专利名称：：一种洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法
技术领域：
：本发明涉及植物脱毒组培快繁
技术领域：
，尤其涉及一种洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法。
背景技术：
：洋水仙(A^r/M")是从欧洲引入我国的水仙新品种的统称，为石蒜科水仙属多年生草本植物。20世纪80年代后进行较大规模的引入,主要用于春季花展，少量盆栽作为年宵花使用。洋水仙与中国水仙相比，具有花大色艳，清香宜人等特点；大部分品种副花冠成喇叭状，且以黄色为多，因而又泛称为"喇叭水仙"或"黄水仙"。洋水仙是优良的园林地被花丼，可以盆栽观赏和切花使用。洋水仙一般通过分蘖的子球进行繁殖，每个母鳞茎可分蘖24个小鳞茎。但是，由于病毒侵染导致逐年退化，鳞茎变小，开花能力下降。浙江省农业科学院从英国引进洋水仙新品种，拟通过脱毒组培技术大量繁殖脱毒鳞茎，以满足国内市场需要，同时克服病毒的危害和蔓延。我们在从英国引进栽培于温室的洋水仙中发现，绝大部分植株均表现花叶和斑驳等症状。通过对病毒病原的普通生物学、血清学特征和基因组全序列的研究，鉴定了侵染水仙的主要线状病毒有4个属的8个成员，包括马铃薯Y病毒属(genusPotyvirus)水仙黄条病毒(Narcissusyellowstripevirus,NYSV),水仙迟季黄化病毒(Narcissuslateseasonyellowsvirus，NLSYV),TK仙退化病毒(Narcissusdegenerationvirus,NDV),虎眼万年青花叶病毒(Ornithogalummosaicvirus,OrMV)，香石竹潜隐病毒属(genusCarlavirus)水仙普通潜隐病毒(Narcissuscommonlatentvirus,NCLV)，水仙无症病毒(Narcissussymptomlessvirus,NSV)，柘橙病毒属(genusMacluravirus)zK仙潜隐病毒(Narcissuslatentvirus，NLV)，马铃薯X病毒属(genusPotexvirus)zK仙花叶病毒(Narcissusmosaicvirus,NMV)等8种病毒。这8种病毒单独或复合侵染是引起洋水仙种质严重退化的重要原因之一。植物病毒的毒源保存特别是纯种毒源保存是抗病毒育种和病毒检测中制备抗血清及病毒的基础研究必备的材料。传统保存是在温室内将病毒接种到指示植物或寄主植物上定期转接进行保存，工作量大且效果不理想。由于多种病毒毒源植物在裸露的条件下保存在同一温室内，易造成混杂；同时需一定的温室面积，适宜的温、湿条件，尤其寒区冬季的取暖，耗费人力、财力大；另外毒源植物在棚室内，易感染杂菌死亡，导致病毒丢失；同时此法保存的毒源亦不便携带和利用。因此，迫切需要选择一种更佳的保存方法。
发明内容本发明要解决上述现有技术的缺陷，提供一种洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法。本发明目的通过以下技术方案来实现这种洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法，按如下步骤进行1)、洋水仙病毒病原种类的鉴定(1)取病样取洋水仙花叶病害病样，-8(TC储存备用。(2)电镜观察取病汁液经负染后，用电镜观察病毒粒子的形态。(3)病毒的提纯利用差速离心和蔗糖阶梯式密度离心的分离法，对感染叶片的有关病毒进行分离、纯化。(4)病毒种类的鉴定利用RT-PCR检测和鉴定洋水仙的病毒种类。2)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为(1)基本培养基:选用MS培养基，蔗糖或白糖2040g/L，琼脂79g/L，pH5.65.8;(2)子鳞茎诱导培养基MS+BA0.1lmg/L和NAA0.050.5mg/L十蔗糖或白糖30g/L;(3)子鳞茎增殖培养基MS+BA0.050.5mg/L和NAA0.1lmg/L+蔗糖或白糖40g/L;(4)子鳞茎保存培养基1/2MS+BA0.010.lmg/L和NAA0.050.5mg/L+庶糖或白糖20g/L;(5)鳞茎生长培养基MS+BA0.010.lmg/L和NAA0.050.5mg/L+蔗糖或白糖40g/L;(6)生根培养基1/2MS+NAA0.10.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L。3)、洋水仙脱毒组培鳞茎的培养，按如下步骤进行(1)鳞茎低温处理鳞茎经8'C低温处理24周。(2)鳞茎萌芽将步骤(1)低温处理过的鳞茎放在25'C培养室内培养12周，使鳞茎快速萌芽。(3)外植体的选取与灭菌取步骤(2)35cm的新芽为外植体，经灭菌处理，作为脱毒组培用的外植体；(4)茎尖培养将步骤(3)灭菌处理后的幼芽在无菌条件下，在40倍的双筒解剖镜下，摘出0.20.3腿大小的带12个叶原基的茎尖，接种在子鳞茎诱导培养基上，经12个月后，从茎尖诱导形成幼芽或子鳞茎；(5)子鳞茎增殖培养将步骤(4)诱导形成的幼芽或子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养3045天增殖出子鳞茎；每隔3045天，将增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养3045天再增殖出子鳞茎；(6)子鳞茎生长培养将步骤(5)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养3045天使鳞茎长大到0.5lcm;(7)生根培养将步骤(6)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，2030天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(8)移栽当步骤(7)的生根子鳞茎苗高生长至35cm以上、根长出5根以上时，移栽基质培养12个月至成苗。(9)定植将步骤(8)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养610个月至植株。4)、病毒ELISA检测应用病毒外壳蛋白基因扩增、克隆和原核表达，以获得大量相关病毒外壳蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制备病毒特异性抗血清，对步骤3)的洋水仙植株进行病毒ELISA检测。5)、病毒摩擦接种按照裘维蕃的方法，将步骤1)分离纯化的病毒通过汁液摩擦接种到步骤4)检测为无病毒的洋水仙植株上。6)、病毒的鳞茎保存将步骤5)接种上病毒的洋水仙进行组培鳞茎的培养和保存，按如下步骤进行(1)鳞茎低温处理鳞茎经8'C低温处理24周。(2)鳞茎萌芽将步骤(1)低温处理过的鳞茎放在25'C培养室内培养12周，使鳞茎快速萌芽。(3)外植体的选取与灭菌取步骤(2)35cm的新芽为外植体，经灭菌处理，作为组培用的外植体；(4)幼芽培养将步骤(3)灭菌处理后的幼芽在无菌条件下，接种在子鳞茎诱导培养基上，经12个月后，诱导形成子鳞茎；(5)子鳞茎增殖培养将步骤(4)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养3045天增殖出子鳞茎；每隔3045天，将增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养3045天再增殖出子鳞茎；(6)子鳞茎保存将步骤(5)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎保存培养基上，子鳞茎生长缓慢，保存培养1012个月，鳞茎长大到0.5lcm;(7)子鳞茎生长培养将步骤(6)保存的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养3045天使鳞茎长出叶片；(8)生根培养将步骤(7)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，2030天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(9)移栽当步骤(8)的生根子鳞茎苗高生长至35cm以上、根长出5根以上时，移栽基质培养12个月至成苗。(10)定植将步骤(9)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养610个月至植株。所述的洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于所述的培养基，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为(1)基本培养基:选用MS培养基，蔗糖或白糖2040g/L，琼脂79g/L，pH5.65.8;(2)子鳞茎诱导培养基MS+BA0.5mg/L和NAA0.lmg/L+蔗糖30g/L;(3)子鳞茎增殖培养基MS+BA0.lmg/L和NAA0.5mg/L+白糖40g/L;(4)子鳞茎保存培养基1/2MS+BAO.Olmg/L和NAA0.05mg/L十蔗糖或白糖20g/L;(5)鳞茎生长培养基MS+BA0,05mg/L和NAA0.lmg/L+白糖40g/L;(6)生根培养基1/2MS+NAA0.25mg/L+白糖20g/L。所述的洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于所述的灭菌处理是经体积比75%酒精浸泡0.51.0min,再用重量/体积比0.1%升汞溶液灭菌1015min，最后用无菌水冲洗35次。所述的洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于，所述的各脱毒组培阶段的培养条件是，培养温度为25土2'C，光照光强为IOOO2500Lx，光照时间为10h/d。所述的洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于，所述的组培鳞茎保存的培养条件是，培养温度为10土2'C，光照光强为5001000Lx，光照时间为8h/d。所述的洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于所述的移栽基质由泥炭珍珠岩蛭石按体积比l:2:2配制而成。本发明的有益效果是(1)传统保存毒源的方法易导致病毒污染混杂及感染杂菌丢失病毒，且保存的毒源不便携带利用。利用洋水仙脱毒组培鳞茎感染提纯病毒，再进行洋水仙组培鳞茎保存病毒，克服了传统保存的不足，可防止病毒混杂与丢失，且易提取制备高滴度病毒，为抗病毒育种和病毒检测抗血清制备中提供高纯度的病毒。(2)毒源洋水仙鳞茎在花盆栽培及用毒源洋水仙组培苗汁液接种指示植物均表现典型的病毒症状，说明组培鳞茎保存的病毒有侵染力。(3)利用洋水仙组培鳞茎保存病毒便于携带交流，为开展病毒研究提供了方便，降低了保存成本并提高了保存效果。具体实施方式通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。实施例1:1)、洋水仙病毒病原种类的鉴定(1)取病样取洋水仙花叶病害病样，-8(TC储存备用。(2)电镜观察取病汁液经负染后，用电镜观察病毒粒子的形态。(3)病毒的提纯利用差速离心和蔗糖阶梯式密度离心的分离法，对感染叶片的有关病毒进行分离、纯化。(4)病毒种类的鉴定利用RT-PCR检测和鉴定洋水仙的病毒种类。2)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为(1)基本培养基选用MS培养基，蔗糖或白糖2040g/L，琼脂79g/L，pH5.65.8;(2)子鳞茎诱导培养基MS+BA0.llmg/L和NAA0.050.5mg/L十蔗糖或白糖30g/L;(3)子鳞茎增殖培养基MS+BA0.050.5mg/L和NAA0.1lmg/L十蔗糖或白糖40g/L;(4)子鳞茎保存培养基1/2MS+BA0.010.lmg/L和NAA0.050.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L;(5)鳞茎生长培养基^5+BA0.010.lmg/L和NAA0.050.5mg/L+蔗糖或白糖40g/L;(6)生根培养基1/2.MS+NAA0.10.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L。3)、洋水仙脱毒组培鳞茎的培养，按如下步骤进行(1)鳞茎低温处理鳞茎经8'C低温处理24周。(2)鳞茎萌芽将步骤(1)低温处理过的鳞茎放在25'C培养室内培养12周，使鳞茎快速萌芽。(3)外植体的选取与灭菌取步骤(2)35cm的新芽为外植体，经灭菌处理，作为脱毒组培用的外植体；(4)茎尖培养将步骤(3)灭菌处理后的幼芽在无菌条件下，在40倍的双筒解剖镜下，摘出0.20.3mm大小的带12个叶原基的茎尖，接种在子鳞茎诱导培养基上，经12个月后，从茎尖诱导形成幼芽或，鳞茎；(5)子鳞茎增殖培养将步骤(4)诱导形成的幼芽或子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养3045天增殖出子鳞茎；每隔3045天，将增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养3045天再增殖出子鳞茎；(6)子鳞茎生长培养将步骤(5)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养3045天使鳞茎长大到0.5lcm;(7)生根培养将步骤(6)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，2030天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(8)移栽当步骤(7)的生根子鳞茎苗高生长至35cm以上、根长出5根以上时，移栽基质培养12个月至成苗。(9)定植将步骤(8)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养610个月至植株。4)、病毒ELISA检测应用病毒外壳蛋白基因扩增、克隆和原核表达，以获得大量相关病毒外壳蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制备病毒特异性抗血清，对步骤3)的洋水仙植株进行病毒ELISA检测。5)、病毒摩擦接种按照裘维蕃的方法，将步骤1)分离纯化的病毒通过汁液摩擦接种到步骤4)检测为无病毒的洋水仙植株上。6)、病毒的鳞茎保存将步骤5)接种上病毒的洋水仙进行组培鳞茎的培养和保存，按如下步骤进行(1)鳞茎低温处理鳞茎经8。C低温处理24周。(2)鳞茎萌芽将步骤(1)低温处理过的鳞茎放在25-C培养室内培养12周，使鳞茎快速萌芽。(3)外植体的选取与灭菌取步骤(2)35cm的新芽为外植体，经灭菌处理，作为组培用的外植体；(4)幼芽培养将步骤(3)灭菌处理后的幼芽在无菌条件下，接种在子鳞茎诱导培养基上，经12个月后，诱导形成子鳞茎；(5)子鳞茎增殖培养:'将步骤(4)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养3045天增殖出子鳞茎；每隔3045天，将增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养3045天再增殖出子鳞茎；(6)子鳞茎保存将步骤(5)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎保存培养基上，子鳞茎生长缓慢，保存培养1012个月，鳞茎长大到0.5lcm;(7)子鳞茎生长培养将步骤(6)保存的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养3045天使鳞茎长出叶片；(8)生根培养将步骤(7)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，2030天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(9)移栽当步骤(8)的生根子鳞茎苗高生长至35cm以上、根长出5根以上时，移栽基质培养12个月至成苗。(10)定植将步骤(9)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养610个月至植株。所述的灭菌处理是经体积比75%酒精浸泡0.51.0min，再用重量/体积比0.1%升汞溶液灭菌1015min，最后用无菌水冲洗35次。所述的各脱毒组培阶段的培养条件是，培养温度为25土2X:，光照光强为10002500Lx，光照时间为10h/d。所述的组培鳞茎保存的培养条件是，培养温度为10土2'C，光照光强为5001000Lx，光照时间为8h/d。所述的移栽基质由泥炭珍珠岩蛭石按体积比l:2:2配制而成。实施例2:1)、洋水仙病毒病原种类的鉴定(1)取病样取洋水仙花叶病害病样，-8(TC储存备用。(2)电镜观察取病汁液经负染后，用电镜观察病毒粒子的形态。(3)病毒的提纯利用差速离心和蔗糖阶梯式密度离心的分离法，对感染叶片的有关病毒进行分离、纯化。(4)病毒种类的鉴定利用RT-PCR检测和鉴定洋水仙的病毒种类。2)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为(1)基本培养基:选用MS培养基，蔗糖或白糖2040g/L，琼脂79g/L，pH5.65.8;(2)子鳞茎诱导培养基MS+BA0.5mg/L和NAA0.lrag/L+蔗糖30g/L;(3)子鳞茎增殖培养基MS+BA0.lmg/L和NAA0.5mg/L+白糖40g/L;(4)子鳞茎保存培养基1/2MS+BA0.Olmg/L和NAA0.05mg/L+蔗糖或白糖20g/L;(5)鳞茎生长培养基MS+BA0.05mg/L和NAA0.lmg/L+白糖40g/L;(6)生根培养基1/2MS+NAA0.25mg/L+白糖20g/L。3)、洋水仙脱毒组培鳞茎的培养，按如下步骤进行(1)鳞茎低温处理鳞茎经8'C低温处理24周。(2)鳞茎萌芽将步骤(1)低温处理过的鳞茎放在25-C培养室内培养12周，使鳞茎快速萌芽。(3)外植体的选取与灭菌取步骤(2)35cm的新芽为外植体，经灭菌处理，作为脱毒组培用的外植体；(4)茎尖培养将步骤(3)灭菌处理后的幼芽在无菌条件下，在40倍的双筒解剖镜下，摘出0.20.3mm大小的带l2个叶原基的茎尖，接种在子鳞茎诱导培养基上，经12个月后，从茎尖诱导形成幼芽或.子鳞茎；(5)子鳞茎增殖培养将步骤(4)诱导形成的幼芽或子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养3045天增殖出子鳞茎；每隔3045天，将增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养3045天再增殖出子鳞茎；(6)子鳞茎生长培养将步骤(5)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养3045天使鳞茎长大到0.5lcm;(7)生根培养将步骤(6)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，2030天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(8)移栽当步骤(7)的生根子鳞茎苗高生长至35cm以上、根长出5根以上时，移栽基质培养12个月至成苗。(9)定植将步骤(8)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养610个月至植株。4)、病毒ELISA检测应用病毒外壳蛋白基因扩增、克隆和原核表达，以获得大量相关病毒外壳蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制备病毒特异性抗血清，对步骤3)的洋水仙植株进行病毒ELISA检测。5)、病毒摩擦接种按照裘维蕃的方法，将步骤1)分离纯化的病毒通过汁液摩擦接种到步骤4)检测为无病毒的洋水仙植株上。6)、病毒的鳞茎保存将步骤5)接种上病毒的洋水仙进行组培鳞茎的培养和保存，按如下步骤进行(1)鳞茎低温处理鳞茎经8'C低温处理24周。(2)鳞茎萌芽将步骤(1)低温处理过的鳞茎放在25T:培养室内培养12周，使鳞茎快速萌芽。(3)外植体的选取与灭菌取步骤(2)35cm的新芽为外植体，经灭菌处理，作为组培用的外植体；(4)幼芽培养将步骤(3)灭菌处理后的幼芽在无菌条件下，接种在子鳞茎诱导培养基上，经12个月后，诱导形成子鳞茎；(5)子鳞茎增殖培养将步骤(4)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养3045天增殖出子鳞茎；每隔3045天，将增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养3045天再增殖出子鳞茎；(6)子鳞茎保存将步骤(5)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎保存培养基上，子鳞茎生长缓慢，保存培养1012个月，鳞茎长大到0.5lcm;(7)子鳞茎生长培养将步骤(6)保存的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养3045天使鳞茎长出叶片；(8)生根培养将步骤(7)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，2030天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(9)移栽当步骤(8)的生根子鳞茎苗高生长至35cm以上、根长出5根以上时，移栽基质培养12个月至成苗。(10)定植将步骤(9)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养610个月至植株。所述的灭菌处理是经体积比75%酒精浸泡0.51.0min，再用重量/体积比0.1%升汞溶液灭菌1015min，最后用无菌水冲洗35次。所述的各脱毒组培阶段的培养条件是，培养温度为25土2。C,光照光强为10002500Lx，光照时间为10h/d。所述的组培鳞茎保存的培养条件是，培养温度为10土2'C，光照光强为5001000Lx,光照时间为8h/d。所述的移栽基质由泥炭珍珠岩蛭石按体积比l:2:2配制而成。试验例(病毒检测)1、对照材料从田间采集的洋水仙病叶为材料。2、处理材料以实施例1或实施例2获得的脱毒组培鳞茎和保存的带病毒组培鳞茎为材料。3、病毒ELISA检测应用病毒外壳蛋白基因扩增、克隆和原核表达，以获得大量相关病毒外壳蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制备病毒特异性抗血清，供病毒ELISA检测之用。4、检测结果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求1、一种洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于该方法按以下步骤进行1)、洋水仙病毒病原种类的鉴定2)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为(1)基本培养基选用MS培养基，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；(2)子鳞茎诱导培养基MS+BA0.1～1mg/L和NAA0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；(3)子鳞茎增殖培养基MS+BA0.05～0.5mg/L和NAA0.1～1mg/L+蔗糖或白糖40g/L；(4)子鳞茎保存培养基1/2MS+BA0.01～0.1mg/L和NAA0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L；(5)鳞茎生长培养基MS+BA0.01～0.1mg/L和NAA0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖40g/L；(6)生根培养基1/2MS+NAA0.1～0.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L；3)、洋水仙脱毒组培鳞茎的培养，按如下步骤进行(1)鳞茎低温处理鳞茎经8℃低温处理2～4周；(2)鳞茎萌芽将步骤(1)低温处理过的鳞茎放在25℃培养室内培养1～2周，使鳞茎快速萌芽；(3)外植体的选取与灭菌取步骤(2)3～5cm的新芽为外植体，经灭菌处理，作为脱毒组培用的外植体；(4)茎尖培养将步骤(3)灭菌处理后的幼芽在无菌条件下，在40倍的双筒解剖镜下，摘出0.2～0.3mm大小的带1～2个叶原基的茎尖，接种在子鳞茎诱导培养基上，经1～2个月后，从茎尖诱导形成幼芽或子鳞茎；(5)子鳞茎增殖培养将步骤(4)诱导形成的幼芽或子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养30～45天增殖出子鳞茎；每隔30～45天，将增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养30～45天再增殖出子鳞茎；(6)子鳞茎生长培养将步骤(5)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养30～45天使鳞茎长大到0.5～1cm；(7)生根培养将步骤(6)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，20～30天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(8)移栽当步骤(7)的生根子鳞茎苗高生长至3～5cm以上、根长出5根以上时，移栽基质培养1～2个月至成苗；(9)定植将步骤(8)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养6～10个月至植株；4)、病毒ELISA检测应用病毒外壳蛋白基因扩增、克隆和原核表达，以获得大量相关病毒外壳蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制备病毒特异性抗血清，对步骤3)的洋水仙植株进行病毒ELISA检测；5)、病毒摩擦接种按照裘维蕃的方法，将步骤1)分离纯化的病毒通过汁液摩擦接种到步骤4)检测为无病毒的洋水仙植株上；6)、病毒的鳞茎保存将步骤5)接种上病毒的洋水仙进行组培鳞茎的培养和保存，按如下步骤进行(1)鳞茎低温处理鳞茎经8℃低温处理2～4周；(2)鳞茎萌芽将步骤(1)低温处理过的鳞茎放在25℃培养室内培养1～2周，使鳞茎快速萌芽；(3)外植体的选取与灭菌取步骤(2)3～5cm的新芽为外植体，经灭菌处理，作为组培用的外植体；(4)幼芽培养将步骤(3)灭菌处理后的幼芽在无菌条件下，接种在子鳞茎诱导培养基上，经1～2个月后，诱导形成子鳞茎；(5)子鳞茎增殖培养将步骤(4)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养30～45天增殖出子鳞茎；每隔30～45天，将增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养30～45天再增殖出子鳞茎；(6)子鳞茎保存将步骤(5)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎保存培养基上，子鳞茎生长缓慢，保存培养10～12个月，鳞茎长大到0.5～1cm；(7)子鳞茎生长培养将步骤(6)保存的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养30～45天使鳞茎长出叶片；(8)生根培养将步骤(7)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，20～30天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(9)移栽当步骤(8)的生根子鳞茎苗高生长至3～5cm以上、根长出5根以上时，移栽基质培养1～2个月至成苗；(10)定植将步骤(9)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养6～10个月至植株。2、根据权利要求1所述的洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于所述的培养基，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为-(1)基本培养基选用MS培养基，蔗糖或白糖2040g/L，琼脂79g/L，pH5.65.8;(2)子鳞茎诱导培养基MS+BA0.5mg/L和NAA0.lmg/L+蔗糖30g/L;(3)子鳞茎增殖培养基MS+BA0.lmg/L和NAA0.5mg/L+白糖40g/L;(4)子鳞茎保存培养基1/2MS+BAO.Olmg/L和NAA0.05mg/L十庶糖或白糖20g/L;(5)鳞茎生长培养基MS+BA0.05mg/L和NAA0.lmg/L+白糖40g/L;(6)生根培养基1/2MS+NAA0.25mg/L+白糖20g/L。3、根据权利要求1所述的洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于所述的灭菌处理是经体积比75%酒精浸泡0.51.0min，再用重量/体积比0.1%升汞溶液灭菌1015min，最后用无菌水冲洗35次。4、根据权利要求1所述的洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于，所述的各脱毒组培阶段的培养条件是，培养温度为25士2'C，光照光强为10002500Lx，光照时间为10h/d。5、根据权利要求1所述的洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于，所述的组培鳞茎保存的培养条件是，培养温度为10士2'C，光照光强为5001000Lx，光照时间为8h/d。6、根据权利要求1所述的洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于所述的移栽基质由泥炭珍珠岩蛭石按体积比h2:2配制而成。7、根据权利要求1所述的洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于所述的洋水仙病毒病原种类的鉴定包括如下步骤(1)取病样取洋水仙花叶病害病样，-S(TC储存备用；(2)电镜观察取病汁液经负染后，用电镜观察病毒粒子的形态；(3)病毒的提纯利用差速离心和蔗糖阶梯式密度离心的分离法，对感染叶片的有关病毒进行分离、纯化；(4)病毒种类的鉴定利用RT-PCR检测和鉴定洋水仙的病毒种类。全文摘要本发明涉及一种洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法，属植物病毒保存
技术领域：
，包括如下步骤病毒病原种类的鉴定、培养基的配制、脱毒组培鳞茎的培养、病毒ELISA检测、病毒摩擦接种、病毒的鳞茎保存。本发明的优点是利用洋水仙脱毒组培鳞茎感染提纯病毒，再进行洋水仙组培鳞茎保存病毒，克服了传统保存的不足，可防止病毒混杂与丢失，且易提取制备高滴度病毒，为抗病毒育种和病毒检测抗血清制备中提供高纯度的病毒，降低了保存成本并提高了保存效果，并便于携带交流。文档编号C12N7/00GK101215551SQ20081005930公开日2008年7月9日申请日期2008年1月16日优先权日2008年1月16日发明者吕永平,刚徐,林林,汪一婷,牟豪杰,晔程,郑红英,陈剑平申请人:浙江省农业科学院