专利名称：南方豇豆花叶病毒检测用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及南方豇豆花叶病毒检 测用引物。
背景技术：
南方哀工豆花叶病毒附osa/c v/ras， SCPMV)是南 方菜豆花叶病毒属(5b&woWmO重要病毒之一，主要自然寄主为 豆科植物。SCPMV非常稳定，致死温度90-95°C,稀释终点10-5-10—6, 体外存活期最长可达165天，而且该病毒还可通过种子传播。2007 年9月，厦门出入境检验检疫局首次从进口的豇豆种子中截获该病 毒，这也是我国首次从进境种子中检出该病毒。因为国内学者对该 病毒的研究较少，相关资料及防治经验缺少。SCPMV抗原性较强,容易研制出高滴度的特异抗血清,一般可达 1/2048至1/4096。SCPMV与同属的南方菜豆花叶病毒(5bw/2emZ)e朋 wo^n'c Wras, SBMV)有非常密切的血清学关系，因此很难通过血清 学检测将SCPMV和SBMV准确鉴定。近年来已经广泛应用于分子 检测领域的聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction, PCR) 为实现这一 目标提供了解决方案。本发明选择南方豇豆花叶病毒外壳蛋白基因和3'端非翻译区序 列，设计用于RT-PCR检测的特异性引物，通过反转录和PCR扩增 建立了南方虹豆花叶病毒的分子检测方法，反应结束后根据特异性 扩增DNA片段的位置判定结果。发明内容本发明目的在于提供用于南方豆工豆花叶病毒RT-PCR检测的引 物序列。本发明通过分析已报道的SCPMV外壳蛋白基因和3'端非翻译 区序列，设计SCPMV特异性引物。所述的引物对由正向和反向引 物组成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.l&2所示。本发明还进一步给出了应用上述引物的RT-PCR检测方法，其 以样品总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，反应结東后根据特异性 扩增的979 bp DNA片段判定结果。具体地说本发明以样品总RNA为模板，进行RT-PCR反应。 RT-PCR反应包括反转录和PCR扩增两个过程。首先在20pL反应体系进行反转录反应，即在0.2mL的反应管 中加入6.75 DEPC处理水，4 |iL总RNA, 1 SCPMV-RP ( 10 pmol/L), 1 pLdNTP ( 10mmol/L),混勻后于65。C保持5 min，迅 速转移到冰上骤冷5min;然后向反应管中加入2 pL DTT (0.1 mmol/L)， 4pL5x反转录缓冲液，ljiLRNA酶抑制剂(40U/|iL)， 0.25 |iL反转录酶(200 U4iL )， 42。C反应50 min; 72 。C 15 min灭活 反转录酶后获得反转录产物cDNA。PCR反应体系为50pL，即在0.2mL的PCR反应管中加入30.5 DEPC处理水，2 (xL cDNA， 2 pL SCPMV-FP ( 10 (xmol/L )， 2 [iL SCPMV-RP ( 10 |xmol/L), 10xPCR缓冲液5 ^L, 8 pL dNTP (2.5 mmol/L )， 0.5 (iL DNA聚合酶(5 U/(iL )。反应条件为94 °C ， 5 min; 94 °C 30 s, 52 °C 45 s， 72 °C 1 min,共30个循环；72 °C延伸5 min。进一步，还可以将本发明引物及相关试剂组装成试剂盒，以方 便使用。本发明根据南方豆工豆花叶病毒外壳蛋白和3'端非编译区序列设 计引物，该引物特异性好，用于SCPMV的RT-PCR检测。本发明检 测方法具有高特异性和灵敏度，其能够快速准确地判断样品是否有 SCPMV,为进出口安全提供了保证。
图1是应用RT-PCR检测南方豇豆花叶病毒的结果，其中，l为 100 bp ladder, 2为SCPMV阳性对照，3、 4为SCPMV侵染发病 植株，5为健康植株，6为SBMV阳性对照，7为SBMV阳性对照； 1~6为SCPMV特异性RT-PCR产物扩增；7为SBMV特异性引物扩 增。图2是本发明检测方法的灵敏度试验结果，其中，1为100 bp ladder, 2~7为发病样本，50 pL反应体系中总RNA分别为5 |aL, 4 (iL, 3 ^L, 2 (xL, 1 0.5 |xL。
具体实施方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明 的范围。实施例l引物设计和合成根据SCPMV外壳蛋白和3，端非编译区(GenBank No. M23021 )的公开序列，釆用引物设计软件Primer 5.0设计引物，引物 序列为SCPMV-FP (正向)5，國atg tec ggt eta ttc cat c國3， SCPMV國RP (反向)5，- cca ttc gga tag cgc tc -3， 实施例2总RNA的提取1) 取0,2g发病叶片，剪成小段，用液氮研磨成粉末状，移入 灭菌的1.5 ml离心管中，然后加入1 ml的Trizol试剂，剧烈震荡摇 匀；2) 4°C， 12000 g离心10 min以除去不溶的成份，将上清液转入 一新的1.5 ml离心管中；3) 室温下保持5min，加0.2ml氯仿，剧烈振荡15 s,然后在 室温下保持2-15min后，4。C, 12000 g离心15 min;4) 将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇， 颠倒混匀，室温下保持15min;5) 4°C, 12000 g离心10 min， RNA就会在管的侧壁和底部形 成沉淀；6) 倒掉上清液，加入75%的乙醇洗涤沉淀，然后4匸，7500g 离心5min (如沉淀悬浮起来，则用12000g)，弃去乙醇；7) 沉淀于室温下充分干燥后，溶于40pldH20 (DEPC处理) 中，-20°。保存备用。实施例3 RT-PCR扩增方法的建立以总RNA为模板，进行RT-PCR反应。20pL反应体系进行反 转录反应，即在0.2mL的反应管中加入6.75(xLDEPC处理水，4 |iL 总RNA， 1 SCPMV-RP ( 10 pmol/L )， 1 pL dNTP ( 10 mmol/L )， 混匀后于65 °C保持5 min，迅速转移到冰上骤冷5min;然后向反 应管中加入2 ^LDTT (0.1 mmol/L), 4 pL 5x反转录缓冲液，1 RNA酶抑制剂(40U/pL)， 0.25 (iL反转录酶(200 U/VL)， 42""C反 应50 min; 72 °C 15 min灭活反转录酶后获得反转录产物cDNA。PCR反应体系为50pL，即在0.2mL的PCR反应管中加入30.5 DEPC处理水，2 cDNA， 2 SCPMV-FP ( 10 [imol/L ), 2 SCPMV隱RP ( 10 (imol/L), 10xPCR缓冲液5 (iL， 8 jiL dNTP (2.5 mmol/L ), 0.5 DNA聚合酶(5 U/jiL )。反应条件为94 °C, 5 min; 94 °C 30 s， 52 °C 45 s， 72 °C 1 min,共30个循环；72 °C延伸5 min。 实施例4 SCPMVRT-PCR方法的特异性确定以表现症状的豇豆叶片总RNA为模板，以健康叶片和SBMV阳性 材料作为对照，通过RT-PCR进行扩增。反应结束后根据SCPMV特异 性扩增DNA片段(979 bp)的位置判定结果。根据SBMV外壳蛋白和3，端非编译区(GenBankNo.DQ836714) 的公开序列，釆用引物设计软件Primer5.0设计引物，引物序列为SBMV-FP (正向)ATG GCG AAG AGG TTG ACSBMV-RP (反向)ACT TTT GGA TTA CGC TCC ATCSBMV扩增条件与SCPMV完全相同，扩增片段930bp。 试验结果以表现症状的豇豆叶片总RNA为模板，通过RT-PCR检测可观察 到979 bp的特异性扩增片段，而健康对照和SBMV阳性材料则没有特 异性扩增条带的出现。说明建立的RT-PCR对SCPMV具有良好的特异 性，可将SCPMV与其同属的SBMV区分开来。结果见图l。 实施例5 SCPMVRT-PCR方法的灵敏度确定使用l ml的Trizol试剂从0.2 g发病叶片中提取总RNA，用40 (iL DEPC处理水溶解总RNA,进行相对灵敏度检测。在50 ^L反应体系中， 总RNA分别为5 jiL， 4 ^L, 3 (aL, 2 1 ^L， 0.5 |aL。检测结果如图2所 示。表明建立的RT-PCR方法可从0.5 pL总RNA中成功检测出SCPMV。 具有较高的灵敏度，符合检测的要求。序歹U 表〈110〉厦门出入境检验检疫局，中国检验检疫科学研究院 〈120〉南方豇豆花叶病毒检测用引物 〈130〉〈160〉 2〈170〉 Patentln version 3.3<210〉 1〈211〉 19〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈400〉 1atgtccggtc tattccatc 19〈210〉 2 〈211> 17 〈212〉 薩 〈213>人工序列 〈400〉 2ccattcggat agcgctc 1权利要求
1、一种南方豇豆花叶病毒检测用引物，其核苷酸序列为SCPMV-FP5’-atg tcc ggt cta ttc cat c-3’SCPMV-RP5’-cca ttc gga tag cgc tc-3’
2、 一种检测南方豇豆花叶病毒的方法，该方法以样品总RNA 为模板，利用权利要求1所述的引物进行RT-PCR扩增，反应结束 后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果。
3、 如权利要求2所述的方法，其特征在于，RT-PCR的反应过 程中反转录反应的温度为42°C, PCR扩增的退火温度为52°C,延伸 温度为72°C。
4、 含有权利要求1所述南方S工豆花叶病毒检测用引物的试剂盒。
5、 权利要求l所述的引物在南方豆工豆花叶病毒检测中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种南方豇豆花叶病毒检测用引物，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1&2所示。本发明还进一步提供了检测南方豇豆花叶病毒的方法，该方法以样品总RNA为模板，利用特异性引物进行RT-PCR扩增，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，灵敏度高，为进出口安全提供了保证。
文档编号C12Q1/70GK101215611SQ20081005611
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月11日 优先权日2008年1月11日
发明者朱水芳, 林石明, 赵文军, 青 陈, 陈洪俊, 陈红运 申请人:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局;中国检验检疫科学研究院