专利名称：一种浙贝母病毒的组培鳞茎保存方法
技术领域：
本发明涉及植物脱毒组培快繁技术领域，尤其涉及一种浙贝母脱毒组培鳞茎的培养方法。
背景技术：
浙贝母(^Wri//fli7'aA""6wg//Miq.)是百合科贝母属植物，其干燥鳞茎是著名中药材"浙 八味"之一，是化痰止咳、治疗气管炎、感冒等呼吸道疾病的常用良药。浙贝母原产象山县， 故又称象贝母。据传清康熙年间，象山农民开始将贝母从野生转入家种。 一直以来，浙贝母 以磐安、鄞州为主产地，约占全国浙贝母总产量的70%，江苏、江西、上海、湖北和湖南省 亦有栽培。随着种植业结构调整的深入，近年来浙江省浙贝母的栽培面积迅速扩大。但在人工栽培中，浙贝母生产由于采用大鳞茎作种，其繁殖系数极低，约为1.6 1.8倍， 用种量极大，用种500kg/亩，种子地下休眠期长，约4个月。浙贝母如此低的繁殖系数和如 此高的耗种量，导致生产用地和留种地面积的增加及生产成本增加。同时，长期的营养繁殖 导致浙贝母种质严重退化，鳞茎产量和品质下降，已成为严重地阻碍了浙贝母产业的发展的 重要问题之一。近年来的研究揭示，植物病毒的侵染是引起浙贝母种质退化的主要原因之一。 最近我们在浙江磐安县田间对浙贝母进行调査发现，绝大部分植株均表现花叶和斑驳等典型 的马铃薯Y病毒科成员侵染症状。通过对该病毒病原的普通生物学、血清学特征和基因组全 序列的研究，结果表明存在二种新的复合侵染， 一种是浙贝母花叶病毒(Thunberg fritillary mosaic Virus, TFMV)，另一种命名为贝母Y病毒(尸ritj77ar/virus Y， FVY)。 该病毒病害普遍发生是引起浙贝母种质严重退化的重要原因之一。植物病毒的毒源保存特别是纯种毒源保存是抗病毒育种和病毒检测中制备抗血清及病毒 的基础研究必备的材料。传统保存是在温室内将病毒接种到指示植物或寄主植物上定期转接 进行保存，工作量大且效果不理想。由于多种病毒毒源植物在裸露的条件下保存在同一温室 内，易造成混杂；同时需一定的温室面积，适宜的温、湿条件，尤其寒区冬季的取暖，耗费 人力、财力大；另外毒源植物在棚室内，易感染杂菌死亡，导致病毒丢失；同时此法保存的 毒源亦不便携带和利用。因此，迫切需要选择一种更佳的保存方法。发明内容本发明要解决上述现有技术的缺陷，提供一种浙贝母病毒的组培鳞茎保存方法。 本发明目的通过以下技术方案来实现这种浙贝母病毒的组培鳞茎保存方法，按如下步 骤进行1)、浙贝母病毒病原种类的鉴定 (1)取病样取浙贝母花叶病害病样，-8(TC储存备用。(2) 电镜观察取病汁液经负染后，用电镜观察病毒粒子的形态。(3) 病毒种类的鉴定利用RT-PCR检测和鉴定浙贝母的病毒种类。2) 、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为(1) 基本培养基选用MS培养基，蔗糖或白糖20 40g/L，琼脂7 9 g/L， pH5. 6 5. 8;(2) 子鳞茎诱导培养基MS+2,4-D 0.5 1.5mg/L和ZT 1 3mg/L+蔗糖或白糖30g/L;(3) 子鳞茎增殖培养基MS+ BA l 3mg /L和NAA 1 3mg/L+蔗糖或白糖40g/L+盐酸 硫胺素(VB! ) 4mg/L;(4) 壮苗培养基MS+ BA 0. 5 1.5mg /L和NAA 0. 5 1. 5mg/L十蔗糖或白糖40g/L + 盐酸硫胺素(VB! ) 4mg/L;(5) 子鳞茎保存培养基1/2MS+ BA 0.05 0. lmg /L和NAA 0. 05 0. lmg/L+蔗糖或白 糖20g/L+盐酸硫胺素(VB! ) 4mg/L;(6) 鳞茎生长培养基:'MS+ BA 0. l lmg /L和NAA 0. 1 lmg/L+蔗糖或白糖40g/L + 盐酸硫胺素(VBi ) 4mg/L+水解酪蛋白(CH) 500 mg/L;(7) 生根培养基1/2MS+ NAA 0. 1 lmg/L+蔗糖或白糖20g/L+盐酸硫胺素(VB! ) 4mg/L。3) 、浙贝母脱毒组培鳞茎的培养，按如下步骤进行(1) 外植体的选取与灭菌取浙贝母新生长的鳞茎或嫩茎或花梗为外植体，经灭菌处理， 作为脱毒组培用的外植体；(2) 子鳞茎诱导培养将步骤(1)灭菌处理后的鳞茎或嫩茎或花梗在无菌条件下，切 成0.3 0.6cm的切段，接种在子鳞茎诱导培养基上，经1 2个月后，从鳞茎或嫩茎或花梗 外植体上诱导形成子鳞茎；.(3) 子鳞茎增殖培养将步骤(2)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培 养30 45天增殖出子鳞茎；(4) 壮苗培养将步骤(3)增殖的子鳞茎经4'C低温处理l周，然后培养30 45天后 长成壮苗；(5) 热处理将步骤(4)长成的壮苗经35i:、 2 4周处理后，供茎尖培养用。(6) 茎尖培养将步骤(5)热处理过的组培苗在40倍的双筒解剖镜下，摘出0. 2 0. 5mra 大小的带1 2个叶原基的茎尖作为脱毒培养的外植体。(7) 子鳞茎诱导培养将步骤(6)摘出的茎尖接种在子鳞茎诱导培养基上，经1 2个 月后，诱导形成子鳞茎；(8) 子鳞茎增殖培养将步骤(7)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养30 45天增殖出子鳞茎；每隔30 45天，将步骤10)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培 养基上，培养30 45天再增殖出子鳞茎；(9) 子鳞茎生长培养将步骤(8)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养30 45天使鳞茎长大到0. 5 lcm。(10) 生根培养将步彈(9)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，20 30 天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(11) 移栽当步骤(10)的生根子鳞茎苗高生长至3 5cm以上、根长出5根以上时， 移栽基质培养1 2个月至成苗。(12) 定植将步骤(11)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养6 10个月至植株。4) 、病毒ELISA检测应用病毒外壳蛋白基因扩增、克隆和原核表达，以获得大量相关病毒外壳蛋白，用于小 鼠或家兔免疫，制备病毒特异性抗血清，供病毒ELISA检测之用。5) 、病毒摩擦接种按照裘维蕃的方法，将步骤1)分离纯化的病毒通过汁液摩擦接种 到步骤4)检测为无病毒的浙贝母植株上。6) 、病毒的鳞茎保存将步骤5)接种上病毒的浙贝母进行组培鳞茎的培养和保存，按如下步骤进行U)外植体的选取与灭菌取浙贝母新生长的鳞茎或嫩茎或花梗为外植体，经灭菌处理， 作为组培用的外植体；(2) 子鳞茎诱导培养将步骤(1)灭菌处理后的鳞茎或嫩茎或花梗在无菌条件下，切 成0.3 0.6cm的切段，接种在子鳞茎诱导培养基上，经1 2个月后，从鳞茎或嫩茎或花梗 外植体上诱导形成子鳞茎；(3) 子鳞茎增殖培养将步骤(2)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培 养30 45天增殖出子鳞茎；每隔30 45天，将增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上， 培养30 45天再增殖出子鳞茎；(4) 子鳞茎保存将步骤(3)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎保存培养基上，保存培养10 12个月，子鳞茎生长缓慢，鳞茎长大0. 3 0. 6cm;每隔10 12个月，将保存的子鳞茎转接 到新鲜的子鳞茎保存培养基上，继续进行保存培养；(5) 子鳞茎生长培养将步骤(4)保存的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养30 45天使鳞茎长大到0. 5 lcm。(6) 生根培养将步骤(5)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，20 30 天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(7) 移栽当步骤(6)的生根子鳞茎苗高生长至3 5cm以上、根长出5根以上时，移 栽基质培养1 2个月至成苗。(8) 定植将步骤(7)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养6 10个月至植株。 所述的一种浙贝母病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于所述的培养基，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为(1) 基本培养基选用MS基本培养基，蔗糖或白糖20 40g/L，琼脂7 g/L， pH5.8;(2) 子鳞茎诱导培养基MS+2，4-D lmg/L和ZT 2mg/L+蔗糖30g/L;(3) 子鳞茎增殖培养棊MS+BA2mg/L和NAA ^g/L+白糖40g/L+盐酸硫胺素(VBi ) 4mg/L;(4) 壮苗培养基MS+ BA lmg /L和NAA lmg/L +白糖40g/L +盐酸硫胺素(VB! ) 4 mg/L;(5) 子鳞茎保存培养基1/2MS+ BA 0. lmg /L和NAAO. lmg/L +蔗糖或白糖20g/L+盐酸 硫胺素(VB1 ) 4 mg/L;(6) 鳞茎生长培养基MS+ BA 0. 5mg /L和NAA 0. 5mg/L +白糖40g/L +盐酸硫胺素(VB1 ) 4 mg/L+水解酪蛋白(CH) 500 mg/L;(7) 生根培养基1/2MS+ NAA 0.5mg/L+白糖20g/L+盐酸硫胺素(VB! ) 4mg/L。 所述的浙贝母病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于所述的灭菌处理是经体积比75%酒精浸泡0.5 1.0min，再用重量/体积比0.1%升汞溶液灭菌10 15min，最后用无菌水冲洗3 5次。所述的浙贝母病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于，所述的各脱毒组培阶段的培养条 件是，培养温度为23土2。C，光照光强为2000 3000 Lx,光照时间为12h/d。所述的浙贝母病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于，所述的组培鳞茎保存的培养条件 是，培养温度为8 10'C，光照光强为1000 2000Lx，光照时间为10h/d。所述的浙贝母病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于所述的移栽基质由泥炭珍珠岩 蛭石按体积比l: 2: l配制而成。本发明的有益效果是-(1) 传统保存毒源的方法易导致病毒污染混杂及感染杂菌丢失病毒，且保存的毒源不便 携带利用。利用浙贝母脱毒组培鳞茎感染提纯病毒，再进行浙贝母组培鳞茎保存病毒，克服 了传统保存的不足，可防止病毒混杂与丢失，且易提取制备高滴度病毒，为抗病毒育种和病 毒检测抗血清制备中提供高纯度的病毒。(2) 毒源浙贝母鳞茎在花盆栽培及用毒源浙贝母组培苗汁液接种指示植物均表现典型的病毒症状，说明组培鳞茎保存的病毒有侵染力。(3)利用浙贝母组培鳞茎保存病毒便于携带交流，为开展病毒研究提供了方便，降低了 保存成本并提高了保存效果。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。 实施例11) 、浙贝母病毒病原种类的鉴定(1) 取病样取浙贝母花叶病害病样，-8(TC储存备用。(2) 电镜观察取病汁液经负染后，用电镜观察病毒粒子的形态。(3) 病毒种类的鉴定:.利用RT-PCR检测和鉴定浙贝母的病毒种类。2) 、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为(1) 基本培养基选用MS培养基，蔗糖或白糖20 40g/L，琼脂7 9g/L， pH5. 6 5. 8;(2) 子鳞茎诱导培养基MS+2，4-D 0. 5 1.5mg/L和ZT 1 3mg/L+蔗糖或白糖30g/L;(3) 子鳞茎增殖培养基MS+ BA l 3mg /L和NAA 1 3mg/L+蔗糖或白糖40g/L+盐酸 硫胺素(VBi ) 4mg/L;(4) 壮苗培养基MS+ BA 0. 5 1.5mg /L和NAA 0. 5 1. 5mg/L+蔗糖或白糖40g/L + 盐酸硫胺素(VBi ) 4mg/L;(5) 子鳞茎保存培养基1/2MS+ BA 0. 05 0. lmg /L和NAA 0. 05 0. lmg/L +蔗糖或白 糖20g/L+盐酸硫胺素(VB! ) 4mg/L;(6) 鳞茎生长培养基MS+ BA 0.1 lmg /L和NAA 0. 1 lmg/L十蔗糖或白糖40g/L + 盐酸硫胺素(VB! ) 4mg/L+水解酪蛋白(CH) 500 mg/L;(7) 生根培养基1/2MS+ NAA 0. 1 lmg/L+蔗糖或白糖20g/L+盐酸硫胺素(VBi ) 4mg/L。3) 、浙贝母脱毒组培鳞茎的培养，按如下步骤进行(1) 外植体的选取与灭菌取浙贝母新生长的鳞茎或嫩茎或花梗为外植体，经灭菌处理，作为脱毒组培用的外植体；(2) 子鳞茎诱导培养将步骤(1)灭菌处理后的鳞茎或嫩茎或花梗在无菌条件下，切成0. 3 0. 6cm的切段，接种在子鳞茎诱导培养基上，经1 2个月后，从鳞茎或嫩茎或花梗 外植体上诱导形成子鳞茎；'(3) 子鳞茎增殖培养将步骤(2)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养30 45天增殖出子鳞茎；(4) 壮苗培养将步骤(3)增殖的子鳞茎经4'C低温处理l周，然后培养30 45天后 长成壮苗；(5) 热处理将步骤(4)长成的壮苗经35'C、 2 4周处理后，供茎尖培养用。(6) 茎尖培养将步骤'(5)热处理过的组培苗在40倍的双筒解剖镜下，摘出0. 2 0. 5mra 大小的带1 2个叶原基的茎尖作为脱毒培养的外植体。(7) 子鳞茎诱导培养将步骤(6)摘出的茎尖接种在子鳞茎诱导培养基上，经1 2个 月后，诱导形成子鳞茎；(8) 子鳞茎增殖培养将步骤(7)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培 养30 45天增殖出子鳞茎；每隔30 45天，将步骤10)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培 养基上，培养30 45天再增殖出子鳞茎；(9) 子鳞茎生长培养将步骤(8)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养30 45天使鳞茎长大到0. 5 lcm。(10) 生根培养将步骤(9)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，20 30 天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(11) 移栽当步骤(10)的生根子鳞茎苗高生长至3 5cm以上、根长出5根以上时， 移栽基质培养1 2个月至成苗。(12) 定植将步骤(11)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养6 10个月至植株。4) 、病毒ELISA检测应用病毒外壳蛋白基因扩增、克隆和原核表达，以获得大量相关病毒外壳蛋白，用于小 鼠或家兔免疫，制备病毒特异性抗血清，供病毒ELISA检测之用。5) 、病毒摩擦接种按照裘维蕃的方法，将步骤1)分离纯化的病毒通过汁液摩擦接种 到步骤4)检测为无病毒的浙贝母植株上。6) 、病毒的鳞茎保存将步骤5)接种上病毒的浙贝母进行组培鳞茎的培养和保存，按如下步骤进行(1) 外植体的选取与灭菌取浙贝母新生长的鳞茎或嫩茎或花梗为外植体，经灭菌处理， 作为组培用的外植体；(2) 子鳞茎诱导培养将步骤(1)灭菌处理后的鳞茎或嫩茎或花梗在无菌条件下，切成0.3 0.6cm的切段，接种在子鳞茎诱导培养基上，经1 2个月后，从鳞茎或嫩茎或花梗 外植体上诱导形成子鳞茎；(3) 子鳞茎增殖培养将步骤(2)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养30 45天增殖出子鳞茎；每隔30 45天，将增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上， 培养30 45天再增殖出子鳞茎；(4) 子鳞茎保存将步骤(3)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎保存培养基上，保存培养10 12个月，子鳞茎生长缓慢，鳞茎长大0. 3 0. 6cm;每隔10 12个月，将保存的子鳞茎转接 到新鲜的子鳞茎保存培养基上，继续进行保存培养；(5) 子鳞茎生长培养将步骤(4)保存的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养30 45天使鳞茎长大到0.5 lcm。(6) 生根培养将步骤(5)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，20 30 天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(7) 移栽当步骤(6)的生根子鳞茎苗高生长至3 5cm以上、根长出5根以上时，移 栽基质培养1 2个月至成苗。(8) 定植将步骤(7)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养6 10个月至植株。 所述的灭菌处理是经体积比75%酒精浸泡0.5 1.0min，再用重量/体积比0.1%升汞溶液灭菌10 15min，最后用无菌水冲洗3 5次。所述的各脱毒组培阶段的培养条件是，培养温度为23士2。C，光照光强为2000 3000Lx， 光照时间为12h/d。所述的组培鳞茎保存的培养条件是，培养温度为8 10。C，光照光强为1000 2000Lx， 光照时间为10h/d。所述的移栽基质由泥炭珍珠岩蛭石按体积比l: 2: 1配制而成。实施例2:1) 、浙贝母病毒病原种类的鉴定(1) 取病样取浙贝母花叶病害病样，-8(TC储存备用。(2) 电镜观察取病汁液经负染后，用电镜观察病毒粒子的形态。(3) 病毒种类的鉴定利用RT-PCR检测和鉴定浙贝母的病毒种类。2) 、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为(1) 基本培养基选用MS基本培养基，蔗糖或白糖20 40g/L,琼脂7 g/L， pH5.8;(2) 子鳞茎诱导培养基MS+2，4-D lmg/L和ZT 2mg/L+蔗糖30g/L;(3) 子鳞茎增殖培养基MS+ BA 2mg /L和NAA 2mg/L+白糖40g/L +盐酸硫胺素(VB!) 4 mg/L;(4) 壮苗培养基MS+ BA lmg /L和NAA lmg/L +白糖40g/L +盐酸硫胺素(VB! ) 4 mg/L;(5) 子鳞茎保存培养基1/2MS+ BA 0. lmg /L和NAAO. lmg/L +蔗糖或白糖20g/L+盐酸 硫胺素(VBl ) 4 mg/L;(6) 鳞茎生长培养基MS+ BA 0. 5mg /L和NAA 0. 5mg/L +白糖40g/L +盐酸硫胺素(VBl ) 4 mg/L+水解酪蛋白(CH) 500 mg/L;(7) 生根培养基1/2MS+ NAA 0.5mg/L+白糖20g/L+盐酸硫胺素(VB! ) 4mg/L。3) 、浙贝母脱毒组培鳞茎的培养，按如下步骤进行(1) 外植体的选取与灭菌取浙贝母新生长的鳞茎或嫩茎或花梗为外植体，经灭菌处理， 作为脱毒组培用的外植体；(2) 子鳞茎诱导培养将步骤(1)灭菌处理后的鳞茎或嫩茎或花梗在无菌条件下，切 成0.3 0.6cm的切段，接种在子鳞茎诱导培养基上，经1 2个月后，从鳞茎或嫩茎或花梗 外植体上诱导形成子鳞茎；(3) 子鳞茎增殖培养将步骤(2)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培 养30 45天增殖出子鳞茎；(4) 壮苗培养将步骤(3)增殖的子鳞茎经4t低温处理l周，然后培养30 45天后 长成壮苗；(5) 热处理将步骤(4)长成的壮苗经35'C、 2 4周处理后，供茎尖培养用。(6) 茎尖培养将步骤(5)热处理过的组培苗在40倍的双筒解剖镜下，摘出0. 2 0. 5ram 大小的带1 2个叶原基的茎尖作为脱毒培养的外植体。(7) 子鳞茎诱导培养将步骤(6)摘出的茎尖接种在子鳞茎诱导培养基上，经1 2个 月后，诱导形成子鳞茎；'(8) 子鳞茎增殖培养将步骤(7)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培 养30 45天增殖出子鳞茎；每隔30 45天，将步骤10)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培 养基上，培养30 45天再增殖出子鳞茎；(9) 子鳞茎生长培养将步骤(8)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养30 45天使鳞茎长大到0. 5 lcm。(10) 生根培养将步骤(9)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，20 30 天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(11) 移栽当步骤(10)的生根子鳞茎苗高生长至3 5cm以上、根长出5根以上时， 移栽基质培养1 2个月至成苗。(12) 定植将步骤(11)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养6 10个月至植株。4) 、病毒ELISA检测应用病毒外壳蛋白基因扩增、克隆和原核表达，以获得大量相关病毒外壳蛋白，用于小 鼠或家兔免疫，制备病毒特异性抗血清，供病毒ELISA检测之用。5) 、病毒摩擦接种按照裘维蕃的方法，将步骤1)分离纯化的病毒通过汁液摩擦接种到步骤4)检测为无病毒的浙贝母植株上。6) 、病毒的鳞茎保存将步骤5)接种上病毒的浙贝母进行组培鳞茎的培养和保存，按如下步骤进行(1) 外植体的选取与灭菌取浙贝母新生长的鳞茎或嫩茎或花梗为外植体，经灭菌处理，作为组培用的外植体；(2) 子鳞茎诱导培养将步骤(1)灭菌处理后的鳞茎或嫩茎或花梗在无菌条件下，切 成0. 3 0. 6cm的切段，接种在子鳞茎诱导培养基上，经1 2个月后，从鳞茎或嫩茎或花梗 外植体上诱导形成子鳞茎；(3) 子鳞茎增殖培养将步骤(2)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培 养30 45天增殖出子鳞茎;.每隔30 45天，将增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上， 培养30 45天再增殖出子鳞茎；(4) 子鳞茎保存将步骤(3)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎保存培养基上，保存培养10 12个月，子鳞茎生长缓慢，鳞茎长大0. 3 0. 6cm;每隔10 12个月，将保存的子鳞茎转接到新鲜的子鳞茎保存培养基上，继续进行保存培养；(5) 子鳞茎生长培养将步骤(4)保存的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养30 45天使鳞茎长大到0. 5 lcm。(6) 生根培养将步骤(5)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，20 30 天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(7) 移栽当步骤(6)的生根子鳞茎苗高生长至3 5cm以上、根长出5根以上时，移 栽基质培养1 2个月至成苗。(8) 定植将步骤(7)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养6 10个月至植株。 所述的灭菌处理是经体积比75%酒精浸泡0.5 1.0min，再用重量/体积比0.1%升汞溶液灭菌10 15min，最后用无菌水冲洗3 5次。所述的各脱毒组培阶段的培养条件是，培养温度为23土2。C，光照光强为2000 3000 Lx， 光照时间为12h/d。所述的组培鳞茎保存的培养条件是，培养温度为8 1(TC，光照光强为1000 2000Lx， 光照时间为10h/d。所述的移栽基质由泥炭珍珠岩蛭石按体积比l: 2: 1配制而成。试验例(病毒检测)1、 对照材料从田间采集的浙贝母病叶为材料。2、 处理材料以实施例1或实施例2获得的脱毒组培鳞茎和保存的带病毒组培鳞茎为材料。3、 病毒ELISA检测应用病毒外壳蛋白基因扩增、克隆和原核表达，以获得大量相关病毒外壳蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制备病毒特异性抗血清，供病毒ELISA检测之用。4、 检测结果如下表所示处理检测的结果对照阳性保存的带病毒组培鳞茎阳性脱毒组培鳞茎阴性
权利要求
1、一种浙贝母病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于该方法按以下步骤进行1)、浙贝母病毒病原种类的鉴定2)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为(1)基本培养基选用MS培养基，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；(2)子鳞茎诱导培养基MS+2，4-D 0.5～1.5mg/L和ZT 1～3mg/L+蔗糖或白糖30g/L；(3)子鳞茎增殖培养基MS+BA 1～3mg/L和NAA 1～3mg/L+蔗糖或白糖40g/L+盐酸硫胺素(VB1)4mg/L；(4)壮苗培养基MS+BA 0.5～1.5mg/L和NAA 0.5～1.5mg/L+蔗糖或白糖40g/L+盐酸硫胺素(VB1)4mg/L；(5)子鳞茎保存培养基1/2MS+BA 0.05～0.1mg/L和NAA 0.05～0.1mg/L+蔗糖或白糖20g/L+盐酸硫胺素(VB1)4mg/L；(6)鳞茎生长培养基MS+BA 0.1～1mg/L和NAA 0.1～1mg/L+蔗糖或白糖40g/L+盐酸硫胺素(VB1)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L；(7)生根培养基1/2MS+NAA 0.1～1mg/L+蔗糖或白糖20g/L+盐酸硫胺素(VB1)4mg/L；3)、浙贝母脱毒组培鳞茎的培养，按如下步骤进行(1)外植体的选取与灭菌取浙贝母新生长的鳞茎或嫩茎或花梗为外植体，经灭菌处理，作为脱毒组培用的外植体；(2)子鳞茎诱导培养将步骤(1)灭菌处理后的鳞茎或嫩茎或花梗在无菌条件下，切成0.3～0.6cm的切段，接种在子鳞茎诱导培养基上，经1～2个月后，从鳞茎或嫩茎或花梗外植体上诱导形成子鳞茎；(3)子鳞茎增殖培养将步骤(2)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养30～45天增殖出子鳞茎；(4)壮苗培养将步骤(3)增殖的子鳞茎经4℃低温处理1周，然后培养30～45天后长成壮苗；(5)热处理将步骤(4)长成的壮苗经35℃、2～4周处理后，供茎尖培养用；(6)茎尖培养将步骤(5)热处理过的组培苗在40倍的双筒解剖镜下，摘出0.2～0.5mm大小的带1～2个叶原基的茎尖作为脱毒培养的外植体；(7)子鳞茎诱导培养将步骤(6)摘出的茎尖接种在子鳞茎诱导培养基上，经1～2个月后，诱导形成子鳞茎；(8)子鳞茎增殖培养将步骤(7)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养30～45天增殖出子鳞茎；每隔30～45天，将步骤10)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养30～45天再增殖出子鳞茎；(9)子鳞茎生长培养将步骤(8)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养30～45天使鳞茎长大到0.5～1cm；(10)生根培养将步骤(9)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，20～30天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(11)移栽当步骤(10)的生根子鳞茎苗高生长至3～5cm以上、根长出5根以上时，移栽基质培养1～2个月至成苗；(12)定植将步骤(11)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养6～10个月至植株4)、病毒ELISA检测应用病毒外壳蛋白基因扩增、克隆和原核表达，以获得大量相关病毒外壳蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制备病毒特异性抗血清，供病毒ELISA检测之用；5)、病毒摩擦接种按照裘维蕃的方法，将步骤1)分离纯化的病毒通过汁液摩擦接种到步骤4)检测为无病毒的浙贝母植株上；6)、病毒的鳞茎保存将步骤5)接种上病毒的浙贝母进行组培鳞茎的培养和保存，按如下步骤进行(1)外植体的选取与灭菌取浙贝母新生长的鳞茎或嫩茎或花梗为外植体，经灭菌处理，作为组培用的外植体；(2)子鳞茎诱导培养将步骤(1)灭菌处理后的鳞茎或嫩茎或花梗在无菌条件下，切成0.3～0.6cm的切段，接种在子鳞茎诱导培养基上，经1～2个月后，从鳞茎或嫩茎或花梗外植体上诱导形成子鳞茎；(3)子鳞茎增殖培养将步骤(2)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养30～45天增殖出子鳞茎；每隔30～45天，将增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养30～45天再增殖出子鳞茎；(4)子鳞茎保存将步骤(3)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎保存培养基上，保存培养10～12个月，子鳞茎生长缓慢，鳞茎长大0.3～0.6cm；每隔10～12个月，将保存的子鳞茎转接到新鲜的子鳞茎保存培养基上，继续进行保存培养；(5)子鳞茎生长培养将步骤(4)保存的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养30～45天使鳞茎长大到0.5～1cm；(6)生根培养将步骤(5)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，20～30天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(7)移栽当步骤(6)的生根子鳞茎苗高生长至3～5cm以上、根长出5根以上时，移栽基质培养1～2个月至成苗；(8)定植将步骤(7)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养6～10个月至植株。
2、 根据权利要求1所述的浙贝母病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于所述的培养基， 包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为(1) 基本培养基选用MS基本培养基，蔗糖或白糖20 40g/L，琼脂7 g/L， pH5. 8;(2) 子鳞茎诱导培养基MS+2，4-D lmg/L和ZT 2mg/L+蔗糖30g/L;(3) 子鳞茎增殖培养基MS+BA2mg/L和NAA 2mg/L+白糖40g/L+盐酸硫胺素(VB!) 4mg/U(4) 壮苗培养基MS+ BA lmg /L和NAA lmg/L +白糖40g/L +盐酸硫胺素(VB! )4 mg/L;(5) 子鳞茎保存培养基1/2MS+ BA 0. lmg /L和NAAO. lmg/L +蔗糖或白糖20g/L+盐酸 硫胺素(VB1 ) 4 mg/U(6) 鳞茎生长培养基'MS+ BA 0. 5mg /L和NAA 0. 5mg/L +白糖40g/L +盐酸硫胺素(VB1 ) 4 mg/L+水解酪蛋白(CH) 500 mg/L;(7) 生根培养基1/2MS+ NAA 0.5mg/L+白糖20g/L+盐酸硫胺素(VB! ) 4mg/L。
3、 根据权利要求1所述的浙贝母病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于所述的灭菌处 理是经体积比75%酒精浸泡0.5 1.0min，再用重量/体积比0.1%升汞溶液灭菌10 15min, 最后用无菌水冲洗3 5次。
4、 根据权利要求1所述的浙贝母病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于，所述的各脱毒 组培阶段的培养条件是，培养温度为23±2°C ，光照光强为2000 3000 Lx，光照时间为12h/d。
5、 根据权利要求1所述的浙贝母病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于，所述的组培鳞 茎保存的培养条件是，培养温度为8 10'C，光照光强为1000 2000Lx，光照时间为10h/d。
6、 根据权利要求1所述的浙贝母病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于所述的移栽基质由泥炭珍珠岩蛭石按体积比l: 2: 1配制而成。
7、 根据权利要求1所述的浙贝母病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于所述的浙贝母 病毒病原种类的鉴定包括如下步骤(1) 取病样取浙贝母花叶病害病样，-8(TC储存备用；(2) 电镜观察取病汁液经负染后，用电镜观察病毒粒子的形态；(3) 病毒种类的鉴定利用RT-PCR检测和鉴定浙贝母的病毒种类。
全文摘要
本发明涉及一种浙贝母病毒的组培鳞茎保存方法，属植物病毒保存技术领域，包括如下步骤病毒病原种类的鉴定、培养基的配制、脱毒组培鳞茎的培养、病毒ELISA检测、病毒摩擦接种、病毒的鳞茎保存。本发明的优点是利用浙贝母脱毒组培鳞茎感染提纯病毒，再进行浙贝母组培鳞茎保存病毒，克服了传统保存的不足，可防止病毒混杂与丢失，且易提取制备高滴度病毒，为抗病毒育种和病毒检测抗血清制备中提供高纯度的病毒，降低了保存成本并提高了保存效果，并便于携带交流。
文档编号C12N7/00GK101215550SQ20081005930
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月16日 优先权日2008年1月16日
发明者吕永平, 刚 徐, 林 林, 汪一婷, 牟豪杰, 晔 程, 郑红英, 陈剑平 申请人:浙江省农业科学院