专利名称：埃博拉病毒荧光定量pcr检测新方法及埃博拉病毒检测pcr体系的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，具体涉及埃博拉病毒的快速定性和定量检测方法，提 供一对特异性引物和探针。
背景技术：
埃博拉病毒(Ebola virus, EB0V)能够引起一种人畜共患传染病，即埃博拉出血 热(Ebola hemorrhagil fever，EBHF)，1976年在苏丹南部和扎伊尔即现在的刚果(金)的 埃博拉河地区首次爆发，患者死亡率高达90%，引起医学界的广泛关注，埃博拉病毒由此得 名。埃博拉病毒感染性极强，可通过直接接触感染者的体液或其他感染组织、皮肤溃破伤口 和飞沫等多种途径传播。感染者会出现严重的出血现象并导致休克综合征。世界卫生组织 已经将EBOV列为对人类危害最严重的病毒之一，即第4级病毒，与其相关的试验操作必须 在P4级实验室中进行。目前用于埃博拉病毒的检测方法已经有免疫组织化学检查、血清学检测、电镜检 查、病毒分离、RT-PCR核酸检测、real-time RT-PCR核酸检测，每种方法都有各自优势与缺 陷，但荧光定量PCR核酸检测的方法不失为公认的一种更直观、更快速的一种适合早期诊 断的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种埃博拉病毒荧光定量PCR检测新方法及埃博拉病毒 检测PCR体系，该方法能够快速定性和定量检测埃博拉病毒，包括一对特异性更高、灵敏度 高、重复性好的引物和探针。为实现上述目的，本发明埃博拉病毒荧光定量PCR检测新方法中设计采用的引物
探针为
权利要求
1.埃博拉病毒荧光定量PCR检测新方法，其特征在于，该方法中设计采用的引物探针为NameSequencePosition Tm°C Modification引物 1 CAAGGACTGATACAATATCCAACAG1025-1049 58引物 2 GAATTTGMATCACAGCATCGT1164-1185 5 7 探针TGGCAATCAGTAGGACACATGATGGTG1052-1078 69 Texas Red/BHQ-2
2.如权利要求1所述的埃博拉病毒荧光定量PCR检测新方法，其特征在于，该方法具体为1)设计引物探针；2)根据仪器选择荧光素；3)合成引物和探针；4)制备阳性质粒标准品；5)运行PCR；6)数据分析；7)提取病毒RNA进行体系验证。
3.如权利要求2所述的埃博拉病毒荧光定量PCR检测新方法，其特征在于，所述步骤 2)中荧光素的供选择的荧光发射基团有6-FAM、TET、HEX、J0E、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red, 荧光淬灭基团有 BHQ-I、BHQ-2、Lowa Black RQ、Lowa Black FQ、Dabcyl。
4.如权利要求2所述的埃博拉病毒荧光定量PCR检测新方法，其特征在于，所述步骤4)中采取基因合成方式制作阳性质粒CBG233-4作为阳性样品将引物设计过程中筛选出 的高保守区域bpl025-bpll85前后分别延长30 50bp进行基因合成，然后将其克隆至 PMD19-T载体中，即为所述阳性质粒样品，编号CBG233-4。
5.如权利要求2所述的埃博拉病毒荧光定量PCR检测新方法，其特征在于，所述步骤5)中Real-TimePCR反应适用于所有荧光定量PCR反应仪。
6.权利要求5中所述的埃博拉病毒荧光定量PCR检测新方法，其特征在于，所述荧 光定量PCR反应仪包括SmartCyclerll，ABI实时PCR系统、BioRad实时PCR检测系统、 Stratagene定量多聚酶链反应仪。
7.如权利要求2所述的埃博拉病毒荧光定量PCR检测新方法，其特征在于，所述步骤 5)中最佳扩增条件为
8.一种埃博拉病毒检测PCR体系，其特征在于，其中包括引物或者其他能与埃博拉全 长序列特异性结合并扩增的等同引物，其相似同源性不能超过90%，引物序列如下引物 1 (5,-3,):_CAAGGACTGATACAATATCCAACAG_引物 2 (5'-3') GAATTTGAAATCACAGCATCGT_-r --- ■ ■——---
9. 一种埃博拉病毒检测PCR体系，其特征在于，其中包括引物及能与埃博拉全长序列 特异性探针，探针序列如下探针(5’-3,):_TGGCAATCAGTAGGACACATGATGGTG""-‘■1 ‘“................................丨丨·.…. niniiiii-n—............. "'(“…...…”..............................1 丨丨丨丨丨丨-..............." """""能与埃博拉全长序列特异性结合并扩增的等同探针，其位点区域的覆盖率不能超过 50 %，其同源性不能超过70 %。
全文摘要
本发明公开了一种埃博拉病毒荧光定量PCR检测新方法及埃博拉病毒检测PCR体系，由引物和探针、Premix Ex Taq反应液、灭菌Tris水组成，该引物和探针检测特异性好，灵敏度高，非常适用于埃博拉病毒，与马尔堡病毒无交叉反应。
文档编号C12N15/11GK102140532SQ20101060551
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者孙肖红, 徐宝梁, 杨宇, 王静, 白琳, 胡孔新 申请人:中国检验检疫科学研究院