使用孔的方法

专利名称：：使用孔的方法
技术领域：
：本发明涉及使用跨膜孔进行的单个核苷酸以及其他含磷酸部分的鉴定。具体而言，本发明涉及使用跨膜孔进行的目标核酸的测序。
背景技术：
：现有的DNA测序方法涉及使用多种昂贵的试剂，例如荧光标记的ddXTP、dXTP、引物和聚合酶。这种方法需要使用有资质的技术人员才能操作的复杂的仪器。而且，这种方法的限制是只能测定长度在一千个核苷酸以内的序列。也已经考虑了使用其他测序方法以降低费用、简化方法和使得测序可以在实验室外进行。考虑到的方法有循环延伸(Cycleextension)、聚合酶读取(polymerasereading)、夕卜切核酸酶测序(exonucleasesequencing)和DNA微阵歹'J(Braslavsky，I.，B.Herbert,etaL(2003)，100(7):3960-3964)。这些方法已被全面地综述过(Marziali，A.andM.Akeson(2001)，Arm.Rev.Biomed.Eng.3:195-223)。一种有效的DM测序方法基于下述步骤将DNA的一条链穿过一个纳米孔，然后通过该链穿过孔时流过该孔的离子电流的变化来识别该链的序歹'J(Kasianowicz,J.J.，E.Brandin，etal.(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.93:13770-13773)。另一种有效的方法是外切核酸酶测序(Chan，E.Y.(2005)，Mutat.Res.573:13-40)。这一方法包括每次从DNA上消^匕下一个核苷酸(Dapprich,J.(1999)，Cytomet.36:163-168;和Matsuura，S.-I.，J.Komatsu,etal.(2001)，Nuc.Ac.29(16):e79),然后识别每个释》史出的核苷酸。然而，上述方法需要在消化前对DNA进行修饰，或者在核苷酸通过外切核酸酶从DNA上释放后对该核普酸进行修饰。外切核酸酶测序方法的发展目前受到的限制是在核苷酸通过酶释放时难以在单分子水平上识别所述核苷酸。研究者尝试使用荧光标记识别核苷酸，但是成效不大。随机传感(stochasticsensing)方法包括在绝缘的脂双层膜中放置一个纳米大小的孔，并且测量穿过该孔的离子转运。当分析物与孔内结合位点相互作用的时候，可以检测到离子电流的变化(Braha,0.，B.Walker,etal.(1997)，Chem.&Biol.4:497-505;和Bayley，H.andP.S.Cremer(2001)，Nature413:226-230)。由每次结合事件产生的电流阻断的程度和持续时间可以揭示该分析物的身份。结合事件的频率可以表明分析物的浓度。可以通过蛋白突变、化学修饰以及使用分子接头和载体，在孔中制造各种不同的结合位点(Gu,L.-Q.，0.Braha，etal.(1999)，Nature398:686-690;和Braha，0.，J.Webb,etal.(2005)，Chem.Phys.Chem.6:889-892)。
发明内容令人意外的是，已证明当单个核苷酸与跨膜孔相互作用时，可以根据其电流振幅而在单分子水平上识别该单个核苷酸。因此可以使用随机传感来识别单个核苷酸，并通过外切核酸酶测序来测定核酸序列。因此，本发明提供了一种识别单个核苷酸的方法，包括(a)将所述核苷酸与跨膜蛋白质孔相接触，以使得所述核苷酸与所述孔相互作用，以及(b)测量在相互作用过程中流过孔的电流，由此确定所述核苷酸的身份(identity)。本发明还提供了---种测定目标核酸序列的方法，包括(a)^f吏用进4亍'I"生夕卜切核酸酶(progressiveexonuclease)从目标序列的一端消化下单个核苷酸；(b)将所述核苷酸与跨膜蛋白质孔相接触，以使得所述核苷酸与所述孔相互作用；(c)测量在相互作用过程中流过孔的电流，由此确定所述核苷酸的身份；以及(d)在所述核酸序列的同一端重复步骤(a)至(c),由此测定所述核酸的序列。以及---种核酸测序试剂盒，包括---种环糊精；以及---种进行性外切核酸酶。本发明的测序方法是一种在单分子水平上快速简便的DNA测序方法。而且，由于这一方法不需要使用例如荧光团的昂贵试剂，它还是一种成本低廉的DNA测序方法。图1显示的是ot溶血素(M113R)7突变体和七-6-氨基-P-环糊精(am7-pCD)。A:oc溶血素结构的矢状切面图，箭头指示的是113位。B:am「pCD的空间填充结构。C:am7-^CD与oc溶血素(M113R)7可能的相互作用。图2A显示的是dCMP检测。A:在+130mV时，插入至磷脂双层中的单独的(M113R)7突变体的电流图。Ll表示未填充的蛋白纳米孔中的电流。B:在反式腔室中存在40pM的am厂pCD。L2表示当am广PCD在纳米孔内暂时结合时观察到的电流水平。C:将5pM的dCMP加入至顺式腔室。L3表示dCMP与(M113R)7/am7-PCD暂态复合物结合时观察到的电流水平。图2B显示的是ot溶血素(ocHL)孔与七-(6-脱氧-6-氨基)-p-环糊精(am7^CD)和dCMP的相互作用。A:七聚体cxHL孔(7AHL)的模型，其中Met-113#皮Arg置换。一个用ChemDrawUltra产生的am7pCD的截面模型被人为地置于与Arg侧链相距为范德华距离的位置，这样可以在环糊精从反式侧进入孔时阻断其通过。当am7PCD存在于孔中时，下述的两个带正电荷的环之间彼此相距约IOA，一个是由环糊精贡献的七个伯胺基团形成的环，另一个是七个精氨酸侧链形成的环。之前已表明氨基环糊精可以通过其质子化的氨基基团与单磷酸核苷的磷酸基团以离子相互作用的方式相结合。核苷酸碱基与Arg侧链之间的p-阳离子相互作用可能能够增强这种复合物的总体稳定性。dCMP分子所处的位置可使得磷酸基团与am7PCD的质子化氨基相互作用，而且可使得胞嘧啶环与Arg侧链的胍基相互作用。B:在+130mV时，单个的(M113R)孔的电流图。Ll表示流过未填充的纳米蛋白质孔的电流，右侧示出了所述纳米孔的模型。C:在向反式腔室中加入40jlaM的amjCD后的电流图。L2表示当ani7-pCD结合至纳米孔内时观察到的电流水平。D:将5HM的dCMP加入至顺式腔室后的电流图。L3表示dCMP与(M113R)7.am7PCD复合物结合时观察到的电流水平。图3显示的是dXMP电流振幅。在+130mV电压下，插入至磷脂双层的单个(M113R)7孔的电流图。在反式腔室中存在40jliM的am7-pCD。A:在顺式腔室中加入5pM的dGMP。右侧示出了电流图的全点直方图(allpointshistogram),以及dGMP、dTMP(B)、麵P(C)和dCMP(D)的结构。图4显示的是环糊精电流水平。在+130mV电压下，插入至磷脂双层的单个(M113R)7突变体的电流图，其中在反式腔室中存在40jLiM的am广pCD。Ll和Ll，表示未填充的纳米孔的两种电流水平，L2和L2，表示am7-PCD与(M113R)7的结合所导致的两种电流水平。插图显示的是电流图的振幅直方图，各峰值对应的是L1、Ll，、L2和L2，的电流水平。图5显示的是单事件分析。A:显示的是在相同溶液中的所有四种dXMP的L3电流水平的单事件分析直方图。B:显示的是仅由L2产生的L3的单事件分析直方图。在顺式腔室中存在5pM的dGMP、dAMP、dCMP和10jiM的dTMP。图6显示的是dXMP的同时检测。A:显示的是在Ag/AgCl电极之间施加+130mV电压时，插入至磷脂双层的单个(M113R)7突变体的电流图。緩冲液为25mM的Tris-HCl緩沖液，pH8.0，并含有1MKC1。在反式腔室中存在40pM的am7-PCD。在顺式腔室中加入5jiM的dGMP、dTMP、dAMP和dCMP。有色的条带表示每种dXMP的振幅分布。B:显示的是8000次结合事件的电流图的全点直方图。每个峰值与每种dXMP的统计学分布相重合。图7显示的是统计学方法。A和B两个高斯分布在交集I处重叠。对交集I处以外的高斯分布A的面积求积分，该面积表示A群被识别为B群的概率。序列表说明SEQIDNO:1显示编码ot溶血素的一个亚基的多核苷酸序列。SEQIDNO:2显示a溶血素的一个亚基的氨基酸序列。SEQIDNO:3显示编码a溶血素M113H的一个亚基的多核苷酸序列。SEQIDNO:4显示ot溶血素M113H的一个亚基的氨基酸序列。SEQIDNO:5显示编码ot溶血素M113K的一个亚基的多核苷酸序列。SEQIDNO:6显示a溶血素M113K的一个亚基的氨基酸序列。SEQIDNO:7显示编码oc溶血素M113R的一个亚基的多核苷酸序列。SEQIDNO:8显示a溶血素M113R的一个亚基的氨基酸序列。SEQIDN0:9显示入外切核酸酶的氨基酸序列。该序列是组成三聚体的三个相同亚基的其中之一的序列。具体实施例方式识群付茅磁W才法在第一个实施方案中，本发明涉及一种识别单个核苷酸的方法，包括将所述核苷酸与跨膜蛋白质孔相接触，以使得所述核苷酸与所述孔相互作用，以及测量在相互作用过程中流过孔的电流，由此确定所述核苷酸的身份。因此，本发明包括单个核苷酸的随机传感(stochasticsensing)。本发明可用于基于各种核苷酸对于流过跨膜蛋白质孔的电流的不同作用，从而区别结构相似的核苷酸。本发明还可用于确定在样本中是否存在某种特定的核苷酸。本发明还可用于测量样本中某一特定核苷酸的浓度。根据本发明的单个核苷酸是一个核苷酸。单个核苷酸为未通过核苷酸键与另一多核苷酸结合的核苷酸。核苷酸键涉及与另一核苷酸的糖基结合的一核苷酸的一个磷酸基团。单个核苷酸通常为未通过核苷酸鍵与另一多核苷酸序列结合的核苷酸，所述另一多核苷酸序列至少有5个、至少10个、至少20个、至少50个、至少100、至少200个、至少500个、至少1000个或至少5000个核苷酸。例如，已从例如DNA链或RNA链的目标多核苷酸序列上消化得到单个核苷酸。然而，所述单个核苷酸可以键合或结合有其他的化学基团，例如荧光分子或含有例如mi或35s的放射性同位素的化学基团。可以根据本发明识别的核苷酸的类型将在下文中详细地进4亍讨论。所述方法可使用任何合适的其中跨膜蛋白质孔被插入膜中的膜/孔系统进行。所述方法通常使用下述系统进行(i)含有天然存在的或重组的跨膜蛋白质孔的人工膜，(ii)含有重组跨膜蛋白质孔的分离的天然存在的膜，(iii)含有跨膜蛋白质孔的分离的天然存在的膜，或(iv)表达天然存在的或重组的跨膜蛋白质孔的细胞。所述方法优选地使用人工膜进行。所述膜除含有上述跨膜蛋白质孔之外，还可含有其他的跨膜蛋白和/或膜内蛋白，以及其他分子。本发明的方法通常在体外进行。if所述膜形成离子和核苷酸流动的屏障。所述膜优选地为脂双层。适用于本发明的脂双层可使用本领域已知的方法制备。例如，可使用MontalandMueller(1972)的方法形成脂双层膜。可使用任何膜脂形成的脂双层进行本发明的方法，所述膜脂包括但不限于磷脂、糖脂、胆固醇以及它们的混合物。所述脂双层优选地由1，2-二植烷酰基(diphytanoyl)-^/~甘油-3-磷酸胆碱形成。将孔插入膜(例如脂双层)的技术是本领域已知的。例如，可将纯化的形式的孔悬浮于含有脂双层的溶液中，以使其扩散至脂双层并通过与脂双层结合而插入至脂双层中，并组装成有功能的状态。或者，可使用M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005，127，6502-6503所述的方法，直接将孔插入至膜中。辦f醋/乙本发明方法使用跨膜蛋白质孔进行。跨膜蛋白质孔为这样一种多肽它可使得离子沿电化学梯度从膜的一侧流向另一侧。所述孔优选地可使得核苷酸沿电化学梯度从膜的一侧流向另一侧。所述孔通常为寡聚体。所述孔优选地由几个重复亚基构成。所述孔优选地为五聚体或七聚体。所述孔通常包括可允许离子流过的管道或通道。所述孔的管道或通道通常含有能促进与核苷酸相互作用的氨基酸。可用于本发明的孔通常包括一个或多个带正电荷的氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸或组氨酸。这些带正电荷的氨基酸优选地位于所述管道或通道的狭窄处附近。这些氨基酸通常可通过与核普酸的磷酸基团相互作用或通过与核苷酸的碱基的p-阳离子相互作用，从而促进所述孔和核苷酸之间的相互作用。所述孔优选地具有由带正电荷的氨基酸(如精氨酸、赖氨酸或组氨酸)形成的环，所述环位于所述管道或通道的狭窄处附近。通常，由孔的每个亚基提供一个带正电荷的氨基酸。适用于本发明的孔包括但不限于oc-溶血素、孔蛋白(porin)和杀白细胞素。用于本发明的优选的孔为oc溶血素或其变体。a溶血素孔由七个相同的亚基构成(七聚体)。ct溶血素的其中一个亚基的序列示于seqidno:2。七聚体孔的变体是指七个亚基中的一个或多个亚基的氨基酸序列与seqidn0:2相比有变化，但是仍保持着孔活性。变体oc溶血素中的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个亚基可具有与seqidno:2相比有变化的氨基酸序列。一种变体孔中的七个亚基通常是相同的，但也有可能不同。一种优选的ot溶血素变体具有一个或多个带正电荷的氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸或组氨酸，它们位于所述管道或通道的狭窄处附近。所述孔优选地具有由4个、5个、6个或优选地7个带正电荷的氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸或组氨酸)构成的环，所述环位于所述管道或通道的狭窄处附近。通常，由每个变体亚基提供环中的一个氨基酸。通常，变体在每个亚基的113位上含有一个带正电荷的氨基酸。用于本发明的孔优选地为oc溶血素(m113k)7,它包括七个序列如seqidn0:4所示的亚基；或者，用于本发明的孔优选地为oc溶血素(m113h)7，它包括七个序列如seqidno:6所示的亚基；或者，用于本发明的孔最优选地为oc溶血素(m113r)7，它包括七个序列如seqidn0:8所示的亚基。所述变体可为由生物体表达的天然存在的变体，例如由葡萄球菌(5^/At7ococcm)细菌表达的天然存在的变体。变体也可包括由重组技术生产的非天然存在的变体。在seqidno:2所示的氨基酸序列的长度上，变体的亚基可优选地与seqidno:2所示的氨基酸序列基于氨基酸同一性方面具有至少50%的同源性。更优选地，亚基多肽可与seqidno:2所示的氨基酸序列在其全长上基于氨基酸同一性方面具有至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%的同源性，更优选地具有至少95%、97%或99%的同源性。可在200个或更多个(例如230、250、270或280或更多个)连续氨基酸的序列具有至少80%，例如至少85%、90%或95%的氨基酸同一性("硬同源性(hardhomology)")。可对SEQIDNO:2的氨基酸序列进行氨基酸置换，例如进行最多达l个、2个、3个、4个、5个、10个、20个或30个氨基酸的置换。可例如根据下表进行保守性置换。在第二栏中同一框内的氨基酸可彼此置换，优选地，在第三栏中同一行内的氨基酸可彼此置换<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>替代地或附加地，SEQIDNO:2的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基可被缺失。可缺失最多达l个、2个、3个、4个、5个、10个、20个或30个或更多个氨基酸残基。变体可包括由SEQIDN0:2的片段构成的亚基。这种片段保持了孔形成活性。片段的长度可为至少50个、100个、200个或250个氨基酸。这类片段可用于产生嵌合孔。片段优选地包括SEQIDN0:2的孔形成结构域。变体包括含有SEQIDNO:2的片段或部分的嵌合蛋白质孔。嵌合蛋白质孔由含有SEQIDNO:2的片段或部分的各个亚基形成。嵌合蛋白质孔的孔部分或通道部分通常由SEQIDN0:2的片段或部分形成。替代地或附加地，可将一个或多个氨基酸加入至上述多肽中。可在SEQIDNO:2的氨基酸序列或其多肽变体或其片段的N端或C端进行延伸。所述延伸可以很短，例如长度为1至10个氨基酸。或者，所述延伸可以较长，例如长度最长为50或100个氨基酸。也可以将本发明的氨基酸序列与载体蛋白相融合。可使用本领域的标准方法来测定同源性。例如，UWGCG软件包提供了可用于计算同源性的BESTFIT程序，例如可以按其默认设定值使用(Devereuxef(1984)^c他^yea"力12，p387-395)。例如可以按照AltschulS.F.(1993)JMolEvol36:290-300;Altschul，S.Fefa/(1990)JMolBiol215:403-10所述，使用PILEUP和BLAST算法计算同源性或进行序列比对(例如识别等价残基或相应序列(通常使用其默认设定值))。进行BLAST分析的软件可公开地从国家生物技术信息中心(NCBI)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。所述算法涉及到首先鉴定高分值序列对(HSP)，这个步骤是通过在查询序列中鉴定长度为W的短字(word)进行，其中当所述短字与数据库序列中相同长度的字对齐的时候，匹配或者满足某个正值的阔值评分T。T是指邻近字评分阈值(AltschulWa/，上文)。将这些初始邻近字匹配作为种子启动检索，以寻找包含它们的HSP。在每条序列的两个方向上都进行字匹配延伸，到达累积比对分值能够增加的程度。在每个方向上的字匹配的延伸停止的条件是所述累积比对分值从其达到的最大值回落数值X;由于一个或多个负分值的残基比对的积累，所述累积分值降至O或小于0;或者达到任何一个序列的端点。所述BLAST算法的参数W、T和X决定比对的敏感度和速度。所述BLAST程序使用的默认字长(W)为11、BL0SUM62评分矩卩车(见HenikoffandHenikoff(1992)户roc.^a〃.JcacT.Sc丄USA89:10915-10919)比对(B)为50、期望(E)为10、M=5、N=4，并且是进行双链比较。所述BLAST算法进行两个序列之间的相似性的统计分析；参见例如KarlinandAltschul(1993)Jcad.Sc/.USA90:5873-5787。所述BUST算法提供的一种相似性的量度是最小和概率(P(N))，所述最小和概率表示两个氨基酸序列之间偶然出现匹配的概率。例如，如果在一个序列与另一个序列的比较中最小和概率小于大约1、优选小于大约0.1、更优选小于大约0.01,并且最优选小于大约0.001，那么第一序列被认为与第二序列相似。可对本发明所用的孔进行修饰，例如可添加组氨酸残基以有利于其鉴定或纯化；或者当多肽并不天然地含有信号序列时，可添加这类序列以促进其从细胞的分泌。可能需要提供适于附着在固体载体上的形式的多肽。例如，可将所述孔附着在固体载体上以便于将孔插入至膜中。可^吏用显示标i己(revealinglabel)来标、i己孑L。所述显示标i己可为任何能使所述孔被检测到的合适标记。合适的标记包括但不限于荧光分子、放射性同位素(例如1251和353)、酶类、抗体、多核苷酸和例如生物素的连接物。所述孔可以从产生孔的生物体例如金黄色葡萄球菌(i^a/7Ar/ococc^awe〃》中分离，或者可以通过合成或重组手段制备。例如，所述孔可以通过体外翻译转录来合成。所述孔的氨基酸序列可被修饰以使其包含非天然存在的氨基酸或增加化合物的稳定性。当通过合成手段产生孔时，可在生产过程中引入这类氨基酸。还可以在合成或重组生产之后对所述孔进行修饰。还可以使用D氨基酸生产所述孔。在这种情况下，可将氨基酸按照从C端至N端的方向以反向顺序连接。这在生产这类蛋白质或肽的
技术领域：
中是常规技术。许多侧链修饰手段在本领域中是已知的，并可被用于对所述孔进行侧链修饰。这类修饰包括例如通过与醛进行还原烷基化反应再用NaBH4还原而对氨基酸进行的修饰、用乙酰亚胺甲酯进行的脒基化(amidination)，或者用乙酸酐进行的酰基化。重组跨膜孔可通过本领域已知的标准方法产生。可使用本领域的标准方法分离和复制编码孔的核酸序列。可使用本领域的标准技术在细菌宿主细胞中表达编码孔的核酸序列。可通过从重组表达载体中原位表达多肽，从而将所述孔引入细胞。所述表达载体任选地带有可诱导的启动子以控制所述多肽的表达。可使用本领域的标准方法分离和复制编码孔的核酸序列。可从产生孔的生物体(例如金黄色葡萄球菌)中提取染色体DNA。可使用涉及特异性引物的PCR扩增编码所述孔的基因。然后可将扩增出的序列整合至重组可复制载体例如克隆载体中。所述载体可被用于在相容的宿主细胞中复制核酸。这样可通过将编码孔的多核苷酸引入可复制栽体、将所述载体引入相容的宿主细胞，并且在适于使所述载体复制的条件下使所述宿主细胞生长，从而制备编码孔的核酸序列。可从所述宿主细胞中回收栽体。用于克隆编码孔的多核苷酸的合适的宿主细胞是本领域已知的，并将在下文中更详细地加以描述。编码孔的核酸序列可被克隆至合适的表达载体中。在表达栽体中，编码孔的核酸序列通常与控制序列有效地连接，所述控制序列可使得宿主细胞能够表达编码序列。这类表达载体可被用于表达孔。术语"有效连接"指一种并置关系(juxtaposition),其中所述组件之间的关系能使他们以预期的方式发挥功能。"有效连接"到编码序列的调控序列的连接方式能够使得在与所述调控序列相容的条件下实现所述编码序列的表达。可在所述载体中引入相同或不同孔基因的多个拷贝。然后可将表达栽体引入合适的宿主细胞中。这样可通过将编码孔的核酸序列引入表达载体、将所述载体引入相容的细菌宿主细胞，并且在适于使编码所述孔的核酸序列表达的条件下使所述宿主细胞生长，从而在所产生的细胞中进行本发明的方法。或者，可将这种方式产生的重组孔从细菌宿主细胞中分离并插入至另一膜中。所述载体例如可为带有复制起点、任选地含有用于表达所述核酸序列的启动子、任选地含有所述启动子的调节子的质粒、病毒或噬菌体载体。所述载体可含有一个或多个可篩选的标记基因，例如四环素抗性基因。可以选择与适于所设计的表达载体的宿主细胞相容的启动子和其他表达调控信号。通常使用的是T7、"c、/ac,ara减？u启动子。宿主细胞通常以高水平表达所述孔。应选择被编码孔的核酸序列转化的宿主细胞，以使其与用于转化细胞的表达载体相容。宿主细胞通常为细菌，优选为大肠杆菌(i""力er/c力/aco/i。任何带有XDE3溶素原(例如C41(DE3)、BL21(DE3)、JM109(DE3)、B834(DE3)、TUNER、Origami和OrigamiB)的细胞都可以表达含有T7启动子的载体。在通过任何蛋白质液相色镨系统从产生孔的生物体纯化孔或按上文所述进行重组表达之后，可以大规模地生产所述孔。常规的蛋白质液相色谱系统包括FPLC、AKTA系统、Bio-Cad系统、Bio-RadBioLogic系统和GilsonHPLC系统。然后可将天然存在的或重组产生的孔插入至用于本发明的天然存在的膜或人工膜中。本发明方法可使用上述任何一种孔。摩迷'在与*茅凝^^3#^核苷酸可与所述膜上任一侧的孔相接触。核苷酸可被引入所述膜上任一侧的孔中。优选地，使核苦酸与膜一侧的孔相接触以使得离子进入孔中并沿电化学梯度流动而穿过膜。优选地，使核苷酸与膜一侧相接触以使得核普酸通过所述孔到达膜的另一侧。例如，核苷酸与孔的一端相接触，该孔在其天然环境下能使得离子或小分子(例如核苷酸)进入至孔的管道或通道中，从而使得所述离子或小分子穿过所述孔。核苷酸可以任何方式在任何位点与所述孔相互作用。优选地，核苷酸与所述孔可逆地结合。更优选地，核苷酸与所述孔的管道或通道可逆地结合。最优选地，当核苷酸穿过所述跨膜孔时，它会与所述孔的管道或通道可逆地结合。在核苷酸与所述孔相互作用的过程中，核苷酸会以该种核普酸特异性的方式影响流过所述孔的电流。例如，某种特定的核苷酸将使流过孔的电流在特定时间段内减少并减少至特定的程度。可进行对照实验以测定特定核苷酸对流过孔的电流的影响。然后可将对测试样品实施本发明方法之后所得到的结果与对照实验的结果相比较，以识别样品中的特定核苷酸或测定样品中是否存在特定的核苷酸。流过孔的电流被影响的方式能够指示出特定的核苷酸，从而可以通过所述电流的频率来测定样品中的该核苷酸的浓度。农器所述方法可以使用任何适于研究其中跨膜蛋白质孔被插入膜中的膜/孔系统的仪器来进行。所述方法可使用任何适用于随机传感的仪器来进行。例如，仪器包括一个含有水溶液的腔室和一个将所述腔室分为两部分的屏障。所述屏障具有一个孔洞，在该孔洞上形成含有所述孔的膜。通过将核苷酸引入腔室之中而使核苷酸与所述孔相接触。核苷酸可被引入腔室的两个部分中的任一个。本发明方法涉及在所述孔与核苷酸相互作用的过程中测量流过孔的电流。因此，所述仪器还包括一个能够施加穿过膜和孔的电信号并测量该信号的电路。可以使用膜片钳或电压钳进行所述方法。优选地，所述方法涉及膜片钳的使用。实施例中公开了一种使用膜片钳进行的方法。所述跨膜孔优选地包括能够促进所述孔和核苷酸之间相互作用的分子接头。所述接头通常能够影响孔的物理或化学性质，从而促进所述孔与核苷酸的相互作用。接头通常可改变所述孔的管道或通道的电荷，或者特异性地与核苷酸相互作用或结合，借此促进核苷酸与孔的相互作用。优选地，所述接头与核苷酸上的一个或多个磷酸基团相互作用，或通过p-阳离子相互作用而与核苷酸中的碱基相互作用。接头可以介导核苷酸和孔的相互作用，例如，核苷酸可通过接头与孔可逆地结合。或者，接头可与核苷酸和孔共同相互作用。例如，核苷酸可与孔和接头二者同时可逆地结合。接头优选地使所述管道或通道变狭窄以便与核苷酸相互作用。接头本身也可以与孔可逆地相互作用，因而可以移入或移出所述孔的管道或通道。或者，接头可与所述孔的管道或通道共价结合，这样它就不能离去。接头通常具有一个由氨基形成的环。优选地，接头具有一个由七个氨基形成的环。这种氨基形成的环可以与核苷酸以及由位于所述孔的管道或通道狭窄处的带正电荷的氨基酸形成的环相互作用。一种合适的接头为环糊精。接头优选地为七-6-氨基-p-环糊精(am广P-CD)。#茅凝本发明方法可用于识别任何核苷酸。所述核苷酸可为天然存在的核苷酸或人工获得的核苷酸。核苷酸通常含有核苷酸碱基(nucleobase)、糖基团和至少一个磷酸基团。所述核苷酸碱基通常为杂环。合适的核苷酸碱基包括嘌呤和嘧啶，更具体而言包括腺噤呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶。所述糖通常为戊糖。合适的糖包括但不限于核糖和脱氧核糖。核苷酸通常为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。核苷酸通常含有单磷酸、二磷酸或三磷酸。合适的核苷酸包括但不限于腺苷单磷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、鸟苷单磷酸(GMP)、鸟苷二磷酸(GDP)、鸟苷三磷酸(GTP)、胸苷单磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)、胸苷三磷酸(TTP)、尿苷单磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞苷单磷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、环腺苷单磷酸(cAMP)、环鸟苷单磷酸(cGMP)、脱氧腺苷单磷酸(dAMP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胸苷单磷酸(dTMP)、脱氧胸苷二磷酸(dTDP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧尿苷单磷酸(dUMP)、脱氧尿苷二磷酸(dUDP)、脱氧尿苷三磷酸(dUTP)、脱氧胞苷单磷酸(dCMP)、脱氧胞苷二磷酸(dCDP)和脱氧胞苷三磷酸(dCTP)。优选地，所述核苷酸为AMP、TMP、GMP、UMP、薩P、dTMP、dGMP或dCMP。所述核苷酸可通过对核酸序列(例如核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸)的消化而产生。可将来自单一核酸序列的单个核苷酸按序贯方式与所述孔相接触，以测定所述核酸的全部或部分序列。根据本发明第二实施方案进行的核酸测序将在下文更详细地讨论。例如当从核酸序列消化产生核苷酸时，所述核苷酸通常是未经修饰的。或者，核苷酸可以是经过修饰的或损坏的。核苷酸通常为甲基化的。可使用显示标记来标记核苷酸。所述显示标记可为任何能使所述核苷酸被检测的合适标记。合适的标记包括但荧光分子、放射性同位素(例如1251和"S)和例如生物素的连接物。核苷酸通常存在于任何合适的生物样品中。本发明通常在已知含有或怀疑含有一种或多种核苷酸的样品上进行。本发明可在含有一种或多种未知身份的核苷酸的样品上进行。或者，本发明可在已知含有或预计含有一种或多种核苷酸的样品上进行，以确认所述一种或多种核苷酸的身份。本发明可以在获自或提取自任何生物或微生物的体外样品上进行。所述生物或微生物通常为原核生物或真核生物，通常属于下述的五界之一植物界(plantae)、动物界(animalia)、真菌界(fungi)、原核生物界(monera)和原生生物界(protista)。本发明可以在获自或提取自任何病毒的体外样品上进行。优选地，所述样品为液体样品。所述样品通常包括患者的体液。所述样品可为尿液、淋巴液、唾液、粘液或羊水，但是优选地为血液、血浆或血清。通常，所述样品来源于人类，但是也可以来源于其他哺乳动物，例如来源于市售的家畜(例如马、牛、羊或猪)或者可以是宠物(例如猫或狗)。所述样品在分析之前通常要经过处理，例如通过离心或通过透膜过程以滤去不需要的分子或细胞，例如红细胞。可以在采样后立即测试。通常也可以在测试之前进行储存，优选地在-7ox:以下储存。务斧本发明方法涉及在孔与核苷酸相互作用的过程中测量流过所述孔的电流。适于测量流过跨膜蛋白质孔的离子电流的条件为本领域已知并在实施例中公开。在进行所述方法时要在膜和孔上施加电压。所使用的电压通常为+50mV至+200mV。优选地，所4吏用的电压为+70mV至+150mV、+85mV至+145mV或+100mV至+140mV。优选地，对于脱氧核糖核苷酸5'单磷酸(例如dAMP、dTMP、dGMP和dCMP),所使用的电压为约+130mV;对于核糖核苷酸5'单磷酸(例如AMP、TMP、GMP和UMP),所4吏用的电压为约+110mV。本发明方法可在存在任何碱金属氯盐(chloridesalt)的条件下进行。在上述的示例性仪器中，所述盐存在于腔室中的水溶液中。通常使用的是氯化钾(KC1)、氯化钠(NaCl)或氯化铯(CsCl)。优选地使用KC1。所述盐的浓度通常为0.1至2M、0.3至1.9M、0.5至1.8M、0.7至1.7M、0.9至1.6M或1M至1.4M。所述盐的浓度优选地为约1M。本发明方法通常在存在緩冲液的条件下进行。在上述的示例性仪器中，所述緩沖液存在于腔室中的水溶液中。在本发明方法中可使用任何緩沖液。一种合适的緩冲液为Tris-HCl緩冲液。本发明方法通常在下述pH值下进行，所述pH值为7.5至12.0、7.6至11.0、7.7至10.0、7.8至9.5、8.0至9.0或8.0至8.5。所4吏用的pH优选地为约8.0。进行本发明方法的温度条件通常为14。C至IOO"C、15n至901C、16n至8ox:、17x:至7or;、isx:至60x:、19x:至5ox:或2ot:至4ox:。本发明方法优选地在室温下进行。对于脱氧核糖核苷酸5，单磷酸(例如dAMP、dTMP、dGMP和dCMP)，本发明方法的优选条件为+130mV、pH8.0和1MKC1;对于核糖核苷酸5，单裤酸(例如AMP、TMP、GMP和UMP)，本发明方法的优选条件为+110mV、pH8.0和1MKC1攀裙虔浙y^才法在第二实施方案中，本发明涉及一种对目标核酸序列测序的方法，包括(a)使用进行性外切核酸酶从目标序列的一端消化下单个核苷酸；(b)将所述核苷酸与跨膜蛋白质孔相接触，以使得所述核苷酸与所述孔相互作用；(c)测量在相互作用过程中流过孔的电流，由此确定所述核苷酸的身份；以及(d)在所述核酸序列的同一端重复步骤(a)至(c)，由此测定所述核酸的序列。因此，所述第二实施方案包括以连续的方式对核酸序列的每一个单个核苷酸进行随机传感，以便对核酸进行测序。使用所述第二实施方案的方法可以对核酸的全部或部分进行测序。所述核酸可为天然存在的或人工合成的。例如，可以使用所述第二实施方案的方法验证制得的寡核苷酸的序列。所述第二实施方案的方法通常在体外进行。所述第二实施方案的方法的步骤(b)和(c)与上述第一实施方案中进行的步骤总体上相同。涉及上述第一实施方案的全部讨论，特别是关于可用于第一实施方案的膜、仪器、孔、分子接头、核苷酸和条件的讨论同样适用于所述第二实施方案。所述第二实施方案中的核酸通常也存在上述第一实施方案中提及的任何生物样品中。所述第二实施方案的方法可在含有一种或多种序列未知的核酸的样品上进行。或者，所述第二实施方案的方法可在已知含有或预计含有核酸的样品上进行，以确认所述核酸的身份。通常，在使用所述第二实施方案的方法进行测序之前，要对所述核酸序列进行扩增。迷#遂#勿裙凝雜所述第二实施方案的方法包括将核酸序列与进行性外切核酸酶相接触，从而从核酸的一端释放单个核苷酸。进行性外切核酸酶为这样一种酶类它通常锚定于核酸序列的一端，并且每次从该序列的这一端上消化出一个核苷酸。进行性外切核酸酶可以按5，至3，方向或按3，至5，方向消化核酸。通常可通过选择所用的酶类和/或通过使用本领域已知的方法来确定进行性外切核酸酶结合到所述核酸的哪一端。也经常在核酸序列的任一端使用羟基或帽结构来防止或促进进行性外切核酸酶与所述核酸序列的特定端的结合。在本发明方法中可以使用任何进行性外切核酸酶。用于本发明方法的优选的酶为入外切核酸酶。入外切核酸酶的一个亚基的序列示于SEQIDN0:9。由三个相同的亚基相互作用形成三聚体外切核酸酶。入外切核酸酶的变体为这样一种酶形成它的多肽亚基的氨基酸序列与SEQIDN0:9相比有所不同，但是仍保留了进行性外切核酸酶活性。所述变体相对于SEQIDNO:9变异的方式和程度都可与上述SEQIDNO:2变体的情况相同。优选地，变体含有用于与所述核酸结合的结构域和用于消化核酸的结构域(催化结构域)。优选地，变体与野生型酶相比具有降低的酶活性水平和/或更高的盐耐受力。可使用任何上述用于生产跨膜蛋白质孔的方法来生产进行性外切核酸酶。所述第二实施方案的方法包括将核酸序列与进行性外切核酸酶相接触，以使得可以从所述核酸的一端消化出核苷酸，消化的速度应使得可以根据本发明的第一实施方案来识别每一个单个核苦酸。进行上述过程的方法是本领域公知的。例如，可使用Edman降解从多肽的一端连续消化出单个氨基酸，以使得可以通过高效液相色谱(HPLC)对它们进行识别。在本发明中可以使用相似的方法。优选地，进行性外切核酸酶与所述跨膜蛋白质孔共价结合。将进行性外切核酸酶与所述孔共价结合的方法是本领域公知的。在所述第二实施方案的方法中，进行性外切核酸酶起作用的必需速度通常低于野生型进行性外切核酸酶的最优速度。在所述第二实施方案的方法中进行性外切核酸酶活性的合适速度包括每秒消化0.5至1000个核苷酸、每秒Q.6至5GQ个核苷酸、每秒G.7至200个核苷酸、每秒0.8至100个核苷酸、每秒0.9至50个核苷酸或每秒1至20个或10个核苷酸。所述速度优选地为每秒1个、10个、100个、500个或1000个核苷酸。可以通过各种方法获得合适的进行性外切核酸酶的活性速度。例如，可根据本发明使用最优活性速度较低的进行性外切核酸酶变体。进行性外切核酸酶的活性通常依赖于pH值，这使得pH值降低时其活性会下降。因此，所述第二实施方案的方法通常在pH为7.5至8.0或7.7至8.0的条件下进行。所使用的pH优选地为大约8.0。在盐浓度升高时，进行性外切核酸酶的活性速度通常会下降。然而，太高的盐浓度通常会对酶活性产生有害的影响。限制酶的速度的另一种方法是在能降低酶活性而又不会对酶活性产生有害影响的盐浓度条件下进行所述第二实施方案的方法。例如，可在盐浓度为0.5至1M的条件下进行所述第二实施方案的方法。优选的盐浓度为大约lM。试W盆在第三实施方案中，本发明还涉及可用于实施本发明的第二实施方案的试剂盒。因此，所述试剂盒适用于核酸的测序。所述试剂盒包括一种环糊精和一种进行性外切核酸酶。所述环糊精优选地为七-6-氨基-P-环糊精。所述进行性外切核酸酶可为上述有关第二实施方案的讨论中提及的任何进行性外切核酸酶。优选地，所述试剂盒还包括跨膜蛋白质孔。所述孔可为上述有关第一实施方案的讨论中提及的任何孔。所述试剂盒还可包括一种或多种可使得上述方法的任何实施方案得以实施的其他试剂或装置。这类试剂或装置包括下述的一种或多种合适的緩沖液(水溶液)、用于从受试者取样的工具(例如管或带有针头的装置)、用于扩增核酸序列的工具，如上文定义的膜或电压钳或膜片钳仪器。试剂可以干燥状态存在于所述试剂盒中，这样可以用液体样本重新悬浮所述试剂。任选地，所述试剂盒还可包括关于如何在本发明方法中使用所述试剂盒的说明或关于本发明适用于哪些患者的详细说明。任选地，所述试剂盒可包括核苷酸。通过下述实施例举例说明本发明实施例为了使a溶血素(Ml13R)7突变体(图1A)的离子电导通道的大小更接近待检测的核苷酸的大小，通过将环糊精安置于孔的狭窄处附近来减小纳米孔的直径。使用了七-6-氨基-p-环糊精(am7-pCD)(图1B),它具有七个伯胺基团。当环糊精位于所述孔内(图1C)，以及有该蛋白质突变体113位的精氨酸的存在，在所述孔通道中的最狭窄的部位存在两个彼此距离很近的环，即一侧的一个由七个氛基形成的环，以及另一个由七个精氨酸形成的环。这种JtJ7精氨酸环结构具有能够可逆性结合磷睃基团的性质，因此能够将XMP和dXMP固定在孔中5至30ms。上述的结合事件可通过其所引起的电流振幅的改变来清楚地检测。1.材料和方法按照前人所述，表达和纯化a溶血素突变体(M113R)7(Cheley，S.，L.-Q.Gu，etal.(2002)，Chem.&Biol.9:829-838)。化学试剂1,2-二植烷酰基-s/^甘油-3-磷酸胆碱购自AvantiPolarLipidsInc。戊烷购自JTBaker,十六烷(99+°/。)购自Sigma-Aldrich。七(6-脱氧-6-氨基)-P-环糊精.11(:1(>99%)购自CYCL0LABLtdBudapest,Hungary。2-脱氧-鸟苷5'单磷酸钠盐(99°/)购自Acros,2-脱氧-胞苷5，单磷酸二钠盐095%)、2-脱氧-胸苷5，单磷酸二钠盐(>97%)和2-脱氧-腺苷5，单磷酸二钠盐095%)购自Fluka。尿苷5，单磷酸二钠盐(9950和胞苷5，单磷酸(>98%)购自Fluka。腺苷5，单磷酸(99%)和鸟苷5，单磷酸二钠盐(97%)购自Acros。氨基丁三醇碱(TrizmaBase)(99.9%)购自Sigma-Aldrich,分析纯级浓盐酸购自FisherScientific,氯4匕钾(99%)和氯化钠(99.9%)购自Sigma-Aldrich。溴化钾(99.5%)和氯化铯(99%)购自Fluka。设备使用AxonInstruments的膜片钳放大器Axopatch200B，该放大器与装备有Digidata1200A/D转换器(Axoninstruments)的计算机一起使用。使用Teflon腔室。用pClamp9.2采集数据，用Clampfit9.0分析数据。用MicrocalOrigin6.0获得曲线图(plot)和图表(graph)，用个人计算机进行积分。实验条件在20jum聚碳酸酉旨膜(20pm厚度，购自Goodfellow，MalvernPA)上的直径为100-150jam的孔洞上，根据MontalandMueller(1972)的方法，用1，2-二植烷酰基-s/^甘油-3-磷酸胆碱形成脂双层膜，所述聚碳酸酯膜将腔室分隔为顺式腔室和反式腔室。腔室的顺式侧位于下方，反式側与顶台相连。电势指的是良式側电极上的电势值。将接头分子加入至反式侧，将ct溶血素突变体和分析物分子加入至顺式侧。在+130mV的电压进行dXMP实验，在+110mV的电压下进行XMP实验。本文所述的所有实验均在1MKC1中含25mMTris-HCl的pH8.0的条件下获得。每天均使用新鲜的核苷酸溶液等分试样。除非另外指明，实验在温度为室温即22.5±2匸下进行。2.结果2-脱氧-核苷酸5，单磷酸部分地阻断由(M113R)7/七-6-氨基-e-环糊精形成的同七聚体孔对由aHL-M113R和从反式侧加入的am7-PCD形成的同七聚体孔进行单通道记录(图2A和2B)。在不存在am7-0CD的情况下，孔在含1MKC1的25mMTris-HCl緩冲液(pH8.0)中保持永久开放的状态(图2A和2B，B)，并具有145±5pA(+130mV)的单式电流(unitarycurrent)(LI)。仅仅在反式腔室中加入40mM的am7-pCD可导致可逆性阻断事件，使电流水平下降到65士5pA(图2A，B和图2B,C中的L2)。在顺式腔室中加入5jaM的dCMP后，可，见察到来源于电流水平L2的第三电流水平22±1pA(图2A，C和图2B，D中的L3)。L3代表dCMP与由(M113R)7和am7-PCD形成的复合物相结合。在腔室的反式侧而非顺式侧加入最高达300pM的dXMP不会使环糊精结合导电状态发生任何的改变(未示出)。在上述实验条件下，当在存在otHL-M113R单纳米孔的条件下向反式腔室中加入未修饰的p-环糊精(40uM)时，可观察到由于环糊精结合导致的电流阻断事件。然而，当向反式或顺式腔室中加入dXMP(最多达300nM)时，未观察到进一步的电流阻断事件(未示出)。在反式腔室中不存在am广pCD的条件下，最少要在顺式腔室中加入浓度为300pM的dGMP或dTMP时才能够观察到阻断事件(〈lms)(未示出)。在dXMP或XMP的浓度为5jiM时，在本实验的时间量程内观察不到上述事件。当测量通过野生型cx-HL单通道的电流时，将am广PCD加入至反式腔室中导致了环糊精结合事件，但是当将dXMP加入至顺式或反式腔室中时未观察到电流的进一步变化。通过部分地阻断由(Ml13R)7/七-6-氨基-0-环糊精形成的同七聚体孔产生的振幅可以识别2-脱氧-核苷酸5，单磷酸当加入至顺式腔室中的dXMP种类不同时，其对暂态复合物(M113R)7/am厂pCD的部分阻断的振幅不同(图3)。向顺式侧中加入dGMP(5juM)可将电流水平平均阻断至16pA(图3A)。图3A中在电流图的右方还显示了电流图的全点振幅直方图，以及dGMP的结构。其他各种核苷酸均显示了不同的振幅，其中图3B为dTMP、图3C为dAMP、图3D为dCMP。在四种dXMP中，dGMP对电流的阻断作用最强。独立实验的结果显示，蛋白质纳米孔的特性不同会使电流的振幅产生一些差异。(M113R)7在+130mV下的平均电流为139pA,但其中一些通道产生的最高电流为147pA,最低电流为131pA。因此，为了比较电流图，对不同实验中的电流图进行了0电流至设定为65pA的(M113R)7/am厂PCD电流水平的标准化。每种dXMP的停留时间(T。ff)是通过三次独立实验计算的，每次实验中对500次事件进行计算(表1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>环糊精电流水平在pH8.O条件下，当蛋白质通道未被填充时，突变体(M113R)7表现出两种电流水平L1/L1，(图4)。不论蛋白质处于L1/L1，哪种电流水平下，环糊精接头都可以与蛋白质相结合。当记录(M113R)7纳米孔的电流水平时观察到两种电流水平(图4)。Ll为主电流水平，示于图4的插图中。am7-pCD与纳米孔的结合产生由L2和L2，表示的两种电流水平(在pH7.5的条件下观察到三种电流水平，未示出)。无论在L1或L1，哪种电流水平下，都会发生am广pCD与蛋白质纳米孔的结合。L2为am厂PCD与(M113R)7结合时观察到的主电导水平，它在空纳米孔的Ll和Ll，两种电导通水平下都可产生，并且没有明显的相关性。当环糊精接头结合且am7-pCD与(M113R)7结合时，观察到电流水平L2，，它可造成电导率产生少于15%的下降(见图4中的插图)。核苷酸结合事件产生的振幅有时会因为该事件所来源的电流水平是L2还是L2，而有所不同。观察到由于来源为L2或L2，的不同而使dXMP的结合事件的电流水平产生0.5pA的变化(未示出)。这使得在核苷酸结合事件直方图(图5)的重叠增加。可以对每次的记录进行人工分析，以便消除来源于图3所示的结合的环糊精电流水平L2，的每次分析物结合事件。图5显示了由未修饰的dXMP检测电流记录获得的单事件分析直方图(图5A)，与来源于电流水平L2，的分析物结合事件(图4)已被除去时的上述记录获得的单事件直方图之间的差异。两个直方图显示了对应于dGMP、dTMP、dAMP和dCMP的同样的四个峰。图5A中的峰的振幅大于图5B中峰的振幅，这是因为来源于L2，的分析物结合事件已被除去，因此，该直方图来源于较少的事件。图5B中每个峰之间的分离程度看起来要优于图5A。但是，从记录中除去上述事件也不能使每个峰完全分离(图5B)。因此，在单事件分析直方图中并未考虑图4中所示的环糊精电流水平L2和L2，，所得的统计学结果在下文有述。通过部分地阻断由(M113R)7/七-6-氨基-P-环糊精暂态复合物形成的同七聚体孔产生的振幅可以识别2-脱氧-核苷酸5，单磷酸已证实(M113R)7/am7-PCD孔的部分阻断的振幅会因为在顺式腔室中加入的dXMP种类不同而不同。当将dGMP、dTMP、dAMP和dCMP同时加入顺式腔室时，可以解析上述不同的振幅(图5)。图6A显示了单次实验中含有全部4种核苷酸的混合溶液的电流振幅。在所记录的电流图上叠加有色条带来说明每种dXMP的振幅分布。图6B显示了8000次事件的电流图的振幅直方图，假设该图是由每种核苷酸产生的振幅分布。使振幅直方图与高斯分布相重叠。利用由这一实验所给出的峰电流值作为分布平均值，以及a值进行拟合，所述C7值通过独立地拟合每种核苷酸分布并独立地计算其平均值而获得(表2)。通过用高斯分布对电流图进行拟合，可以确认鉴别每种核苷酸种类的概率。统计学方法将在反式侧存在am广PCD和顺式侧存在一种分析物核苷酸的条件下获得的(M113R)7的电流图以300Hz进行数字滤波(低通高斯滤波器)，并且构建全点振幅直方图。上述直方图显示一个大峰，所述大峰对应于am厂PCD与(M113R)7(x溶血素突变体相结合时观察到的电流振幅(对应于图1中的L2)。对于不同实验的各蛋白质通道，这一电流振幅的变化在5%以内。因此，对全振幅直方图进行0电流至主要环糊精峰设置65pA的标准化。在标准化之后的直方图中，用高斯分布拟合核苷酸峰。同一种核苷酸的平均值和a值来自至少三次独立实验的平均值，每一实验包括1000个事件(值列于表2)。表2.来自三个独立实验并全部按照0至65pA进行标准化之后的每种核苷酸分布的平均值。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>读出每一碱基的概率是通过同时存在全部4种核普酸的实验来测定的，在所述实验中每一电流图中至少发生3000次核苷酸结合事件。对电流图进行滤波(300Hz低通高斯数字滤波器)和0至环糊精峰值65pA的标准化(如上文单个核苷酸实验中所述)。每种核苷酸的峰值来自5次独立实验的平均值(表3)。表3.在5次独立的存在全部4种核苷酸的实验中，每种核苷酸的峰值。最后一列显示的是对每个峰的高斯分布的重叠部分进行积分之后所得的平均值。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>在存在全部4种核苷酸的实验中，全部4种核苷酸的高斯分布存在重叠。根据某种核苷酸及其相邻的核苷酸的高斯分布之间的重叠水平，计算了来自该种核苷酸的结合信号会被识别为其本身或是被识别为另一种核苷酸的统计学概率。根据各自的峰位置(由混合核苷酸的实验得到)和每种分布的a值(由单个核苷酸实验的拟合得到)计算两个高斯分布之间的交点。通过对截距值确性概率(图6，表4)。表4中的第一列为与纳米孔相互作用的核苷酸,第一行为从相应的电流振幅读出的核苷酸。表4.显示了所加入的核苷酸(纵向)被检测为其本身或被检测为另一种核苷酸的概率(横向)。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>3.结论所给出的结果表明，随机传感是一种有前景的识别单个核苷酸的替代方法。这还意味着外切核酸酶测序可被用作一种单分子水平上的快速简便且成本低廉的DNA测序方法。外切核酸酶测序还是一种成本低廉的DNA测序方法，因为它不需要昂贵的试剂，例如荧光团。全点直方图是一种识别每种核苷酸的有效分析方法，其准确率为74%至94%(表4)。在实验条件下XMP和dXMP的停留时间值过于接近，以至于无法进一步区分每种分析物。可以通过补偿图4中所示的环糊精电流水平来进一步改进由振幅直方图得到的统计学结果。每种dXMP之间的电流振幅差异约为lpA。这一分辨率依赖于下述的各种参数。电压依赖性结合事件依赖于电压。在50mV条件下，仅能观察到极少量的结合事件，表明驱动dXMP和XMP接近结合位点需要一个最低电场。在+l50mV和+200mV条件下，所产生的振幅使得不再能区分各核苷酸。已证实+130mV是用于脱氧核糖核苷酸5，单磷酸的最佳电压，+110mV时对于核糖核苷酸5，单磷酸可获得最佳的分辨率。盐浓度测试了分别含有0.5M、1M和2MKC1的pH8的Tris-HCl緩冲液。从全点振幅直方图来看，在1MKC1时获得了峰之间的最佳分辨率。pH依赖性电流振幅依赖于pH，测试了pH分别为7.5、8.0、8.2、8.5、9.0和9.5的含1MKC1的Tris-HCl緩沖液。在pH为8.0或更高时，am7-PCD结合时可观察到两种电流水平(图4)。在pH7.5时，七-6-氨基-P-环糊精表现出第三种电流水平(未示出)。这使得dTMP表现出两种振幅不同的事件类型，而其中一种处于dGMP事件的范围内，因此使得分辨率降低。在pH9.5时，不再能够观察到核苷酸结合事件。在pH8.0时获得最佳的峰分辨率。盐依赖性使用KCl获得的dXMP和XMP之间的分辨率要好于使用NaCl或CsCl。1MKC1产生的分辨率好于2MKC1。使用KBr则不能识别不同的核苷酸，因为此时每种结合事件都会导致(Ml13R)7/am7-PCD暂态复合物的完全阻断。温度依赖性将温度降低至141C或升高至50t:都不会干扰dXMP/XMP的检测。但是这也不会提高振幅直方图的分辨率。其他的a溶血素突变体观察到(M113N)7可以结合am7-PCD,但是观察不到核苷酸的检出。不论是否加入am7-PCD,使用(M113F)7和(M113F/147K)7都无法进行检测。在相同条件下测试了(M113K)7。在这种情况下，所得的记录很接近图1的结果。使用(M113K)7突变体和am7-pCD可以检出核苷酸，但是各核苷酸之间的峰分离程度比使用(M113R)时要小。核糖核苷酸5，单磷酸使用上述方法可以成功地识别XMP，但是每种碱基之间的分辨率不如对dXMP的每种碱基之间的分辨率，同时U、A和C的峰分离度小于1pA。在XMP的全点直方图中，电流振幅出现的顺序与dXMP的相同，GMP表现出的电流最低(最强的阻断)，然后是UMP、AMP和CMP,CMP表现出最高的电流振幅(最弱的阻断)。在pH8.0且1MKC1时，发现用于识别XMP的最佳电压为+110mV。机理还发现(Ml13R)7/am7-PCD暂态复合物可以结合和区分磷酸葡萄糖(单磷酸葡萄糖和单磷酸半乳糖)。这表明在一侧的精氨酸环、磷酸基团和另一侧的am7-pCD的氛基环之间存在强烈的相互作用。未修饰的P-环糊精不能产生任何检出结果。观察到XMP与dXMP之间的差异很小，表明羟基在所述结合过程中并不起重要的作用。权利要求1.一种识别单个核苷酸的方法，包括(a)将所述核苷酸与跨膜蛋白质孔相接触，以使得所述核苷酸与所述孔相互作用，以及(b)测量在相互作用过程中流过孔的电流，由此确定所述核苷酸的身份。2.根据权利要求1的方法，其中所勤目互作用包括所述核苷酸与所述孔的通道可逆地结合。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述孔为SEQIDNO:2所示的a溶血素或其变体。4.根据权利要求3的方法，其中所述变体为(M113R)7。5.根据权利要求1-4任一项的方法，其中所述孔含有^!Ui所述核苷酸与所述孔之间相互作用的分子接头。6.根据权利要求5的方法，其中所述分子接头为七-6-^J^-e-环糊精(am厂pCD)。7.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述单个核苷酸为单磷酸核苷酸、二磷酸核苷酸或三磷酸核苷酸。8.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述单个核苷酸为核糖核苷酸。9.根据权利要求8的方法，还包括在步骤(a)之前消化核糖核酸(RNA)序列以提供单个核苷酸。10.根据权利要求l-7任一项的方法，其中所述单个核苷酸为脱氧核糖核苷酸。11.根据权利要求10的方法，还包括在步骤(a)之前消化脱氧核糖核酸(DNA)序列以提供单个核苷酸。12.根据权利要求9或11的方法，其中将多于一个的RNA序列或DNA序列的单个核苷酸以连续的方式地与孔接触，以使得所述序列的全部或部分的身份可以被确定。13.孔用于识别单个核苦酸的用途。14.一种测定目标核酸序列的方法，包括(a)使用进行性外切核酸酶从目标序列的一端消化下单个核苷酸；(b)将所述核苷酸与跨膜蛋白质孑14目接触，以使得所述核苷酸与所述孔相互作用；(c)测量在相互作用过程中流过孔的电流，由此确定所述核苷酸的身份；以及(d)在所述核酸序列的同一端重复步骤(a)至(c)，由此测定所述核酸的序列。15.—种核酸测序试剂盒，包括---种环糊精；以及---种进行性外切核酸酶。16.根据权利要求15的试剂盒，还包括一种跨膜蛋白质孔。全文摘要本发明涉及一种识别单个核苷酸的方法，包括(a)将所述核苷酸与跨膜蛋白质孔相接触，以使得所述核苷酸与所述孔相互作用，以及(b)测量在相互作用过程中流过孔的电流，由此确定所述核苷酸的身份。本发明还涉及核酸序列的测序方法及其相关的试剂盒。文档编号C12Q1/68GK101356288SQ200680050878公开日2009年1月28日申请日期2006年11月15日优先权日2005年11月15日发明者H·贝利,O·布雷厄,Y·阿斯泰尔申请人:Isis创新有限公司