专利名称：鱼类异源冷冻精子诱导雌核发育的方法
技术领域：
本发明属于鱼类遗传育种技术，是一种采用异源冷冻精子培育鱼类雌核发育二倍体的方法，可应用于鱼类性别控制和全雌苗种的生产。
背景技术：
许多鱼类在生长速率上存在雌雄差异。例如，罗非鱼雄性个体生长比雌性个体快50％以上，而许多海水鲆鲽鱼类的雌性个体生长比雄性个体快许多，如星鲽和大西洋牙鲆等鲆鲽鱼类雌性个体生长比雄性个体快50-100％。由于雄性个体生长过慢，降低了这些鲆鲽鱼类的养殖产量和养殖效益，增加了养殖成本，严重影响了这些鱼类苗种的推广和养殖产业的形成，因此，对这些鱼类开展雌核发育技术的研究、研制全雌群体，在渔业生产中推广应用全雌苗种，对于提高这些鱼类的养殖产量和商品价值，非常重要，同时，全雌苗种的推广必将产生巨大的经济和社会效益。
雌核发育是单性生殖的一种，指卵子依靠自身的遗传物质发育成个体的生殖行为。雌核发育现象最早发现于天然鱼类阿马逊花鳉(Poeciliaformosa)，分布于我国的方正银鲫、彭泽鲫等也属于天然雌核发育鱼类。
目前国内，对银鲫天然雌核发育机理进行了大量的研究(中国科学院水生生物研究所，桂建芳等，1996)，最早在鲤鱼上建立了雌核发育技术(中国科学院水生生物研究所，吴清江，1981)；迄今，在淡水鱼类雌核发育的研究中，通常采用同源新鲜精液进行刺激，诱导雌核发育二倍体的产生(中国水产科学研究院长江水产研究所，潘光碧等，1995)。但由于同源精子来源于同一种鱼类，其染色体数量相同，因而同源精子诱导存在精子失活不完全、雌核发育苗与正常受精来源的鱼苗难以鉴别等问题，因而影响了雌核发育技术的应用效果，影响了全雌鱼类苗种的培育。因此，探索采用染色体数量不相同的异源鱼类精子进行鱼类雌核发育的诱导，将具有更大的实用性和应用价值。
由于不同鱼类的繁殖期不同，所以很难采用异源鱼类的新鲜精液进行雌核发育的诱导，因此，我们采用现代生物技术手段，对异源鱼类精子进行冷冻保存，待需要时进行解冻，用于鱼类卵子雌核发育的诱导，则可以克服上述诸多问题，使鱼类雌核发育变得简便易行，有利于进行推广应用，因而成为国际上的发展趋势。有关鱼类异源冷冻精子诱导的雌核发育研究，目前国内外均未见报道。
发明内容
本发明的目的是采用遗传失活的异源冷冻精子诱导鱼类卵子进行雌核发育，并在适宜的时期对授精卵进行染色体加倍处理，以阻止卵的第二极体排出，使雌核发育卵的染色体加倍，发育成具有活力的雌核发育二倍体鱼苗。
本发明其技术内容如下 包括三个方面一、异源鱼类冷冻精子的遗传失活；二、雌核发育二倍体鱼苗的诱导；三、雌核发育鱼苗的鉴定。
一、异源鱼类冷冻精子的遗传失活它的技术内容包括1、适宜的异源精子的选择；2、异源精子的冷冻保存和解冻；3、异源冷冻精子的遗传失活 1、适宜的异源鱼类精子的选择 首先，通过染色体分析比较，尽量选取染色体数量不同的鱼类精子作为雌核发育用精子；其次，采用多种鱼类精子分别同拟诱导雌核发育的鱼类卵子进行杂交授精，观察受精卵的发育情况，寻找可以与鲆鲽鱼类(条斑星鲽、大菱鲆等)卵受精后胚胎可以发育至原肠胚、并且受精率较高的鱼类精子。通过这种筛选方法，本发明发现花鲈(染色体数为48条)精子可以刺激多种鲆鲽鱼类(条斑星鲽染色体为46条，大菱鲆染色体为44条)卵子进行雌核发育。
2、异源精子的冷冻保存和解冻 在繁殖季节，选取发育成熟的花鲈雄鱼，用手挤压腹部采集无尿污的精液，利用显微镜检查精子的活力，选择精子活力在80％以上的精液用于冷冻保存。将精液与4℃预冷的冷冻稀释液(配方为KCl 0.39g/L，CaCl2·2H2O 0.17g/L，NaHCO3 0.25g/L，NaCl 3.59g/L，NaH2PO4 0.22g/L，MgCl2 0.23g/L，Glucose 1.0g/L，DMSO 20％)，以体积比1∶1的比例混合后，分装到2.0ml的冷冻保存管，在4℃冰箱平衡20分钟后，放入液氮罐口下平衡5分钟，再在液氮面上平衡5分钟，最后浸入液氮中冷冻保存。解冻时，将精液冷冻管从液氮中取出来，先在液氮面上平衡5分钟，然后将冻精管拿出来在38℃水浴中解冻后备用。
3.异源冷冻精子遗传物质的失活 冷冻精子的遗传失活采用紫外线照射完成。首先镜检解冻后精子的活力，精子活力达到70％以上者用于紫外线失活处理。吸取100μL冷冻解冻的花鲈精液，置于在6℃预冷过的直径为10cm的培养皿中，加入900μL不含DMSO的上述精子冷冻稀释液进行稀释，摇匀平辅在直径10厘米的塑料培养皿底部，将装有冷冻精液的培养皿置于紫外照射仪(UVC500，Pharmacia)中，利用10-80mJ/cm2紫外线照射0.1-0.9min，照射后的精子活力应该保持在20-40％左右。
二、雌核发育二倍体的诱导它的技术内容包括1、未受精卵的采集及与失活精子的“授精”；2、雌核发育鱼卵冷休克起始时间的确定；3、雌核发育鱼卵冷休克强度，即处理时间和温度的确定。
1.未受精卵的采集及与失活精子的“授精” 选择性成熟的条斑星鲽、大菱鲆或犬齿牙鲆雌鱼，在自然产卵前1h采用人工挤压腹部法采卵，将卵采入干燥的烧杯中，根据鱼的种类不同，将采集的鱼卵置于不同的温度下，其中条斑星鲽卵放在8℃，大菱鲆卵放在14℃，犬齿牙鲆卵在18℃；将以上经过遗传灭活的花鲈精液加入不同鱼的未受精卵中，轻轻摇动混匀，加入2倍于卵量的海水完成“授精”过程，海水温度根据鱼的种类确定，其中条斑星鲽卵授精温度为8℃，大菱鲆卵放在为14℃，犬齿牙鲆卵为18℃。精液和卵的授精最小体积比为100μL4-8ml，授精过程在250ml烧杯中进行。通过遗传失活的花鲈精子刺激鱼卵进行雌核发育。
2.雌核发育鱼卵冷休克起始时间的确定 根据雌核发育鱼种类的不同，在“授精”后不同时间(3，5，7，9，11和13分钟)，将盛有雌核发育卵的烧杯浸入0-2℃的海水浴中进行冷休克处理，冷休克处理时间为20-25min，冷休克处理完毕后将卵杯移入8-18℃海水中培养。在雌核发育鱼苗孵化出膜后，计算雌核发育诱导率，从而确定适合于不同海水鱼类雌核发育冷休克诱导的有效起始时间，其有效起始时间分别为条斑星鲽为7-9分钟；大菱鲆为4-6分钟；犬齿牙鲆为3-5分钟。
3、雌核发育鱼卵冷休克强度，即处理适宜时间和温度的确定 雌核发育鱼卵冷休克温度和冷休克处理时间，根据确定的冷休克起始时间，设计试验，将紫外线(UV)处理过的花鲈精子与条斑星鲽、大菱鲆和犬齿牙鲆等鱼类鲜卵授精，然后按冷休克温度和冷休克持续时间两因素进行正交试验设计，根据鱼的种类不同，设计的参数不尽相同；冷休克温度取-2℃、-1.5℃、-1℃、0℃、1℃、2℃、3℃、4℃等几个水平，冷休克持续时间取20、30、40、50、60、90和100分钟等7个水平，进行冷休克处理。
计数后代中雌核发育二倍体产生情况，实验结果表明 条斑星鲽雌核发育卵在-0.5℃到-1.5℃的冷休克下，均能成功诱导出雌核发育的二倍体条斑星鲽鱼苗；而最佳的冷休克处理时间为60-90min，二倍体雌核发育鱼苗的诱导率为7.8-40.7％。
犬齿牙鲆雌核发育卵适宜的冷休克温度为1-2.0℃；冷休克处理的适宜时间为40-50min，其诱导率明显高于其他处理组。二倍体雌核发育鱼苗的诱导率为10-25％。
大菱鲆雌核发育卵的有效冷休克温度为-1-2℃，冷休克的有效持续时间为20-30分钟。在这些诱导条件下，孵化出雌核发育二倍体仔鱼的比例最高，二倍体雌核发育鱼苗的诱导率为26-34％； 三、雌核发育鱼苗的鉴定它的技术内容包括1.通过染色体数量和核型鉴定雌核发育鱼苗；2.通过微卫星分子标记手段鉴定雌核发育鱼苗。
1.染色体分析鉴定雌核发育鱼苗由于花鲈染色体数目为2n＝48条，其核型为48t；条斑星鲽染色体数目为2n＝46，其核型为44t+2sm大菱鲆染色体数目为2n＝44，其核型为2n＝4m+12st+28t，因此花鲈的染色体数目与这些鱼类不相同，通过染色体分析即可证明雌核发育鱼苗是否为雌核发育而来。如果雌核发育鱼苗的染色体数目及核型与母本(条斑星鲽、大菱鲆或犬齿牙鲆等)完全相同，则证明这些鱼苗是雌核发育而来。本发明采用常规染色体制片方法，对条斑星鲽、大菱鲆等鱼类雌核发育鱼苗进行了染色体分析，发现条斑星鲽雌核发育鱼苗的染色体数为46条，大菱鲆雌核发育鱼苗的染色体数为44条，与母本完全相同，从而证明这些鱼苗为雌核发育二倍体个体。
2.用微卫星标记鉴定雌核发育鱼苗； 微卫星标记具有较高的多态性，能够检测出种群及个体间的异质性，可以用于检测雌核发育二倍体是否有父方基因表达及其与母本的遗传同质性；微卫星共显性遗传的特点使其能够应用于雌核发育二倍体的纯合性研究。因此，我们采用微卫星标记鉴定雌核发育鱼苗。
(1).基因组DNA的提取 采取高盐法提取雌核发育鱼和正常鱼基因组DNA，首先将固定于纯酒精中的鱼苗或鱼鳍条置于1.5ml离心管中，剪碎后加入400μlTENS裂解液(10mM Tris-HCl，pH 7.5，400μM NaCl，100mM EDTA，0.6％SDS10mMTris-HCl，PH 7.5，400μM NaCl，100mM EDTA，0.6％SDS)和10μl蛋白酶K(10mg/ml)，然后至于55℃消化。消化完全后，加入140μl饱和氯化钠，混匀，12000 rpm/min 4℃离心30min。取上清加入两倍体积预冷的无水乙醇沉淀，然后将絮状沉淀挑出后用70％的酒精洗涤两次，待酒精挥发干后，用TE(10mMTris-HCl，pH 8.0，10mM EDTA)溶解DNA。
(2)PCR扩增 PCR反应体系为10μl，包括1×PCR buffer[20mMTris-HCl，PH8.4，20mM KCl，10mM(NH4)2SO4]，10-50ng基因组DNA，0.2μM引物，120μMdNTPs，1.5mM MgCl2和0.5U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。PCR扩增条件为94℃热变性5min，然后进行38个循环，每个循环包括94℃变性30s，56-62℃退火30s，72℃延伸30s，最后在72℃延伸7min。用于雌核发育犬齿牙鲆检测的PCR引物为Pade30，其序列为CGAGGAGGGGAAGAAAGAAC和CACAACCCAAGCGCAACTAT；用于雌核发育条斑星鲽检测的PCR引物为Vmo4，其序列为CACTGTGCCCACTGTCTG和TTTTCCTCTTACTCCCTCTCTT；用于雌核发育大菱鲆检测的微卫星引物为SmaC03，其序列为TGGACTGGTTTACTGCTGGA和AGGGAACCGATCTGAGAACA。
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳 在PCR产物中加入1/2体积的甲酰胺上样液(0.01M EDTA，1mg/ml溴芬蓝，1mg/ml二甲苯青)于95℃变性5分钟，然后立刻放在冰上。在6％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，以pBR322DNA/Msp I(TIANGEN)为标记。采用银染法染色。
(4)结果分析 首先通过微卫星富集文库法构建了大西洋牙鲆和条斑星鲽富集文库，从中筛选出多态性微卫星标记。然后用这些多态引物在正常群体和雌核发育群体中进行扩增，从中进一步筛选出在正常群体里杂合率较高、在雌核发育群体里纯合率较高的引物。经过筛选，从犬齿牙鲆微卫星富集文库中筛选到的微卫星引物CGAGGAGGGGAAGAAAGAAC和RCACAACCCAAGCGCAACTAT可以用来鉴定大西洋牙鲆雌核发育二倍体，该引物在犬齿牙鲆正常鱼苗中扩增出2条带(即杂合率)的比例为86％，而在雌核发育鱼苗(12尾)中，有9个个体只扩增出1条DNA带，仅有3个个体扩增出2条DNA带，杂合率仅为25％，并且在所有检测的纯合个体中未见异于正常群体的等位基因，由此可以证明这批鱼苗是雌核发育而来。采用条斑星鲽微卫星引物CACTGTGCCCACTGTCTG和TTTTCCTCTTACTCCCTCTCTT扩增条斑星鲽正常鱼苗(12尾)基因组DNA，其中9个个体扩增出2条DNA带，杂合率为75％，而在雌核发育鱼苗(9尾)中，所有个体都只扩增出1条DNA带，均为纯合型，杂合率为0，同样在所有检测的纯合个体中未见异于正常群体的等位基因，由此表明这批鱼苗是雌核发育鱼苗。采用大菱鲆微卫星引物TGGACTGGTTTACTGCTGGA和AGGGAACCGATCTGAGAACA进行雌核发育大菱鲆检测时，扩增大菱鲆正常鱼时，85％以上的鱼苗产生2条DNA带，表现为杂合型，而在雌核发育鱼苗中，75％以上的个体只产生1条DNA带，表现为纯合型，而只有25％的个体表现为杂合型。因此可以用于鉴定大菱鲆雌核发育鱼苗。
本发明与已有技术对比其特点是 本发明筛选到能有效诱导海水鱼类进行雌核发育的异源鱼类-花鲈精子，建立了采用冷冻保存2年以上的花鲈精子诱导条斑星鲽、大菱鲆和犬齿牙鲆等多种海水鱼类卵子进行雌核发育的技术方法；首次筛选出有效的诱导各种鱼类卵子进行雌核发育的技术参数；因为，花鲈精子与上述鱼类卵子杂交后均难以成活，因此，和以往的同源精子诱导方法相比较，本发明建立的异源冷冻精子诱导鱼类雌核发育的方法具有明显的创新性，本方法诱导出的个体均为雌核发育个体，不存在杂交二倍体个体，也不存在同种精子诱导过程中可能出现的精子灭活不完全时在后代中会出现正常受精个体，因此，本方法非常有效和可靠。
本发明采用长期冷冻保存的花鲈精子，解决了花鲈繁殖时间与其它海水鱼类因繁殖时间不同而难以进行交配的问题，可以不受时间限制地为各种鱼类雌核发育研究提供精子材料。
本发明首次建立了用异源冷冻精子诱导鱼类雌核发育的技术方法，其特点是操作简单、实用性强、易行、安全、可靠等优点，为鱼类性别控制和单性育种开辟了新的技术途径，可推广应用于几乎所有鱼类，可应用于鱼类性别控制及全雌苗种的生产。
具体实施例方式 采用遗传失活的异源冷冻精子刺激卵子，同时对雌核发育卵进行冷休克处理，抑制第二极体排出使染色体进行加倍，可以成功诱导条斑星鲽、大西洋牙鲆和大菱鲆等鲆鲽鱼类的雌核发育，建立在海水鱼类上通用的异源冷冻精子诱导的雌核发育诱导技术，对于这些鲆鲽鱼类的性别控制、培育全雌单性苗种，进行全雌苗种养殖，提高这些鱼类的养殖产量和经济效益，具有重要的现实意义和巨大的推广应用潜力。
下面以条斑星鲽和大菱鲆为例，对本发明的技术内容进行详细说明 本发明的技术内容包括三个方面一、异源鱼类冷冻精子的遗传失活；二、雌核发育二倍体鱼苗的诱导；三、雌核发育鱼苗的鉴定。
一、异源鱼类精子的冷冻保存及遗传失活；它的技术内容包括1、适宜的异源鱼类精子的选择；2、异源鱼类精子的冷冻保存和解冻；3、异源鱼类冷冻精子的遗传失活 1、适宜的异源鱼类精子的选择 首先，通过染色体分析比较，尽量选取染色体数量不同的鱼类精子作为雌核发育用精子；其次，采用多种鱼类精子分别同条斑星鲽卵子进行杂交授精，观察受精卵的发育情况，寻找可以与条斑星鲽卵受精后胚胎可以发育至原肠胚以后，并且受精率较高的鱼类的精子。通过这种筛选方法，本发明发现花鲈(染色体数为48条)精子可以刺激条斑星鲽(染色体为46条)卵子进行雌核发育。从表1可见，当用未经紫外线照射的花鲈精子与条斑星鲽卵子授精后，不进行任何处理，这种杂交授精的胚胎只能存活1天(杂交组)；当用未经紫外线照射的花鲈精子与条斑星鲽卵子授精后，再进行冷休克处理时，这种胚胎也只能存活1天(杂交休克组)；当用紫外线(剂量为10-80mJ/cm2，照射时间为0.1-0.9min)照射过的花鲈精子与条斑星鲽卵进行授精时，授精卵不进行冷休克处理，这种胚胎为单倍体，只能存活9天，孵化出的鱼苗不能继续发育而死亡(灭活不休克组)；当用紫外线照射过的花鲈精子与条斑星鲽卵授精后，再进行冷休克处理，胚胎可以正常发育，孵化出的鱼苗可以存活下来(灭活休克组)。
由此表明花鲈精子与条斑星鲽卵子杂交是不育的，而经过紫外线遗传失活的精子是可以诱导条斑星鲽卵雌核发育的。
表1四种不同灭活和冷休克组合处理条斑星鲽胚胎存活率(％) 注条斑星鲽的胚胎需要孵化7-8天才能孵化出鱼苗。
2、花鲈精子的冷冻保存和解冻 在繁殖季节，选取发育成熟的花鲈雄鱼，注射催产素(1-2μg LRH-A3/kg，20-40UI HCG/kg)后15-20小时，用手挤压雄鱼腹部采集无尿污的精液，利用显微镜检查精子的活力，选择精子活力在80％以上的精液用于冷冻保存。将精液与在4℃预冷的抗冻稀释液-二甲亚砜(DMSO)混合液(配方为KCl 0.39g/L，CaCl2·2H2O 0.17g/L，NaHCO3 0.25g/L，NaCl 3.59g/L，NaH2PO4 0.22g/L，MgCl2 0.23g/L，Glucose 1.0g/L，DMSO 20％)以体积比1∶1的比例混合后，分装到2.0ml的冷冻保存管，在4℃冰箱平衡20分钟后，放入液氮罐口下平衡5分钟，再在液氮面上平衡5分钟，最后浸入液氮中冷冻保存。解冻时，将精液冷冻管从液氮中取出来，先在液氮面上平衡5分钟，然后将冻精管拿出来在38℃水浴中解冻后备用。
3.花鲈冷冻精子遗传物质的失活 冷冻精子的遗传失活采用紫外线照射完成。首先镜检解冻后精子的活力，精子活力达到70％以上者用于紫外线灭活处理。吸取100μL冷冻解冻的花鲈精液置于在6℃预冷过的直径为10cm的培养皿中，加入900μL不含DMSO的上述精子冷冻稀释液进行稀释，摇匀平辅在直径10厘米的塑料培养皿底部，将装有冷冻精液的培养皿置于紫外照射仪(UVC500，Pharmacia)中，利用10mJ/cm2紫外线分别照射0.1-0.9min，每0.1min为1个梯度，照射后在镜下检查其活力，如表1。从表中可以看出，经紫外线照射0.3min后精子活力会大幅度降低，因此选择照射0.1-0.3min较好，精子活力保持在40-43％较好。
表2冷冻/解冻鲈鱼精子经紫外线照射后活力(％)(n＝3) 二、雌核发育二倍体鱼苗的诱导；它的技术内容包括1、未受精卵的采集及与失活精子的“授精”；2、雌核发育鱼卵冷休克起始时间的确定；3、雌核发育鱼卵冷休克强度，即处理时间和温度的确定；4、雌核发育结果。
(一)、条斑星鲽雌核发育二倍体的诱导 1.未受精卵的采集及与失活精子的“授精”； 在条斑星鲽繁殖季节(每年1-3月份)，选择腹部开始膨大的雌性亲鱼，按照常规方法，采用温度刺激方法，诱导亲鱼成熟时，将亲鱼池水温从18℃逐渐下降，在1.5-2个月内将水温降到7-8℃，即可诱导雌鱼成熟，然后维持在7-8℃，通过注射激素诱导雌鱼排卵。在自然产卵前1h采用人工挤压腹部法采卵，将卵采入干燥的烧杯中，条斑星鲽卵须放在8℃左右存放。然后，将以上经过遗传灭活的花鲈精液加入条斑星鲽的未受精卵中，轻轻摇动混匀，加入2倍于卵量的海水完成“授精”过程，海水温度为8℃。精液和卵的授精最小体积比为100μL4ml，授精过程在250ml烧杯中进行。通过遗传灭活的花鲈冷冻精子刺激鱼卵进行雌核发育。在“授精”后1天(原肠期，1dpf)、3天(眼囊期，3dpf)、9天(孵化期，9dpf)和12天(孵化后第3d，12dpf)分别计数胚胎或鱼.苗的成活率。
2.雌核发育鱼卵冷休克起始时间的确定； 在“授精”后以不同时间(3，5，7，9，11和13分钟)将盛有雌核发育卵的烧杯浸入0-2℃的海水浴中进行冷休克处理，冷休克处理时间为20-25min，冷休克处理完毕后将卵杯移入8-18℃海水中培养。在雌核发育鱼苗孵化出膜后，计算雌核发育诱导率，从而确定适宜条斑星鲽卵冷休克诱导的起始时间为“授精”后7-9分钟。
表3不同冷休克起始时间下条斑星鲽雌核发育二倍体诱导率(％) 3、雌核发育鱼卵冷休克处理适宜时间和温度的确定 冷休克强度分为两个方面，一是冷休克温度，二是冷休克处理时间。根据确定的冷休克起始时间，设计试验，将UV处理过的花鲈精子与条斑星鲽鲜卵授精，然后按冷休克温度和冷休克持续时间两因素进行正交试验设计；冷休克温度取-2℃、-1.5℃、-1℃、0.5℃、0℃、1℃等几个水平，冷休克持续时间取30、60、90分钟等3个水平，进行冷休克处理。
计数后代中雌核发育二倍体产生情况，实验结果表明条斑星鲽雌核发育卵在0℃到-1.5℃的冷休克下，均能成功诱导出雌核发育的二倍体条斑星鲽鱼苗；而最佳的冷休克处理时间为60-90min。
表4不同冷休克处理强度下条斑星鲽雌发育二倍体诱导率(％) 4、条斑星鲽雌核发育结果； 最终的试验结果见附图
，从图中可见不灭活的精子和灭活精子均可以同条斑星鲽的卵授精，授精率没有明显的差异，但未灭活精子和条斑星鲽的杂交胚胎，在眼囊期以前全倍死亡，而灭活精子和条斑星鲽的授精后胚胎可以发育至鱼苗孵化。这说明，花鲈精子和条斑星鲽卵可以杂交，但是杂交胚不能成活到眼囊期以后。由于杂交不成活，所以在用花鲈精子进行条斑星鲽雌核发育的诱导时，可以不用考虑精子灭活不完全产生的杂交问题。灭活精液授精的胚胎，如不进行冷休克处理大部分胚胎可以发育至眼囊期以后，但只有小部发鱼苗可以孵化，表现为明显的体短，弯曲，卵黄囊变粗大等特征，为典型的单倍体综合症。这些鱼苗在孵化后的数天内全部死亡。而经过冷休克处理的灭活精子组，孵出的鱼苗一部分表现为单倍体综合症，但也有一少部分鱼苗在形态上表现正常，并存活到孵化后的7天以上，这部分鱼苗即为雌核发育二倍体鱼苗。
根据前面的试验结果，最终确定了条斑星鲽雌核发育的有效诱导条件为授精后7-9min，在温度为-1- -1.5℃的海水中冷休克处理60-90min。
根据以上条件，处理条斑星鲽卵共进行4批，总卵量为5000ml左右(约130万粒)，按以上确定的最佳条件进行诱导。共获得雌核发育二倍体鱼苗16000余尾，总诱导率约为0.5％。
(二)、大菱鲆雌核发育二倍体的诱导 1.大菱鲆鱼卵和花鲈精子； 利用莱州市明波水产有限公司人工培育的大菱鲆亲鱼20尾，雌鱼体重1-2kg/尾，经过生殖调控达到性成熟并开始自然产卵，人工挤压腹部获得大菱鲆未受精卵。实验用异种鱼精子为2002年10月-2003年11月冷冻保存的花鲈精子，保存期限为3-4年，利用37℃水浴解冻后在显微镜下检查，精子活力保持在80-90％。
2.减数分裂雌核发育冷休克起始时间筛选 每一次实验吸取100μL冷冻精子置于经6℃预冷的培养皿中，加入900μL的精子稀释液稀释，平辅底部，利用强度为10-30mj/cm2紫外线照射0.1-0.3min，取大菱鲆卵4mL于烧杯中，加入照射后的精子充分混合，再加入4mL温度为14℃的海水，轻轻摇动授精。分别在授精3、4、5、6、7、8min后将盛卵的烧杯放入0℃水浴中进行冷休克25min，之后将卵放入14℃海水中复温，利用相同温度的海水冲洗受精卵，最后将卵放入14℃海水中培养。胚胎发育到囊胚期或原肠前期统计胚胎发育率，孵化后统计成活率。结果如表5。
表5受精后不同时间休克后雌核发育胚胎的发育率和孵化率(％)(n＝3-6) 受精后3～5min休克胚胎发育至原肠期的发育率都较高，能到60％以上，受精后4-6min休克组的雌核二倍体成活率要较其它时间高，为26.55-33.69％，因此选择受精后4-6min作为大菱鲆卵冷休克的适宜起始时间。另外，对照实验表明，未经紫外线照射的花鲈精子与大菱鲆卵的杂交受精率和发育至尾芽期成活率较紫外线照射精子的受精率明显高，但胚胎发育不能形成正常肌节，视泡较小、胚体周围组织散乱，尾部畸形短小，是明显的单倍体综合症，不能成活。
3.冷休克持续时间的筛选 将紫外线失活后的花鲈冷冻精子100μL与4ml大菱鲆卵授精，授精后将卵放在14℃海水中进行培养；在授精后5min将卵杯置于0℃水浴中分别休克15、20、25、30、35min。同时，取1组受精卵在授精后不经过冷休克，直接在14℃海水中培养做为对照组。胚胎发育到原肠期统计发育率，孵化后统计正常育苗比率，结果如表6。
从表6可以看出，各实验组胚胎都会孵出正常仔鱼，但是休克20-30min实验组正常鱼苗数量较其它组多。不经休克的大菱鲆卵发育至原肠早期的发育率可达75.24±6.79％，与其它实验组有显著性差异(p＜0.05)，但不休克组发育至原肠后期不能形成完整的胚体，无肌节、视泡和神经管等组织，孵化仔鱼畸形。因此，冷休克时间选择20-30min较为合适。
表6休克时间对大菱鲆雌核发育鱼苗百分率的影响(％)(n＝3-9) 4.冷休克温度的筛选； 利用紫外线照射的鲈鱼冷冻精子与大菱鲆卵受精，每个实验的精子和卵量及精子处理方法与实验2相同，在受精后5min分别将卵置于-1、0、1、2、3、4、5、6℃的水浴中冷休克25min，其中1组卵受精后不休克做为对照，然后进行复温和培养，培养方法与实验2相同。分别在胚胎发育到囊胚期统计胚胎发育率，孵化后统计正常仔鱼比率。结果如表7。
从表7可以看出，在各温度处理组，原肠发育率无显著性差异(p＞0.05)。但是，在-1、0和2℃冷休克胚胎孵化出正常的仔鱼所占比例最高，在26％-35％之间；在3-4℃休克胚胎有部分可继续发育至尾芽期并能孵化出正常的鱼苗，但是大部分仔鱼都畸形，有单倍体综合症的特征。5、6℃组几乎没有正常形态的仔鱼。不休克胚胎的原肠发育率达75.24±12.72％(p＜0.05)，但胚胎在原肠中期后发育不正常，头部小，尾部畸形，不能出膜。因此，选择-1-2℃水浴进行冷休克较为适宜。
表7不同休克温度下大菱鲆胚胎发育率和孵化率(％)(n＝3) 5.大菱鲆雌核发育诱导结果 依据以上实验将鲈鱼冷冻精子诱导大菱鲆雌核发育的技术参数确定为利用10mJ/cm2紫外线照射鲈鱼冷冻精子0.1-0.3min灭活，与大菱鲆卵进行人工授精，授精后5min用-1℃到2℃的水浴冷休克处理受精卵20-30min，然后将胚胎置于14℃海水中培育，这样就可以获得雌核发育大菱鲆鱼苗。二倍体雌核发育鱼苗的诱导率为26-34％。利用以上技术方案培育出大菱鲆雌核发育鱼苗约1500多尾。
(三)、雌核发育鱼苗的鉴定它的技术内容包括1.通过染色体数量和核型鉴定雌核发育鱼苗；2.通过微卫星分子标记手段鉴定雌核发育鱼苗。
1.染色体分析鉴定雌核发育鱼苗 由于花鲈染色体数目为2n＝48条，其核型为48t.而条斑星鲽染色体数目为2n＝46，其核型为44t+2sm；因此花鲈的染色体数目与条斑星鲽的染色体数目不相同，通过染色体分析即可证明雌核发育鱼苗是否为雌核发育而来。如果雌核发育鱼苗的染色体数目及核型与条斑星鲽完全相同，则证明这些鱼苗是雌核发育而来。本发明采用常规的染色体制片方法，对条斑星鲽雌核发育鱼苗进行了染色体分析，发现条斑星鲽雌核发育鱼苗的染色体数为46条，染色体核型也与条斑星鲽相同，从而证明这些鱼苗为条斑星鲽雌核发育二倍体个体。
2.用微卫星标记鉴定雌核发育鱼苗 (1).基因组DNA的提取 采取高盐法提取条斑星鲽雌核发育鱼和正常鱼基因组DNA，首先将固定于酒精中的鱼苗或鱼鳍条置于1.5ml离心管中，剪碎后加入400μlTENS裂解液(10mM Tris-HCl，PH 7.5，400μM NaCl，100mM EDTA，0.6％SDS)和10μl蛋白酶K(10mg/ml)，然后置于55℃消化。消化完全后，加入140μl饱和氯化钠，混匀，12000rpm/min 4℃离心30min。取上清加入两倍体积预冷的无水乙醇沉淀，然后将絮状沉淀挑出后用70％的酒精洗涤两次，待酒精挥发干后，用TE缓冲液溶解DNA。
(2)PCR扩增； PCR反应体系为10μl，包括1×PCR buffer(20mMTris-HCl，PH8.4，20mM KCl，10mM(NH4)2SO4)，10-50ng基因组DNA，0.2μM微卫星引物，120μMdNTPs，1.5mM MgCl2和0.5U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。PCR扩增条件为94℃热变性5min，然后进行38个循环，每个循环包括94℃变性30s，56-62℃退火30s，72℃延伸30s，最后在72℃延伸7min。用于雌核发育条斑星鲽检测的PCR引物为Vmo4，其序列为LCACTGTGCCCACTGTCTG，RTTTTCCTCTTACTCCCTCTCTT。
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳； 在PCR产物中加入1/2体积的甲酰胺上样液(0.01M EDTA，1mg/ml溴芬蓝，1mg/ml二甲苯青)于95℃变性5分钟，然后立刻放在冰上。在6％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，以pBR322DNA/Msp I(TIANGEN)为标记。采用银染法染色。
(4)微卫星分析结果； 首先通过微卫星富集文库法构建了条斑星鲽富集文库，从中筛选出多态性微卫星标记。然后用这些多态引物在正常群体和雌核发育群体中进行扩增，从中进一步筛选出在正常群体里杂合率较高，在雌核发育群体里纯合率较高的引物。采用条斑星鲽Vmo4微卫星标记在条斑星鲽正常鱼苗(12尾)中有9个个体为杂合，杂合率为75％，而在雌核发育鱼苗(9尾)中，所有个体都为纯合型，杂合率为0，同样在所有检测的纯合个体中未见异于正常群体的等位基因，由此表明这批鱼苗是雌核发育鱼苗。
权利要求
1.一种异源冷冻精子诱导鱼类雌核发育的方法，其特征在于它的操作方法包括1)、异源鱼类冷冻精子的遗传失活；2)、雌核发育二倍体鱼苗的诱导；3)、雌核发育鱼苗的鉴定
1)、异源鱼类冷冻精子的遗传失活通过染色体分析比较和杂交授精实验确定花鲈精子可以有效刺激多种鲆鲽鱼类卵子进行雌核发育，为诱导鲆鲽鱼类卵子进行雌核发育的有效异源鱼类精子；采用配方为KCl0.39g/L，CaCl2·2H2O 0.17g/L，NaHCO3 0.25g/L，NaCl 3.59g/L，NaH2PO4 0.22g/L，MgCl2 0.23g/L，Glucose 1.0g/L，DMSO 20％的冷冻稀释液对花鲈精子进行冷冻保存；花鲈精液在液氮中可以进行长期冷冻保存；解冻时，将在液氮中保存的冷冻精液管从液氮中取出来，先在液氮面上平衡5分钟，然后将冻精管拿出来在38℃水浴中解冻后备用；冷冻精子的遗传失活采用紫外线照射完成；选取解冻后精子活力在60-70％以上者用于紫外线失活处理；吸取100μL冷冻解冻的花鲈精液置于在6℃预冷过的直径为10cm的培养皿中，加入900μL不合DMSO的上述精子冷冻稀释液进行稀释，摇匀平辅在直径10厘米的塑料培养皿底部，将装有冷冻精液的培养皿置于10-80mJ/cm2紫外线下照射0.1-0.9min，照射后的精子活力应该保持在20-40％，经这样处理过的精子可以用来诱导鱼卵雌核发育；
2)、雌核发育二倍体鱼苗的诱导选择性成熟的条斑星鲽、大菱鲆或犬齿牙鲆等鲆鲽鱼类雌鱼，在自然产卵前1h采用人工挤压腹部法采卵，将卵采入干燥的烧杯中，根据鱼的种类不同，将采集的鱼卵置于不同的温度下，其中条斑星鲽卵放在8℃，大菱鲆卵放在14℃，犬齿牙鲆卵放在18℃；将以上经过紫外线照射失活的花鲈精液分别加入到条斑星鲽、大菱鲆、犬齿牙鲆鱼的未受精卵中，轻轻摇动混匀，加入2倍于卵量的海水完成“授精”过程，海水温度根据鱼的种类确定，其中条斑星鲽卵授精温度为8℃，大菱鲆卵放在为14℃，犬齿牙鲆卵放在18℃；精液和卵的“授精”最小体积比100μL精液4-8ml卵，授精过程在250ml烧杯中进行；在授精后不同时间，对受精卵进行冷休克处理；通过大量实验确定适合于我国几种重要海水鱼类雌核发育卵染色体加倍的诱导条件分别为
条斑星鲽在用紫外线失活的花鲈精子与条斑星鲽卵子“授精”后7-9分钟，将授精卵放在-0.5℃到-1.5℃的水浴中进行冷休克处理，处理时间为60-90min，然后将授精卵置于8℃左右的海水中进行孵化，能够获得雌核发育的二倍体条斑星鲽鱼苗，二倍体雌核发育鱼苗的诱导率为7.8-40.7％；
大菱鲆在用紫外线失活的花鲈精子与大菱鲆卵子“授精”后4-6分钟，将授精卵放在温度为-1-2℃的水浴中进行冷休克处理，冷休克的持续时间为20-30分钟。然后将授精卵置于14℃左右的海水中进行孵化，能够获得雌核发育的二倍体大菱鲆鱼苗；二倍体雌核发育鱼苗的诱导率为26-34％；
犬齿牙鲆在用紫外线灭活的花鲈精子与犬齿牙鲆卵子“授精”后3-5分钟，将授精卵放在温度为1-2.0℃的水浴中进行冷休克处理，冷休克的持续时间为40-50分钟；然后将授精卵置于18℃左右的海水中进行孵化，能够获得雌核发育的二倍体犬齿牙鲆鱼苗；二倍体雌核发育鱼苗的诱导率为10-25％；
3)、雌核发育鱼苗的鉴定
染色体分析鉴定雌核发育鱼苗
由于花鲈染色体数目为2n＝48条，其核型为48t，而条斑星鲽染色体数目为2n＝46，其核型为44t+2sm；而大菱鲆染色体数目为2n＝44，其核型为2n＝4m+12st+28t，因此花鲈的染色体数目与这些鱼类不相同，通过染色体分析即可证明雌核发育鱼苗是否为雌核发育而来；如果雌核发育鱼苗的染色体数目及核型与条斑星鲽、大菱鲆或犬齿牙鲆等母本相同，则证明这些鱼苗是雌核发育而来；本发明采用染色体制片技术，对条斑星鲽和大菱鲆等鱼类雌核发育鱼苗进行了染色体分析，发现条斑星鲽雌核发育鱼苗的染色体数为46条，大菱鲆雌核发育鱼苗的染色体数为44条，与母本完全相同，从而证明这些鱼苗为雌核发育二倍体个体；
用微卫星标记鉴定雌核发育鱼苗
基因组DNA的提取将固定于纯酒精中的鱼苗或鱼鳍条剪碎后加入400μl配方为10mM Tris-HCl，pH7.5，400μM NaCl，100mM EDTA，0.6％SDS10mM Tris-HCl，PH7.5，400μM NaCl，100mM EDTA，0.6％SDS的TENS裂解液和10μl浓度为10mg/ml的蛋白酶K，55℃消化完全后，加入140μl饱和氯化钠，混匀，12000rpm/min 4℃离心30min；取上清加入两倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA，然后将絮状沉淀挑出后用70％的酒精洗涤两次，待酒精挥发干后，用TE缓冲液溶解DNA；
PCR扩增及结果分析PCR反应体系为10μl，包括配方为20mM Tris-HCl，pH8.4，20mM KCl，10mM硫酸铵，10-50ng基因组DNA，0.2μM微卫星引物，120μMdNTPs，1.5mM MgCl2和0.5U Taq DNA聚合酶；PCR扩增条件为94℃热变性5min，然后进行38个循环，每个循环包括94℃变性30s，56-62℃退火30s，72℃延伸30s，最后在72℃延伸7min；采用序列为CGAGGAGGGGAAGAAAGAAC和CACAACCCAAGCGCAACTAT的Pade 30微卫星引物，扩增普通犬齿牙鲆基因组DNA时，85％以上的个体扩增出2条DNA带，而当扩增犬齿牙鲆雌核发育鱼苗时，75％以上个体只扩增出1条带；当用序列为CACTGTGCCCACTGTCTG和TTTTCCTCTT ACTCCCTCTCTT的Vmo4微卫星引物扩增普通条斑星鲽基因组DNA时，75％以上的个体扩增出2条DNA片段，而当扩增条斑星鲽雌核发育鱼苗基因组DNA时，90％以上的个体只扩增出1条DNA片段；采用序列为TGGACTGGTTTACTGCTGGA和AGGGAACCGATCTGAGAACA的SmaC03微卫星引物扩增正常大菱鲆鱼苗时，85％以上的个体产生2条DNA带，而当扩增雌核发育大菱鲆鱼苗时，75％以上的个体只产生1条DNA带；因此，这些微卫星标记可以用于鉴定这些鱼类雌核发育鱼苗。
全文摘要
一种鱼类异源冷冻精子诱导雌核发育的方法，包括异源鱼类精子的冷冻保存和遗传失活、雌核发育二倍体鱼苗的诱导和雌核发育鱼苗的鉴定方法。本发明首次建立了采用花鲈冷冻精子诱导多种海水鱼类卵子雌核发育的方法，筛选到分别适合条斑星鲽、大菱鲆和犬齿牙鲆鱼卵的冷休克起始时间、冷休克温度和冷休克持续时间，建立了雌核发育鱼苗的微卫星标记鉴定方法。采用本发明方法获得条斑星鲽、大菱鲆和犬齿牙鲆雌核发育鱼苗的百分率分别为7.8-40.7％，26-34％和10-25％。本发明建立的方法具有先进、高效、准确、可靠的特点，在鱼类性别控制和全雌苗种生产中具有重要应用价值，在鱼类养殖和育种上具有广阔的推广应用前景。
文档编号C12N5/06GK101120660SQ200710016988
公开日2008年2月13日 申请日期2007年8月28日 优先权日2007年8月28日
发明者陈松林, 杨景峰, 苏鹏志, 翟介明, 田永胜, 廖小林, 邵长伟 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所