专利名称：登革热病毒荧光定量pcr检测新方法及登革热病毒检测pcr体系的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，具体涉及登革热病毒的快速定性和定量检测方法，提 供一对特异性引物和探针。
背景技术：
登革热(Dengue fever, DF)是由1 4型登革病毒引起、经伊蚊传播的急性传染 病，按照《中华人民共和国传染病防治法》的规定为乙类传染病。亚洲、大洋洲、美洲和非洲 均有本病发生，是热带、亚热带地区的一个非常严重的公共卫生问题。登革出血热和登革休 克综合征的病死率较高，不仅严重影响人民的身体健康，而且严重影响当地经济、贸易和旅 游事业的发展。目前登革热的监测方法有ELISA血清学检测、RT-PCR核酸检测、病毒分离 序列测定、免疫荧光抗原检测法等。但荧光定量PCR核酸检测的方法不失为一种更直观、准 确、快速的适合早期诊断的检测标准。
发明内容
本发明的目的在于提供一种登革热病毒荧光定量PCR检测新方法及登革病毒检 测PCR体系，其能够快速定性和定量检测登革热病毒，包括一对特异性更高、灵敏度高、重 复性好的引物和探针。为实现上述目的，本发明登革热病毒荧光定量PCR检测新方法中设计采用的引物
探针为
权利要求
1.登革热病毒荧光定量PCR检测新方法，其特征在于，该方法中设计采用的引物探针为
2.如权利要求1所述的登革热病毒荧光定量PCR检测新方法，其特征在于，该方法具体为1)设计引物探针；2)根据仪器选择荧光素；3)合成引物和探针；4)制备阳性质粒标准品；5)运行PCR；6)数据分析；7)提取病毒RNA进行体系验证。
3.如权利要求2所述的登革热病毒荧光定量PCR检测新方法，其特征在于，所述步骤 2)中荧光素的供选择的荧光发射基团有6-FAM、TET、HEX、J0E、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red, 荧光淬灭基团有 BHQ-I、BHQ-2、Lowa Black RQ、Lowa Black FQ、Dabcyl。
4.如权利要求2所述的登革热病毒荧光定量PCR检测新方法，其特征在于，所述步骤4)中采取基因合成方式制作阳性质粒CBG231-3作为阳性样品将引物设计过程中筛选出 的高保守区域bpl0627-bpl0768前后分别延长30 50bp进行基因合成，然后将其克隆至 PMD19-T载体中，即为所述阳性质粒样品，编号CBG231-3。
5.如权利要求2所述的登革热病毒荧光定量PCR检测新方法，其特征在于，所述步骤5)中Real-TimePCR反应适用于所有荧光定量PCR反应仪。
6.如权利要求5所述的登革热病毒荧光定量PCR检测新方法，其特征在于，所述荧 光定量PCR反应仪包括SmartCyclerll、ABI实时PCR系统、BioRad实时PCR检测系统、 Stratagene定量多聚酶链反应仪。
7.如权利要求2所述的登革热病毒荧光定量PCR检测新方法，其特征在于，所述步骤 5)中最佳扩增条件为95°C 60s950C 5s 56。C 30s } 45 循环。
8.一种登革热病毒检测PCR体系，其特征在于，该体系包括引物或者其他能与登革全 长序列特异性结合并扩增的等同引物，其相似同源性不能超过90%，引物序列如下引物 1 (5,-3’) GCTGGAAGGACTAGAGGTTAGAG_引物 2 (5’-3’)GATTCAACAGCACCATTCCAT_
9. 一种登革热病毒检测PCR体系，其特征在于，该体系包括引物及能与登革全长序列 特异性探针，探针序列如下探针(5’-3’) AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGA_能与登革全长序列特异性结合并扩增的等同探针，其位点区域的覆盖率不能超过 50 %，其同源性不能超过70 %。
全文摘要
本发明公布了一种登革热病毒荧光定量PCR检测新方法及登革热病毒检测PCR体系，由引物和探针、Premix Ex Taq反应液、灭菌Tris水组成，该引物和探针检测特异性好，灵敏度高，非常适用于登革热病毒，与黄热病毒、乙型脑炎病毒无交叉反应。
文档编号C12N15/11GK102140529SQ201010605470
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者孙肖红, 杨宇, 王静, 白琳, 胡孔新, 韩辉 申请人:中国检验检疫科学研究院