专利名称：：一种城市污水中浮游生物群落dna指纹的分析方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物分子生态学领域的分析方法，具体是一种利用PCR-DGGE分析城市污水中浮游生物生物群落DNA指纹图谱的技术，即通过PCR-DGGE分析城市污水中浮游生物群落DNA多态性，利用其多态性分析各个污水处理阶段间的关系以及活性污泥的运行状况。
背景技术：
：城市污水处理厂的二级污水处理工艺大都是活性污泥法及其改进工艺，其原理是通过由各种细菌、真菌、藻类和原生动物等构成的一个复杂的生态系统，对有机污染物进行生物降解，同时除去污水中过量的磷和氮、吸附重金属离子甚至浮游病毒等，来达到净化水质的目的。污水处理厂通常只检测常规理化指标以判断污水处理效果，很少对浮游生物群落进行监测。城市污水来源复杂，通常含有多种污染物，若同时结合浮游生物群落动态对污水处理效果进行评价，则不但能了解污染物浓度的变化情况，还可了解其对浮游生物群落的影响，从而揭示活性污泥的运行状态，并对此后的污水处理效果进行预报。传统的污水微生物群落的检测一般通过各种培养基进行纯化培养来鉴定菌种，但传统的微生物分离培养技术存在诸多瓶颈，如大多数微生物难以进行分离培养；少数能进行分离培养的需要较复杂的培养条件；分离培养出来菌种不一定是污水中优势类群，很可能只是较其它菌种更易在培养基上生长；一些数量较少，4起重要作用的细菌种群很可能因难以在培养基上生长而被忽略。有鉴于此，微生物学家将分子生物学的方法引入生态学研究，希望能弥补分类学上的不足，进而希望得到更真实和更全面的微生物群落的信息。自变性梯度凝月交电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)技术被用于分子生态学研究以来，己经成为研究生物群落多样性的重要工具。PCR-DGGE技术具有灵敏度高，重复性好，易操作，能同时分析多个平行样品而被人广泛应用与微生物分子生态学的研究中。人们已经利用PCR-DGGE技术分析了环境中微生物群落的DNA指纹，从而揭示了更加丰富的生物多样性。目前的研究主要集中在对土壤、湖泊、河流和废水等各种环境中细菌群落结构及功能的研究，同时有少量关于环境中古细菌、真菌和真核藻类群落多样性的研究。当前的研究手段主要是利用针对原核生物16SrRNA基因V3或V4V5区设计的特异引物扩增环境样品中的生物群落DNA，尤其是在废水和活性污泥生物群落的研究中该方法应用的更加广泛。但是，对于污水处理中同样占有十分重要地位的真菌以及其它真核生物却常常被忽略了。利用针对原核生物16SrDNA和真核生物18SrDNA设计的引物，同时进行原核生物及真核生物群落多样性的研究，对于全面掌握污水中浮游生物群落的动态是十分必要的。
发明内容本发明的目的是在现有的基础上进一步完善微生物群落DNA指纹检测方法，提供一种城市污水中浮游生物群落DNA指纹的分析方法。传统的微生物鉴定工作繁琐耗时，而且大部分的微生物难以培养，本方法避免了对污水中微生物(如细菌、真菌)进行传统的分类学鉴定，快速地对污水中浮游生物的多样性进行分析，所得结果可以准确地反映污水中浮游生物群落结构，尤其是在以往只分析细菌群落的基础上加入了真核生物DNA指纹图谱，使本方法能更加全面的分析污水中浮游生物群落的结构。本发明通过以下技术方案实现，其具体步骤是.-1.浮游生物群落的宏基因组DNA提取直接使用采水器采得城市污水水样，水样充分混匀，吸取混匀水样转入1.5mL离心管，离心获得沉淀，并去除上清液，转速为10000r/min，时间5min，然后用灭菌双蒸水清洗沉淀，再离心一次，将所获沉淀悬浮于1.5mL灭菌的TENP缓冲液中，TENP缓冲液含有50mmol/LTris-base;20mmol/LEDTA;100mmol/LNaCl;0.01g/mL聚乙烯吡咯烷酮；pH-lO，接着将沉淀悬浮液振荡混匀，离心去除上清液，转速为8000r/min，日寸间5min。去除上清液，灭菌双蒸水清洗沉淀，然后再次离心，重复清洗沉淀的步骤直至上清液清亮。最后将沉淀悬浮于300mL灭菌双蒸水，置于液氮中lmin，室温(20-25°C)下融解，待样品完全融解后直接加入裂解液，裂解液含有0.5%SDS;10mmol/LTris-Cl,pH=8.0;0.1mol/LEDTA，pH=8.0;100ng/mL蛋白酶K,然后将样品置于水浴箱中5(TC温浴裂解过夜。DNA抽提参照使用酚一氯仿抽提法，最后加TE缓冲液溶解，取溶解的DNA用0.7%的琼脂糖凝胶进行电泳评估，其余DNA-2(TC保存。2.采用特异性引物污水中浮游生物群落的宏基因组PCR扩增所用引物原核生物16SrDNA引物为Pl(5，-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3，)和P2(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，)；真核生物18SrDNA引物为P3(5，-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG-3')和P4(5，-GCGGTGTGACAAAGGGCAGGG-3')。PCR扩增采用50pL的反应体系，其中包含有10XPCRbuffer(不含Mg2十)，5pL;MgCl2溶液，25mmol/L,4^L;dNTP，2mmol/L，2pL;引物P1和P2或P3和P4，lO^mol/L,各0.8^L;Taq酶3.0U;模板DNA20ng左右；最后加灭菌双蒸水补足至终体积50pL。采用TouchdownPCR模式，运行条件如下94。C，5min;然后94。C下变性1min;69。C或67X:下退火30s;72。C下延伸lmin，之后每个循环降rC，共10个循环；再进行18或20个扩增循环，扩增参数为94i:下变性lmin;59'C或57'C下退火30s;72'C延伸1min;最后72"延伸10min，反应终止于4'C。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳确认目标片段。3.变性梯度凝胶电泳电泳在INGENYphorU-2system中进行，所用胶浓度为9%，聚丙烯酰胺配制凝胶的溶液含有丙烯酰胺21.9156g，N，N'-甲叉双丙烯酰胺0.5844g，50XTAE5mL，最后加灭菌双蒸水补足至终体积250mL。进行两次变性梯度凝胶电泳(DGGE)，以获得群落DNA指纹图谱。第一次采用较宽的变性梯度30%—70%，根据结果在第二次电泳时调整变性梯度为以获得最好效果。运行条件:在1XTAE缓冲液中，6(TC恒温，120V恒电压条件下运行llh左右。凝胶用溴化乙锭染色20min，经UVP成像分析系统拍照得到DNA指纹图谱。4.利用软件对图谱进行分析利用QuantityOne(Bio-Rad,美国)软件分析浮游生物群落DNA指纹图谱获得光密度值等数据，利用STATISTICA6.0软件中的主成分分析功能对数据进行统计分析，获得各个不同污水处理阶段间浮游生物群落DNA指纹数据相对于两个主成分的坐标及基于坐标的二维图。传统的微生物种类鉴定方法用于研究城市污水中浮游生物群落通常需要专业的分类学人员，而且工作量大，耗时耗力，所获结果也不能充分说明污水中浮游生物的群落结构。本发明与之相比有以下几个优点操作简便，只需普通技术人员按照发明步骤进行操作即可获得结果；节省时间，从DNA的提取到指纹图谱的获得只需两天时间；可以同时比较不同时间和不同空间的多个平行样品；所获的结果重复性好，灵敏度高，DNA指纹图谱能真实反映出污水中浮游生物的群落结构，其中DNA条带能够回收并进行克隆测序，从而得到DNA条带所代表的物种信息。本发明在很大程度上减少了人为因素的影响，从而使其能够应用于城市污水厂的生物监测，为污水的处理效果评估和活性污泥动态的监测提供一份可靠的科学依据。图1为一种城市污水中浮游生物群落DNA指纹的分析方法的流程示意图图2为武汉市某污水处理厂污水处理工艺流程3为浮游生物群落总DNA的琼脂糖凝胶电泳图。M-分子量Marker,1-进水口，2-厌氧段，3-缺氧段，4-曝气池，5-出水口图4为扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。M-分子量Marker,l-进水口，2-厌氧段，3-缺氧段，4-曝气池，5-出水口，箭头所指为250bp大小的条带，即目标条带。图5为污水处理系统中浮游生物群落DGGE指纹图谱。(A)16SrDNA指纹图谱；(B)18SrDNA指纹图谱。I-进水口，II-厌氧段，III-缺氧段，IV-曝气池，V-出水口。图6为基于各采样点DGGE指纹图谱相似性的主成分分析结果。(A)原核生物PCA分析结果(基于原核生物图谱量化数值)；(B)真核生物PCA分析结果(基于真核生物图谱量化数值)。i-进水口，n-厌氧段，III-缺氧段，IV-曝气池，V-出水口。图7活性污泥发生膨胀前后浮游生物群落DGGE指纹图谱。(A)16SrDNA指纹图谱；(B)18SrDNA指纹图谱。l-厌氧段，2-缺氧段，3-曝气池，1、2、3为发生膨胀前；4-厌氧段，5-缺氧段，6-曝气池，4、5、6为发生膨胀后。图8为基于各采样点DGGE指纹图谱相似性的主成分分析结果。(A)原核生物PCA分析结果(基于原核生物图谱量化数值)；(B)真核生物PCA分析结果(基于真核生物图谱量化数值)。图中数字代表各图谱中自上而下的DNA条带。具体实施方式下面结合附图对本发明作进一步详细描述实施例1对武汉市某污水处理厂中污水进水口(i)、厌氧池(n)、缺氧池(ni)、曝气池(iv)、二沉池出水口(V)5个采样点的水样进行采集分析(见附图2)。1.浮游生物群落的宏基因组DNA提取A直接使用采水器采得城市污水水样，水样充分混匀，吸取混匀水样转入1.5mL离心管，离心获得沉淀，并去除上清液，转速为10000r/min,时间5min,然后用灭菌双蒸水清洗沉淀，再离心一次，将所获沉淀悬浮于1.5mL灭菌的TENP缓冲液中，TENP缓冲液含有50mmol/LTris-base;20mmol/LEDTA;100mmol/LNaCl;0.01g/mL聚乙烯吡咯烷酮；pH=10，接着将沉淀悬浮液振荡混匀，离心去除上清液，转速为8000r/min，时间5min。去除上清液，灭菌双蒸水清洗沉淀，然后再次离心，重复清洗沉淀的步骤直至上清液清亮。最后将沉淀悬浮于300nL灭菌双蒸水，置于液氮中lmin，室温(20-25°C)下融解，待样品完全融解后直接加入裂解液，裂解液含有0.5%SDS;10mmol/LTris-Cl，pH=8.0;0.1mol/LEDTA,pH-8.0;100ng/mL蛋白酶K，然后将样品置于水浴箱中5(TC温浴裂解过夜。DNA抽提参照使用酚一氯仿抽提法，最后加TE缓冲液溶解，-2(TC保存。将溶解的DNA原液取lpL稀释50倍，稀释液取5^L用0.7y。的琼脂糖凝胶进行电泳评估(见附图3)。2.采用特异性引物污水中浮游生物群落的宏基因组B采用针对16SrDNA和18SrDNA的引物(引物序列见
发明内容P1、P2、P3、P4)进行PCR扩增。PCR扩增采用50^L的反应体系，其中包含有10XPCR1\^6"不含^^2+),5pL;MgCl2溶液，25mmol/L,4dNTP,2mmol/L，2pL;引物P1和P2或P3和P4，1Opmol/L,各0,8|iL;Taq酶3.0U;模板DNA20ng左右；最后加灭菌双蒸水补足至终体积50|aL。采用TouchdownPCR模式，运行条件如下94°C，5min;然后94"C下变性1min;69'C或67。C下退火30s;72。C下延伸lmin，之后每个循环降rC，共10个循环；再进行18或20个扩增循环，扩增参数为94'C下变性lmin;59。C或57。C下退火30s;72。C延伸lmim最后72。C延伸10min，反应终止于4"。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳确认目标片段(见附图4)。3.变性梯度凝胶电泳C电泳在INGENYphorU-2system中进行，所用胶浓度为9%聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺配制凝胶的溶液含有丙烯酰胺21.9156g，N，N'-甲叉双丙烯酰胺0.5844g，50XTAE5mL，最后加灭菌双蒸水补足至终体积250mL。进行两次变性梯度凝胶电泳，以获得群落DNA指纹图谱。第一次采用较宽的变性梯度30%一70%，根据结果在第二次电泳时调整变性梯度为原核生物为35%65%，真核生物为40°/。~60%(100%的变性剂含有7mo1'U1尿素和40%(体积分数)甲酰胺)。运行条件在1XTAE缓冲液中，60'C恒温，120V恒电压条件下运行11h。凝胶用溴化乙锭染色20min，经UVP成像分析系统拍照得到浮游生物群落DNA指纹图谱(见附图5)。4.利用软件对图谱进行分析D利用QuantityOne分析浮游生物生物DGGE图谱获得光密度值等定量数据。利用STATISTICA6.0软件中的主成分分析功能对数据进行基于相关性的统计分析，获得两个主成分，其中原核主成分总共能代表数据特征的75.9%，真核主成分总共能代表数据特征的78.4%，计算得各阶段DNA指纹的坐标(表l)作二维图。结果显示(见附图6)进水与出水的差异最大，而厌氧池、缺氧池和曝气池差异较小，从而说明了进水与出水浮游生物群落结构差异最大，厌氧、缺氧和曝气三个阶段的浮游生物群落结构最相似。表1各阶段DNA指纹相对于两个主成分的坐标<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例2在武汉市某污水处理厂运行过程中发生了活性污泥起泡膨胀，生物池中出现大量难以除去的泡沫。由于活性污泥膨胀原因较多，故使用本发明检测生物池中厌氧段、缺氧段、曝气段等三处的水样中的浮游生物群落结构，以确定膨胀原因。利用活性污泥膨胀前的水样和膨胀后的水样进行检测，前后时间间隔为15天。1.浮游生物群落的宏基因组DNA提取A直接使用采水器采得生物池中厌氧段(n)、缺氧段(m)、曝气段(IV)等三处的活性污泥悬浮液样品。水样充分混匀，吸取混匀水样转入1.5mL离心管，离心获得沉淀，并去除上清液，转速为10000r/min,时间5min。然后加入灭菌双蒸水，将沉淀打散混匀清洗l次，再离心一次。将所获沉淀悬浮于1.5mL灭菌的TENP缓冲液中，TENP缓冲液含有50mmol/LTris-base;20mmol/LEDTA;100mmol/LNaCl;0.01g/mL聚乙烯吡咯垸酮；pH=10。接着将沉淀悬浮液振荡混匀，离心去除上清液，转速为8000r/min，时间5min。去除上清液，灭菌双蒸水清洗沉淀，然后再次离心，重复清洗沉淀的步骤直至上清液清亮。最后将沉淀悬浮于300nL灭菌双蒸水，置于液氮中lmin，室温(20-25°C)下融解。待样品完全融解后直接加入裂解液，裂解液含有0.5%SDS;10mmol/LTris-Cl,pH=8.0;O.lmol/LEDTA,pH=8.0;100ng/mL蛋白酶K。然后将样品置于水浴箱中50'C温浴裂解过夜。DNA抽提参照使用酚氯仿抽提法，最后加TE缓冲液溶解，-20'C保存。将溶解的DNA原液取lpL稀释50倍，稀释液取5^用0.7%的琼脂糖凝胶进行电泳评估提取效果。2.采用特异性引物污水中浮游生物群落的宏基因组B采用针对16SrDNA和18SrDNA的引物(引物序列见
发明内容P1、P2、P3、P4)进行PCR扩增。PCR扩增采用50iiL的反应体系，其中包含有10XPCRbuffer(不含Mg2十)，5pL;MgCl2溶液，25mmol/L,4dNTP,2mmol/L，2pL;引物P1和P2或P3和P4，10|amol/L,各0.8nL;Taq酶3.0U;模板DNA20ng左右；最后加灭菌双蒸水补足至终体积50nL。采用TouchdownPCR模式，运行条件如下94°C，5min;然后94。C下变性1min;69。C或67"C下退火30s;72。C下延伸lmin,之后每个循环降rc，共10个循环；再进行18或20个扩增循环，扩增参数为94'C下变性lmin;59。C或57。C下退火30s;72。C延伸lmin;最后72。C延伸10min，反应终止于。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳确认目标片段。3.变性梯度凝胶电泳C电泳在INGENYphorU-2system中进行，所用胶浓度为9%聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺配制凝胶的溶液含有丙烯酰胺21.9156g，N，N'-甲叉双丙烯酰胺0.5844g，50XTAE5mL，最后加灭菌双蒸水补足至终体积250mL。进行两次变性梯度凝胶电泳，以获得群落DNA指纹图谱。第一次采用较宽的变性梯度30%一70%,根据结果在第二次调整变性梯度为扩增产物的线性梯度凝胶浓度范围原核生物为35%~65%，真核生物为40%~60%。运行条件在1XTAE缓冲液中，6(TC恒温，120V恒电压条件下运行llh。凝胶用溴化乙锭染色20min，经UVP成像分析系统拍照得到浮游生物群落DNA指纹图谱(见附图7)。4.利用软件对图谱进行分析D比较活性污泥膨胀前后三个采样点的DNA图谱可知，原核生物DNA图谱膨胀前后的差异不大，表示浮游细菌群落结构未发生较大变化，而真核生物DNA图谱则发生了明显改变，尤其是在膨胀后出现数条明显的新条带，这说明真核生物群落发生了明显改变。利用QuantityOne分析浮游生物生物DNA图谱获得光密度值等数据。利用STATISTICA6.0软件中的主成分分析功能对数据进行基于协方差的统计分析，获得两个主成分，其中原核主成分总共能代表数据特征的84.9%,真核主成分总共能代表数据特征的98.7%，计算得不同DNA指纹的坐标(表2)作二维图。利用主成分分析各图谱不同泳道间DNA条带光密度值的差异，由结果(见附图8)可知，原核生物图谱中的条带分散分布，而真核生物图谱中有三条带明显区别于其它聚集在一起的条带。因此，由此推知，此次活性污泥膨胀可能是由丝状真菌引起的生物性膨胀。表2不同DNA指纹条带相对于两个主成分的坐标<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>SEQUENCELISTING<110>中国科学院水生生物研究所<120>—种城市污水中浮游生物群落DNA指纹的分析方法<130>—种城市污水中浮游生物群落DNA指纹的分析方法<150>200810046909.5<151>2008-02-20<160>4<170>Patentlnversion3.1<210><211><212><213>〈400>157DNA人工合成1cgcccgccgcgccccgcgcccggcccgccgcccccgcccccctacgggaggcagcag57〈210〉2〈211〉17<212>DNA<213>人工合成<400〉2attaccgcggctgctgg17<210>3<211>66<212>DNA〈213>人工合成<3cgcccgccgcgccccgcgcccggcccgccgcccccgcccctctgtgatgcccttagatgt60tctggg66<210>4<211>22<212〉DNA<213>人工合成〈400〉4gcggtgtgt3caaagggcsggg2权利要求1.一种城市污水中浮游生物群落DNA指纹的分析方法，其特征在于A.浮游生物群落的宏基因组DNA提取直接使用采水器采得污水水样，水样充分混匀，吸取混匀水样转入离心管，离心获得沉淀，并去除上清液，灭菌双蒸水清洗沉淀，再离心一次，将所获沉淀悬浮于灭菌的TENP缓冲液中，接着将沉淀悬浮液振荡混匀，离心去除上清液，灭菌双蒸水清洗沉淀，然后再次离心，最后将沉淀悬浮于灭菌双蒸水，置于液氮中，室温下融解，待样品完全融解后直接加入裂解液，然后将样品置于水浴箱中温浴裂解过夜，DNA抽提参照使用酚-氯仿抽提法，最后加TE缓冲液溶解，取溶解的DNA进行琼脂糖凝胶电泳评估，其余DNA-20℃保存；B.采用特异性引物扩增污水中浮游生物群落的宏基因组PCR扩增采用50μL的反应体系，其中包含有10×PCRbuffer(不含Mg2+)，5μL；MgCl2溶液，25mmol/L，4μL；dNTP，2mmol/L，2μL；引物P1和P2或P3和P4，10μmol/L，各0.8μL；Taq酶3.0U；模板DNA20ng；最后加灭菌双蒸水补足至终体积50μL，采用TouchdownPCR模式，运行条件如下94℃，5min；然后94℃下变性1min；69℃或67℃下退火30s；72℃下延伸1min，之后每个循环降1℃，共10个循环；再进行18或20个扩增循环，扩增参数为94℃下变性1min；59℃或57℃下退火30s；72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，反应终止于4℃，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳确认目标片段；扩增16SrDNA的引物正向引物P15’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；反向引物P25’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；扩增18SrDNA的引物正向引物P35’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG-3’；反向引物P45’-GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG-3’；C.变性梯度凝胶电泳电泳在INGENYphorU-2system中进行，所用胶浓度为9％聚丙烯酰胺，配制凝胶的溶液含有丙烯酰胺21.9156g，N，N′-甲叉双丙烯酰胺0.5844g，50×TAE5mL，最后加灭菌双蒸水补足至终体积250mL，进行两次变性梯度凝胶电泳，以获得群落DNA指纹图谱，第一次采用较宽的变性梯度30％-70％，第二次根据结果调整变性梯度为以获得更好效果，运行条件在1×TAE缓冲液中，60℃恒温，120V恒电压条件下运行11h，凝胶用溴化乙锭染色，经UVP成像分析系统拍照得到DNA指纹图谱；D.利用软件对图谱进行分析利用QuantityOne软件分析浮游生物群落DNA指纹图谱获得光密度值等数据，利用STATISTICA6.0软件中的主成分分析功能对数据进行统计分析，获得各个不同污水处理阶段间浮游生物群落DNA指纹数据相对于两个主成分的坐标及基于坐标的二维图。全文摘要一种城市污水中浮游生物群落DNA指纹的分析方法，包括采用针对16SrDNA和18SrDNA的引物扩增污水中浮游生物群落的宏基因组，并进行变性梯度凝胶电泳以获得群落DNA指纹图谱。第一步是提取浮游生物群落的宏基因组DNA；第二步是扩增宏基因组的目标条带；第三步是进行DGGE电泳分离以获得浮游生物群落DNA指纹图谱；第四步是利用DNA凝胶软件分析DGGE凝胶照片，利用条带的光密度值来表示条带，然后利用统计学软件对数据进行分析。本方法方便快捷，重复性好，灵敏度高，成本低廉，可应用于城市污水的生物监测。文档编号C12Q1/68GK101260434SQ200810046909公开日2008年9月10日申请日期2008年2月20日优先权日2008年2月20日发明者余育和,冯伟松,翔张,颜庆云申请人:中国科学院水生生物研究所