与鼻咽癌的发生和淋巴结转移相关的mdm2基因多态性及其检测方法

专利名称：：与鼻咽癌的发生和淋巴结转移相关的mdm2基因多态性及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及鼻咽癌人群预防中的个体易感性及其遗传学检测方法。具体地，本发明涉及与鼻咽癌易感性相关的易感基因Mi)M2的SNP309多态性位点的基因型及其检测方法。本发明进一步涉及上述易感基因型的检测试剂盒，以及该试剂盒的应用。另外,本发明还涉及上述检测方法和易感基因在鼻咽癌的预防和控制以及相关遗传咨询中的应用。
背景技术：
：鼻咽癌(NPC)是一种上皮源性的恶性肿瘤，其发病具有明显的地域和种族差异。在中国南方和东南亚国家或地区(如新加坡、中国台湾和中国香港等)相对高发，其发病率几乎是高加索人群的100倍。鼻咽癌的易感性在种族和地区分布上的明显差异是多因素或多基因协同交互作用的结果，与EB病毒(Epstdn-Barr)感染、环境理化因素和遗传因素有关。鉴定NPC的易感基因有助于预测鼻咽癌发生的个体风险和群体风险、有助于阐明该疾病的致病机制。以往的连锁分析提示多个染色体区域可能包含NPC的易感基因。一项基于中国南方人群的受累同胞对研究将易感位点定位于染色体的6p22区域，提示了HLA分子在NPC发病中的重要作用。最近，两项分别基于中国广东地区的20个家系和中国湖南地区的18个家系的全基因组连锁分析显示，在4pl5.1-q12和3p21.31-21.2区域也分别存在NPC的易感位点。多个基于群体的遗传流行病学研究也揭示了一些与鼻咽癌易感性相关的位点，包括热休克蛋白70-2(heatshockprotein70-2,HS尸70-2)，周期素Dl(cyclinDl,CCA〖ZXO，DNA修复酶//OGG7和ZiCC，以及谷胱甘肽S-转移酶Ml(glutathioneS-transferaseMl,GXTM7)基因等。近来，我们还发现NPC与尸丄WVC基因(palate,lungandnasalepithelialclonegene)启动子区域的多态性相关。然而，除上述的多个基因外，可能尚有多个未被鉴定的基因修饰鼻咽癌的易感性。众所周知，P53通路由于可导致细胞周期阻滞或凋亡从而在预防肿瘤方面发挥重要作用。已知P53的活性可由于p53基因中的突变而失活。然而，在缺乏户W突变的肿瘤中P53的功能尚可通过其它机制而失活或减弱，如鼠双微粒体2的人同源基因(Mdm2,transformed3T3celldoubleminute2，p53bindingprotein[mouse],MDM2)蛋白产物的过表达。MDM2可通过至少三种不同的途径发挥负调控P53通路活性的作用。首先，MDM2通过结合P53的转录激活结构域，可阻止/xl的转录活性。其次，MDM2作为泛素连接酶促进P53蛋白的降解。第三，由于MDM2具有核输出信号，结合P53之后，MDM2能促进P53的输出。此外，MDM2还可能具有P53非依赖性的功能，即通过与在细胞周期调控中起重要作用的其它蛋白(包括pRb、E2F/DP1和19ARF)相互作用而发挥相应的功能，虽然其中有些功能尚未得到明确的阐释。已有研究显示，MDM2过表达的转基因小鼠易于自发性形成肿瘤，且这些小鼠显示出由于MDM2引起的P53依赖性及P53非依赖性的致肿瘤性。在人类中，MDM2的扩增和/或过表达已经在超过40种不同类型的恶性肿瘤中得到详尽的描述，其过表达与更差的临床转归，增加的转移潜能，以及对治疗的反应性降低有关。在NPC的研究中表明，MDM2在EBV感染的细胞中以及31-56%的NPC肿瘤组织中过表达；并且MZ)M2mRNA的过表达与NPC颈淋巴结转移显著相关。基于上述体内、外实验中MDM2在NPC致病机制中的潜在作用，我们假设可能是一个极佳的NPC的候选易感基因，的遗传多态性有可能导致NPC易感性的基因型依赖性的差异。近来，内含子区域启动子上的一个功能性单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)得以鉴定，并被命名为SNP309。与携带SNP309T/T基因型的细胞相比，携带SNP309G/G基因型的细胞具有更高的转录激活因子Spl的结合活性，并随后导致较高的MDM2mRNA和蛋白表达水平。其导致的结果是，与携带SNP309T/T基因型的细胞相比，携带G/G基因型的细胞中P53的降解增强，并导致对致DNA损伤因子的反应性降低，进而加速散发性肿瘤和遗传性肿瘤的形成。因此，MDAO中的这个功能性的多态性位点SNP309可能导致个体或群体对肿瘤的易感性的改变。确实，已有多项流行病学研究表明SNP309与食管鳞状上皮细胞癌和肺癌的发生风险有关。然而，SNP309在NPC中的作用尚未得到明确的研究。在本发明中，我们在中国人群中研究了MDM2启动子区的功能性多态SNP309是否与NPC的发生风险或严重程度相关。
发明内容发明人通过病例-对照研究，考察了MDM2基因SNP309多态性位点与鼻咽癌易感性的相关性。通过基于医院的大规模病例-对照研究，进行了大样本的统计分析，判明携带MDM2基因SNP309位点的G/T或G/G基因型的个体对鼻咽癌有更高的发生风险。同时还还判明，携带MZ)M2基因的SNP309位点的G/T或G/G基因型的个体与鼻咽癌更严重的淋巴结转移相关。因此，本发明鉴定了与鼻咽癌的发生风险及更严重的淋巴结转移相关的一种新的易感基因及其易感基因型。本发明还提供了一种检测与鼻咽癌发生风险关联的易感位点MDM2基因SNP309位点基因型的方法，该方法为PCR产物测序法。本发明还提供了与鼻咽癌的发生风险关联的一个易感位点，即MDM2基因的SNP309位点，以及提供了一种通过检测MD7W2基因SNP309位点来判定个体对鼻咽癌是否具有高发生风险的方法。本发明还提供了一种检测与鼻咽癌更严重的淋巴结转移关联的易感位点MDM2基因SNP309基因型的方法，该方法为PCR产物测序法。本发明还提供了与鼻咽癌更严重的淋巴结转移关联的一个易感位点MZ)^G基因SNP309位点，以及提供了一种通过检测MDM2基因SNP309位点来判定个体对鼻咽癌是否具有更严重的淋巴结转移的方法。本发明还提供了用于检测MZ)M2基因SNP309多态性位点的引物对。本发明进一步提供了一种检测与鼻咽癌发生风险及更严重的淋巴结转移关联的MZ)JkG基因的SNP309位点的试剂盒，以及上述试剂盒在人群中预防与控制鼻烟癌的应用。(一)、如上所述，本发明提供了一种检测与鼻咽癌发生风险关联的MDM2基因的SNP309位点基因型的方法，该方法为PCR产物测序法。具体的说，包括了如下步骤1)对MDM2基因SNP309位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的高特异性PCR扩增；2)对扩增的PCR产物进行测序，以此判明MDM2基因SNP309位点的基因型。(二)、本发明提供了与鼻咽癌发生风险关联的2种易感基因型，即MDM2基因SNP309位点的G/T或G/G基因型为鼻咽癌的易感基因型。并提供了一种通过检测M"A"基因SNP309位点的基因型来判定人群或个体对鼻咽癌发生风险的方法。该方法包括1)对MDikO基因SNP309位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的高特异性PCR扩增；2)对PCR产物进行测序，以此判明MDM2基因SNP309位点的基因型；3)当某一个体的MDM2基因的SNP309位点表现为G/T或G/G基因型时，则表明该个体发生鼻咽癌的风险更高。(三)、本发明提供了一种检测与鼻咽癌更严重的淋巴结转移关联的7kTDiW2基因的SNP309位点基因型的方法，该方法为PCR产物测序法。具体的说，包括了如下步骤1)对MDM2基因SNP309位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的高特异性PCR扩增；2)对PCR产物进行测序，以此判明MDM2基因SNP309位点的基因型；(四)、本发明提供了与鼻咽癌更严重的淋巴结转移关联的2种易感基因型，即MZM^基因SNP309位点的G/T或G/G基因型为鼻咽癌的易感基因型。并提供了一种通过检测MDM2基因SNP309位点的基因型来判定人群或个体是否发生鼻咽癌更严重的淋巴结转移关联的方法。该方法包括1)对MZ)M2基因SNP309位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的高特异性PCR扩增；说明书第4/ll页2)对PCR产物进行测序，以此判明MDM2基因SNP309位点的基因型；3)当某一个体的7kTZ)M2基因的SNP309位点表现为G/T或G/G基因型时，则表明该个体患鼻咽癌时更易发生更严重的淋巴结转移。(五)、检测MD^G基因SNP309位点的基因型的特异性引物对的序列为正向弓I物5'-GTCCCCTCTATCGCTGGTTC-3'反向引物5'-AGCAAGTCGGTGCTTACCTG-3'(六)、本发明进一步提供了一种检测与鼻咽癌发生风险和更严重的淋巴结转移关联的MDM2基因的SNP309位点的试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有用以检测MDM2基因SNP309位点基因型的一种或多种组分。与之同时提供的可以是经政府食品与药品监督管理部门审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售方面的信息。例如，在DNA的PCR扩增方法实施中，直接检测样品的MDM2基因SNP309位点基因型的试剂盒，含有PCR的引物7才(5'-GTCCCCTCTATCGCTGGTTC-3'禾口5'-AGCAAGTCGGTGCTTACCTG-3')，—dNTPs，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等等。本领域技术人员已知，以上的组分仅是示意性的，所述用于PCR反应的DNA聚合酶可以是TaqDNA聚合酶，例如，HotStarTaq酶Klenow片段，TthDNA聚合酶，VENTDNA酶等能够用于PCR扩增的酶。但为保证特异性扩增，除了引物和反应条件的优化外，应优选HotStarTaq酶。使用方法说明如下对样品基因组DNA(其具体制备方法参见实施例)，用本发明提供的引物，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增12.51反应体系为10-100ng基因组DNA，0.2M引物，0.2mMdNTP，1.5mMMgCl2，1.0unitHotStarTaqDNA聚合酶以及lx缓冲液(QIAGEN，Chatsworth，CA)。95°C15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94°C30s和72°C50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从62.5'C开始每个循环降0.5°C，第二阶段扩增的退火温度则固定在56.5'C。最后的72'C延伸时间为7min。PCR产物经常规测序，根据峰图判断基因型。(七)、本发明提供了与鼻咽癌发生风险及更严重的淋巴结转移相关的MDM2基因SNP309位点基因型及其检测方法在鼻咽癌人群预防和控制中的应用。例如，由于本发明证实了MZ)旭基因SNP309位点与鼻咽癌的发生风险及更严重的淋巴结转移存在关联,因此，在鼻咽癌人群的预防和控制中，就需要对所咨询的对象进行i^"vl&基因SNP309基因型的分析，以判明该对象是否携带有鼻咽癌的易感基因型G/T或G/G。对具有MDM2基因SNP309位点G/T或G/G基因型的个体(表现为对鼻咽癌具有更高的发生风险和更严重的淋巴结转移)，则可对之进行科学的干预，以针对性地降低这些易感个体的鼻咽癌发病风险和更严重的淋巴结转移。具体实施方式实施例l该实施例设计并合成了一套引物对，并且在该引物对的基础上，设计了一种检测与鼻咽癌发生风险和更严重的淋巴结转移关联的MD7kG基因SNP309多态性位点的方法。1.基因组DNA的提取采取本领域酚/氯仿法提取外周血白细胞的基因组DNA。1)取柠檬酸钠或EDTA-Na2抗凝全血5ml(尽量不用肝素抗凝)，置于50ml有盖离心管；2)加入3-5倍体积冷蒸镏水，反复颠倒混匀，冰中放置5分钟，4'C2000rpm离心20分钟；3)缓慢倾倒上清，沉淀加入预冷的0.P/。Triton-X100(体积同上)，轻柔混匀沉淀，如上离心，弃上清；4)沉淀加入4ml裂解液(50MmTris-Cl-10mMEDTA,pH8.0)，彻底打碎沉淀，然后加入10%SDS至终浓度为0.5%，混匀；5)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度为200吗/ml，混匀，55°C3小时或37"过夜消化(以过夜消化为佳)；6)加入等体积平衡酚，倒转混匀，4000rpm离心10分钟，将上清转移至另一个有盖离心管；7)转移上层水相，重复酚抽提一次；8)转移上层水相，加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)，倒转混匀，4000rpm离心10分钟；9)转移上层水相，加入l/10体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积预冷的无水乙醇混匀；10)置液氮冷冻10分钟或-20'C60分钟后，4000rpm离心10分钟；11)以70%乙醇洗涤沉淀12次，吹干或真空抽干；12)以0.5mlTE(10mMTris-Cl-EDTA，pH8.0)或蒸馏水溶解DNA沉淀，电泳检测DNA片段大小，或测260/280nmOD比值。2.PCR扩增用本发明提供的引物，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增12.51反应体系为10~100ng基因组DNA，0.2M引物，0.2mMdNTP，1.5mMMgCl2，1.0unitHotStarTaqDNA聚合酶以及lx缓冲液(QIAGEN，Chatsworth，CA)。95°C15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94'C30s和72'C50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从62.5'C开始每个循环降0.5°C，第二阶段扩增的退火温度则固定在56.5匸。最后的72'C延伸时间为7min。PCR产物以测序法鉴定SNP309位点的基因型。实施例2该实施例用实施例1建立起来的方法，对两个人群(广西人群593例鼻咽癌患者和480例对照；广东人群239例鼻咽癌患者和286例对照)的MZ)M2基因的SNP309位点基因型的分布进行了分析。1.试验对象本研究包括两个鼻咽癌病例-对照人群，其居住地分别是中国南方的广西壮族自治区和广东省。广西人群包括593例鼻咽癌患者和480例对照个体。所有的个体均是居住于南宁市及周边地区的遗传上无关的中国人。鼻咽癌患者在2003年九月至2005年七月间连续从广西肿瘤医院(中国南宁)收集，均是新诊断并经过病理确认的，且不患有其它类型的肿瘤。患者的反应率是95%。肿瘤的分期根据1997年AJCC体系的国际TNM(TumorNodeMetastasis)分期法进行。所有的TNM分期由医院的资深病理学家在术后组织病理学检查的基础上决定。对照从一社区肿瘤筛査计划中随机选取，该计划的目的是为了早期确诊肿瘤，其实施是在鼻咽癌患者收集的同一时期和同一地区进行的。对照的选择标准包括无肿瘤个人史，且与病例的年龄匹配。对照的反应率是91%。每个参与者均签署知情同意书，通过结构化的问巻来收集个人的人口统计学资料，病史，吸烟史和饮酒史。广东人群包括239例鼻咽癌患者和286例对照，均为无关中国成年人，于2000年2月至2003年5月间从广州市和周边地区收集。简而言之，共239例鼻咽癌患者从广州市南方医院和江门中心医院收集。患者的唯一选择标准是其鼻咽癌诊断已得到病理学确诊。对照组包括286例无关献血者、实验室人员和医务人员。对照的选择标准是没有肿瘤及其它严重疾病的个人史和家族史。本研究得到中国国家人类基因组研究中心伦理委员会的批准。2.Afl)M2基因SNP309位点基因型的分布两个人群中^ff)ilC基因SNP309位点的基因型的频率分布如表1所示。在广西人群中，与T/T基因型相比，携带G/G基因型(OR=1.51，95%CI=1.08-2.12，P=0.016)或G/T+G/G基因型(OR=1.43，95%CI=1.04-1.91，P=0.019)的个体发生鼻咽癌的风险增加(见表l)。在广西人群中根据性别、年龄、吸烟和饮酒状态、吸烟量以及民族进行分层分析后，发现虽然在男性、>47岁、饮酒者、吸烟者、重度吸烟者(〉19年包数，pack-years)患者中患病风险增加，但这些差异可能是随机产生的(所有同质性检验P〉0.30)(见表2)，提示性别、年龄、饮酒、吸烟这些混杂因素对鼻咽癌与SNP309的关联无修饰作用。在广西人群中，进一步比较了鼻咽癌患者淋巴结转移与SNP309多态性之间的相关性，结果发现，AffiMW基因SNP309位点G/G基因型(OR=2.10，95%CI=1.21-3.66，P=0.0080)或G/T+G/G基因型(OR=1.84，95%CI=1.09-3.05，P=0.019)在N2+N3组中比在N0+N1组中多(见表3)，提示携带G/T或G/G基因型的个体与更严重的鼻咽癌淋巴结转移相关。在含有239例鼻咽癌和286例对照的广东人群中也进行了分型以验证MZ)M2在广西人群中的关联结果。结果发现，与T7T基因型相比，G/G基因型(OR=1.76，95%CI=1.06-2.88，P=0.024)或G/T+G/G基因型(OR=1.53，95%CI=1.00-2.36,P=0.049)与鼻咽癌发病风险的显著增加有关(见表l)。在广东人群中根据性别、年龄进行分层分析后，进一步证实了性别、年龄这两个混杂因素对鼻咽癌与SNP309的关联无修饰作用(见表2)。因此，用本发明的方法解析了MDM2的SNP309位点基因型与鼻咽癌的发生风险及更严重的淋巴结转移之间的相关性。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但所作改动或修改的等价形式同样落在本申请权利书所限定的范围之内。表l广西人群和广东人群鼻咽癌患者与健康对照中AOM/2基因的_SNP309位点基因型的分布_病例对照基因型n(%)n(%)OR(95%CI)*广西人群(n=580)(n=478)t/t(参考;i111(19.1)120(25.1)1.00G/T276(47.6)220(46.0)1.36(0.99-1.86)0,056G/G193(33.3)138(28.9)1.51(1.08-2.12)O馬G/T+G/G469(80.9)358(74.9)1.43(1.04-1.91)0.019广东人群(n=223)(n=285)T/T(参考)40(17.9)71(24.9)1.00G/T98(43.9)128(44.9)1.37(0.84-2.19)0.20G/G85(38.2)86(30.2)1.76(1.06-2.88)0.024G/T+G/G183(82.1)214(75.1)1.53(1.00-2.36)0.049注由于某些个体的分型失败，广西人群中进行基因分型的鼻咽癌和对照的个体总数分别等于580和478,广东人群中进行基因分型的的鼻咽癌和对照的个体总数分别等于223和285。缩写词N,淋巴结转移；OR,比值比(oddsratio);CI,置信区间(confidenceinterval)。'在广西人群中，OR值和P值均校正了年龄、性别、吸烟和饮酒状态、吸烟量。在广东人群中，OR值和P值均校正了年龄和性别。表2广西人群中不同年龄、性别、吸烟和饮酒状态及广东人群中不同年龄、性别时<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注由于某些个体的分型失败，广西人群中进行基因分型的鼻咽癌和对照的个体总数分别等于580和478,广东人群中进行基因分型的鼻咽癌和对照的个体总数分别等于223和285。缩写词N,淋巴结转移；OR,比值比(oddsratio);CI,置信区间(confidenceinterval)。*病例数/对照数。t在广西人群中，OR值均校正了年龄、性别、吸烟和饮酒状态、吸烟量。在广东人群中，OR值均校正了年龄和性别。T/T基因型作为参考组}在每个分层中OR值的差异经同质性检验。表3广西人群中鼻咽癌淋巴结转移与SNP309多态性之间的关联<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注由于某些个体的分型失败，广西人群中基因分型成功的鼻咽癌个体的总数等于580。缩写词N，淋巴结转移；OR，比值比(oddsratio);CI，置信区间(confidenceinterval)。N3R值和P值均校正了年龄、性别、吸烟和饮酒状态、吸烟量。N0+N1与N2+N3相比。参考文献1.WardM，PanW,ChengY，etal.DietaryexposuretonitriteandnitrosaminesandriskofnasopharyngealcarcinomainTaiwan.IntJCancer2000;86:603-9.2.FriborgJ,WohlfahrtJ,KochA,StormH，OlsenOR,MelbyeM.Cancersusceptibilityinnasopharyngealcarcinomafamilies—apopulation-basedcohortstudy.CancerRes2005;65:8567-72.3.FengB,HuangW,ShugartY,etal.Genome-widescanforfamilialnasopharyngealcarcinomarevealsevidenceoflinkagetochromosome4.NatGenet2002;31:395-9.4.XiongW，ZengZ，XiaJ,etal.Asusceptibilitylocusatchromosome3p21linkedtofamilialnasopharyngealcarcinoma.CancerRes2004;64:1972-4.5.ChoEY,HildesheimA,ChenCJ,etal.NasopharyngealcarcinomaandgeneticpolymorphismsofDNArepairenzymesXRCC1andhOGGl.CancerEpidemiolBiomarkersPrev2003;12:1100-4.6.TiwawechD,SrivatanakulP,KaralakA,IshidaT.GlutathioneS陽transferaseMlgenepolymorphisminThainasopharyngealcarcinoma.AsianPacJCancerPrev2005;6:270-5.7.HeY,ZhouQZhaiY,etal.AssociationofPLUNCgenepolymorphismswithsusceptibilitytonasopharyngealcarcinomainaChinesepopulation.JMedGenet2005;42:172-6.8.LuoJL,XiaoJY,TianYQ.MDM2geneamplificationandoverexpressioninnasopharyngealcarcinoma.Hu腿YiKeDaXueXueBao2000;25:18-20.9.BondGL，HuW，BondEE,etal.AsinglenucleotidepolymorphismintheMDM2promoterattenuatesthep53tumorsuppressorpathwayandacceleratestumorformationinhumans.Cell2004;119:591-602.10.HongY，MiaoX,ZhangX,etal.TheroleofP53andMDM2polymorphismsintheriskofesophagealsquamouscellcarcinoma.CancerRes2005;65:9582-7.11.ZhangX，MiaoX,GuoY,etal.GeneticpolymorphismsincellcycleregulatorygenesMDM2andTP53areassociatedwithsusceptibilitytolungcancer.HumMutat2006;27:110-7.12.ZhouQZhaiY,DongX,etal.HaplotypestructureandevidenceforpositiveselectionatthehumanIL13locus.MolBiolEvol2004;21:29-35.13.OzdemirE,KakehiY,OkunoH,HabuchiT，OkadaY,YoshidaO.Strongcorrelationofbasementmembranedegradationwithp53inactivationand/orMDM2overexpressioninsuperficialurothelialcarcinomas.JUrol1997;158:206-11.14.SotamaaK,LiyanarachchiS,MecklinJP,etal.p53codon72andMDM2SNP309polymorphismsandageofcolorectalcanceronsetinLynchsyndrome.ClinCancerRes2005;11:6840-4.15.AlhopuroP,Ylisaukko-OjaSK，KoskinenWJ,etal.TheMDM2promoterpolymorphismSNP309T〉Gandtheriskofuterineleiomyosarcoma,colorectalcancer,andsquamouscellcarcinomaoftheheadandneck.JMedGenet2005;42:694-8.16.MillikanRC,HeardK,WinkelS,etal.NoassociationbetweentheMDM2-309T/GpromoterpolymorphismandbreastcancerinAfrican-AmericansorWhites.CancerEpidemiolBiomarkerPrev2006;15:175-7.17.PineSR,MechanicLE，BowmanED,etal.MDM2SNP309andSNP354arenotassociatedwithlungcancerrisk.CancerEpidemiolBiomarkerPrev2006;15:1559-61.18.LiG,ZhaiX，ZhangZ,ChanberlainRM,SpitzMR,WeiQ.MDM2genepromoterpolymorphismsandriskoflungcancer:acase-controlanalysis.2006;27:2028-33.序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所<120>与鼻咽癌的发生和淋巴结转移相关的MD似2基因多态性及其检测方法<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1GTCCCCTCTATCGCTGGTTC<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2AGCAAGTCGGTGCTTACCTG2020权利要求1.一种通过检测MDM2基因SNP309多态性位点的基因型判定个体对鼻咽癌发生风险和更严重的淋巴结转移的方法，其特征在于当MDM2基因SNP309位点表现为G/T或G/G基因型时，则表明该个体对鼻咽癌具有更高的发生风险或更严重的淋巴结转移。2.如权利要求1所述7kTOM2基因SNP309位点基因型的检测方法，该方法为PCR产物测序法，其主要特征在于以下关键方面1)对包含SNP309多态位点的MDM2基因序列，设计基因特异性的引物，其序列为正向引物见序列表中序列l反向引物见序列表中序列2;2)对包含SNP309多态位点的MDM2基因区域，以所设计的引物，通过热启动和梯度的聚合酶链式反应，以基因特异性引物进行DNA扩增。3)对PCR产物以常规测序法测序，根据测序峰图结果判断SNP309位点的基因型。3.与鼻咽癌发生风险和更严重的淋巴结转移关联的MZ)M2基因SNP309位点的一种检测试剂盒，其包括扩增用基因特异性引物，dNTPs，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种。4.如权利要求1-3任一项所述的方法或其试剂盒在鼻咽癌的人群预防和控制以及遗传咨询中的应用。全文摘要本发明将MDM2基因的SNP309多态性位点与鼻咽癌的发生风险及更严重的淋巴结转移联系起来，确定了MDM2基因是鼻咽癌的一个新型易感基因，为鼻咽癌的人群预防和控制提供了新的遗传咨询内容及其分子判据。另外，本发明涉及SNP309多态性位点的检测方法及相应的检测试剂盒，所述检测方法为PCR产物直接测序法(即聚合酶链式反应-测序法)。文档编号C12Q1/68GK101298628SQ20071010367公开日2008年11月5日申请日期2007年4月30日优先权日2007年4月30日发明者周钢桥,张小爱,张红星,芸翟,贺福初申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所