合物存在的浓度方面不同，因此，导致不可预见的培养物生长和生产力。血清白蛋白也可能是未知污染包括病毒的来源。血清和血清白蛋白也是未明确的分化因子的主要来源，其防止了培养物中特定的细胞类型的受控生长和分化。
已经研究了“饲养细胞”在某些细胞培养系统中的用途，通过释放(或吸收)组分进入(或来自)其来增强培养基。这样的“饲养细胞”通常由粘附生长抑制(adherent growth arrested)但有活力的和生物活性的细胞组成，其用作基质，其他细胞在其上进行共培养系统生长。条件培养基(或不含细胞的培养基的上清液)也可用于补充标准细胞培养基，因为其包含许多(不明确的)介质物质(包括细胞因子和生长因子)，所述介质物质为之前在其中培养的细胞释放进入其中的。
血清和不含血清白蛋白的培养基主要对特定的细胞类型有效，比如干细胞。饲养细胞和条件培养基也靶向于需要复杂营养的(fastidious)细胞和细胞系，比如胚胎干细胞。
预期提供一种细胞培养的培养基，其用于较短期和延长的时期的支持在培养基中生长的多种细胞类型的生长和功能，所述细胞类型包括离体和体外生长的细胞和组织。本发明的一个目的是意在实现该迫切需要和/或提供给公众有用的选择。
发明内容
本发明涉及脉络丛(CP)细胞和/或CP条件培养基用于增加非CP细胞在长期或短期培养中生长、存活和/或保持其功能的用途。
已知CP条件培养基用于提高体外SKs(成神经细胞瘤)细胞的生长率和增加体外中脑细胞摄取多巴胺的速率(WO00/66188)。然而，将这样的CP条件培养基用作“一般的”细胞培养的培养基，其是否能增加在长期或短期培养中多种非CP细胞的生长、存活和/或保持其功能是未知的。
而且，因为CP细胞不一定在培养物的片或层中生长，CP细胞是否可以与非CP细胞共同培养以充当“饲养”细胞群来增加非CP细胞在长期或短期培养中的生长、存活和/或保持其功能是未知的。
本发明人出人意外地发现CP制品，包括CP细胞或CP条件培养基，对增加非CP细胞在长期或短期培养中的生长、存活和/或保持其功能有用。
也出人意外地发现CP细胞或CP条件培养基对于保护培养物中的非CP细胞免于撤除血清诱导的细胞死亡有用。
根据本发明，提供CP细胞和/或CP条件培养基在制备用于增加非CP细胞在长期或短期培养中的生长、存活率和/或保持其功能的CP制品中的用途，其中所述CP制品包括 a)CP细胞群，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或 b)CP细胞培养物，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或 c)来自a)或b)的CP条件培养基，其包含一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子。
所述非CP细胞可以是神经元细胞或非神经元细胞，选自包括原发皮层神经元细胞(primary corticoid neuronal cells)、胰岛β细胞、能够生成或分泌因子VIII的细胞、能够生成因子VIII和和血管假性血友病因子的细胞、心肌细胞、心脏传导系统的细胞比如窦房结、房室的节细胞和房室束，及参与修复新生儿畸形的细胞的群体。
优选地，在移植进入接受者之前，短期培养所述非CP细胞。例如，在植入治疗糖尿病中的接受者之前，可以根据本发明培养胰岛β细胞。
所述非CP细胞可包括从不同种类的细胞获得的细胞，并用于CP制品的。因此，本发明可能对增加在异种移植中使用的非CP细胞的生长和存活有用。
在用本发明的CP制品培养之前，所述非CP细胞可以是休眠状态，比如冷冻干燥的或冷冻的。
一个或多个能支持非CP细胞存活和生长的因子可包括神经营养因子、生长因子、营养因子、细胞因子、促细胞分裂剂、基质细胞支持因子、能降解有毒蛋白质沉淀的蛋白酶类(比如淀粉状蛋白和huntingtin)，及能络合有毒金属离子的蛋白质(比如转铁蛋白和血浆铜蓝蛋白)。
所述a)和/或b)的CP细胞可包括纯化的CP细胞群，或者它们还可以或可选地包括CP衍生的细胞，选自包括神经胶质或神经胶质衍生细胞、上皮细胞、多能神经元前体细胞、祖细胞、和对神经元前体细胞标记物为阳性的细胞(比如neu-N)的群组。
所述CP细胞可以直接从适宜的哺乳动物供体获得或可以从第一代或第二代CP细胞培养物或从包括永生的CP细胞系的CP细胞系或从任意上述来源的组合获得。在培养物中的所述CP细胞可以被遗传修饰。所述从供体直接获得的CP细胞可包括包含一种或多种CP细胞的脑脊液。
所述CP和/或非CP细胞可包括分离细胞或细胞培养物，并可以是“裸露的”或包封的(encapsulated)，例如包封在海藻酸盐中。当所述CP和非CP细胞是“裸露的”时，它们可以“自由地”进行彼此直接接触，或者它们可以是通过生物相容的分离工具分离，所述分离工具能使分泌的因子从CP细胞扩散到非CP细胞。所述CP和/或非CP细胞的包封可以起这样的生物相容的分离工具的作用。
所述非CP细胞优选地为非神经元细胞，本发明优选地提供CP细胞和/或CP条件培养基在制备用于增加非神经元细胞在长期或短期培养中的生长、存活率和/或保持其功能的CP制品中的用途，其中所述CP制品包括 a)能产生一种或多种支持非神经元细胞存活和生长的因子的CP细胞群；和/或 b)CP细胞培养物，其能产生一种或多种支持非神经元细胞存活和生长的因子；和/或 c)来自a)或b)的CP条件培养基，其包含一种或多种支持非神经元细胞存活和生长的因子。
本发明进一步提供增加非CP细胞在长期或短期培养中的生长、存活和/或保持其功能的方法，其包括用CP制品培养非CP细胞的步骤，所述CP制品包括 a)CP细胞群，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或 b)CP细胞培养物，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或 c)来自a)或b)的CP条件培养基，其包含一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子。
优选地，所述非CP细胞为非神经元细胞。
本发明还提供保护在培养物中的非CP细胞免于撤除血清诱导的细胞死亡的方法，其包括将非CP细胞培养在不含血清而含有CP制品的培养基中的步骤，所述CP制品包括 a)CP细胞群，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或 b)CP细胞培养物，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或 c)来自a)或b)的CP条件培养基，其包含一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子。
优选地，所述非CP细胞为非神经元细胞。
本发明还涉及使用本发明的CP制品培养的非CP细胞。
如在本说明书和权利要求书中使用的术语“包括”指“由至少部分组成”，即当解释包括该术语的独立权利要求时，需要存在于各个权利要求中所有以该术语开始描述的特征，还可以存在其他特征。
现在，本发明将通过参照附图进行更详细地描述，其中 图1显示了一组于不存在脉络丛细胞的情况下生长的胰岛细胞(对照)或在与脉络丛细胞以1∶3(1∶3)的比例共培养的胰岛细胞的免疫过氧化酶染色的显微照片。对于胰岛素染色的细胞存在于顶行，而对于胰高血糖素染色的细胞出现在底行。这些显微照片显示出CP细胞制品增加了胰岛中胰岛素和胰高血糖素的生成。
图2显示了来自CP制品的条件培养基(CM)增加了神经元的生存力。显示了来自培养的脉络丛的不同浓度的不含血清的CM对神经元细胞生存力的影响，其中对于10％和30％与0％相比，*＝P＜0.0001，对于0％、1％和3％，**＝P＜0.0001 图3显示了来自培养的脉络丛的条件培养基对在补充有胎牛血清的培养基(对照)、不补充的培养基(没有补充)和在补充有脉络丛条件培养基(CP-CM补充)的培养基中培养的神经元细胞的轴突突起(processes)数的影响，其中CP条件培养基增加了神经元细胞上轴突的数量。
图4显示了来自培养的脉络丛的条件培养基对在补充有胎牛血清的培养基(对照)、不补充的培养基(没有补充)和在补充有脉络丛条件培养基(CP-CM补充)的培养基中培养的神经元细胞的轴突突起向外生长的长度的影响，其中CP条件培养基增加了神经元细胞的轴突的长度。
图5显示了包封的CP细胞的共培养对人类脐带血管内皮细胞(HUVEC)增殖的影响，和对VEGF分泌进入培养基的影响，其中包封的CP细胞和HUVEC的共培养导致HUVEC增殖增加。
具体实施例方式 本发明涉及CP细胞或CP条件培养基用于增加非CP细胞在长期或短期培养中的生长、存活和/或保持其功能的用途。
所述CP为分叶结构(lobulated structures)，包括源自脑室的室管膜层的单个连续层的细胞。脉络丛的一个功能是分泌脑脊液(CSF)。脑脊液填充四个脑室，在脊髓周围和脑的凸面上循环。CSF与脑细胞间质液(细胞外)相通，包括大分子的溶质可在CSF和细胞间质液之间自由地交换。除了CSF的生成之外，脉络丛与CSF-血屏障的形成有关(Aleshire SL等人，“Choroid plexus as a barrier toimmunoglobulin delivery into cerebrospinal fluid.”J Neurosurg.63593-7，1985)。然而，其更宽的功能为建立和保持整个脑和脊髓的细胞外环境的基准水平，特别是通过将大量生长因子分泌进入CSF中。研究已经报道了在脉络丛内存在大量有效的营养因子，包括TGFb、GDF-15、GDNF、IGF2、NGF、NT-3、NT-4、BDNF、VEGF和FGF2(参见评述Johanson CE等人，“Choroid plexus recovery after transient forebrainischemiarole of growth factors and other repair mechanisms.”Cell MoINeurobiol.20197-216，2000)。
本发明认识到脉络丛(CP)细胞能够分泌因子，比如神经营养因子、生长因子、血管内皮生长因子、营养因子、细胞因子、促细胞分裂剂、基质细胞支持因子、酶比如蛋白酶类、α-1抗胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶、乳糖酶或麦芽糖酶及其它可在增加非CP细胞在长期或短期培养中的生长、存活和保持其功能中有用的蛋白质。
特别地，本发明提供CP制品用于增加非CP细胞在长期或短期培养中生长、存活和保持其功能中的用途，其中所述制品包括 a)CP细胞群，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或 b)CP细胞培养物，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或 c)来自a)或b)的CP条件培养基，其包含一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子。
所述非CP细胞可以是神经元或非神经元细胞，选自包括原发皮层神经元细胞、胰岛β细胞、成纤维细胞；能生成或分泌因子VIII的细胞，比如肝细胞、胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝脏血管上皮细胞、肝脏血管内皮细胞、血窦细胞(sinusoid cells)、非肝实质细胞和脐带内皮细胞；能生成因子VIII和血管假性血友病因子的细胞，比如内皮细胞、肝脏内皮细胞和脐带内皮细胞；心肌细胞；心脏传导系统的细胞，比如窦房结、房室的节细胞和房室束；和参与修复新生儿畸形和遗传性代谢缺陷的细胞，所述遗传性代谢缺陷比如氨基酸代谢病、有机酸尿症、遗传性特定蛋白质不足、酶不全病包括尿素循环障碍、色素代谢障碍、嘌呤代谢障碍和多糖和粘多糖及糖蛋白代谢障碍。
在用本文定义的制品培养之前，所述要被培养的非CP细胞可以处于休眠状态，比如冷冻干燥的或冷冻的。这样的休眠细胞可以在适宜的条件下，在适宜的细胞培养的培养基中培养，比如Hams F-12、Dulbecco′s修饰的Eagles培养基(DME)、RPMl 1640和Iscove′s修饰的DME，所述适宜的条件取决于细胞类型，如本领域技术人员所能理解的。接着，将所述CP制品以一定量加入到在培养物中的非CP细胞，与没有向其中加入CP制品的这样的细胞相比，其将增加非CP细胞的生长、存活和/或保持其功能。
所述CP制品可包括纯化的CP细胞群和/或CP衍生的细胞，选自神经胶质或神经胶质衍生细胞、上皮细胞、多能神经元前体细胞(multipotent neuronal precursor cells)、祖细胞、和对神经元前体细胞标记物为阳性的细胞(比如neu-N)。
所述CP制品的CP和CP衍生的细胞可以使用本领域已知的方法从任意供体哺乳动物获得，所述哺乳动物包括猪、羊、母牛、山羊、兔、小鼠和灵长类，包括恒河猴和人类，所述方法例如在WO00/66188中描述的。所述CP和CP衍生的细胞可以从供体的脑或从脑脊液直接获得。
可选地，所述CP制品的CP和CP衍生的细胞可以从CP或CP衍生的细胞系获得，包括永生的(immortalized)细胞系，比如TR-CSFB细胞(Hosoya K，Hori S，Ohtsuki S，Terasaki T，(2004)。A new in vitromodel for blood-cerebrospinal fluid barrier transport studiesan immortalized choroid plexus epithelial cell line derived fromthe tsA58 SV40 large T-antigen gene transgenic rat.(用于血脑脊液屏障运输的体外模型研究了源自tsA58 SV40大T-抗原基因转基因的大鼠的永生的脉络丛上皮细胞系)，Adv Drug Deliv Rev.56(12)1875-85)；或Z310细胞(Zheng W，Zhao Q，(2002)，Establishment and characterization of an immortalized Z2310 choroidalepithelia cell line form murine choroids plexus，Brain Res.958(2)371-80)。
可以使用本领域众所周知的遗传修饰技术遗传修饰所述CP制品的CP和CP衍生的细胞，以产生一种或多种期望的因子，所述因子将增加非CP细胞在长期或短期培养中的存活和生长。
在本发明中使用之前，所述CP制剂可以被冷冻干燥或冷冻来储存，如本领域技术人员所理解的。当使用时，所述冷冻的或冷冻干燥的CP制剂可以简单地重构。
所述CP制剂可包括分离的CP和/或CP衍生的细胞或小的这样的细胞簇，其可以是“裸露的(naked)”，即，以其在从供体或细胞培养收获后的自然状态存在，或者它们可以被通过本领域已知的方法包封在生物相容性物质比如海藻酸盐中(参见例如WO00/66188和US6322804)。可选地，这样的细胞无论是裸露的或包封的都可以被放入限制工具(confinement means)中，其起与培养物中的非CP细胞分隔CP制品的作用，比如管或其他结构，其由在培养物中允许生长因子等从CP制品扩散进入非CP细胞的生物相容性材料制成。
可选地，所述CP制品包括来自CP和/或CP衍生的细胞的条件培养基。条件培养基为从CP和/或CP衍生的细胞培养物制备，其中所述细胞已经在一定的条件下培养了一段时间，所述条件允许从CP和/或CP衍生的细胞分泌生长因子等进入培养基。接着，将所述条件培养基与细胞分离，提供本发明所用的富含因子、无细胞的CP制品。
本文定义的CP制品对短期或长期培养非CP细胞有用。如上所述，可以在将非CP细胞移植进入接受者之前，将其短期培养。当非CP细胞要培养很长时间时，比如例如，在连续培养系统中培养，所述CP制品可以保持与非CP细胞培养分离，并且例如和当需要时，无论通过是人工的还是自动的输注装置或其类似物加入其中。
可选地将所述CP制剂植入聚合物或其他生物相容性基质中，当与在培养物中的非CP细胞接触时，所述聚合物或其他生物相容性基质可以被降解，以释放CP细胞。可选地，所述聚合物可以是不可降解的，但替换的是可以对丛CP制品分泌的或释放的生长因子是可渗透的。
本发明还涉及脑脊液(CSF)作为本发明所用的CP制品的用途。如上讨论的，在体内CP细胞分泌生长因子等进入CSF。因此，CSF将包含能增加非CP细胞生长和存活的CP分泌的因子，其可以用于本发明。所述CSF可包括CP和/或CP衍生的细胞。
本发明为还涉及增加非CP细胞在长期或短期培养中的生长、存活和/或保持其功能的方法，其包括用CP制品培养非CP细胞的步骤，所述CP制品包括 a)CP细胞群，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或 b)CP细胞培养物，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或 c)来自a)或b)的CP条件培养基，其包含一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子。
本发明进一步涉及保护在培养物中的非CP细胞免于撤除血清诱导的细胞死亡的方法，其包括将非CP细胞培养在不含血清而含有CP制品的培养基中的步骤，所述CP制品包括 a)CP细胞群，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活率和生长的因子；和/或 b)CP细胞培养物，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或 c)来自a)或b)的CP条件培养基，其包含一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子。
优选地，所述非CP细胞为非神经元细胞。
本发明有许多益处，包括 -保护培养物中的非CP细胞免于在比如损伤、疾病、创伤、撤除血清等事件中的损伤； -预防或最小化在培养物中的非CP细胞的细胞凋亡性细胞死亡； -再生在培养物中的非CP细胞的破坏的细胞； -阻止或终止由事件比如细胞损伤、疾病、创伤、撤除血清引起的在培养物中的非CP细胞的细胞死亡和/或细胞死亡级联(cascades)； -增强在培养物中的非CP细胞的细胞功能； -增强在培养物中的非CP细胞的细胞存活； -提供在培养物中的非CP细胞的细胞存活、生长和/或保持其功能所需的因子。
广义地说，本发明也可以包括分别或组合的在本申请的说明书中所指出的或显示的部分、要素和特征，及任意两种或多种所述部分、要素或特征的所有组合，其中本文提及的具体的完整的事物具有本发明涉及的领域已知的同等物，这样的已知的同等物被认为包括在本文中，就像它们被分别阐述一样。
本发明包括前述的以及下述的内容，其中下述的内容仅仅是举例。
实施例1 CP制剂支持非神经元细胞在培养物中生长和存活的用途 将游离的和包封的猪胰岛细胞与CP细胞或CP条件培养基共同培养，在短期和长期培养条件下测定胰岛细胞的生存力、成熟和功能。
材料和方法 胰岛细胞和分离和纯化 通过经由Ricordi等人(1990)记载的步骤用胶原酶(Liberase)消化切碎的胰腺来分离猪胰岛细胞，方法有一些修饰。使用无菌技术，用Liberase(1.5mg/ml)扩张腺，修剪(trimmed)过量的脂肪、血管和结缔组织，切碎并在37℃在以120rpm振摇的水浴中消化10分钟。消化后，将细胞通过无菌280μm目筛，进入无菌烧杯中。对于任何没有消化的组织进行第二次消化(10分钟)。
胶原酶消化过程的更详细的细节在Diatranz′s Manual of StandardOperating Procedures，SOP P101中和在前述专利，比如例如WO01/52871和WO02/32437中可获得。
胰岛的产量和生存力 经由二硫腙(DTZ)染色细胞测定胰岛产率。二硫腙为锌螯合剂，其选择性染色Langherhans的胰岛中的锌，产生特定的红色外观。
使用吖啶橙和碘化丙啶(AO/PI)测定胰岛细胞的生存力。吖啶橙为一种发荧光的染料，其易于穿过所有的细胞膜染色细胞质和细胞核。暴露于紫外线(UV)灯时，在细胞核和细胞质中的亮绿色荧光指示完整的活细胞。相反，碘化丙啶为一种发荧光的染料，其不能通过完整的膜。当暴露于紫外线灯时，它发射鲜红色荧光，碘化丙啶在细胞核中的存在指示严重破坏或死亡细胞。
胰岛的成熟和功能体外胰岛素分泌能力 通过将猪胰岛暴露在低浓度的葡萄糖(2.8mmol/L)和高浓度的葡萄糖(19.4mmol/L)加茶碱(10mmol/L)两者中，使用稳定的葡萄糖刺激(SGS)来评价其在体外的功能。然后，计算胰岛素刺激指数，作为对于SGS测定中高浓度对低浓度葡萄糖从胰岛中释放胰岛素的速率(以μU/100IEQ/小时)。胰岛素刺激指数＞3被认为是可接受的活细胞的指示剂。
组织学 在SGS后，将细胞放置在凝血酶结块中(20-50μl的猪血浆与相同量的凝血酶1000U/ml混合)。然后，将含细胞结块固定在10％福尔马林中，并包埋在石蜡中。制备5μm切片用于标准的苏木精和伊红(H &E)、胰岛素和胰高血糖素(IPX)免疫过氧化酶染色。
共培养的条件 如下将来自单批(BR50)的胰岛制剂与CP细胞的制品或来自CP细胞培养的培养基共培养 1.在共培养中的猪游离的胰岛与包封的CP(比例1∶1)。通过40μm目膜将两种细胞类型分离，游离的胰岛在篮状植入物(basket insert)中，和脉络丛微胶囊在植入物下的孔中自由浮动。所有的试验进行一式三份。
2.猪游离的胰岛与游离的CP(比例1∶1)聚集。在分离后第3天，将胰岛和脉络丛细胞团块放在一起。聚集的目的是修复胰岛周围的施旺细胞。
3.用CP条件培养基培养猪游离的胰岛。将游离的胰岛放置在6孔培养皿中的40μm目篮状植入物中。所述CP条件培养基为来自CP细胞培养物(批BR52)的48-72小时培养基的上清液。
4.培养的包封的猪胰岛与游离的CP细胞簇(比例1∶3)。将所述包封的胰岛包含在40μm目篮状植入物中，将所述CP细胞附着在6孔培养皿上。
5.培养的包封的猪胰岛与CP条件培养基。将所述包封的胰岛包含在40μm目篮状植入物中，将所述CP细胞附着在6孔培养皿上。
结果 1.在共培养中的猪游离的胰岛与包封的CP细胞(比例1∶1)。
与包封的CP细胞共培养的猪胰岛保持活性并响应稳定的葡萄糖刺激(SGS)至多21天。与7天相比，在第21天胰岛素应答增加59.8％，如下表1所示。
组织学显示了在第21天的胰岛素和胰高血糖素阳性细胞(IPX)。
表1 2.猪游离的胰岛与游离的CP细胞的聚集(比例1∶1)。
胰岛释放足量的胰岛素至多60天。在第21天，胰岛素生成增加最大值为83％。在第60天，应答类似于第7天的，如下表2所示。
表2 3.用CP条件培养基培养的游离的胰岛 在CP条件培养基的存在下，胰岛生成大量的胰岛素。例如在第7天，与对照胰岛相比，胰岛素增加332％，在第21天，增加114％。在第60天，与对照细胞相比，胰岛生成高于612％的胰岛素，如下表3所示。
表3 4.培养的包封的猪胰岛与游离的CP细胞簇(比例1∶3) 与对照相比，在培养物中21天后，与CP细胞簇共培养后对SGS的应答高，如下表4所示。
表4 在培养60天后，也研究这些胰岛细胞的组织学。
在第60天，共培养的胰岛细胞显示出形成胰岛素阳性细胞的新簇，与对照胰岛相比胰岛更成熟(上部，图1)，而且，与对照细胞相比，胰高血糖素阳性细胞(包括强阳性细胞)的数量更多(底部，图1)。
5.用CP培养基培养包封的猪胰岛 在第7天，胰岛对SGS的应答比对照细胞高368％；在第21天，比对照细胞高350％，且在第60天，胰岛素的含量比第21天高173％，结果如在下表5中所示。
表5 总结 这些数据表明CP制品增加了生成胰岛素的胰岛细胞的存活和功能。
实施例2 CP制品保护培养物中的神经元细胞免于撤除血清诱导的细胞死亡 脉络丛(CP)细胞分泌神经营养因子的混合物(cocktail)。在下述研究中，CP条件培养基促进了培养基中胎大鼠神经元细胞的存活和功能，提供了对在体外神经营养缺乏的保护。
材料和方法 体外生物活性 通过将CP条件培养基放置在原发的15天胚胎皮层神经元上测定脉络丛的体外生物活性，并测定其在撤除血清的条件下对神经元存活的影响。用于制备和保持原发皮层神经元培养物的技术与之前描述的那些类似(Fukuda A，Deshpande SB，Shimano Y，Nishino H.“Astrocytes are more vulnerable than neurons to cellular Ca2+overloadinduced by a mitochondrial toxin，3-nitropropionic acid”，Neuroscience.87497-507，1998)。从在15天胚胎的Wistar大鼠取下大脑，培养在用冰冷却的HBSS中。解剖分离皮层组织，切成小块，在37℃，用不含Ca2+的Hanks′溶液培养30分钟，所述Hanks′溶液包含胰蛋白酶(0.05mg/ml)和胶原酶(0.01mg/ml)，接着，加入大豆胰蛋白酶抑制剂(0.1mg/ml)和DNase(0.1mg/ml)。然后，在补充有10％胎牛血清的Dulbecco′s修饰的Eagle’s培养基中的组织离心5分钟(1000rpm)。再悬浮沉淀，并通过使用防火(fire polished)Pasteur吸量管温和的研磨制得均匀的细胞悬浮液。将细胞放置在35mm组织培养皿上(5×104细胞/ml)。将所述培养皿保存在37℃和5％CO2和95％空气下的湿润的培养箱中4天。在第4天，将细胞再放置在24孔培养皿中，经过又一个两天后，不用血清和用大范围浓度的条件培养基(0-30％)培养细胞的子集。如在本文的实施例3中的描述制备CP条件培养基，使用前，储存在-20℃。在第6天，使用台盼蓝排除分析细胞生存力。所有的研究进行一式三份。
神经元细胞功能 根据如上所述的方法制备15天胎大鼠大脑的原始培养物，放置在96孔培养皿中。用补充有B27营养和胎牛血清(10％)的Neurobasal培养基建立培养物4天。建立后，将培养细胞分成三组在血清补充的培养基中生长的对照细胞；在没有补充的培养基中生长的细胞；和在补充有的CP条件培养基的培养基中生长的细胞。然后，对于每个细胞组，测定轴突突起数和轴突突起的向外生长的程度，作为神经元细胞功能的指示剂。
结果 体外生物活性 体外试验证实由包封的脉络丛分泌的分子发挥有效的神经营养的效果。整体ANOVA揭示了对神经元细胞生存力的处理效果(ANOVA，F5，3.8＝109.01，p＜0.0001)。与保持在血清培养基中的细胞相比，不含血清2天的原发皮层神经元显示出明显的细胞死亡(约90％)(图2)。从猪脉络丛收集的条件培养基明显地防护撤除血清诱导的细胞死亡。该效果为剂量依赖性的，当用10％至30％的来自猪脉络丛的条件培养基培养不含血清的神经元时，获得最大的效果(p′s＜0.0001)。在这些浓度下，神经元存活率为60％-85％，并且与血清维持的细胞细胞差别不大(p′s＞0.05)。
神经元细胞功能 在补充有B27营养和胎牛血清(10％)的Neurobasal培养基中培养的神经元已建立，并伸出轴突伸展，其包括神经元网络的基本的和主要的成分。在血清中存在的神经营养生长因子的影响下，这些轴突突起的数量和长度增加。
用未补充的培养基替换培养基(因此，所述神经元没有血清衍生的神经营养生长因子的支持)，导致轴突数和长度减少。用通过CP细胞簇的分泌活性处理48小时的条件培养基的50％补充所述未补充的培养基，导致轴突数恢复(CP-CM补充，图3)和轴突延伸(CP-CM补充，图4)至接近10％胎牛血清中可见的数量和长度(图3和4，对照)。
实施例3 包含多能神经元细胞前体的CP制品 根据本文描述的方法制备包含具有多能神经元前体特征的细胞的脉络丛(CP)细胞簇。
材料和方法 细胞培养物 如本文所述分离新生的猪和成年大鼠的脉络丛，将其培养在空气中含有5％CO2和补充有2％新生猪血清、烟酰胺和cyproxin的RPMI中的细胞培养物中，如实施例1所描述的。
免疫组织化学 沉淀细胞簇(约2000-2500)，去掉培养基使其减少为100微升的体积，在35-37℃，在Hanks平衡盐类缓冲溶液(200微升)将悬液与2％低熔点的琼脂糖混合。使该物质冷却，并将包含所述细胞簇的凝固的琼脂糖块固定在中性缓冲的福尔马林中。使用标准方法将所述块处理进入石蜡，在切片机上将这些块切成切片(5微米厚)，放置在标准的玻璃显微镜载片上。根据抗血清供应者的说明，使用对使用免疫组织化学检测技术的neu-N特异性的抗血清染色neu-N的切片。
结果 当在培养物中7-8天后测定时，发现约20％的细胞，主要在所述簇的外周，对神经元前体标记物neu-N为阳性。这些数据表明包括细胞的脉络丛具有多能神经元前体的特征，当在本文描述的条件下培养时，这样的细胞存活并保持它们的表型。
实施例2和3的总结 这些数据表明CP制品增加神经元细胞的存活和功能分化，并且也可以生成多能神经元前体。
实施例4 用脉络丛(CP)细胞的条件生长培养基处理的猪成纤维细胞增殖 评价来自CP细胞的24小时培养物的不含血清的条件培养基增加成纤维细胞增殖的能力。
材料和方法 CP细胞SFCM 在不含血清的条件培养基(SFCM)中培养脉络丛细胞簇24小时。收获所述培养基，过滤并冷冻至-80℃直到使用。
猪皮肤成纤维细胞 成纤维细胞源自猪皮肤，培养和传代并冷冻，当需要时溶化。在24孔培养皿中，以15,000细胞每孔用在1ml的培养物中包括MinimumEssential Media(MEM，Gibco，USA)+10％胎牛血清(FBS+0.08％环丙沙星)的完全生长培养基接种猪皮肤成纤维细胞，一式三份。
也在不含血清的生长培养基(MEM+0.08％环丙沙星)中，以20,000细胞每孔接种猪皮肤成纤维细胞。在24孔培养皿中，在1ml培养基中接种细胞，一式三份，24小时后检查细胞增殖。
增殖测定 使用细胞计数试剂盒8(CCK-8)，Dojindo(Japan)测定猪皮肤成纤维细胞的增殖。使用Dojindo′s四唑盐、WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑，一钠盐)进行CCK-8的测定，当在电子载体1-甲氧基PMS存在下生物还原时，所述WST-8生成水溶性的甲月替(formazan)染料。将CCK-8溶液直接加入到细胞中。通过细胞脱氢酶将WST-8生物还原成橙色甲月替产物，其可溶于组织培养基中。生成的甲月替的含量与活细胞数成正比。
对于接种在24孔培养皿上的细胞，将100μl的CCK试剂加入到1ml生长培养基中。培养该培养皿24小时。将100μl的等分试样转移到96孔培养皿中，使用E-Liza MAT 3000培养皿阅读器在450nm(DRG，USA)读其相对于含有试剂(没有细胞)的对照生长培养基的光密度(ODs)。
由直线标准曲线计算细胞数，所述直线标准曲线为从一个范围内的通过血细胞计数器和CCK试剂测定的成纤维细胞数的ODs产生的。
结果 1.在完全生长培养基和不含血清的生长培养基中的猪皮肤成纤维细胞 与在不存在CP条件培养基下生长的成纤维细胞相比(对照)，在CP条件培养基中培养的猪皮肤成纤维细胞导致在完全生长培养基(表6)和不含血清的生长培养基(表7)中的生长率增加。
表6 培养基条件 每孔细胞数 ％ 完全生长培养基(对照) 159×103100 完全生长培养基+5％CP细胞SFCM 183×103115 完全生长培养基+10％CP细胞SFCM178×103112 完全生长培养基+15％CP细胞SFCM190×103120 完全生长培养基+20％CP细胞SFCM173×103109 表7 培养基条件 每孔细胞数 ％ 完全生长培养基(对照) 144×103100 完全生长培养基+5％CP细胞SFCM 168×103114 完全生长培养基+10％CP细胞SFCM164×103116 完全生长培养基+15％CP细胞SFCM176×103122 完全生长培养基+20％CP细胞SFCM158×103110 总结 这些数据表明CP条件培养基包含增加非神经元细胞比如成纤维细胞增殖的因子。
实施例5 包封的CP制品增加人类脐带血管内皮细胞(HUVEC)增殖的用途 材料和方法 包封的CP细胞的分离和制备 如本文描述的，从7天龄猪中分离脉络丛。在包含2％从小猪供体同窝的小猪获得的新生猪血清和抗生素(RPMI-CP)的RMPI中的7天培养期后，通过已知的方法以30K/mL海藻酸盐的密度将脉络丛簇包封在海藻酸盐-聚鸟氨酸-海藻酸盐微胶囊中。在与HUVEC共培养前，在最适宜的培养条件下使包封的脉络丛(eCP)培养3天。此时，通过在1mL新鲜RPMI-CP中培养6000个包封的簇同等物24小时并用R&D系统生成的夹心ELISA测定VEGF来评价样品分泌血管内皮生长因子(VEGF)。
eCP与HUVEC的共培养 HUVEC培养物是在24孔组织培养皿中建立的，其在包含大脑抽出物(BE)的基础培养基中融合50％，大脑抽出物为一种已知的促进HUVEC生长的制剂。从所有的样品中除去培养基，向每孔加入新的培养基和/或eCP。每个样品包括1mL总体积的培养基。各组如下 样品 N培养基 HUVEC 10 基础+BE(完全) HUVEC 10 基础(不完全) eCP(2.5K)+HUVEC 3基础 eCP(5K)+HUVEC 4基础 eCP(10K)+HUVEC3基础 共培养72小时后，收集eCP和条件培养基、分开并且经72小时测定培养基的VEGF。通过受胰蛋白酶作用细胞计数HUVEC，并在超声溶解细胞后，使用来自Molecular Probes的PicoQuant DNA测定试剂盒检测DNA。
结果 体外保存3天的来自eCP的条件培养基显示出6000个包封的簇分泌1.15±0.02ng VEGF/1mL/24小时。当在最低限度培养基中与HUVEC培养时，观察到HUVEC的细胞增殖显著的增加，如图5所示，其显示出每组共培养条件的细胞数和最终VEGF水平。对所有的组，除了10K和5K eCP组，VEGF水平，在右Y轴显示并对应于三角形标记，除了10K和5K eCP组之外所有都低于检测极限，所述10K和5K eCP组测定的VEGF水平分别为546±51和174±69pg/mL/72小时。
在图5中显示的细胞计数证实了eCP对HUVEC增殖的清楚的效果，其没有表明在这些试验中评价的水平的剂量依赖性。所有eCP组和在特别用于HUVEC增殖的培养基配方(完全培养基)中培养的组为统计学相等的，并且高于在不完全培养基中的细胞计数。所述eCP组，其缺少用于HUVEC生长配制的脑抽出物，得到了与完全培养基相同的生长水平。
总结 这些结果表明包封的脉络丛分泌较高水平的生物活性VEGF。在与HUVEC的共培养系统中，eCP能够刺激在不完全培养基中与如在包含特别地制备用于HUVEC增殖的大脑抽出物的培养基中相同水平的HUVEC生长。这点似乎不是剂量依赖性作用，然而，因为VEGF在培养基中的半衰期短、试验的72小时持续期和HUVEC的未知代谢率，这一可能不能被排除。这些数据表明eCP分泌增加非神经元细胞比如脐带细胞增殖的因子。
讨论 这些试验证实CP制品，包括CP细胞和/或CP衍生的细胞和/或CP条件培养基，生成显著量的神经营养因子和生长因子，其能增加非CP细胞在细胞培养物中的生长和存活，所述非CP细胞包括神经元细胞和非神经元细胞。而且，实验证实CP制品可以保护神经元免于撤除血清诱导的细胞死亡。所述CP制品进一步能刺激和/或保持在神经元细胞中的神经元轴突突起，其对支持(underpins)所有大脑活动的中枢神经系统网状结构是必不可少的。尽管对CP条件培养基补充剂的应答没有超过在实施例2中对血清的应答，在该培养基中的蛋白质浓度少于在血清补充剂中的1％，因此，其为非常有效的制剂。这些试验证实如本文定义的CP制品能增加体外神经元和非神经元细胞的血清存活和功能。
工业实用性 本发明在增加非CP细胞在长期或短期培养中的生长和存活特别有用。这样的非CP细胞可包括已经从供体获得的细胞或组织，其在移植到接受者之前保持短期培养。可选地，所述非CP细胞可包括用于体外试验的第一代和第二代细胞培养物或细胞系，其包括永生的细胞系。
其不意味着限制本发明的范围到上述实施例。如本领域技术人员将理解的，在不背离附加权利要求的范围下，多种变化都是可能的。
在本说明书中，其中所用的参考有专利说明书、其它外部文献或其它信息资源，这些通常是为了提供讨论本发明特征的背景。除非另有特别的说明，对这些外部文献的参考不能被看作是一种许可，这些任意权限的文献或这些信息来源是现有技术或者成为本领域公知常识的一部分。
权利要求
1.脉络丛(CP)制品用于增加非CP细胞在长期或短期培养中生长、存活和/或保持其功能的用途，其中所述制品包括
a)CP细胞群，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或
b)CP细胞培养物，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或
c)来自a)或b)的CP条件培养基，其包含一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述非CP细胞为神经元或非神经元细胞，选自原发皮层神经元细胞、胰岛β细胞、成纤维细胞、能生成或分泌因子VIII的细胞、能生成因子VIII和血管假性血友病因子的细胞、心肌细胞、心脏传导系统的细胞或参与修复新生儿畸形或矫正遗传性代谢缺陷的细胞。
3.如权利要求2所述的用途，其中所述能生成因子VIII的细胞选自肝细胞、胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝脏内皮细胞、血窦细胞、非肝实质细胞或脐带内皮细胞。
4.如权利要求2所述的用途，其中所述能生成因子VIII和血管假性血友病因子的细胞选自内皮细胞、脐带内皮细胞或肝脏内皮细胞。
5.如权利要求2所述的用途，其中所述心脏传导系统的细胞选自窦房结细胞或来自房室束的细胞。
6.如权利要求2所述的用途，其中所述细胞参与修复新生儿畸形和遗传性代谢缺陷，选自氨基酸代谢病、有机酸尿症、遗传特异性蛋白质缺乏症、酶不全病包括尿素循环障碍、色素代谢障碍、嘌呤代谢障碍和多糖和粘粘多糖和糖蛋白代谢障碍。
7.如权利要求1所述的用途，其中在移植进入接受者之前将所述非CP细胞培养短时期。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述非CP细胞为胰岛β细胞，在移植进入接受者用于治疗糖尿病之前培养。
9.如权利要求1所述的用途，其中所述非CP细胞获得自与CP制品的细胞不同的种类。
10.如权利要求9所述的用途，用于增加在异种移植中使用的非CP细胞的生长和存活。
11.如权利要求1所述的用途，其中所述非CP细胞在用CP制品培养之前为休眠状态。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述非CP细胞被冷冻干燥或冷冻。
13.如权利要求1所述的用途，其中一种或多种能支持非CP细胞存活和生长的因子选自神经营养因子、生长因子、血管内皮生长因子、营养因子、细胞因子、促细胞分裂剂、基质细胞支持因子、酶、能降解有毒蛋白质沉淀的蛋白酶类或能络合有毒金属离子的蛋白质。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述酶选自蛋白酶类、α-1抗胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶、乳糖酶和麦芽糖酶。
15.如权利要求13所述的用途，其中所述能络合有毒金属离子的蛋白质选自转铁蛋白和血浆铜蓝蛋白。
16.如权利要求1所述的用途，其中所述a)和/或b)的CP细胞包括纯化的CP细胞群和/或CP衍生的细胞，选自神经胶质或神经胶质衍生细胞、上皮细胞、多能神经元前体细胞、祖细胞、和对神经元前体细胞标记物为阳性的细胞。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述神经元前体细胞标记物为neu-N。
18.如权利要求1所述的用途，其中所述CP细胞为直接从下述获得a)适宜的哺乳动物供体，b)第一代或第二代CP培养物，c)包括永生的CP细胞系的CP细胞系，或者a)、b)和c)的组合。
19.如权利要求18所述的用途，其中在培养物中的所述CP细胞已经被遗传修饰。
20.如权利要求18所述的用途，其中当所述CP细胞为直接地从供体获得时，其被包在脑脊液中。
21.如权利要求1所述的用途，其中所述CP和/或非CP细胞包括分离的细胞或细胞簇，并且是游离的或被包封的。
22.如权利要求21所述的用途，其中所述CP和非CP细胞是游离的以便彼此直接接触，或者它们是游离的但通过生物相容的分离工具分离，所述分离工具能使CP细胞分泌的因子扩散到非CP细胞。
23.CP制品用于增加非神经元细胞在长期或短期培养中生长、存活和/或保持其功能的用途，其中所述制品包括
a)CP细胞群，其能产生一种或多种支持非神经元细胞存活和生长的因子；和/或
b)CP细胞培养物，其能产生一种或多种支持非神经元细胞存活和生长的因子；和/或
c)来自a)或b)的CP条件培养基，其包含一种或多种支持非神经元细胞存活和生长的因子。
24.增加非CP细胞在长期或短期培养中生长、存活和/或保持其功能的方法，其包括用CP制品培养非CP细胞的步骤，所述CP制品包括
a)CP细胞群，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或
b)CP细胞培养物，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或
c)来自a)或b)的CP条件培养基，其包含一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述非CP细胞为非神经元细胞。
26.保护在培养物中的非CP细胞免于撤除血清诱导的细胞死亡的方法，其包括将非CP细胞培养在不含血清而含有CP制品的培养基中的步骤，所述CP制品包括
a)CP细胞群，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或
b)CP细胞培养物，其能产生一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子；和/或
c)来自a)或b)的CP条件培养基，其包含一种或多种支持非CP细胞存活和生长的因子。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述非CP细胞为非神经元细胞。
28.使用权利要求1定义的CP制品培养的非CP细胞。
全文摘要
本发明涉及脉络丛细胞和/或脉络丛条件培养基用于增加非脉络丛细胞在长期或短期培养中生长、存活和/或保持其功能的用途。
文档编号C12N5/071GK101189328SQ200680012956
公开日2008年5月28日 申请日期2006年4月18日 优先权日2005年4月18日
发明者R·B·埃利奥特, S·J·M·斯金纳, L·D·C·E·奥雷利亚纳, C·萨诺斯 申请人:神经营养细胞私人有限公司