专利名称：：稳定化的酶组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及稳定化的酶组合物。更具体地，本发明涉及用咖啡衍生的材料稳定化的酶组合物。本发明的稳定化的酶组合物具有与常规的稳定化制剂相当的活性组分稳定性，但仅含有咖啡衍生的制剂成分。本发明的稳定化的酶组合物可用于^f可需要避免含入常规的稳定剂和其它增强稳定性的添加剂的应用中。稳定化的酶组，在可溶咖啡和其它咖啡产品的,生产中特别有用。本发明提供了稳定化的酶组合物，其包含酶和有效量的用来稳定酶的咖啡衍生的材料。雌的，该稳定化的麟本上由,口有效量的用来稳定该酶的咖啡衍生的材料纟贼，并且^7K溶、^l悬浮液、千燥粉末、千^^粒,或咖啡衍生的油中的千燥粉M千^^粒的悬浮液的形式。本发明还織了生产可溶咖N魄取物的方法，戶;M方、跑括(1)精细地鹏悟炒的咖啡固体以形成含有咖啡固体的咖啡浆；(2)在一定温度下并以足够7jC解戶，咖啡固体的时间，用有效量的处于稳定化的酶组，形式的酶来处理戶M咖啡浆以形成可溶咖啡提取物材料，其中稳定化的酶组合物包括麟口有效量的用来稳定该酶的咖闷銜生的材料；以及(3)将戶皿可溶咖啡提取^t才料分离为滞留物和渗透物，其中渗ittl包含可溶咖啡提取物。本发明还提供了生产可溶咖啡提取物的半连续的或连续的方法，戶脱方飽括(1)在容器中用有效量的处于稳定化的酶组合物形式的酶来处理精细地磨制的焙炒的咖啡固体以水解咖啡固体，以形成含有可溶咖啡提取物的可溶咖啡提取trt才料，其中稳定化的酶组，包含ll^有效量的用来稳定化该酶的咖啡衍生的材料(2)将可溶咖啡提取物材茅4#环皿半,分离设备^续地形留物和渗邀勿，其中渗含有可溶咖啡提取物并且被连续地收集，而其中至少一部分滞留物被积盾环到容器中。详细说明如已经提到的，本发明涉及用咖啡衍生的材料稳定化的酶组合物。本发明的稳定化的酶组糊可用于樹可需要避免含ASSM顿常规稳定齐诉口其它增强稳定性的添加剂的細中。因而，只要在加工期间和在最终产品中咖啡衍生的材料是可以接受的，本发明稳定化的酶组合物就可用于各种食物产品、药物产品、化妆品产品等的生产。这些稳定化的酶组糊避免了常规稳定抓而仅4顿咖啡衍生的材料在保存和域湖期间i^m了所需的麟定性和活性。稳定化的酶组合物在可溶咖啡和其它咖啡产品的生产中特别有用，其中i顿的酶不含通常与酶制剂结合的常规稳定剂。因而，本发明的稳定化的酶组合物在酶处理咖啡固体以水,中的咖闷附料中特另IJ有用。本发明也可以用于稳定在不希望有常规稳定剂的食物、药物、化妆品和其它工业中有用的酶制剂。可以〗顿这种方、絲稳定化的、在食物制备中特别有用的酶包括甘露聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、半纤维素酶、月旨肪酶、酯酶、蛋白酶、糖酶(例如，阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶(galactanase)、阿拉伯半乳聚糖酶(arabinogalactanase))、核酸酶、果胶酶、异构酶、淀粉酶和木质素酶，以及它们的混合物。4顿本发明咖啡衍生材料稳定化的酶组，，可以容易地制备可溶咖啡产品而不〗顿常规的,定剂。对于稳定酶组合物有用的咖啡衍生的材料包括，例如，可溶咖啡、焙炒和磨制咖啡、咖啡油、用过的(即，部分提取的)咖闷隨滓、磨制的生咖啡豆、含水的咖闷離取物、生咖啡豆提取物等等以及它们的混合物；如果需要，可以歉缩提取物或其它咖啡材料。当然，这种咖啡衍生的材料不应包括本发明设法从最终产品中消除的常规稳定抓或不应当用含有戶脱常规稳定剂的酶组，来制备。因而，例如，用来稳定本发明酶组合物的可溶咖啡材料不应当衍生自利用常规稳定化的酶组糊而制备的可溶咖啡。本发明的稳定化的酶组合物可以被配制为含水组合物或可以被千燥以形成固体组糊(例如，粉棘附聚的颗粒)。一般地，根据总组合物，这种组，将含有约1%到约25%的酶以及约10%到约99%的咖闷绅才料。一般iWM水制剂，活性酶蛋白构成总制剂的约1°/。到约25%，且咖叫断生的材料构成总制剂的约10%至哟50%(^i^勺20%到约40%)。对^FP燥的制剂，活性酶蛋白构成总制剂的约1%到约25%,且咖啡衍生的材料构成总制剂的约75%到约99%。对^FP燥的形式，咖啡衍生的材料雌在千燥的酶组糊形成期间(例如，M:喷雾千燥、冷冻千燥等等)存在。含水组合物雌保存在冷藏或冷冻^l牛下，干燥的组合物一般可以保雜环境的、冷藏的或冷冻的^#下。对本发明来说，"常规稳定剂"包括抑制产品中微生物生长的常规抗微生物剂和在^P燥、保存或误用期间保持酶活性的常规稳定剂。虽然不希望受理论的限制，但自来在本发明中使用的咖啡衍生的材料起到了这两种作用(即，抑制微生物生长和在保存和/或误用期间保持酶活性)。还是不希望受理论的限制，咖啡衍生的材料又似乎还具有其它功能，例如，酶制剂中的缓冲剂和分散剂。因而，来本发明的咖啡衍生的稳定剂提供了保护酶蛋白(或在某些瞎况下，活猷万需的非蛋白实体)免于热极限、千燥、剪切、渗舰力、pH应激、离子梯度、蛋白7K解和其它有害影响力的变性^活。当本发明的稳定化的酶被用于制备可溶咖啡提取物时，未纯化的提取材料包括可溶咖啡提取物、麟口其它不溶',粒。当然，由于戶舰酶组合物是用咖啡衍生的材料稳定的，所以不存在常规的稳定剂，且可以S3i常规方法分离酶和其它不,粒来获得基本上没有非咖啡材料的可溶咖啡提取物。所需的咖啡提取物优选地可以通过使反应混合物通过半透膜而与其它组分分离，如在例如2005年7月18日提交的欧洲专利申请05106563.9中描述的。该膜可以是具有一定孔径大小的^M类型的材料，所述孔径大小能够保留酶和其它不溶物而允许7K溶性的糖类、咖叫魄取物和其它材料的舰。一般地，具有低于约0.8微米的标称孔径大小的膜是适合的。例如，由聚醚砜(polyethersulfone)制成的具有约20,000到约50,000道尔顿的分子量1±值(CUtK)ff)的膜适合于分离可溶咖啡提取物。适合在本发明的方法中使用的优选的聚iTO可以从S印ro,Inc.(Oceanside，CA)获得。当然，可以4柳其它的膜构建材料。膜可以被包含在皆M分离单元鹏它可用于膜分离的對鹏置的内部，例如螺旋缠绕模块、中空纤维系统、管形束或平板和模块。通过以下实施例进一步说明了本发明的益处和实施方式，但其中弓间的特定材料和其量、以及其它条件和细节不应被理解为是过度地限制本发明。除非另有说明，所有份、比率和百分比都是根据錢的。所有公微,包括专利和公开的专利申请ltetl:弓l入作为参考。具体实施例方式实施例1.使用冷冻的、未配制的甘露聚糖酶(FUM'.ChemGenCL60,来自ChemGenCorp.，Gaithersbui]g，MO)。FUMSI^自ifiM，杆菌(&d/ZuSfe"加)发酵；通过离心取出细胞和残渣，随后使用自皿行酶浓縮和纯化；不添加其它材料。解冻的酶在去离子水(样品1)和含有10%KencoReallyRich零售可溶咖啡的去离子水(样品2)中l:20稀释。将两个溶液的样品浸于沸水浴中30秒，然后立即在冰浴中7糊。对处理的溶液以及样品1的未加热的溶液(即，对照)l顿角豆树胶粘度湖啶^it行甘露聚,活性测定。与对照相比，处理的样品1损失了约33%的初始酶活性，而用咖啡衍生的材料稳定化的样品2仅损失了约2%的初始酶活性(即，在实验限度内基本上不变的活性)。实施例2.这个实施例说明了由咖啡衍生的材料稳定化的千燥酶制齐啲制备。4顿实施例1的冷冻的未配制的甘露聚糖酶("FUM")。解冻冷冻FUM的部分，并舰向解冻的FUM样品中添加以下斜虫成分(20%)来制备五^B喿(固体)制剂(1)可溶咖啡(MaxwellHouse);(2)山梨糖醇和氯化钠(各10%);(3)硅石(40-100目；FisherScientific);(4)纤维素(NeoceP^粉末；MingtaiChemical);和(5)焙炒和磨制(R&G)咖啡(MaxwellHouse气干磨至30目)。用酶制剂中使用的一般稳定齐l顶己制样品24。将每种制剂充分混合，然后立即在WTis型25ES冷冻千中冷冻千燥。将冷冻千燥的制剂的部^H^存在20'C和50'C;以不同的时间间隔取出样品用于酶活性和微生物学测定。利用fl羊制备的剌aM胶的水溶液(1%;20'C2800-3500cP的初々辩占度)使用粘度测定来测量酶的活性。在水中1:10,酶制剂，充分混合，然后按需要鄉一步繊。,的样品在制备之后立即进行测定。在20。C"零时间"点向含有30ml树胶溶液的管添加25微州适当稀度的给定的酶溶液。酶制剂的适合的稀度(一般约1:100)可有效在约5-15溯内将树胶粘度斷氐到<500cP。針树胶-酶溶液被混^^勺30秒,然后在布氏(Brookfield)DVII+粘度计(Spindle6，在20RPM)Jdit行分析。舰BrookfieldWingather软件记mf占颇比时间。以到500cP的粘舰时间的曲线线性拟"af斗對卩/或达到500cP所需的时间来测定相对酶活性。由预率反应不;1^、须与||#度成线性，所以雌在相同稀度(一般约1:100)测量比较样品和参考对照。由于冷冻干燥中涉及的、M因素，^"燥的样品，假定没有活性损失，应具有最初的FUM样品(g卩，100)的约2.5倍的每单位重量活性(即，250)。结果在以下表l中示出。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*FUM的相胂话性是100。由于鄉作用，制剂可能具有大于100的活性。+酶制剂中4顿的常关鹏定剂。保存在20'C的咖啡材料稳定化的样品甚至在几乎3个月的保存后也令人惊讶地具有比其它制剂更高一些的话性。在50'C的湖驗保存的制剂比在20'C保存的那些有显著更低的活性。然而，令人惊讶地，与非咖啡材料制剂相比，基于咖啡的制剂保持了更高的活性百分比(即，在20'C保存时麟了鹏约60%的活性)。因此，在2(TC和5(TC的保^Jt下，干"燥的制剂中咖啡衍生的材料充当了稳定剂。Mi^顿AOAC方法966.23测定微生物总平板计数(TPC)来刑古微生物学稳定性。初始冷冻的丽具有9800计掛gm的TPC。冷冻干燥处理将千燥物质浓度提高了2.5倍。表2显示了在20'C保存3周和9周以及在50'C保存3周的样品中的微生物TPC。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*参考FUM液#^有9800的总平板计l5(/g。+酶制剂中<顿的常规稳定剂。所有的:^燥样品都显示了TPC的明显降低(与仅由于浓缩因素的提高相反)。用咖啡材料配制的样品与其它制剂材料是相当的。在50'C保存的样品比在20'C保存的那些的计数低得多。在20'C保存9周的千麟品均测定为低于300TPC/gm。这^f燥样品具有非常低的7K活性，从而微生物生长WP制。所有千燥样品都具有可接受的低微生物TPC。实施例3.这个实施例说明了由咖啡衍生的材料稳定化的液体酶制剂的制备。解冻实施例1的冷冻的未配制的甘露聚糖酶，并M添加以下单独成分(以20%)制备液体制剂(1)可溶咖啡(MaxwellHouse);(2)山梨糖醇和氯化钠(各20%);和(3)对照FUM(无添加剂)。将7jC性液体制剂的部，存在4、20和50°C，并在不同的时间间隔抽取样品用于釆用与实施例1中相同的分析技术鄉行酶活性和微生物学测定。在表3和4中分别显示酶活性和微生物学结果。表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>+酶制剂中使用的常规稳定剂。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>+酶制剂中{顿的常规稳定剂。在不同时间和,保存的液体样品的酶活性在表3中示出。由于制剂成分的稀释作用，假定添加剂没有作用，配制的液体预计将具有对照(即，未配制的FXJM)的活性的约60%。对于在化保存的样品，甚至鄉过7周的保存之后，未配制的FUM也保持了高百分比的对照活性(B卩，皿97%)。令人惊讶地，在4'C保存超过7周的可溶咖啡制剂具有超过73%的对照活性；这高于假如成分没有作用的预测的60%。保存在化的掛山梨糖醇制剂具有47.6%的对照活性。对于在50'C的误用^f牛下保存8周，未配制的FUM仅维持了11%的对照活性。在50'C可溶咖啡制剂形成了实际上不溶的繊，射员失了基本上所有的活性。对于20'C的保存，虽然在未配制的FUM中存在相当大的微生物生长(见下文)，保持了约32%的对照酶活性；但这种材料将由于微生物生长而不能接受。该可溶咖啡制剂仅保持了10%的对照活性，且形成了部分不溶的凝胶。根据这个，可溶咖啡#^*是在冷藏^#(4'C)下保存的水性液体制剂的有效的酶活性稳定剂。然而，对于室温(20'C)保存舰于更高的误用斜牛(50'C),它不是有效的。如表4戶标，当保存在20'C时，未配制的对照FUM是微生物不稳定的；在3周时间内总平板计数已^M著地提高。然而，在4'C保存的未配制的对照显示了TPC中皿60X的斷氏，且当在50'C保存时为99X。ij起総是由于最初存在的部分微生鹏保存期间的死亡。相反，当在20'C保存3周时，两种配制的样品都显示了良好的微生物稳定性，可溶咖啡制剂得出了更低一些的TPC。因此，40wt、的可溶咖叫瞎20'C保存期间抑制了微生物生长。在20'C的6周保存时，配制的样品显示了TPC中的轻微改变。权利要求1.一种稳定化的酶组合物，其包含酶和有效量的用来稳定化酶的咖啡衍生的材料。2.权利要求1的组，，其中所述酶是水解酶。3.权利要求2的组，，其中所述的水解酶选自甘露聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、酯酶、蛋白酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯半乳聚糖酶、核酸酶、果胶酶、异构酶、淀粉酶、木质素断咜们的混合物。4.权利要求l的组合物，其中所述咖啡衍生的材料选自可溶咖啡、餘炒和磨制咖啡、咖啡油、用过的咖闷隨滓、磨制的生咖啡豆、含水咖啡提取物、生咖啡豆提取物和它们的混，。5.权利要求3的组，，其中戶腿咖啡衍生的材料选自可溶咖啡、悟炒和磨制咖啡、咖啡油、用过的咖闷隨滓、磨制的生咖啡豆、含水咖啡提取物、生咖啡豆提取物和它们的混合物。6.权利要求1的组合物，其中所述组合物，含有约1%到约25%的酶和约10%到约99%的咖啡衍生的材料。7.权利要求4的组合物,其中所述组合物含有约1%到约25%的酶和约10%到约99%的咖啡衍生的材料。8.权利要求5的组合物,其中所述组合物含有约1%到约25%的酶和约10%到约99%的咖啡衍生的材料。9.权利要求1的组合吻，其中所述组，是含水的组合吻的形式，且其中所述组合物tl含有约1%到约25%的断口约10%到约50%的咖啡衍生的材料。10.权利要求1的组，，其中所述组合物是干燥的形式，且其中所述脱组合物含有约1%到约25%的酶约75%到约99%的咖啡衍生的材料。11.一种生产可溶咖啡提取物的方法，所述方法包括(1)处理焙炒的咖啡固体来形成含有咖啡固体的咖啡浆；(2)在一定温度下并以足够水解咖啡固体的时间，用有效量的处于稳定化的酶组合物形式的酶来处S^M咖啡浆以形成可溶咖啡提取物材料，其中所述稳定化的酶组合物包括断口有效量的用来稳定酶的咖啡衍生的材料；和(3)处掛腿可溶咖啡提取辦才料来获得可溶咖鹏取物。12.权利要求11的力祛，其中所述步骤(1)中的咖啡^3131MltJ^炒的咖啡固体来形成，且其中在步骤(3)中的可溶咖啡提取物JiM^将自可溶咖啡提取tlt才料分离为滞留物和渗繊来获得的，其中戶腿渗透物包含可溶咖,取物。13.权利要求11的方法，其中所述酶选自甘露聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、酯酶、蛋白酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯半乳聚糖酶、核酸酶、果胶酶、异构酶、淀粉酶、木质素,咜们的混^th且其中戶腿咖啡衍生的材料选自可溶咖啡、餘炒和磨制咖啡、咖啡油、用过的咖闷隨滓、磨制生咖啡豆、含水咖闷瞎取物、生咖啡豆提取物和它们的混溯。14.权利要求12的方法，其中戶腿酶选自甘露聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、酯酶、蛋白酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯半乳聚糖酶、核酸酶、果胶酶、异构酶、淀粉酶、木质素,咜们的混糊;且其中戶脱咖啡衍生的材料选自可溶咖啡、悟炒和磨制咖啡、咖啡油、用过的咖闷隨滓、磨制生咖啡豆、含水咖闷魄取物、生咖啡豆提取物和它们的混溯。15.权利要求13的方法，其中戶腿组^tf含有约1%至哟25%的断啲10%到约99%的咖啡衍生的材料。16.权利要求14的方法，其中所i^且^/含有约1%到约25%的酶和约10%到约99%的咖啡衍生的材料。17.权利要求12的方法，其中将戶;M可溶咖啡提取辦才料分离成滞留物和渗^513^顿具有约20,000到约50,000道尔顿的^量iUh值的半透18.权利要求14的方法，其中将戶;M可溶咖啡提取自料分离成滞留物和滲透物^iii^ffi具有约20，ooo到约50，ooo道尔顿的^MiUh值的半透19.一种生产可溶咖闷魄取物的半，的或，的方法，戶腐对鲍括(1)用有效量的处于稳定化的酶组合物形式的酶来处理精细地磨制的咖啡固体以水解戶腿咖啡固体，以形成含有可溶咖啡提取物的可溶咖啡提取物材料，其中戶臓稳定化的酶组^;包含酶和有效量的用来稳定酶的咖啡衍生的材(2)将所述可溶咖啡提取物材料循环通过半透膜分离设备来连续地形成滞留物和渗透物，其中所述渗透物含有可溶咖啡提取物并且被连续地收集，和其中至少部分滞留物被再循环至所述脱容器中。20.权利要求19的方法，其中所述酶选自甘露聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、酯酶、蛋白酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯半乳聚糖酶、核酸酶、果胶酶、异构酶、淀粉酶、木质素和它们的混合物;和其中所述咖啡衍生的材料选自可溶咖啡、焙炒和磨制咖啡、咖啡油、用过的咖啡隨滓、磨制生咖啡豆、含水咖叫瞎取物、生咖啡豆提取物和它们的混合物。21.权利要求19的方法，其中所述组合物含有约1%到约25%的酶和约10%到约99%的咖啡衍生的材料。22.权利要求20的方法，其中所述组合物含有约1%到约25%的酶和约10%到约99%的咖啡衍生的材料。23.权利要求21的方法，其中所述半透膜具有约20,000到约50,000道儿顿的分子量截止值。24.权利要求22的方法，其中所述半透膜具有约20,000到约50,000道儿顿的分子量截止值全文摘要提供了用咖啡衍生的材料稳定化的酶组合物。所述稳定化的酶组合物在由焙炒的咖啡固体生产可溶咖啡中特别有用。文档编号C12N9/96GK101200713SQ20071010358公开日2008年6月18日申请日期2007年4月9日优先权日2006年4月10日发明者E·惠伦-彼得森,R·S·西尔弗申请人:卡夫食品集团公司