天然食品追溯物的制作方法

专利名称：天然食品追溯物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含天然核酸序列的用于食品的追溯物，用于该产品的追溯方法，所述追 溯物的用途，以及以所述追溯物标记的食品。
背景技术：
、.对产品来源的认识问题，反假冒品的斗争问题，追溯某 一产品的准确来源的可能性问 题，都是目前的现实问题，人们已经提出几种方法与追溯系统来解决这些问题。例如，国际申请WO 03/087765揭示了一种用于追溯动物和食品的各自起源的方法， 通过个体DNA的指紋分析来追溯。所揭示的方法的目的是通过整个食物链回溯到在生产 农场的来源系统来实现食品的可追溯性。在WO 03/087765中所揭示的方法提供了一种用 于可追溯性的亲代动物的遗传概貌，或者亲代动物的产品的遗传概貌，包括获得所述亲代 动物样品或者该亲代动物的所述产品的样品，利用基于DNA标记的系统对所述亲代动物 或者该亲代动物的所述产品进行基因分型，以从基于使用DNA遗传标记的系统中获得所 述亲代动物或者该亲代动物的产品的基因组序列概貌。所述的概貌可实现系统的确定或者 所述亲代动物样品或者该亲代动物的产品的农场来源的确定。基因分型可通过微卫星、 SNPs、 AFLPs、缺失、插入的方法得到实现，并要求该动物的基因图语有可追溯性。这可 以通过采用同一动物的多态性来实现，如通过该专利的实施例中的方式，因此建立用于获 得产品的标记的装置。显然，所描述的方法能被部分应用于来自农场的肉类，因为单个繁 殖雄体(牛、猪等)的基因分型提供了用于数百个动物的从所述亲代动物带来的一半的基 因遗传信息。然而，所述追溯方法仅应用于食品，例如奶制品或蔬菜产品。而且，在亲代 动物的例子中也发现，动物的死亡与有用的生殖材料和/或卯细胞的不足，将不可避免地带 来新动物基因分型的需要。因此，用于动物和/或它们的产品的识别方法需要后续的调整和 进一 步分析，并且不可以被用于亲代动物的基因分型未知的系统。美国专利申请US2004/0137458描述了 一种以单链核脊酸制备的标签，以及所述标签 用于监控、'检测或追溯含有所述标签的物质的用途。该专利申请揭示了这样的情况所描述的标签可被用于标记食品，但是，该专利申请并未指出该发明将怎样进行以实现用于标 记食品的目的。国际专利申请WO 00/44891揭示了一种含有DNA片段的墨水，该DNA片段以含有3' 和5'端标记基团的引物扩增得到，目的是识别已标记或以所述墨水染色的产品。所有上面提及的例子揭示了 一种标记物，它包含人工合成的和/或以并不适用于食品的 物质标记的序列；还揭示了另一种标记物，它包含需要每次对在被追溯的食物链的起始处 的对象进行基因分型的序列，以使该对象被定义。直至现在，本领域的技术中尚未提供用于农产品和食品的合适的追溯物，即使在如上 所述的被追溯的动物基因分型的例子中，也未提供可信赖的、快速检测的，以及不依赖于 来自动物或者来自植物的，可直接用于食品的生产的追溯物。发明内容本发明提供了一种用于天然来源的食品的追溯物，不需要产品自身的指紋分析，所述 追溯物也适用于农业食品，典型的产品例如来源的注册标记(R.D.O.)产品，来源的保 护标记(P.D.O.)产品，保护的地理说明(P.G丄)产品，来源的保证和注册标记(G.R.D.O.) 产品。本发明是基于DNA多态序列作为标记的用途，所述的标记例如，通常用于可食用产 品的植物、动物、细菌、真菌、酵母或者其他微生物的SNPs (单核普酸多态性)或者微卫 星如SSRs (单序列重复)或者STRs (单串联重复)等。所述的标记被包括在一种用于食 品的追溯物内，因此它们也适用于农业食品，因为它们不包含人工序列或人工标记分子， 而这些人工序列或人工标记分子是不适用于可食用产品的，或者是不能满足高品质典型产 品如R.D.O.产品、P.D.O.产品、P.G丄产品、G.R.D.O.产品的要求的。因此，本发明的目的是一_提供了一种包含天然来源和/或天然材料的DNA序列的用于食品的追溯物，它包 括所述序列与合适的赋形剂，其特征在于所述DNA序列包括一个或多个的多态序列，该多态序列可在等于或高于50°C的退火 温度的条件下通过DNA扩增检测到，所述序列包括SNPs和/或微卫星，其中，所述的微 卫星在每个微卫星位点呈现至少5个等位基因，而且,考虑到对于每个微卫星的等位基因 的数量，在所述微卫星位点的等位基因之间的多样性指数必须等于或大于0.5,且该多样性指数与每个等位基因的相对频率符合下列公式DI= 1- Sp 其中，DI表示多样性指数，而Pi表示第i个等位基因的频率。 -一一提供了一种用于制备所述追溯物的方法，包括以下步骤a. 选择植物品种和/或动物系或品种和/或真菌或细菌或酵母或其他微生物系或品系或 种类；b. 从在步骤a所选择的一个或多个的所述种类、系、品种、品系或物种的多个标本中 提取DNA，对每个种类、系、品种、品系或物种进行同质性检验，并选择显示同质性的种 类、系、品种、品系和/或物种；c. 根据以下参数挑选对于所述种类、系、品种、品系和/或物种的一个或多个的多态性 ——所述多态性必须包括SNPs和/或微卫星，且所述微卫星对于每个微卫星位点必须呈现至少5个等位基因；一_考虑到对于每个微卫星的等位基因的数量，在所述位点的等位基因之间的多样 性指数必须等于或大于0.5，且该多样性指数与每个等位基因的相对频率符合下列公式DI= l-Spi2其中，DI表示多样性指数，而Pi表示第i个等位基因的频率；d. 选择一个或多个SNP和/或从步骤C中所选择的微卫星，步骤C的DNA扩增要求 退火温度等于或高于50。 C;e. 分离包含DNA的材料，该DNA来自包含SNPs和/或微卫星的种类、系、品种、 品系和/或物种，该微卫星选自步骤c和d，并将所述材料与合适的赋形剂混合；—_提供了包含SNPs和/或根据前述方法选择的微卫星的多态序列用于沿着整个产 品链识别和追溯食品来源的用途，在该用途中，所选择的并包含在本发明所述的追溯物中 的多态序列是可采用特定引物扩增得到的；一一提供了一种用于检测本发明所述的用于食品的追溯物的方法，包括以下步骤 a.直接以特异引物扩增方法对所述追溯物或从所述追溯物提取的DNA进行微卫星分 析，所述扩增是以以下的一种或多种技术来实现聚合酶链反应(PCR)、实时聚合酶链 反应(RT-PCR)、等温的和嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN)、滚环扩增(RCA)、侵 染技术、单引物等温扩增技术(SPIA技术)、环介导恒温扩增(LAMP )、分枝扩增(RAM )与压力循环技术(PCT);b.将从所分析的追溯物中获得的等位基因与所述追溯物的对照样品的等位基因进行比 较分析；一一提供了以本发明所述的追溯物标记的食品。 本发明的详迷如上所述，本发明所述的追溯物包含天然DNA多态序列。为了实现本发明，所述多 态序列是包含在任一种天然生物体的基因组DNA中，并符合前面章节所描述的参数的， 这些天然生物体例如动物、植物、细菌、真菌、酵母或另一种微生物。所述DNA不是必 须提取自所述生物体，但要求所采用的生物体须含有该DNA,也就是可采用从所述生物体 得到的包含该DNA的材料。当所选择的生物体是不包含在食品本身时，该追溯物能以外 部方式应用于该食品，而不是以任何方式掺杂在食品的器官感觉特性中。如果所选择的生 物体或者其衍生物是包含在所要追溯的产品中(经由实施例中橄榄油、葡萄酒的方式)， 该追溯物可直接以最小量插入该产品。举例来说，可选择橄榄树或葡萄的一个特定性质， 从它们所生产的油或酒是可被作为可追溯的油或酒，因而可引入为追溯物。在本发明的进一步实施例中，所选择用作追溯物的材料通常可被用作产品的制造，例 如，实施例中将植物粉与猪肉脂肪混合后在火腿、种子或破碎的种子上涂脂以制造涂布产 品的程序中，又例如，实施例中将胡椒粉颗粒用于制造意大利腊肠的程序中，等等。因此，本发明所述的追溯物，能被外部地应用于所述产品(相当于以鉴定标签的形式)， 并且也可被应用于所述产品本身，甚至可在制备所述产品的程序中与可食用墨水混合或结 合在所述产品内。针对本发明的目的，所选择的多态序列必须可通过以下的一种或多种的DNA扩增技 术检测到，这些技术例如聚合酶链反应(PCR)、实时聚合酶链反应(RT-PCR)、等温 的和嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN)、滚环扩增(RCA)、侵染技术、单引物等温扩 增技术(SPIA技术)、环介导恒温扩增(LAMP )、分枝扩增(RAM )与压力循环技术(PCT ) 以及其他技术。所有这些技术都是本领域所熟知的技术，且所有这些技术的规程都是本领 域技术人员可以容易完成的。特别地，微卫星分析(SSR)是目前认为容易应用于动物和 植物的追溯和指紋分析的 一种^t术。如前所述，所选择生物体的DNA必须是可由DNA扩增检测到的多态序列，且所述序列必须具有高数量的等位基因(对于一个最理想的结果应至少有5个)，且所述等位基因 必须表现出高杂合性。举例来说，考虑到一个多态位点呈现5个等位基因，如果所述等位 基因之一是以相当高的频率呈现在群体中，而其他四个等位基因呈现相当低的频率，该位 点将不适合被选择作为本发明所述的追溯物。本发明所述的杂合性，表现为多样性指数。 该多样性指数必须高于0.5。而且，本发明所述的追溯物的多态序列必须是可通过采用某 个特定引物在标准扩增条件(约1-3 mM MgC12 )下扩增的，该特定引物具有不低于50°C 的退火温度。在本发明的实施例中，所述DNA序列可来源于植物、动物、细菌、真菌、酵母或其 他微生物。对于所选择的生物材料来说，获得恒定或稳定的DNA标记，是有利于本发明所述的 追溯物的用途的实现的，如果可能的话，取自物种的序列应呈现出无性生殖的或自花受粉 繁殖能力，并表现出高的内在多样的可变性。呈现出前述特征的物种的例子，包括但不限 于橄榄树、软或硬小麦和稻。对于文献已广泛报道的研究较为深入的物种的用途，将导致可以非常快地选择到适用 于本发明所述追溯物的多态性。在本发明的一个实施例中，所述的微卫星序列是一段包括50至540个核苷酸的序列， 甚至只包括100至300个核香酸。相对较短的序列(如前所述)可带来一定的优势，例如， 当该DNA是通过PCR扩增时，PCR的效率取决于所述序列的长度，短序列比较长序列具 有更高的PCR效率，而且，上述短序列的分析也更容易进行。对于采用前述任一种技术扩增得到的多态序列，人们能以本领域技术人员所熟知的标 准技术，容易地分析这些序列的等位基因的成分。例如，对于微卫星，在PCR过程中，可 直接使用已标记的引物，该引物允许在所扩增的DNA的等位基因的成分的变性凝胶上进 行简单检测。对于SNPs,可采用标准的实时PCR。在任意实施例中，DNA多态性的分析 对于本领域技术人员而言是熟知的，可从实验室手册和大量出版物中了解到。任何适用于 分析所述多态性的技术都能被用于检测本发明所述的追溯物。对于本发明的目的，所述追溯物可包含一个以上的可由PCR技术检测到的多态序列。 因此，在实现本发明的过程中，在单独的多重PCR中扩增得到的多态性中进行选择是有利 的。如果这样做，所选择的引物必须是具有较低的退火温度。因此，在本发明的这个优选 实施例中，所选择的多态性能以具有最理想退火温度的引物扩增得到，对于不同微卫星，该引物的退火温度在0.5至3。 C的范围之内，也就是，在具有最低退火温度的引物的退火 温度与具有最高退火温度的引物的退火温度之间的差异是不会超出上述的范围。而且，本 实施例所述的可通过多重PCR扩增的多态性中，该引物对于关注的序列是高特异性的，是 可取的。因此，选择具有等于或高于60。 C的退火温度的引物是有利的。有利的是，对于 每个多态性的任一引物均可被适当地标记，以致使所扩增的序列从其他扩增序列中立即得 到检测，例如，不同的正向引物可被分别标记，以Fam、 Hex、 Vic、 Tet或其他本领域技 术人员所熟知的合适的标记物来标记。在本发明的另一个实施例中，可选择不同的多态性，通常包含在前述的范围内，这些 多态性在扩增后呈现出不同大小的产品。在本实施例中，不必以不同方式标记所述引物， 因为梯形图语(ladder)可指示在对照凝胶中所扩增序列的长度，这将允许即时鉴别每个 扩增产物。与多重扩增相同的原理，可显而易见地应用于本发明所述的所有其他DNA扩增系统。 为了获得一个有效的追溯系统，DNA分析不仅应具有高选择性，而且也应是切实可行 的，通过分析不同种类的样品(粉、液体、种子、提取物、冻干产物，以及所有已经罗列 的样品)，可构建生物型追溯物本身。在经过一段时间后，或者在对要追溯的产品进行热 量和物理处理后，所述分析必须仍是可实现的。本发明所述的追溯物可以采用以下形式来制造固体、溶液、粉末、面粉状、冻干状、 干的野生植物材料、液体，取决于所要标记的食品。更多合适的形式对于本领域技术人员 而言是显而易见的。在一个容易实现的实施例中，所述追溯物能直接以种子、油、酒、面 粉或其他形式出现。在其他实施例中，取自选择用来制备所述追溯物的生物体的材料(包 含本发明所述的DNA序列)可与其他合适的食品、可食用赋形剂或者可食用墨水混合。 在这些实施例中，所述追溯物在储存过程(也就是种子、面粉、油等)中将特别稳定，这 将是特别有利的。显然，应选择制备的形式，该形式将导致所述追溯物更容易应用于选择的食品，而且 在这些形式中，包含在追溯物中的DNA将更容易呈现出来。举例来说，以小麦为例，所选择的追溯物可以选自以下方式- 将小麦粉加入到产品中作为追溯物；- 将小麦粉在可食用墨水中解冻并应用于产品；- 将种子应用于产品作为追溯物；- 将冻千小麦产品应用于产品；- 将小麦板(panels)应用于产品；- 取自小麦的其他产品作为追溯物或者以多种方式进行。 在本发明的一个特别优选实施例中，所选择的追溯物呈现出以下特征- 应用于典型产品具有实用性和容易性；- 具有易于及时呈现的特性，不仅在应用于典型产品之前，而且在保存和销售该产 品的整个过程；- 即使经历了技术处理，起始品种的DNA仍充分完整地保持在所述追溯物中。 相同的评论是有根据的，与所选择用于制备所述追溯物的生物体无关。 在本发明所述的追溯物中，为了避免假冒品，用于制备追溯物的品种(或物种、系、品系)的名称与相应的DNA概貌对于公众是保密的。针对所采用的品种的沉默，将降低 本发明所述的追溯物浮&假冒的风险，4吏假冒成为不可能。事实上，为了假冒本发明所述的 追溯物，假设所选择用于生产所述追溯物的生物体是强制公开的(至少当该追溯物是包含 于食品中时)，为了揭示所采用的品种，用于制备本发明所述的追溯物的物种的所有品种 都应当被测试。而且，为了使用DNA呈现所述追溯物的相同的等位基因成分来进行模仿， 这将需要鉴别所有选择的多态性。当 一种植物品种被用于制备本发明所述的追溯物时，因 为这种植物品种具有成千上万的变异品种分布于全球，这将实际上不可能用来假冒生产本 发明所述的追溯物。在本发明的一个实施例中，所述追溯物可包含取自同一物种的一种以上品种的材料， 也可包含取自同一界的不同物种的一种以上品种的材料，甚至可包含取自不同界的不同物 种的一种以上品种的材料，所述的界包括动物、植物、真菌、原生动物。因此，可选择多态性的混合方式用于检测本发明所述的追溯物，例如，针对品种、物 种和界等的多态性，以便降低本发明所迷的追溯物被复制用于假冒产品的情形，所述追溯 物是应用于该产品上的。呈现特异的和易于区分的DNA指紋的不同系或品种，能被用作 本发明所述追溯物的起始材料，被应用在不同生产阶段中获得的产品上，或者应用在不同 地方获得的产品上，或者应用在通过不同工艺过程获得的产品上，等等，举例来说，品种 A可被用作"标记(label)" 在某年或某月来自地区X的产品，而品种B可被用作"标 记(label)" 在同一年或同一月来自地区Y的产品。本发明所述的追溯物能以外部接触 的方式应用于产品，使产品在标印的同时被追溯，举例来说，以生产者协会批准的方法，在盖上传统印章的相同地区。本发明所述的追溯物也可被应用在食品的包装上，应用在包 裹上，应用在容器上，应用在包含印章的标签上，应用在印章上，等等。从本说明书可以容易地理解到，为了识别与某个标记一起销售的产品的真实性，或者 识别在某个确定期间内从某个地方生产的产品的真实性，以一个用于制备本发明所述追溯 物的品种，用于特别的可追溯系统(采用一个或多个的前述扩增技术)，以及用于对抗以 期待的技术获得的等位基因的板(panel),这将足以检验含有所述追溯物的材料样品的 DNA指紋的准确重叠。如果与所期待的用作本发明所述追溯物的相应的DNA指紋相比， 它是特定的，所检测的产品是可信的。反之亦然，产品是假货。因此，所述追溯物的DNA的简单分析能实现对某一产品的真实性的确认。 如前所述，这也是本发明的目标，即前述的提供用于制备所述追溯物的方法。在制备 所述追溯物的方法中，采用具有特别地遗传稳定性的不同生物体是可能的；因此，采用具 有无性生殖或自花受粉繁殖能力的物种，这些物种具有高的内在多样的可变性，这样是尤 为有利的方式。对于本发明的处理过程，可优选地采用稻、橄榄树或者小麦品种。根据本发明所述的方法，在多态性的选择中，采用本领域所熟知的多态性是有利的， 这样适用于检测，而无须怀疑所选择的品种。尤为有利的是，可选择真核细胞、叶绿体或 者线粒体DNA的多态性。在本发明的一个实施例中，多态性还可基于它们的核苷酸长度来选择，其中，所述长 度是在50至450个核苷酸之间，在所述长度内作为扩增的序列的分析，是更为容易扩增， 且所扩增的DNA比长序列更为容易得到分析。为实现本发明的目标，尤为有利的序列是 在100至300个核苦酸之间。根据本发明所述，用于制备本发明所述追溯物的步骤d的微卫星序列，可通过带有引 物的DNA扩增技术显著地检测到，该引物具有一个退火温度，在具有最高退火温度的引 物的最佳退火温度与具有最低退火温度的引物的最佳退火温度之间的差异是在0.5至3°C 之间。在本发明的一个实施例中，例如用于前述的多重扩增，优选的退火温度应等于或高于 约60。C。事实上，最高温度是保障反应的严格度，最低温度则是保障扩增产物的可能性。在包含多态序列的生物体的选择中，在本发明所述的工艺中，分析要被标记的食品的 制造方法，以及(如果合适的话)选择用于所述食品的生产的生物体，这是有利的。举例来说，在火腿制备过程中，将小麦或稻的面粉与猪肉脂肪混合再用于涂脂，等等。本发明所述的追溯物，包含天然多态序列，该序列包含根据前述工艺选择的SNPs和/ 或微卫星，可被用于沿着整个食品链来鉴定和追溯食品的来源，起码通过采用特定引物对 多态的选择序列的扩增，该序列包含在本发明所述的追溯物中。根据本发明所述，用于检测所述追溯物的扩增技术，以及用于抗假冒对照，或者用于 沿着整个产品链的追溯，均可在追溯物自身得以实现，或者在通过标准提取技术从追溯物 提取的DNA上得以实现，所用的扩增技术例如聚合酶链反应(PCR)、实时聚合酶链 反应(RT-PCR)、等温的和嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN)、滚环扩增(RCA)、侵 染技术、单引物等温扩增技术(SPIA技术)、环介导恒温扩增(LAMP )、分枝扩增(RAM ) 与压力循环技术(PCT)。 如果可能的话，在任优选的实施例中，所述追溯物的检测将以 单独的多重扩增技术来实现，该技术允许有代表性的本发明所述的特殊追溯物的所有多态 序列在单个反应溶液中得到扩增。在这样的实施例中，本发明所述的引物将具有相似的退 火温度，且可进行不同的标记，例如，某个正向引物可被适当地以Fam、 Hex、 Vic、 Pet 及其4也标记物来标记。在目标区得到扩增后，可采用多种方法来鉴定等位基因，例如，采用基于引物延伸的 规程，采用微球体分析，琼脂糖凝胶电泳，或者其他方法，以及采用不同的分析平台，例 如自动测序仪、微阵列仪、质谱仪、流式细胞仪等。以本发明所述追溯物标记的食品，可以是任意形式的食品，无论是固体还是液体食品 都可被标记，如前所述，通过对材料的标记而应用于该产品，或者通过在产品自身的外在 表面进行标记，或者通过在关注的产品内部进行标记，这些产品可以是一些典型产品，例 如R.D.O.产品、P.D.O.产品、P.G丄产品、G.R.D.O.产品，也可以是，例如典型的火腿、 典型的干酪、油、酒、多种冻肉和意大利腊肠，以及用于避免假冒的食品，这是尤为值得 重3见的。以下将给出多个实施例来阐明，但这些实施例并不是对本发明的限制。 具体实施例1、对用于制备食品追溯物的生物体的选择，该食品追溯物用在典型产品上我们以前已经分析过干腌火腿生产周期的各个阶段，目的是鉴别哪种追溯物的形式将更为合适，以及将采用哪种技术的产品。在干腌火腿的实施例中，所述追溯物在涂脂阶段已与猪肉脂肪混合，或者混合到用于 标记的可食用墨水中。经分析，作为适用于制备所述追溯物的多态DNA来源的不同植物种类具有以下特征-良好的保存性；-与典型产品(例如，千腌火腿)的特性之间有低的干扰性； -无性繁殖的物种，以保证在从单个品种中获得的追溯物内没有遗传变异； -自花受粉繁殖的物种，避免从外来花粉带来的最低限度的污染； -高的内在多样的可变性，以致容易通过DNA分析从多个品种中识别出某个品种； -对于一个植物种类，人们已经完成对它的分子遗传学研究，也存在关于它的大量的 学术文献。对文献目录的仔细研究，已经足以选择到具有可包含在所述追溯物的序列的生物体， 以下物种是可供选择的稻、小麦与橄榄树，这三个物种符合所期望的特性，例如，它们 具有容易保存性，自花受粉物种(稻和小麦)或者无性繁殖(橄榄树)，以及具有高的 内在多样的可变性。2、对用于制备本发明所述追溯物的物种的选择，以标记典型的千腌火腿已经考虑到，小麦或稻可用于涂脂用猪肉脂肪的制备阶段，因此也考虑到，选择的结 果可合理地落在所述植物种类(如小麦，无论是软的还是硬的)的某一种，我们已在本实 施例中选择到标记千腌火腿的追溯物。因此，该选择已关系到种子产业，目前种子产业已提供了约20种软的或硬的纯系的 小麦品种，这些品种来自不具有商业利益的选择结果，或者来自古代(罗马时代)的品种， 或者来自新的选择选择，都具有高的保持性特征。对于每个品种，选择了约20种种子来萌芽，且已从每个单独植物的叶中抽提得到 DNA。通过RAPD技术对DNA的同质测试已经完成，以评定每个品种的纯度。我们已经浏览了用于所选择物种的关于SSRs的文献，并将它们中的10种选择出来用 于测试，且已经评定手中的这些品种的同质性，以及已经选定具有最高同质性的这些品种。3、 微卫星的选择我们已经完成微卫星的选择，考虑到以下的SSR微卫星的特征 _所述微卫星必须可呈现至少5个等位基因或SSR;_考虑到对于每个微卫星的等位基因的数量，在所述微卫星位点的等位基因之间的 多样性指数必须等于或大于0.5，且该多样性指数与每个等位基因的相对频率符合下列公 式<formula>formula see original document page 16</formula>,其中，DI表示多样性指数，而Pi表示第i个等位基因的频率； 一所述微卫星必须是可复制的；一所述微卫星必须是具有100-300bp长度，以致即使在变换矩阵中也容易分析到。 对于多重分析，我们已选择5个微卫星的长度为100至200 bp，而另外5个微卫星的 长度为200至300 bp。_所述引物必须具有类似的约60°C的退火温度，以便完成多重扩增。4、 所选择的微卫星的合适程度的评估和控制对于每个收割的品种，我们已从100 g种子磨得面粉，并从该面粉中提取双份DNA, 并已通过PCR完成所选择的SSRs的DNA扩增，该PCR采用了针对每个SSR的特异的正 向引物和反向引物。该正向引物已经标记上一种荧光素(如6-FAM)以便完成后续的片断 分析。我们以25 pi或10 pi终体积在MJ PTC-100热循环扩增仪中已经完成所述的扩增。 主要的反应混合物包括每种引物各2皮摩尔，每种脱氧核苷酸为0.2mM, MgC12为1.5 Mm，以及1单位的Taq聚合酶，与50 - 100 ng的DNA。我们已经根据以下程序扩增了所述的DNA:在94°C 3分钟，然后在94°C 1分钟，在 60。C 1分钟，在72°C 2分钟，做35个循环，最后在72°C延伸10分钟。接着，将1 pi的已扩增DNA加入到10 pi的甲酰胺中，在ROX 500 (ABI)上梯度混合， 在95。C变性2分钟，然后冷却到4。C。我们以自动测序4义(例如ABI 310 )在毛细电泳的条件下完成DNA片断分析。我们佳— 用POP 4 (ABI)扩增仪对于给定的100至300 bp的片断长度进行分析，采用长度为36 cm 的毛细管，以便获得这些片断的好的分离效果。对于每个品种，我们已经分析了以所用的10个微卫星获得的DNA概貌，因此获得了 这样一种基因识别卡，它能识别每个品种的特异特征，并能鉴别所述品种是否受到污染。 我们也因此建立了对于所选择的品种的凄t据库。5、 用于制备所述追溯物的材料的选择一旦选择了某个品种，也应选择更为适用于典型的干腌火腿的制备技术。 因此，猪肉脂肪与所选品种的小麦粉的混合物可被决定用作所述追溯物的制备。我们 已经在不同浓度完成了对该混合物的体外实验，浓度为17oo、 1%、 5%、 10%,以便检验 DNA提取物、DNA扩增和微卫星概貌的有效性。而且，我们已经在不同时间段内完成了 所述实验，验证了在追溯物的DNA提取物、DNA扩增的效果是可及时呈现的；也验证了 所述追溯物或所述DNA不能稍稍变性，否则会使微卫星不能被检测到。6、 所述追溯物对干腌火腿的应用一旦确定了用于检测所述追溯物的最优条件，制备技术可直接应用在火腿上。因此， 我们通过收集追溯物样品，例如通过刮取火腿的外部，完成了在不同时间的对照实验。所 述追溯物受制于DNA提取，也受制于序列微卫星分析。所获得的概貌与登记在数据库中 某个记录进行对照，概貌的重叠部分将确认产品的真实性和本发明所述追溯物的有效性。
权利要求
1、一种包含天然来源和/或天然材料的DNA序列的用于食品的追溯物，包括所述序列与合适的赋形剂，其特征在于所述DNA序列包括一个或多个的多态序列，该多态序列可在等于或高于50℃的退火温度的条件下通过DNA扩增检测到，所述序列包括单核苷酸多态性SNPs和/或微卫星，其中，所述的微卫星在每个微卫星位点呈现至少5个等位基因，而且，考虑到对于每个微卫星的等位基因的数量，在所述微卫星位点的等位基因之间的多样性指数必须等于或大于0.5，且该多样性指数与每个等位基因的相对频率符合下列公式DI＝1-Spi2其中，DI表示多样性指数，而Pi表示第i个等位基因的频率。
2、 根据权利要求1所述的用于食品的追溯物，其特征在于所述的DNA扩增能用 以下的一种或多种技术来实现聚合酶链反应(PCR)、实时聚合酶链反应(RT-PCR)、 等温的和嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN)、滚环扩增(RCA)、侵染技术、单引物 等温扩增技术(SPIA技术)、环介导恒温扩增(LAMP)、分枝扩增(RAM)与压力 循环技术(PCT)。
3、 根据权利要求1或2所述的用于食品的追溯物，其特征在于所述的DNA序列 是来源于植物、动物、细菌、真菌、酵母或其他微生物。
4、 根据权利要求1至3之一所述的用于食品的追溯物，其特征在于所述的DNA 序列是从具有无性生殖或自花受粉繁殖能力的物种中得到的，这些物种具有高的内在多 样的可变性。
5、 根据权利要求4所述的用于食品的追溯物，其特征在于所述的物种是稻、橄 榄树和小麦。
6、 根据权利要求1至5之一所述的用于食品的追溯物，其特征在于所述的微卫 星序列是一段包括50至540个核苷酸的序列
7、 根据权利要求6所述的用于食品的追溯物，其特征在于所述的微卫星序列是 一段包括100至300个核普酸的序列。
8、 根据权利要求1至7之一所述的用于食品的追溯物，其特征在于所述的微卫 星序列能以带有引物的DNA扩增技术检测到，该引物具有一个退火温度，在具有最高 退火温度的引物的最佳退火温度与具有最低退火温度的引物的最佳退火温度之间的差 异是在0.5至3。C之间。
9、 根据权利要求1至8之一所述的追溯物，其特征在于所述的退火温度是等于 或高于60。C。
10、 根据权利要求1至9之一所述的追溯物，其特征在于所述的追溯物的形式是 固体、溶液、粉末、面粉状、冻干状、干的野生植物材料、液体。
11、 一种用于制备权利要求1所述的追溯物的方法，包括以下步骤a. 选择植物品种和/或动物系或品种和/或真菌或细菌或酵母或其他微生物系或品系 或种类；b. 从在步骤a所选择的一个或多个的所述种类、系、品种、品系或物种的多个标本 中提取DNA,对每个种类、系、品种、品系或物种进行同质性检验，并选择显示同质 性的种类、系、品种、品系和/或物种；c. 根据以下参数挑选对于所述种类、系、品种、品系和/或物种的一个或多个的多 态性——所述多态性必须包括SNPs和/或微卫星，且所述微卫星对于每个微卫星位点 必须呈现至少5个等位基因；——考虑到对于每个微卫星的等位基因的数量，在所述位点的等位基因之间的多 样性指数必须等于或大于0.5,且该多样性指数与每个等位基因的相对频率符合下列公式DI= 1- Sp产其中，DI表示多样性指数，而Pi表示第i个等位基因的频率；d. 选择一个或多个SNP和/或从步骤C中所选择的微卫星，步骤C的DNA扩增要 求退火温度等于或高于50°C;e. 分离包含DNA的材料，该DNA来自包含SNPs和/或微卫星的种类、系、品种、 品系和/或物种，该微卫星选自步骤c和d,并将所述材料与合适的赋形剂混合。
12、 根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述扩增能以一种或多种的以下 技术来实现聚合酶链反应(PCR)、实时聚合酶链反应(RT-PCR)、等温的和嵌合 引物起始的核酸扩增(ICAN)、滚环扩增(RCA)、侵染技术、单引物等温扩增技术(SPIA技术)、环介导恒温扩增(LAMP )、分枝扩增(RAM )与压力循环技术(PCT )。
13、 根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于所述步骤a的种类属于一种 无性生殖或自花受粉繁殖的物种，这些物种具有高的内在多样的可变性。
14、 根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述的物种是稻、橄榄树和小麦。
15、 根据权利要求11至14之一所述的方法，其特征在于所述的微卫星是根据其 核苷酸长度来优选的，所述序列长度是50至540个核苷酸。
16、 根据权利要求11至15之一所述的方法，其特征在于所述的微卫星序列能以 带有引物的DNA扩增技术检测到，该引物具有一个退火温度，在具有最高退火温度的 引物的最佳退火温度与具有最低退火温度的引物的最佳退火温度之间的差异是在0.5至 3。C之间。
17、 根据权利要求11至16之一所述的方法，其特征在于所述的退火温度是等于 或高于60°C。
18.包含SNPs和/或根据权利要求11所述方法选择的微卫星的多态序列用于沿着 整个产品链识别和追溯食品来源的用途。
19. 一种用于检测如权利要求1至10之一所述的用于食品的追溯物的方法，包括 以下步骤a. 直接以特异引物扩增方法对追溯物或从所述追溯物提取的DNA进行微卫星分 析，所述扩增以一种或多种的以下技术来实现聚合酶链反应(PCR)、实时聚合酶链 反应(RT-PCR)、等温的和嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN)、滚环扩增(RCA)、 侵染技术、单引物等温扩增技术(SPIA技术)、环介导恒温扩增(LAMP)、分枝扩增(RAM)与压力循环技术(PCT);b. 将从所分析的追溯物中获得的等位基因与所述追溯物的对照样品的等位基因进 行比较分析。
20. 根据权利要求20所述的方法，其特征在于在步骤a所述的扩增是作为一个 单独的多重扩增来进行的。
21. 以根据权利要求1至IO之一所述的追溯物标记的食品。
全文摘要
本发明涉及用于包含天然核酸序列的用于食品的追溯物、用于该产品的追溯方法、所述追溯物的用途，以及以所述追溯物标记的食品。
文档编号C12Q1/68GK101223286SQ200680016420
公开日2008年7月16日 申请日期2006年5月15日 优先权日2005年5月13日
发明者亚历山卓·索维, 卢卡·方汤斯, 埃琳娜·卡波妮, 文森祖·若受, 罗伯塔·达沃丽, 马可·潘科迪 申请人:生物实验室公司;万校之母-博洛尼亚大学(Diproval农业-食品保护与开发系)