专利名称：一种洋水仙脱毒组培鳞茎的培养方法
技术领域：
本发明涉及植物脱毒组培快繁技术领域，尤其涉及一种洋水仙脱毒组培鳞 茎的培养与检测方法。
背景技术：
洋水仙(A^rAs")是从欧洲引入我国水仙新品种的统称，为石蒜科水仙 属多年生草本植物。20世纪80年代后进行较大规模的引入，主要用于春季花展， 少量盆栽作为年宵花使用。洋水仙与中国水仙相比，具有花大色艳，清香宜人 等特点；大部分品种副花冠成喇叭状，且以黄色为多，因而又泛称为"喇叭水 仙"或"黄水仙"。洋水仙又是优良的园林地被花卉作为切花使用。洋水仙一 般通过分蘖的子球进行繁殖，每个母鳞茎可分蘖2 4个小鳞茎。但是，由于病 毒侵染导致逐年退化，鳞茎变小，开花能力下降。浙江省农业科学院从英国引进洋水仙新品种，拟通过脱毒组培技术大量繁 殖脱毒鳞茎，以满足国内市场需要，同时克服病毒的危害和蔓延。我们从英国 引进栽培于温室的洋水仙中发现，绝大部分植株均表现花叶和斑驳等症状。通 过对病毒病原的普通生物学、血清学特征和基因组全序列的研究，首先鉴定、 明确了侵染洋水仙的主要线状病毒有4个属的8个成员，包括马铃薯Y病毒属 (genus Potyvirus) 水仙黄条病毒(vVarcj'ss^yellow stripe virus, NYSV)， 水 仙迟季黄化病毒(Akrcj.ss"s late season yellows virus, NLSYV)， 水仙退化 病毒(Tlkrcj'ss〃s degeneration virus, NDV)， 虎目艮万年青花叶病毒 (6 rait/ o卵2腿mosaic virus, 0rMV)， 香石竹潜隐病毒属(genus Carlavirus)水仙普通潜隐病毒(Akrcj's薦common latent virus, NCLV),水仙无症病毒 (7Varcis5YAS symptomless virus, NSV)，柘橙病毒属(genus Macluravirus) 水 仙潜隐病毒(TVkrcj'ssws latent virus ， NLV)及马铃薯X病毒属(genus Potexvirus)7JC仙花叶病毒(Akrc^sws mosaic virus, NMV)等8禾中病毒，这8 种病毒单独或复合侵染是引起洋水仙种质严重退化的重要原因之一；同时提出 以田间洋水仙发生的病毒，经扩增、克隆和原核表达制备成病毒特异性抗血清， 进而对洋水仙植株样品进行病毒ELISA检测的方法(Chen J etal. 2006. Archives of Virology, 151:2261-2267; Zheng HY et al. 2006. Archives of Virology, 151:1667_1672; Chen J et al. 2006. Archives of Virology, 151:1673-1677; Chen J et al. 2007. Archives of Virology, 152:441-448; Chen J et al. 2003， Journal of Phytopathology, 151:26-29)。到目前为止 有关洋水仙茎尖脱毒组培及病毒检测的研究尚未见报道。发明内容本发明目的是，针对现有洋水仙常规生产繁种技术中所存在的繁殖率低，带 病毒率高，且通常呈多种线状病毒复合侵染，而又难以分离纯化等缺陷，提供一 种能大量、快速繁殖鳞茎，又能脱除鳞茎所带病毒并经特异检测，以确保无毒的 洋水仙鳞茎脱毒、组培与检测的配套方法。本发明目的通过以下技术方案来实现。 一种洋水仙脱毒组培鳞茎的培养方法，按如下步骤进行 (1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升 所含重量为1)基本培养基子鳞茎诱导、增殖及鳞茎生长培养基用MS培养基；生根培养基用1/2 MS培养基;其中，蔗糖或白糖20 40g/L，琼脂7 9 g/L，pH5. 6 5.8;2) 子鳞茎诱导培养基MS+ BA 0. l lmg /L和NAA 0. 05 0. 5mg/L;3) 子鳞茎增殖培养基MS+ BA 0. 05 0. 5mg /L和NAA 0. 1 lmg/L;4) 鳞茎生长培养基MS+ BA 0. 01 0. lmg /L禾卩NAA 0. 05 0. 5mg/L;5) 生根培养基1/2MS+ NAA 0. 1 0. 5mg/L; (2)洋水仙脱毒组培鳞茎的培养1) 鳞茎低温处理鳞茎经8'C低温处理2 4周；2) 鳞茎萌芽将低温处理后的鳞茎放在25X:培养室内，培养1 2周， 使鳞茎快速萌芽；3) 外植体的选取与灭菌取3 5cm的鳞茎幼芽，经灭菌处理后，在无 菌条件40倍的双筒解剖镜下，摘出0. 2 0. 3mm带1 2个叶原基的茎尖作为脱 毒组培用外植体；4) 茎尖诱导培养将外植体接种在子鳞茎诱导培养基上，在培养条件下 培养1 2个月，从茎尖诱导形成幼芽或子鳞茎；5) 子鳞茎增殖培养将幼芽或子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在培 养条件下培养30 45天至增殖出子鳞茎；根据对子鳞茎数量的需求，每隔30 45天按同样方法进行子鳞茎再增殖；6) 子鳞茎生长培养将子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，在培养条件下培养30 45天使鳞茎长大到0. 5 lcm;7) 生根培养将长大的子鳞茎转接在生根培养基中，在培养条件下培养 20 30天至子鳞茎上部长出叶片，基部长出数根根系；8) 移栽当生根子鳞茎苗长高至3 5cm以上、长出5根以上根时，移栽至基质培养基，在培养条件下培养1 2个月后成苗；(3)病毒ELISA检测将田间洋水仙发生的病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外 壳蛋白，注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清后，对脱毒组培获得的鳞茎苗进行病毒ELISA检测。所述培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升 所含重量为(1) 基本培养基子鳞茎诱导、增殖及鳞茎生长用MS培养基；生根用1/2MS培养基，其中，琼脂8g/L， pH为5.7;(2) 子鳞茎诱导培养基蔗糖30g/L的MS+ BA 0. 5mg /L和NAA 0. lmg/L;(3) 子鳞茎增殖培养基:白糖为40g/L的MS+ BA 0. lmg /L和NAA 0. 5mg/L;(4) 鳞茎生长培养基白糖为40g/L的MS+ BA 0. 05mg /L和NAA 0. lmg/L;(5) 生根培养基白糖为20g/L的1/2MS+ NAA 0. 25mg/L。 所述的灭菌处理是将鳞茎幼芽经75%酒精浸泡0. 5 1. 0分钟，再用0. 1%升汞水溶液浸泡10 15分钟，最后用无菌水冲洗3 5次。所述各脱毒组培阶段的培养条件是，培养温度为25±2°C，光照光强为 1500 2500 Lx，光照时间为10h/d。所述的移栽基质由泥炭珍珠岩蛭石按体积比l: 2: 2配制而成。 本发明的有益效果是1)针对洋水仙花叶病毒病通常系由多种线状病毒复合侵染所致，并又难以 分离、纯化的特点，采用由本发明人分离、鉴定明确的洋水仙8种花叶病毒外壳蛋白基因为病原，制备成病毒特异性抗血清后，所建立的ELISA检测技术体系，无需分离、纯化，即能快速对组培鳞茎苗实施是否带毒及带何种病毒的检测，可以杜绝所述病毒的携带与传播，以确保组培苗的安全质量；2) 建立的洋水仙脱毒组培快繁技术体系，脱毒效果好，脱毒鳞茎增殖快， 其月增殖率可达3 5倍，其生根率和移栽成活率达100%，适合工厂化育苗，可 商品化生产；3) 脱毒鳞茎可比未脱毒鳞茎生长速度快、开花期早、花色鲜艳。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。BA: 6-节氨基嘌呤(6-Benzylamin叩urine)，美国进口国内分装，分析纯，纯 度99. 9%。NAA: a-萘乙酸(l-Naphthylaceticacid)，美国进口国内分装，分析纯，纯度 99. 5%。实施例l:一种洋水仙脱毒组培鳞茎的培养方法，按如下步骤进行(1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与每升所 含重量为1) 基木培养基子鳞茎诱导、增殖及鳞茎生长培养基用MS培养基，生 根培养基用1/2 MS培养基；其中，琼脂为8g/L， pH为5. 7;2) 子鳞茎诱导培养基蔗糖30g/L的MS+ BA 0. 5mg /L和NAA 0. lmg/L;3) 子鳞茎增殖培养基白糖40g/L的MS+ BA 0. lmg /L和NAA 0. 5mg/L;4) 鳞茎生长培养基白糖40g/L的MS+ BA 0. 05mg /L和NAA 0. lmg/L;5) 生根培养基白糖20g/L的1/2 MS+ NAA 0. 25mg/L。(2) 洋水仙脱毒组培鳞茎的培养1) 鳞茎低温处理鳞茎经8"低温处理3周；2) 鳞茎萌芽将低温处理后的鳞茎放在25。C培养室内，培养1 2周， 使鳞茎快速萌芽；3) 外植体的选取与灭菌:取3 5cm的鳞茎幼芽，经75似酉精浸泡0.7分 钟，再用0. 1%升汞水溶液浸泡13分钟，最后用无菌水冲洗3 5次后，在无菌条 件40倍的双筒解剖镜下，摘出0. 2 0. 3mm带1 2个叶原基的茎尖作为脱毒组 培用外植体；4)茎尖诱导培养将外植体接种在子鳞茎诱导培养基上，在温度25i2'C， 光强2000 Lx，光照时间10h/d的条件下培养1 2个月，从茎尖诱导形成幼芽或 子鳞茎；5) 子鳞茎增殖培养将幼芽或子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在同 步骤4)培养条件下培养30 45天至增殖出子鳞茎；根据对子鳞茎数量的需求， 每隔30 45天按同样方法进行子鳞茎再增殖；6) 子鳞茎生长培养将子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，在同步骤4) 培养条件下培养30 45天使鳞茎长大到0. 5 lcm;7) 生根培养将长大的子鳞茎转接在生根培养基中，在同步骤4)培养 条件下培养20 30天至子鳞茎上部长出叶片，基部长出数根根系；8) 移栽当生根子鳞茎苗长高至3 5cm以上、长出5根以上根时，移 栽至由泥炭珍珠岩蛭石按体积比l: 2: 2配制而成的基质培养基中，在同 步骤4)培养条件下培养1 2个月后成苗；(3) 病毒ELISA检测1)洋水仙病毒病原种类的鉴定① 取病样取洋水仙花叶病害病样，-S(TC储存备用；② 电镜观察取病汁液经负染后，用电镜观察病毒粒子的形态；③ 病毒种类RT-PCR检测和鉴定对侵染洋水仙8种病毒的序列分别合成 扩增各种病毒外壳蛋白基因的引物；以植物总RNA为模板，逆向引物(-)合成 病毒第一链cDNA，进而以此cDNA为模板，采用TaKaRa公司LA TaqTMPCR体系 或ET化^ DNA聚合酶体系，对各种病毒逐一进行RT-PCR检测；2)病毒ELISA检测 将田间洋水仙发生的病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外 壳蛋白，注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清，对脱毒组培获得的 鳞茎苗进行病毒ELISA检测(1) 病毒外壳蛋白基因扩增、克隆和原核表达应用上述RT-PCR技术扩增相关病毒的外壳蛋白基因，与TA载体连接克隆， 然后经双酶切，产物与用同样双酶切的原核表达载体连接，连接产物转化BL21 plysaE或plysaS，并经IPTG诱导表达，用SDS-PAGE检测病毒外壳蛋白基因的 表达情况；(2) 抗血清的制备 (i)目的蛋白纯化制备12% SDS-PAGE，浓縮胶不插梳子，浓縮胶上方留一定的空间用于加样； 取适量表达菌体，加1. 6 mLl X SDS上样缓冲液，充分裂解后置IO(TC水浴10 min， 离心(10，000 g)7min，上清液进行电泳；电泳完毕后，将凝胶置0. 25 M KC1 4 T染色0.5h，切下病毒外壳蛋白条带放入研钵研磨，加入适量1XSDS上样缓 冲液，用5-20%梯度SDS-PAGE进行第2次电泳；电泳完毕后，将凝胶置0. 25 M KC1 4。C染色0.5h，切下目的条带。如果用于免疫小鼠，分装4份；如果用于家兔不需分装。-30 。C保存。(ii) 免疫小鼠或家兔并制备抗血清免疫小鼠取份含目的蛋白的凝胶于研钵，加入生理盐水(约2mL)充 分研磨，用注射器注射小鼠，小鼠每只每次注射0.5 mL;免疫家兔每只家兔蛋白用量是每只小鼠的4倍，每次注射2mL; 7天后注射第二次，总共注射4次；最后一次注射后3天断头取血，制备抗血清；(iii) 吸附去除非目的蛋白产生的抗体加1/4体积BL21 pLys S或BL21 pLys E菌体蛋白吸附抗血清屮的抗BL21 pLys S /BL21 pLys E菌体蛋白的抗体(根据目的蛋白是用BL21 pLys S菌株 还是用BL21 pLys E菌株表达来决定使用何种菌体蛋白吸附)，2 h后离心 (10， 000 g) 7 min，吸取上清液,4 。C保存；吸附用菌体蛋白的制备培养BL21 pLys S或BL21 pLys E 200 mL，离心 后将菌体悬浮于20 mL PBS中，在冰浴条件下用超声波细胞粉碎机充分破碎菌 体，离心(IO，OOO g)7 min，取上清即为菌体蛋白；(iv) 抗血清纯度检测用Western blot的方法检测抗血清的纯度；需要特别注意以下几点第一，选用12%SDS-PAGE进行电泳，每只小鼠的 抗血清需要3个泳道，分别为BL21 pLys S或BL21 pLys E菌体蛋白对照、诱 导表达目的蛋白的菌体蛋白和标准蛋白Marker;第二，加一抗血清(即制备的 小鼠抗血清)时每只小鼠的抗血清用一个培养皿，不要将不同小鼠的抗血清混 在一起，推荐抗血清的用量为15mL —抗稀释液加25uL抗血清；第三，显色 反应后对抗血清的纯度进行评估如果BL21 pLys S或BL21 pLys E菌体蛋白 对照泳道无显色条带，诱导表达目的蛋白的菌体蛋白泳道有显色条带，而且显色条带的位置与H的蛋白大小相一致，说明抗血清的纯度符合要求，个别情况下，BL21 pLys S或BL21 pLys E菌体蛋白对照泳道无显色条带，但诱导表达 冃的蛋白的菌体蛋白泳道有多条显色带，其中主要条带的位置与目的蛋白大小 相一致，这种抗血清也可以用，因为这些细的条带可能是目的蛋白裂解造成的； 第四，将检测合格的抗血清-3(TC保存备用(加入适量叠氮钠)； (3) ELISA检测技术 用建立的ELISA检测技术对洋水仙各脱毒组培阶段的鳞茎进行病毒种类及 其含量检测。(i) 包被称取病叶样品和健叶对照各0. 2 g，分别加入包被液各1 mL研 磨，离心(5，00。 g)后包被96孔板，每孔IOO iiL， 4 。C， 12 h;(ii) 封闭加封闭液，每孔150 wL , 37 。C孵育1 h;(iii) 加一抗加入适当稀释的抗血清(ELISA缓冲液稀释)，37 。C孵育2h;(iv) 加酶标二抗加入1/5000的羊抗鼠IgG-碱性磷酸酶(Sigma， ELISA 缓冲液稀释)，37 。C孵育2 h;(v) 加底物lmg/mL的p-NPP (Sigma，溶于底物缓冲液，pH 9. 8)， 37 。C 黑暗中孵育，分别在40 min、 1 h和2 h测OD舰值;注除封闭为150 uL/孔外，其余步骤均用100 uL/孔，每步后用PBS-T 注满微孔，洗板3次，每次3-5 min; 试剂(i) 包被液(0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6):称Na线0.1465 g， Na2C03 0. 07 95 g溶于40 mL蒸馏水，溶解后定容至50 mL，两周内使用；(ii) 封闭液5 g脱脂奶粉溶于100 mL PBS-T中；(iii) PBS-T: 取10XPBS 40 mL (10XPBS:在800 mL蒸馏水中溶解80 g NaCl、 2 g KC1、 14. 4 g Na2 HP04和2. 4 g K H2P04，用HC1调节pH值至7. 4， 加蒸馏水定容至1 L，高压蒸汽灭菌20 min，保存于室温)，加入0. 2 mL Tween20， 加蒸馏水定容至400 mL;(iv) ELISA缓冲液:称l g脱脂奶粉，2 g PVP (Polyvinyl-Pyrrolidone， Mw 40,000， Sigma),溶于100 mL PBS-T中；(v) 底物缓冲液9.7 mL二乙醇胺(Diethanolamine)， 0.01 g MgCl2，加 入80mL去离子水，用HCl调节pH至9.8，再加水至100 mL，用棕色瓶避光保 存于黑暗中；(vi) 底物称取p-NPP (p-Nitrophenyl Phosphate) 2.5 mg溶于2. 5 mL 底物缓冲液中。实施例2:本实施例基本培养基中的琼脂为7g/L， pH为5.6;子鳞茎诱导培养基为 蔗糖20g/L的MS+ BA O.lmg /L和NAA 0.3mg/L;子鳞茎增殖培养基为白糖 20g/L的MS+BA0.5mg/L和NAA0.1mg/L;鳞茎生长培养基为白糖30g/L的 MS+ BA 0.02mg /L和NAA 0.25mg/L;生根培养基为白糖40g/L的1/2 MS+ NAA0.45mg/L;鳞茎经8°C、 2周低温处理；鳞茎幼芽经75%酒精浸泡0. 5分钟，0. 1%升汞水溶液浸泡10分钟；诱导、增殖、生长、生根各阶段的培养条件为温度25士2i:，光强1500 Lx，光照时间10h/d外；其余步骤工艺均同于实施例1。 实施例3:本实施例基本培养基中的琼脂为9g/L， pH为5.8;子鳞茎诱导培养基为 蔗糖40g/L的MS+BAlmg/L和NAA 0.5mg/L;子鳞茎增殖培养基为白糖30g/L 的MS+BA0.3mg/L和NAA lmg/L;鳞茎生长培养基为白糖20g/L的MS+BA0.09mg /L和NAA 0.5mg/L;生根培养基为白糖30g/L的1/2 MS+ NAA 0.lmg/L; 鳞茎经8t:、 4周低温处理；鳞茎幼芽经75%酒精浸泡l.O分钟，0. 1%升汞水溶 液浸泡15分钟；诱导、增殖、生长、生根各阶段的培养条件为温度25士2。C， 光强2500Lx，光照时间10h/d外；其余步骤工艺均同于实施例1。 试验例(病毒检测)1、 对照材料从田间采集的病叶洋水仙自然分蘖的子球；2、 处理材料以实施例l、 2或3获得的脱毒组培鳞茎；3、 病毒ELISA检测由于洋水仙常含有多种线状病毒复合侵染，通常病毒 难以分离纯化，从而应用本发明人鉴定明确的8种洋水仙病毒外壳蛋白基因，经扩增、克隆和原核表达后获得的大量相关病毒外壳蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制备而成的病毒特异性抗血清，供病毒ELISA检测之用；4、 检测结果如下表所示-处理检测的结果对照阳性脱毒组培鳞茎阴性
权利要求
1、一种洋水仙脱毒组培鳞茎的培养方法，其特征在于按如下步骤进行(1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为1)基本培养基子鳞茎诱导、增殖及鳞茎生长培养基用MS培养基；生根培养基用1/2 MS培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；2)子鳞茎诱导培养基MS+BA 0.1～1mg/L和NAA 0.05～0.5mg/L；3)子鳞茎增殖培养基MS+BA 0.05～0.5mg/L和NAA 0.1～1mg/L；4)鳞茎生长培养基MS+BA 0.01～0.1mg/L和NAA 0.05～0.5mg/L；5)生根培养基1/2MS+NAA 0.1～0.5mg/L；(2)洋水仙脱毒组培鳞茎的培养1)鳞茎低温处理鳞茎经8℃低温处理2～4周；2)鳞茎萌芽将低温处理后的鳞茎放在25℃培养室内，培养1～2周，使鳞茎快速萌芽；3)外植体的选取与灭菌取3～5cm的鳞茎幼芽，经灭菌处理后，在无菌条件下，摘出0.2～0.3mm带1～2个叶原基的茎尖作为脱毒组培用外植体；4)茎尖诱导培养将外植体接种在子鳞茎诱导培养基上，在培养条件下培养1～2个月，从茎尖诱导形成幼芽或子鳞茎；5)子鳞茎增殖培养将幼芽或子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天至增殖出子鳞茎；根据对子鳞茎数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行子鳞茎再增殖；6)子鳞茎生长培养将子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，在培养条件下培养30～45天使鳞茎长大到0.5～1cm；7)生根培养将长大的子鳞茎转接在生根培养基中，在培养条件下培养20～30天至子鳞茎上部长出叶片，基部长出数根根系；8)移栽当生根子鳞茎苗长高至3～5cm以上、长出5根以上根时，移栽至基质培养基，在培养条件下培养1～2个月后成苗；(3)病毒ELISA检测将田间洋水仙发生的病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白，注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清后，对脱毒组培获得的鳞茎苗进行病毒ELISA检测。
2、 按权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为(1) 基本培养基子鳞茎诱导、增殖及鳞茎生长用MS培养基；生根用1/2MS培养基，其中，琼脂8g/L， pH为5.7;(2) 子鳞茎诱导培养基蔗糖30g/L的MS+ BA 0. 5mg /L和NAA 0. lmg/L;(3) 子鳞茎增殖培养基:白糖为40g/L的MS+ BA 0. lmg /L和NAA 0. 5mg/L;(4) 鳞茎生长培养基白糖为40g/L的MS+ BA 0. 05mg /L和NAA 0. lmg/L;(5) 生根培养基白糖为20g/L的1/2MS+ NAA 0. 25mg/L。
3、 按权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的灭菌处理是，将鳞茎 幼芽经75%酒精浸泡0. 5 1. 0分钟，再用0. 1%升汞水溶液浸泡10 15分钟， 最后用无菌水冲洗3 5次。
4、 按权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的各脱毒组培阶段的培 养条件是，温度为25±2°。，光强为1500 2500 Lx，光照时间为10h/d。
5、 按权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的移栽基质由泥炭珍珠岩蛭石按体积比l: 2: 2配制而成。
全文摘要
本发明涉及一种洋水仙脱毒组培鳞茎的培养方法，属植物繁殖技术领域。该方法包括培养基的配制、脱毒组培鳞茎的培养、病毒ELISA检测等步骤。本发明能快速对组培鳞茎苗实施高灵敏度的病毒检测，杜绝病毒的携带与传播，可比未脱毒鳞茎生长速度快、开花期早、花色鲜艳；脱毒鳞茎增殖快，其月增殖率可达3～5倍，适合工厂化育苗。可在洋水仙的提纯复壮及开发中推广应用。
文档编号A01H4/00GK101213938SQ200710306830
公开日2008年7月9日 申请日期2007年12月28日 优先权日2007年12月28日
发明者吕永平, 刚 徐, 林 林, 汪一婷, 牟豪杰, 晔 程, 郑红英, 陈剑平 申请人:浙江省农业科学院