专利名称：：定量pcr检测体系及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种应用定量PCR方法对血液、血小板等无菌制品中细菌污染情况进行鉴定的检测体系及其制备方法。
背景技术：
：由血液、血小板制品细菌污染而引起的死亡已成为输血反应中的第二大致死因素，是危胁血液安全的一大隐患。目前主要应用全自动快速微生物培养检测系统进行鉴定。该系统的结果可靠，操作也相对简单。然而检测所需时间比较长。一般是培养24小时得到初步报告。而一些细菌如痤疮丙酸杆菌等通常要在100多小时后才可被检出。因而在短时间内还会有一些阳性的污染细菌未能被检测出来。很可能被输注到患者体内而引起严重的输血反应。16s核糖体在细菌进化过程中变化缓慢，在细菌中存在着共同的保守区域，使之与真核生物、病毒等相区别。因此，将此保守区域作为鉴定细菌的靶点，应用定量PCR技术可以在几小时内检测出细菌污染情况。国外也有学者将这一技术引入到血小板制品细菌污染的检测中来。但是他们的检测体系并不能将少量菌与阴性对照有效地区别开来，造成假阴性。因此，需要一种快速、高灵敏度和高特异性的定量PCR检测体系，以适用于从血液、血小板制品中检测细菌污染情况。
发明内容本发明的目的之一就在于提供一种新的减除细菌、核酸污染的定量PCR检测体系，该体系可方便细菌检测且灵敏度高，特异性强。本发明的另一个目的是提供上述细菌检测体系的制备方法。本发明的第三个目的是提供利用上述细菌检测体系的检测方法。为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案是一种减除细菌、核酸污染的PCR检测体系，由下列组分组成引物、探针、dNTP、Mg2+、PCR反应液、DNA聚合酶和水。上述减除细菌、核酸污染PCR检测体系的制备采取双过滤的方式减除细菌、核酸污染，包括下列步骤①取引物、探针、dNTP、Mg2+、PCR反应液加入水中混合，配成终浓度分别为引物150-400nM、探针150-400nM、dNTP150-400nM、Mg2+l-10mM的混合物，然后用超滤膜过滤(12000-15000g，20°C，1-20min)。②将DNA聚合酶加入步骤①得到的液体中，用微孔滤膜过滤(12000-15000g，2(TC，l-20min)制得PCR检测体系。本发明中，引物及探针为针对细菌16s保守区域(GENEBANK:AB280354)，该区域在细菌的进化过程中非常保守，为细菌的通用检测区，并且该段序列又是细菌所特有的，与真菌、病毒、细胞均无交叉反应。本发明中，PCR反应液为市售的各公司生产的用于定量的PCR液。各生物公司均有出售。本发明中双过滤时所采用的膜，一为超滤膜，优选截留蛋白质分子量为50-150KD，对蛋白质、DNA有一定吸附能力的膜，如YM-100;二为微孔滤膜，优选微孔直径为0.22un>的可以截留细菌的膜，如Ultmfree-MC，超滤膜主要用于蛋白质的分离纯化，微孔滤膜主要用于过滤除菌。在本实验研究中发现将具备这两种膜引入到PCR反应液的制备中，超滤膜发挥了截留环境中及反应液中存在的细菌、核酸的作用，而微孔滤膜可以滤除DNA聚合酶中可能存在的细菌及其成份。因此，通过两次过滤方法，使得后续PCR反应后，所扩增得到的PCR产物，其模板是来自于所添加的模板中，可有效去除反应液中存在的核酸和细菌污染，避免了外源污染对检测的影响，可有效提高检测的特异性。使用本发明的PCR检测体系，用以检测血液及血小板等无菌制品中的细菌，反应条件如下1.将模板加入PCR检测体系中。2将配制好的PCR体系于5(TC放置2min，再95。C放置10min3.然后以95。C15s，60。Clmin进行40个循环。本发明的优点和有益效果在本发明中，利用细菌特点和核酸的性质。基于这些特点和性质创造了去除细菌、核酸污染的PCR检测体系，以检测血液及血小板制品中细菌污染情况。与其它细菌检测方法相比，本发明有几个明显的优点和有益效果。l.检测的灵敏度高，'检测细菌无种属限制，尤其有利于难培养细菌的检出；2.检测的特异性强，少量菌与无菌情况能够有效地区别开，避免了假阳性；3.污染菌和核酸的去除步骤简便，整个检测体系操作简单，3-4小时就可以得出结果，便于临床应用。具体实施方式实施例实施例1实验方法配制PCR反应液25ul1.取浓度为100uM的上、下游引物各0.05ul，100uM的探针0.05ul，10uM的dNTP0.5ul，250mM的Mg2+0.35ul，水13.85ul，5XPCR反应液5ul制成混合物，上游引物5，-TCCTACGGGAGGCAGCA-GT-3，，下游引物5'國GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT陽3'，探针FAM-5'-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3，國TAMRA2.YM-100过滤步骤1所得的液体，3.将6ulDNA聚合酶0.25U加入步骤2所制得过滤液后，用Ultrafree-MC过滤4.将5ul模板加入步骤3所得过滤液中。5.将配制好的PCR体系于50。C放置2min，再95。C放置10min，最后95。C15s，6(TClmin，40cycles。按以下配方制作细菌基因组DNA提取液①将0.043%(g/100ml)SDS、1.43%(v/v)NP-40和1.43X(v/v)吐温-20混合，然后用0.22nm滤器过滤除菌，最后加入7.17%(g/100ml)chelex-100，②将溶菌酶、蛋白酶K和溶葡萄球菌素按活力单位比例4.5:1.25:l混合，YM-100蛋白过滤柱过滤13000g/分钟，4'C离心24分钟；◎将经步骤①得到的液体23ul，加入10ul经步骤②得到的液体，即得产品细菌基因组DNA抽提液。按以下程序进行操作以提取细菌基因组DNA即模板①取血浆800ul，13000g/分钟，离心10分钟，收集细菌；②弃上清，加入本发明的抽提液33ul，③37。C孵育60分钟，56'C孵育30分钟，加热煮沸10分钟，于0'C放置60秒，⑤10000g/分钟，离心5分钟，所得上清液即为细菌基因组DNA。'未过滤的检测方法除了删除过滤步骤外，其它条件与过滤法相同。双过滤法应用前后的PCR检测体系，分别用于对血小板制品中的金黄色葡萄球菌进行检测，结果如表l:表1两种PCR体系检测结果不同浓度金黄色葡萄球菌DNA扩增Ct值*(浓度单位:CFUs/PCR)阴性对照48.217.65.70.70.3尸过滤31.88±0.6521.72±0.5324.36±0.8826.64±0.7027.36±0.3528.98±1.0129.51±1.58>0.05未过滤34.30±0.0521.40±0.3424.73±0.5226.43±0.4427.18±0.0330.04±0.8530.06±0.92<0週表中，"*"表示3次平行实验的标准差；户表示最低稀释菌量与阴性对照Ct值的/检验在金黄色葡萄球菌中，应用过滤法的定量PCR检测体系进行鉴定，0.7、0.3/PCR所得Ct值与阴性对照Ct值之间相差大于4，经t检验证明Ct值有极显著差异(P<0.001)，而未应用过滤法的PCR体系中0.7、0.3/PCR所得Ct值与阴性对照Ct值没有明显差异，证明本发明的细菌检测方法特异性好。实施例2应用实施例1的双过滤定量PCR检测体系和检测方法与BacT/ALERT3D全自动培养方法相对比，对人为混有六种不同细菌的200ul血小板制品进行检测，在全自动培养方法中，用一次性无菌注射器吸取200ul血小板制品分别接入厌氧瓶和需氧瓶中。接种后，培养瓶经扫描确认并放入BacT/ALERT3D全自动细菌培养仪中，由仪器自动检测。结果如下应用PCR法与全自动培养法对血小板制品中的六种菌进行检测<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注一代表阴性BacT/ALERT3D全自动细菌培养仪检测样本，金黄色葡萄球菌量大于25CFU/ml时，均可被检出，菌量为5CFU/ml时需氧瓶的检出率为4/5，厌氧瓶的检出率为3/5;表皮葡萄球菌及大肠杆菌需氧瓶和厌氧瓶中最少含菌量组的检出率仅为1/3;蜡样芽孢杆菌菌量大于20CFU/ml时，两组瓶子均可被检出，5CFU/ml时检出率为1/3;铜绿假单胞杆菌需氧瓶的检出率为9/9，厌氧瓶的检出率为4/9;痤疮丙酸杆菌需氧瓶的检出率为2/12，厌氧瓶最少含菌量组有一瓶未被检出。而应用本发明的定量PCR检测体系进行鉴定其CT值均小于阴性对照的CT值，且有显著差异，判定为阳性。以上结果证明本发明的细菌检测方法灵敏度高。权利要求1、一种定量PCR检测体系，其特征在于，包括引物、探针、dNTP、Mg2+、PCR反应液、DNA聚合酶和水。2、如权利要求1所述定量PCR检测体系，其特征在于，所述引物及探针为针对细菌16s保守区域的特异性引物及探针。3、如权利要求1所述定量PCR检测体系，其特征在于，所述PCR检测体系经超滤膜及微孔滤膜过滤制得。4、如权利要求3所述定量PCR检测体系，其特征在于，所述超滤膜为YM-100，微孔滤膜为Ultrafree-MC。5、权利要求1一4中任一权利要求所述定量PCR检测体系的制备方法，包括下列步骤a)取引物、探针、dNTP、Mg2+、PCR反应液加入水中混合，配成终浓度分别为引物150-400nM、探针150-400nM、dNTP150-400nM、Mg2+l-10mM的混合物，然后用超滤膜过滤；b)将DNA聚合酶加入步骤a得到的液体中，用微孔滤膜过滤制得PCR检测体系。6、如权利要求5所述定量PCR检测体系的制备方法，其特征在于，所述超滤膜截留蛋白质分子量为50-150KD。7、如权利要求6所述定量PCR检测体系的制备方法，其特征在于，所述超滤膜为YM-IOO。8、如权利要求5所述定量PCR检测体系的制备方法，其特征在于，所述微孔滤膜为微孔直径为0.22um的膜。9、如权利要求8，所述定量PCR检测体系的制备方法，其特征在于，所述微孔滤膜为Ultrafree-MC。10、权利要求1一4中任一权利要求所述定量PCR检测体系的使用方法，其特征在于，使用时，PCR的循环条件为a〉将配制好的PCR体系于50。C放置2min,再95。C放置10min;b)而后以95。C15s，60。Clmin进行40个循环。全文摘要本发明涉及血液制品中细菌保守区域检测体系。公开了一种针对细菌保守区域的定量PCR检测体系，由引物、探针、dNTP、Mg<sup>2+</sup>、PCR反应液、DNA聚合酶和水组成。本发明还进一步公开了上述检测体系的制备方法。本发明可有效用于检测细菌，灵敏度高、特异性强，生产方法和使用操作简单、方便。文档编号C12Q1/68GK101250579SQ20081003546公开日2008年8月27日申请日期2008年4月1日优先权日2008年4月1日发明者刘晓颖,忠徐,迅王,钱开诚,敏马申请人:上海市血液中心