专利名称：氨基酸材料的非病毒基因载体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一类非病毒基因治疗的载体，具体是涉及一类修饰性氨基酸材料作为非病毒 基因治疗的载体。
技术背景聚氨基酸材料由于可生物降解性，低毒性等特点，作为非病毒性基因载体材料而被广泛地 研究。其中研究较多的有聚赖氨酸，聚天冬氨酸，聚鸟氨酸，聚谷氨酸等。聚氨基酸材料具 有相对明确的分子结构，这是因为它是氨基酸单体通过分子间脱水形成肽键而得到的。聚赖 氨酸在生理条件下带有正电荷，可以通过静电吸引结合DNA。聚天冬氨酸具有酰亚胺环状结 构，可被碱性试剂开环，因此可通过开环反应接合各种功能性的基团，具有很强的改造性， 从而增加新的功能。基因药物治疗是近二十年来兴起的新型治疗方法，其基本策略是将外源基因通过各类载 体导入目的细胞并得到有效表达，从而达到治疗疾病的目的。在基因药物释放体系中，载体 的研究始终是研究的热点。目前普遍应用的病毒载体介导系统，虽然其有很高的基因转染效 率，但高的细胞毒性、较低的靶向性、DNA携带能力的限制性、生产包装及高价格等问题限 制了病毒载体的应用范围，尤其是1999年，美国基因治疗临床实验因使用腺病毒载体导致 "Jesse Gelsinger"死亡事件，使研究者在病毒类载体的临床使用上更为谨慎。相反，非病 毒性转基因载体具有免疫反应低，安全性能高，易于人工合成等特点，在基因药物的研究中 曰益受到重视。随着人类基因组框架图的解析成功，更多的基因药物从实验室研究所阶段进 入临床实用阶段。非病毒型基因载体存在着毒性、生物相容性、降解性等问题，目前有一种合成的材料聚 乙烯亚胺(PEI)，实验发现分子量22000—25000的聚乙烯亚胺转染效率非常高，但是存在毒 性和降解性的问题，小分子量(600， 1200， 2000)的聚乙烯亚胺毒性小，易于在生物体内代 谢，但是几乎没有转染效率。Kim课题组报导了 (Kazuyoshi Sagara and Sung Wan KimJournal of Controlled Release, Volume 79， Issues 1-3， 19 February 2002， Pages 271-281)用低分子量聚乙烯亚胺修饰 聚乙二醇提高聚乙烯亚胺的转染效率，降低聚乙烯亚胺的毒性；ChoiYH课题组报导(ChoiY H, Liu F, Choi J S, et al. Human Gene Therapy, Volume 10， Issues 16， November 1999, Pages 2657-2665)聚L 一赖氨酸可通过静电吸引与DNA自动结合。由于其良好的DNA压縮能力，可以有效地保护 DNA防止被核酸酶降解，已经被广泛地应用于基因载体材料。Mousazadeh M (Mousazadeh M,Palizban A， Saiehi R， Saiehi M. Journal of Drug Targeting, Volume 15， Issues 3, 2007, Pages 226-230)报导了聚赖氨酸结合转脂蛋白-E-衍生肽，作为针对脑细胞的基因载体材料。 发明内容本发明目的是提供一类新型的非病毒基因治疗的载体。本发明以聚氨基酸材料为骨架，用 氨基丙醇等碱性试剂对聚氨基酸环进行开环，然后用特殊的连接试剂进行修饰，连接不同分 子量的聚乙烯亚胺作为新型非病毒基因治疗的载体。其优点在于修饰后的聚氨基酸材料具有 可生物降解、低毒性和高的基因转染效率。本发明提供的聚氨基酸的修饰方法，总的发明构思是由氨基酸单体经縮聚反应得到聚 氨基酸，经氨基醇试剂对聚氨基酸侧基开环后，再用连接试剂进行结构修饰，通过活化氨基 醇上的活泼羟基，连接聚乙烯亚胺(PEI)，经透析冰冻干燥，获得聚氨基酸一氨基醇与聚乙 烯亚胺的功能性复合材料。反应式如下<formula>formula see original document page 6</formula>反应式中n为氨基酸单元结构数量，其大小与聚氨基酸的分子量相关。 反应式中ml， m2为开环单元结构的个数，ml和m2的数值与聚氨基酸-氨基醇聚合物的分子 量有关，m,为PEI中伯氨基单元的数量，m2为仲氨基单元的数量，ra,和ni2的数值与PEI的分子 量有关,X为氨基醇试剂中亚甲基个数，数值乂=2-12。反应式中结构(l)为聚氨基酸，结构(2)为用氨基醇试剂开环后的聚氨基酸-氨基醇聚合 物，结构(3)为用活化试剂R活化的聚氨基酸-氨基醇聚合物，结构(4)为最终产物聚氨基 酸-氨基醇-PEI聚合物。本发明提供的聚氨基酸材料的修饰方法，包括如下步骤1) 聚氨基酸材料的合成氨基酸单体在磷酸催化下，在160-180°C、真空减压到3mmHg条件 下，脱水反应2小时，移去真空泵，趁热加入N，N—二甲基甲酰胺(DMF)，使固体物充分 溶解，将反应液逐滴加入到蒸馏水中，得白色片状物沉淀，过滤，用蒸馏水洗至中性，干 燥，得到聚氨基酸材料。2) 聚氨基酸材料连接侧基得到开环的聚氨基酸将制备的聚氨基酸材料，溶于N，N—二甲基 甲酰胺中，在冰浴下滴加氨基醇试剂，室温反应3-4小时，将反应液逐滴加入到正丙醇中， 析出沉淀，用丙酮洗涤，抽滤得固体，固体置于圆底烧瓶中，用水泵抽3小时，再用油泵 抽至完全千燥，得到聚氨基酸一氨基醇聚合物。3) 对开环的聚氨基酸进行功能基团的修饰取干燥的聚氨基酸一氨基醇聚合物溶于二甲基亚 砜中，将活化试剂R溶于二甲基亚砜中，在氮气保护下，加入聚氨基酸一氨基醇聚合物溶 液中，边加边搅拌，加完后在室温下反应3小时，获得活化的聚氨基酸一氨基醇聚合物溶 液；4) 将聚乙烯亚胺溶于二甲基亚砜中，加入三乙胺作为催化剂，避光、氮气保护、室温下加入 到活化的聚氨基酸一氨基醇聚合物溶液中，边底加边搅拌，3-4小时内加完，加完后避光、 室温下继续反应12小时，将反应完成的溶液经透析、冰冻、干燥、获得聚氨基酸一氨基醇 -聚乙烯亚胺的功能性复合材料。本发明所述的聚氨基酸为聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚赖氨酸、天冬氨酸一谷氨酸共聚 物、天冬氨酸一赖氨酸共聚物、谷氨酸一赖氨酸共聚物中仟一种。分子量分布为10000-1100000。本发明所述的氨基醇试剂为氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇、氨基戊醇、氨基己醇、氨基庚醇、氨基辛醇、氨基壬醇、氨基癸醇中任一种。本发明所述的活化羟基的连接剂为N，N'-羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、氯甲酸酯、羰 基咪唑、N,N'-二琥拍酰亚胺基硫酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯中任一种。本发明所述聚乙烯亚胺分子量为432Da (直链型)、600Da、 1200Da、 2000Da、 25kDa的聚乙烯亚胺中任一种。本发明所述的连接剂用量与聚氨基酸一侧基聚合物重量比为0. 5—2倍量。 本发明所述的聚氨基酸一侧基聚合物用量与二甲基亚砜的重量体积比为10-20倍量。 本发明所述的连接剂用量与二甲基亚砜的重量体积比为3-10倍量。 本发明所述的催化剂为三乙胺,用量与小分子量聚乙烯亚胺重量体积比为0.01-0.05倍且 里。本发明的技术效果本发明采用的聚氨基酸材料由于可生物降解性，低毒性等特点，作为非病毒性基因载体 材料而被广泛地研究。它具有相对明确的分子结构，这是因为它是氨基酸单体通过分子间脱水形成肽键而得到的。聚赖氨酸在生理条件下带有正电荷，可以通过静电吸引结合DNA。聚 天冬氨酸具有酰亚胺环状结构，可被碱性试剂开环，因此可通过开环反应接合各种功能性的 基团，具有很强的改造性，从而增加新的功能。本发明采用的聚乙烯亚胺PEI，具有3种不同的氨基形式，形成了不同的缓冲体系，氨 基的存在基本作用是结合DNA，扩展的功能是在携带DNA进入细胞时不同的氨基组合成不同 的缓冲对，能保护DNA免遭细胞质中的溶酶体降解。本发明聚氨基酸一侧基聚合物用连接剂处理后，连接聚乙烯亚胺。所用的连接剂具有特 殊的结构，能修饰侧基上的羟基，活化后连接的聚乙烯亚胺保留原先的结构和功能。本发明对经縮聚反应得到的聚氨基酸进行结构修饰，该修饰方法优点在于简单高效，回 收率高，经活化的羟基可以连接任何具有活性氢分子的化合物，因此对修饰性聚氨基酸材料 的作用扩展具有非常重要的意义。经活化侧基上的活泼羟基后，连接聚乙烯亚胺，赋予聚氨 基酸新的生物学功能，使其具有低毒性，高基因转染效率，且可生物降解。成为非病毒性基 因载体材料中的一类高分子化合物。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行样细的描述，但不限于实施例所公开的内容。实施例l:以聚天冬氨酸为例。1)聚天冬氨酸一亚氨基丙醇聚合物的制备10g天冬氨酸在85%磷酸的催化下，在160-18(TC、真空减压到3mmHg条件下，脱水反应 2h。移去真空泵，趁热加入N,N—二甲基甲酰胺(DMF)，使固体物充分溶解，将反应液 逐滴加入到500毫升蒸馏水中，得白色片状物沉淀，过滤，用蒸馏水洗至中性，干燥， 得到聚氨基酸6.8克。*取聚天冬氨酸3克，溶解于20毫升DMF中，冷却，冰浴下滴加7毫升3-氨基丙醇，'室温搅拌反应4小时，将反应液逐滴加入到100毫升正丙醇中，析出沉淀，用丙酮洗涤，抽 滤得固体。固体置于圆底烧瓶中，用水泵抽3h，再用油泵抽至完全干燥，得到聚天冬氨 酸一亚氨基丙醇聚合物。 2)聚天冬氨酸一亚氨基丙醇聚合物的修饰*取步骤1中得到的聚天冬氨酸一亚氨基丙醇聚合物0. 5克，溶解于6毫升DMF中。取N，N，-羰基二咪唑0. 7克，溶解于2. 5毫升二甲基亚砜(DMSO)中，在氮气保护、避光条件下加 入至聚合物溶液中，边加边搅拌，反应3小时，得到活化的聚合物。*取分子量600的聚乙烯亚胺1.75克，溶解于6毫升的DMS0中，加入0. 2tnl三乙胺作为 催化剂，避光、氮气保护下加入到活化的聚合物溶液中，边加边搅拌，3小时内加完，加 完后继续避光反应12小时。*将反应完成的溶液装入截留分子量为15000的透析袋中，透析48小时，取袋内溶液冰冻 干燥。实施例2:以谷氨酸为例，合成聚谷氨酸，合成过程与实例l相同。取聚谷氨酸3克，溶于18毫升DMF中，冷却，冰浴下滴加5毫升3-氨基乙醇，室温搅拌 反应4小时，将反应液逐滴加入到100毫升正丙醇中，析出沉淀，用丙酮洗涤，抽滤得固体。 固体置于圆底烧瓶中，用水泵抽3h,再用油泵抽至完全干燥，得到聚谷氨酸一亚氨基乙醇聚 合物。取聚谷氨酸一亚氨基乙醇聚合物0.5克，溶解于6毫升二甲基亚砜(DMSO)中。取苯并三 唑碳酸酯0.8克，溶解于4毫升DMS0中，在氮气保护、避光条件下加入至聚合物溶液中，边 加边搅拌，反应3小时，得到活化的聚合物。取分子量600的聚乙烯亚胺1.7克，溶解于6毫升的DMS0中，加入0. 2ml三乙胺作为催 化剂，避光、氮气保护下加入到活化的聚合物溶液中，边加边搅拌，3小时内加完，加完后 继续避光反应12小时。将反应完成的溶液装入截留分子量为15000的透析袋中，透析48小时，取袋内溶液冰冻干燥。 实施例3:以赖氨酸为例，合成聚赖氨酸，合成过程与实例l相同。取聚赖氨酸3克，溶于18毫升DMF中，冷却，冰浴下滴加8毫升3-氨基戊醇，室温搅拌 反应4小时，将反应液逐滴加入到100毫升正丙醇中，析出沉淀，用丙酮洗涤，抽滤得固体。固体置于圆底烧瓶中，用水泵抽3h，再用油泵抽至完全干燥，得到聚赖氨酸一亚氨基戊醇聚合物。取聚赖氨酸一亚氨基戊醇聚合物0.5克，溶解于6毫升二甲基亚砜(DMSO)中。取N-羟 基琥珀酰亚胺氯甲酸酯1. 0克，溶解于5毫升DMSO中，在氮气保护、避光条件下加入至聚合 物溶液中，边加边搅拌，反应3小时，得到活化的聚合物。取分子量600的聚乙烯亚胺1.7克，溶解于6毫升的DMS0中，加入0. 2ml三乙胺作为催 化剂，避光、氮气保护下加入到活化的聚合物溶液中，边加边搅拌，3小时内加完，加完后 继续避光反应12小时。将反应完成的溶液装入截留分子量为15000的透析袋中，透析48小时，取袋内溶液冰冻 干燥。
权利要求
1、一种氨基酸材料的非病毒基因治疗载体的制备方法，其特征是由氨基酸单体经缩聚反应得到聚氨基酸，经氨基醇试剂对聚氨基酸侧基开环后，再用连接试剂进行结构修饰，通过活化氨基醇上的活泼羟基，连接聚乙烯亚胺，经透析冰冻干燥，获得聚氨基酸-氨基醇与聚乙烯亚胺的功能性复合材料，反应式如下反应式中n为氨基酸单元结构数量，n的值与聚氨基酸的分子量相关；m1，m2为开环单元结构的个数，m1，m2的值与聚氨基酸-氨基醇聚合物分子量有关；m1为PEI中伯氨基单元的数量，m2为仲氨基单元的数量，m1和m2的数值与PEI的分子量有关；X为氨基醇试剂中亚甲基个数，数值X＝2-12；结构(1)为聚氨基酸，(2)为开环后的聚氨基酸-氨基醇聚合物，(3)为用活化试剂R活化的聚氨基酸-氨基醇聚合物，4)为最终产物聚氨基酸-氨基醇-PEI聚合物。
2、 根据权利要求1所述的氨基酸材料的非病毒基因治疗载体的制备方法，其特征是所述反应 步骤如下1) 聚氨基酸材料的合成氨基酸单体在磷酸催化下，在160-180'C、真空减压到3ramHg条件 下，脱水反应2小时，移去真空泵，趁热加入N，N—二甲基甲酰胺，使固体物充分溶解， 将反应液逐滴加入到蒸馏水中，得白色片状物沉淀，过滤，用蒸馏水洗至中性，干燥，得 到聚氨基酸材料；2) 聚氨基酸材料连接侧基得到开环的聚氨基酸将制备的聚氨基酸材料，溶于N,N—二甲基 甲酰胺中，在冰浴下滴加氨基醇试剂，室温反应3-4小时，将反应液逐滴加入到正丙醇中， 析出沉淀，用丙酮洗涤，抽滤得固体，固体置于圆底烧瓶中，用水泵抽3小时，再用油泵 抽至完全干燥，得到开环产物聚氨基酸一氨基醇聚合物；3) 对开环产物进行功能基团的修饰取干燥的聚氨基酸一侧基聚合物溶于二甲基亚砜中，将 活化试剂溶于二甲基亚砜中，在氮气保护下，加入的聚氨基酸一侧基聚合物溶液中，边加边搅拌，加完后在室温下反应3小时，获得活化的聚氨基酸一氨基醇聚合物溶液；4) 将聚乙烯亚胺溶于二甲基亚砜中，加入三乙胺作为催化剂，避光、氮气保护、室温下加入 到活化的聚氨基酸一氨基醇聚合物溶液中，边底加边搅拌，3-4小时内加完，加完后避光、 室温下继续反应12小时，将反应完成的溶液经透析、冰冻、干燥、获得聚氨基酸-氨基醇-聚乙烯亚胺的功能性复合材料。
3、 根据权利要求2所述的氨基酸材料的非病毒基因治疗载体的制备方法，其特征是所述的聚氨基酸为聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚赖氨酸、天冬氨酸一谷氨酸共聚物、天冬氨酸一赖氨酸共聚物、谷氨酸一赖氨酸共聚物中任一种，分子量分布为10000-1100000 Da。
4、 根据权利要求2所述的氨基酸材料的非病毒基因治疗载体的制备方法，其特征是所述的氨 基醇试剂为氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇、氨基戊醇、氨基己醇、氨基庚醇、氨基辛 醇、氨基壬醇、氨基癸醇中任一种。
5、 根据权利要求2所述的氨基酸材料的非病毒基因治疗载体的制备方法，其特征是所述活化 羟基的连接剂为N，N，-羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、氯甲酸酯、羰基咪唑、N,N，-二琥 珀酰亚胺基硫酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯中任一种。
6、 根据权利要求1所述的氨基酸材料的非病毒基因治疗载体的制备方法，其特征是所述聚乙 烯亚胺分子量为直链型432Da、支链型600Da、 1200Da、 2000Da、 25kDa的任一种。
7、 根据权利要求1所述的氨基酸材料的非病毒基因治疗载体的制备方法，其特征是所述连接 剂用量与聚氨基酸一侧基聚合物重量比为0. 5-2倍量。
8、 根据权利要求1所述的氨基酸材料的非病毒基因治疗载体的制备方法，其特征是所述聚氨 基酸一侧基聚合物用量与二甲基亚砜的重量体积比为10-20倍量。
9、根据权利要求1所述的氨基酸材料的非病毒基因治疗载体的制备方法，其特征是所述连接 剂用量与二甲基亚砜的重量体积比为3-10倍量。
全文摘要
一种提供的聚氨基酸的修饰方法，由氨基酸单体经缩聚反应得到聚氨基酸，经氨基醇试剂对聚氨基酸侧基开环后，再用连接试剂进行结构修饰，通过活化氨基醇上的活泼羟基，连接聚乙烯亚胺(PEI)，经透析冰冻干燥，获得聚氨基酸—氨基醇与聚乙烯亚胺的功能性复合材料，具有低毒性，高基因转染效率，且可生物降解。成为非病毒性基因载体材料中的一类高分子化合物。
文档编号C12N15/64GK101225399SQ200810059348
公开日2008年7月23日 申请日期2008年1月25日 优先权日2008年1月25日
发明者海 余, 峻 周, 汤谷平, 王青青, 丹 陈 申请人:浙江大学