专利名称：快速生长的大口黑鲈微卫星标记筛选及其应用的制作方法
技术领域：
大口黑鲈属于我国重要的淡水养殖鱼类之一。本发明属于鱼类分子生物学DNA标 记技术与应用领域，具体涉及快速生长的大口黑鲈微卫星标记筛选，及利用这些标记辅助 大口黑鲈快速生长品系的选育工作。
背景技术：
大口黑鲈(Microp terus salmoides L.)，俗名加外丨鲈，原产于北美洲，属于鲈形 目、鲈亚目、太阳鱼科、黑鲈属，具有生长快、耐低温、肉质鲜美和易捕捞等特点，是重要的淡 水养殖鱼类之一。从上世纪70年代开始推广到世界各地，1983年从台湾引种到广东省， 现在全国大部分地区均有养殖。2000年，广东省大口黑鲈的养殖面积约为10万亩，产量 6.67万吨，全国大口黑鲈的年产量在10万吨左右。2004年，仅广东大口黑鲈产量9.48 万吨，产值约12.86亿元。但是目前我国引进的大口黑鲈是由野生种家养驯化而成的，缺 少定向选育，加上引种20多年来不注重亲本留种需遵守的操作规程，甚至有的苗种生产 单位为了生产上的方便，选择个体小，性成熟早的个体作为亲本，致使我国目前养殖大口黑 鲈种质的质量急剧下降，主要表现在生长速度下降、性成熟年龄普遍提前、饵料转化效率 低、对环境不利影响和疾病的抵抗力也大幅下降，已严重制约我国大口黑鲈养殖业的发展。生长速度是关系到养殖户所养殖大口黑鲈产量的高低，效益的高低的关键。近年 来，由于大口黑鲈有小型化趋势，市场价格也受到极大影响，大大影响了大口黑鲈养殖者的 信心，制约了大口黑鲈养殖业的发展。提高养殖鱼类生长速度的方法很多，如强化喂养，保 持良好水质环境，控制合适的放养密度，挑选优质亲鱼进行繁殖等。其中，挑选个体较大、身 体健壮的鱼作繁殖用亲本，其后代可能具有亲本生长快、抗病等优良品质，但这种方法对亲 本的选择目的性还不够强，仍具有很多人为地因素和不确定的因素。大口黑鲈属于肉食性 为主的鱼类，掠食性强，饵料不足是会互相残食，致使其生长悬殊较大，仅从表型判断大口 黑鲈亲本质量是否优良还是不精确，但从DNA水平上进行选择，可以大大提高选择的准确 性，并可在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选优良亲本，从而缩短育种周期，加快育种 进程。本实验室通过研究，在人工养殖的大口黑鲈群体中对40个微卫星位点进行扩 增，运用卡方检验分析微卫星位点在极端大个体组和极端小个体组中的基因型分布差异， 选择差异显著的16个微卫星位点对大口黑鲈随机群体进行基因型与性状的关联分析。结 果表明关联分析得到5个微卫星位点(JZL60、JZL67、JZL72、MiSaTPW76和MiSaTPW117 )与体重、体长和体高显著或极显著相关(P<0.05或P<0.01 )，同时对差异显著的位点进 行不同等位基因与生长性状的多重比较，找到了与体重、体长和体高性状相关的最有利等 位基因为JZL60的等位基因A、JZL67的等位基因B、JZL72等位基因A，MiSaTPW76的等 位基因B和MiSaTPW117的等位基因B。本实验室根据筛选到的5个具有优势等位基因的微卫星标记引物(JZL60、 JZL67、JZL72、MiSaTPW76和MiSaTPW117 )，建立快速、有效地鉴定具有优良性状的个体。利用本方法将生产中具有该5个优势等位基因的个体保留，以提高大口黑鲈的品种质量。 该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点。且操作简单、检测快速、检 测成本低，便于广泛推广使用。
发明内容
本发明筛选到5个与大口黑鲈生长性状紧密相关的等位基因，并建立一种快速、 准确、有效地利用分子标记检测大口黑鲈优良个体的方法，以早期鉴定出具有优良性状的 个体，为筛选优良亲本提供参考。一、微卫星标记筛选
本申请人于2006年11月从广州市顺德南水大口黑鲈养殖基地选择300对亲鱼，2007 年4月对选择的亲鱼进行人工繁殖，繁殖后代在同一养殖池中进行养殖。同年12月份选择 该养殖池中的大口黑鲈160尾，建立体重的正态分布图，取15%的高值个体即体重为750g 以上的记为“极端大群体”，15%低值个体即体重为315g以下的记为“极端小群体”，从两个 群体中各随机选择12尾用于与生长相关微卫星位点的初步筛选。然后从相同的养殖池中 随机选择121尾大口黑鲈用于生长性状关联分析，此121尾大口黑鲈记为“随机群体”。本申请人利用实验室拥有的具有多态性且分型效果好的40个微卫星标记对极端 群体进行扩增，扩增结果运用卡方检验分析40个微卫星标记在极端大个体组和极端小个 体组中的基因型分布差异，选择差异显著的16个微卫星对大口黑鲈随机群体进行基因型 与性状的关联分析。结果表明关联分析得到5个微卫星位点(JZL60、JZL67、JZL72、 MiSaTPff76和MiSaTPffl 17 )与体重、体长和体高显著或极显著相关(Ρ<0· 05或P<0. 01 )，同时对差异显著的位点进行不同等位基因与生长性状的多重比较，找到了与体重、体长 和体高性状相关的最有利等位基因为JZL60的等位基因A、JZL67的等位基因B、JZL72 等位基因A，MiSaTPW76的等位基因B和MiSaTPW117的等位基因B。二、筛选的微卫星标记应用
利用筛选到的5个具有优势等位基因的微卫星标记，对待选择个体或亲本的大口黑 鲈DNA样品进行PCR检测，扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺进行分析，将同时存在JZL60的 等位基因 A(227bp)、JZL67 的等位基因 BU62bp)、JZL72 等位基因 A(202bp)、MiSaTPff76 的等位基因B (257bp)和MiSaTPWl 17的等位基因B (214bp)的个体保留，去除不存在优 势等位基因的个体。利用本方法将生产中同时具有这5个优势等位基因的个体选作亲本， 有目的的选择优良种质，从而保证后代种质优良，可以大大提高大口黑鲈后代的生长速度。 该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点。且操作简单、检测快速、检 测成本低，便于广泛推广使用。三、具体检测方法 (一)微卫星引物
权利要求
1.快速生长的大口黑鲈微卫星标记筛选，其特征是选择300对亲鱼，对选择的亲鱼进行人工繁殖，繁殖后代在同一养殖池中进行养殖，选 择大口黑鲈160尾，建立体重的正态分布图，取15%的高值个体即体重为750g以上的记为 “极端大群体”，15%低值个体即体重为315g以下的记为“极端小群体”，从两个群体中各随 机选择12尾用于与生长相关微卫星位点的初步筛选，然后从相同的养殖池中随机选择121 尾大口黑鲈用于生长性状关联分析，此121尾大口黑鲈记为“随机群体”；利用实验室拥有的具有多态性且分型效果好的40个微卫星标记对极端群体进行扩 增，扩增结果运用卡方检验分析40个微卫星标记在极端大个体组和极端小个体组中的基 因型分布差异，选择差异显著的16个微卫星对大口黑鲈随机群体进行基因型与性状的关 联分析，结果表明关联分析得到5个微卫星位点JZL60、JZL67、JZL72、MiSaTPW76和 MiSaTPffl 17，与体重、体长和体高显著或极显著相关，如P<0. 05或P<0. 01，同时对差异 显著的位点进行不同等位基因与生长性状的多重比较，找到了与体重、体长和体高性状相 关的最有利等位基因为JZL60的等位基因A、JZL67的等位基因B、JZL72等位基因A， MiSaTPff76的等位基因B和MiSaTPW117的等位基因B。
2.快速生长的大口黑鲈微卫星标记筛选的应用，其特征是利用筛选到的5个具有优势等位基因的微卫星标记，对待选择个体或亲本的大口黑 鲈DNA样品进行PCR检测，扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺进行分析，将同时存在JZL60的 等位基因 A(227bp)、JZL67 的等位基因 BU62bp)、JZL72 等位基因 A(202bp)、MiSaTPff76 的等位基因B (257bp)和MiSaTPW117的等位基因B (214bp)的个体保留，去除不存在优势 等位基因的个体，利用本方法将生产中同时具有这5个优势等位基因的个体选作亲本，有 目的的选择优良种质，从而保证后代种质优良，可以大大提高大口黑鲈后代的生长速度； 具体检测方法 (一)微卫星引物
全文摘要
快速生长的大口黑鲈微卫星标记筛选及其应用，属于鱼类分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及快速生长的大口黑鲈微卫星标记筛选，及利用这些标记辅助大口黑鲈快速生长品系的选育工作。筛选到5个与大口黑鲈生长性状紧密相关的等位基因，并建立一种快速、准确、有效地利用分子标记检测大口黑鲈优良个体的方法，以早期鉴定出具有优良性状的个体，为筛选优良亲本提供参考。利用本方法将生产中同时具有这5个优势等位基因的个体选作亲本，有目的的选择优良种质，从而保证后代种质优良，可提高生长速度。该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点。且操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。
文档编号C12Q1/68GK102127599SQ20101060506
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月26日 优先权日2010年12月26日
发明者叶星, 李胜杰, 樊佳佳, 白俊杰, 马冬梅 申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所